Artykuł metodologiczny

Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO2

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53045

⸱

26 października 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 2CREST, Japan Science and Technology Agency, 3School of Fundamental Science and Engineering, Waseda University, 4Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 5Graduate School of Biomedical Engineering, Tohoku University, 6Faculty of Science and Engineering, Waseda University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół modyfikacji powinowactwa komórek powierzchni rusztowania w środowisku wodnym. Metoda wykorzystuje fotokatalizę dwutlenku tytanu do rozkładu filmu organicznego w obszarze napromieniowanym światłem. Pokazujemy, że można go wykorzystać do tworzenia mikrodomen białek rusztowań, zarówno ex situ, jak i in situ.

Streszczenie

Zanieczyszczenia organiczne zaadsorbowane na powierzchni dwutlenku tytanu (TiO2) mogą być rozkładane przez fotokatalizę pod wpływem światła ultrafioletowego (UV). W tym miejscu opisujemy nowatorski protokół wykorzystujący fotokatalizę TiO2 do lokalnej zmiany powinowactwa komórek na powierzchni substratu. W tym eksperymencie cienka warstwa TiO2 została pokryta napylaniem na szklane szkiełko nakrywkowe, a powierzchnia TiO2 została następnie zmodyfikowana monowarstwą organosilanu pochodzącą z oktadecylotrichlorosilanu (OTS), który hamuje adhezję komórek. Próbkę zanurzono w pożywce do hodowli komórkowej, a skupione światło UV napromieniowano na obszar ośmiokątny. Kiedy komórki PC12 linii komórek neuronalnych zostały posiane na próbce, komórki przylegały tylko do obszaru naświetlanego promieniowaniem UV. Dalej pokazujemy, że ta modyfikacja powierzchni może być również przeprowadzana in situ, tj. nawet wtedy, gdy komórki rosną na podłożu. Właściwa modyfikacja powierzchni wymagała, aby białko kolagenu macierzy zewnątrzkomórkowej było obecne w pożywce w momencie naświetlania promieniami UV. Przedstawiona tutaj technika może być potencjalnie wykorzystana do modelowania wielu typów komórek w celu konstruowania systemów kokultury lub do arbitralnego manipulowania komórkami w hodowli.

Wprowadzenie

Procesy litografii półprzewodnikowej i jej pochodne - takie jak fotolitografia1,2, litografia wiązką elektronów3-6 i druk mikrokontaktowy7-10 - stały się teraz uznanym narzędziem w biologii komórki do hodowli żywych komórek w określonej pozycji i geometrii. Metoda modelowania opiera się na wykorzystaniu mikroprefabrykowanych podłoży, składających się z mikrowyspy permisywnej powłoki komórkowej na nieprzepuszczalnym tle. Takie podłoże służy jako szablon do modelowania komórek. Technologie te dostarczyły nam nowatorskich metod inżynierii komórek i ich funkcji na poziomie jedno- i wielokomórkowym, ekstrakcji wewnętrznych właściwości komórek oraz zwiększenia przepustowości komórkowych badań przesiewowych leków11.

Stopień swobody w tworzeniu wzorów komórkowych znacznie by wzrósł, gdyby geometria wzorca szablonu mogła być zmieniana in situ, tj. podczas hodowli komórek na powierzchni. Konwencjonalne metody tworzenia wzorów nie mogą być tutaj bezpośrednio stosowane, ponieważ przetwarzają próbki w atmosferze lub w próżni. W związku z tym zaproponowano różne nowe techniki modyfikacji powierzchni, które opierają się m.in. na związkach fotoreaktywnych12,13 czy ablacji laserowej5,14. Proponowane metody zostały ładnie zrecenzowane przez Robertusa i wsp.15, a ostatnio przez Choi i wsp.16 i przez Nakanishiego17.

Tutaj w tym artykule opisujemy nowy protokół modyfikacji powierzchni in-situ, który wykorzystuje fotokatalityczny rozkład cząsteczek organicznych na powierzchni dwutlenku tytanu (TiO2)18,19. W tej metodzie folia TiO2 jest umieszczana między szklanym podłożem a folią organiczną, która łączy komórki, a folia organiczna jest rozkładana in situ przez miejscowe naświetlanie światłem ultrafioletowym (UV) do obszaru zainteresowania (λ < 388 nm). Pokazujemy, że nowy protokół może być wykorzystany do tworzenia mikrowzorców białek macierzy zewnątrzkomórkowej i żywych komórek zarówno ex situ, jak i in situ. TiO2 jest biokompatybilny, stabilny chemicznie i optycznie przezroczysty, co sprawia, że jest przyjazny do wprowadzenia w eksperymentach z hodowlami komórkowymi. Protokół ten stanowi opartą na materiałoznawstwie alternatywę dla modyfikacji rusztowań kultur komórkowych w środowisku hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełka podstawowego pokrytego TiO2

  1. Ponumeruj szkiełka nakrywkowe za pomocą rylca diamentowego. Ułatwia to nie tylko śledzenie poszczególnych szkiełek, ale także zapewnia, że prawidłowa strona próbki jest skierowana do góry. Oczyść szkiełka, najpierw pod bieżącą wodą ddH2O, a następnie poprzez zanurzenie ich w roztworze piranha (H2SO4:H2O2 = 4:1). Po 10 min dokładnie wypłucz szkiełka, 8 razy w ddH2O. Wysusz szkiełka w strumieniu N2.
  2. Umieść tarczę TiO2 w systemie rozpylania wysokoczęstotliwościowego (RF). Przymocuj szkiełka do uchwytu próbek urządzenia do rozpylania za pomocą taśmy polimidowej. Umieść uchwyt z próbkami w komorze rozpylania. Odsysaj powietrze z komory, aż ciśnienie osiągnie 2.0×10-4 Pa.
  3. Wprowadź gaz Ar do komory i ustaw ciśnienie nanoszenia na 4.0 mTorr. Przy zamkniętej przesłonie stopniowo zwiększ moc RF do 70 W.
  4. Otwórz przesłonę i rozpylaj przez 15 min, aby uzyskać warstwę o grubości 120-150 nm (Rycina 1: Krok A). Szybkość wzrostu warstwy musi zostać wyznaczona dla każdego urządzenia.

2. Powlekanie powierzchni warstwą odpychającą komórki

  1. Zhydrofilizuj powierzchnię TiO2, poddając próbkę działaniu plazmy O2 zgodnie z instrukcją producenta reaktora plazmowego. Próbkę traktujemy przez 5 min przy mocy 200 W i przepływie O2 wynoszącym 100 sccm. Zanurz próbkę w ddH2O i potwierdź, że powierzchnia jest superhydrofilowa. Dokładnie wysusz powierzchnię w strumieniu N2.
  2. Przygotuj 1 mM roztwór oktadecyltrichlorosilanu (OTS), dodając 39,6 μl OTS do 100 ml toluenu. Zanurz próbkę w roztworze na 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Krok ten należy przeprowadzić wewnątrz worka rękawiczkowego wypełnionego N2 (Ryc. 1: Krok B).
  3. Aby usunąć cząsteczki fizysorbowane, poddaj próbkę sonikacji w toluenie, acetonie, etanolu i ddH2O przez 5 min w każdym z tych mediów, w podanej kolejności. Przepłucz próbkę czterokrotnie w świeżej ddH2O i wysusz powierzchnię w strumieniu N2. Powierzchnia powinna być hydrofobowa, z kątem zwilżania wynoszącym 100-110°.

3. Wzorowanie powierzchni ex-situ

  1. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, narysuj na powierzchni kilka linii pomocniczych za pomocą rysika diamentowego. Znaczniki te pomagają w śledzeniu przetworzonych obszarów oraz w ustawianiu ostrości mikroskopu. Sterylizuj TiO2 powleczony OTS poprzez zanurzenie próbki w 70% etanolu na 5 min. Następnie przemyj próbkę dwukrotnie w sterylnej ddH2O.
  2. Umieść próbkę w szalce 35-mm i dodaj 2 ml pożywki wzrostowej dla linii PC12 (patrz Krok 4.2). Inkubuj przez ponad 3 hr w inkubatorze CO2 (37 °C). Procedura ta ma na celu umożliwienie adsorpcji albumin surowiczych na powierzchni. Zaadsorbowane albuminy hamują późniejszą adsorpcję innych białek i komórek (Rysunek 1: Krok C).
  3. W czasie oczekiwania przygotuj odwrócony mikroskop fluorescencyjny.
    1. Włącz lampę łukową, włóż kostkę z filtrem UV i ustaw obiektyw na 20X.
    2. Zmierz natężenie światła I (W cm-2) za pomocą miernika natężenia UV i oblicz czas naświetlania t (w sekundach) dla dawki d (w J cm-2) według wzoru: t = d/I.
      Na przykład, aby naświetlić próbkę dawką 200 J cm-2 przy użyciu źródła światła o mocy 600 mW cm-2, wymagane jest 333 sec naświetlania.
    3. Użyj mikrometru przedmiotowego i przymknij przysłonę pola widzenia, aby ustawić rozmiar obszaru do naświetlania, np. 200 μm.
  4. Po 3 hr inkubacji uzupełnij pożywkę o 200 μl kolagenu typu IV o stężeniu 3,0 mg ml-1 (Col-IV; stężenie końcowe 300 μg ml-1).
  5. Przenieś szalkę 35-mm na stolik mikroskopu. Znajdź linię pomocniczą, ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni próbki i naświetl światłem UV dawką 200 J cm-2 (Rysunek 1: Krok D). Obszar naświetlania UV można zmieniać, regulując otwór przysłony pola widzenia lub zastępując przysłonę maską metalową o dowolnej geometrii.
  6. Wymień pożywkę na świeżą pożywkę wzrostową (bez Col-IV) i umieść próbkę z powrotem w inkubatorze.

4. Hodowla komórek

  1. Rutynowa hodowla komórek PC12 jest prowadzona na plastikowych szalkach pokrytych kolagenem.
    1. Aby pokryć 60-mm szalkę do hodowli tkankowej Col-IV, najpierw zwilżyć powierzchnię ddH2O, a następnie odessać całą ddH2O.
    2. Przygotować roztwór Col-IV o stężeniu 300 μg ml-1, rozcieńczając roztwór wyjściowy (3 mg ml-1) 10-krotnie w ddH2O.
    3. Dodać 200 μl Col-IV (300 μg ml-1) na jedną 60-mm szalkę. Pozostawić roztwór do rozprowadzenia się po całej powierzchni.
    4. Osuszyć szalkę w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza przez około 1 hr.
    5. Przepłukać powierzchnię dwukrotnie 4 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (D-PBS). W przypadku braku natychmiastowego użycia pokrytej szalki, przepłukać ją raz 4 ml ddH2O. Po odessaniu ddH2O przechowywać szalkę w inkubatorze. Należy starać się nie przechowywać jej dłużej niż dwa tygodnie.
  2. Komórki PC12 hoduje się w pożywce wzrostowej składającej się z: pożywki Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco (niska zawartość glukozy) + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% surowicy końskiej + 1% roztworu penicyliny-streptomycyny. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2) i wymieniać połowę pożywki co drugi dzień. Przesiewać komórki przed osiągnięciem konfluencji.
    1. Odessać pożywkę wzrostową i dodać 2 ml PBS+ (D-PBS + 10 mg ml-1 albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 10 mM EDTA) podgrzanego do 37 °C. Inkubować przez 5 min w 37 °C. Delikatnie opukać szalkę, aby odczepić wszystkie komórki.
    2. Zebrać komórki do 15 ml probówki stożkowej. Przepłukać szalkę 3 ml świeżego D-PBS podgrzanego do 37 °C.
    3. Wirować probówkę przy 150 × g przez 4 min.
    4. Odessać nadsącz i dodać 1 ml pożywki wzrostowej.
    5. W hodowli rutynowej rozdzielać komórki w stosunku od 1:3 do 1:5.
  3. Aby wysiać komórki na próbkę OTS/TiO2 modyfikowaną promieniowaniem UV, należy ocenić gęstość komórek i dodać 3,0×105 komórek na 35-mm szalkę (Figure 1: Krok E). Inkubować szalkę w inkubatorze z nawilżaczem (37 °C, 5% CO2) przez 1-2 dni. Do eksperymentów z wzorcowaniem można wykorzystać zarówno naiwne, jak i zróżnicowane czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) komórki PC12. W celu indukcji różnicowania NGF, kilka dni przed wysianiem komórek na próbkę, do pożywki wzrostowej dodaje się 100 ng ml-1 7S-NGF. Różnicowanie NGF wydaje się zwiększać adhezyjność komórek PC12 i ułatwia ich manipulację, zwłaszcza w eksperymentach z wzorcowaniem in-situ.

5. Wzorowanie powierzchni in situ

  1. Po 1-2 dniach hodowli na powierzchni zmodyfikowanej ex-situ, potwierdź, że komórki przywierają i rosną wyłącznie w obszarze naświetlanym promieniowaniem UV. Przygotuj mikroskop zgodnie z opisem w kroku 3.4.
  2. Przenieś próbkę do nowej 35-milimetrowej szalki do hodowli tkanek zawierającej pożywkę wzrostową, 100 ng ml-1 NGF (w przypadku użycia komórek zróżnicowanych za pomocą NGF) oraz 100 μg ml-1 Col-IV.
  3. Umieść szalkę na stoliku mikroskopu. Znajdź odpowiednią pozycję i naświetl próbkę promieniowaniem UV z dawką 200 J cm-2 (Rysunek 1: Krok F, G). Nowo utworzony obszar dopuszczający jest oznaczony gwiazdką na Rysunku 1: Krok G.
  4. Postaraj się zakończyć obróbkę pojedynczej próbki w ciągu 30 min. Po naświetlaniu przenieś próbkę z powrotem do pożywki bez Col-IV.
  5. Zachowaj szczególną ostrożność podczas przenoszenia szalki z hodowlą komórek oraz podczas transferu próbki między szalkami, aby zapobiec odklejeniu się ukształtowanych struktur komórkowych.

Schemat wiązania białek indukowanego promieniowaniem UV; szkło TiO2, SAM OTS, albumina, kolagen, proces z komórkami PC12.
Rysunek 1. Schematyczny opis całego procesu. Szczegóły znajdują się w tekście. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2A przedstawia obraz z przekroju wykonany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) filmu TiO2 osadzonego metodą rozpylania katodowego. Na podstawie obserwacji oszacowano, że grubość filmu wynosi około 150 nm. Zauważalna jest tutaj płaskość osadzonego filmu TiO2. Dalsza analiza za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) wykazała, że chropowatość powierzchni mierzona jako wartość średnia kwadratowa (rms) wynosiła 0,2 nm (Rysunek 2B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W naszym obecnym protokole folia TiO2 została utworzona przez rozpylanie magnetronowe RF. Preferujemy tę metodę osadzania, ponieważ pozwala nam ona na powtarzalne przygotowanie fotokatalitycznego filmu TiO2 o chropowatości sub-nm. Chociaż procesy osadzania napylania są znane materiałoznawcom i inżynierom elektronikom, mogą nie być do końca dostępne dla biologów. W takim przypadku folia TiO2 z powłoką wirową byłaby alternatywnym wyborem23. W tej metodzie nanocząstki TiO2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu Kotaro Okubo za życzliwą pomoc przy obrazowaniu SEM. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021) oraz przez granty badawcze z Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation i Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkoweszklane Warner InstrumentsCS-15R15średnica 15 mm, grubość #1,5
Rysik diamentowyOgura Jewel IndustryD-Point Pen
System napylania RFANELVASPC350
TiO2 cel rozpylaniaKojundo Chemical LabTlenek tytanu (IV), celCzystość, 99,9%
Reaktor plazmowyYamatoPR301
n-oktadecylotrichlorosilan (OTS)Aldrich104817
ToluenWako204-01866
Naczynie do hodowli tkankowych (35  mm)Greiner627160
Naczynie do hodowli tkankowych (60  mm)BD Falcon353002
Kolagen typu IVNitta GelatinCellmatrix Typ IV
D-PBSGibco14190-144
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM)Gibco11885-084
Surowica bydlęcaGibco12483-020Inaktywacja termiczna i przejście przez 0,22  μ m filtr przed użyciem
Serum dla koniGibco26050-088Przepuścić przez 0,22 i # 160; μ m filtr przed użyciem
Penicylina-streptomycyna (100x)Nacalai tesque26253-84
7S czynnik wzrostu nerwów (NGF)Alomone LabsN-130
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA2153
EDTADojindoN001Roztwór podstawowy w 0,5 M
nanocząsteczce TiO2TaycaTKD-701
płodu

Bibliografia

  1. Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).
  2. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
  3. Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
  4. Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01(2011).
  5. Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
  6. Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
  7. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  8. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164(2011).
  9. Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
  10. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
  11. Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514(2010).
  12. Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
  13. Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
  14. Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012(2014).
  15. Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
  16. Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
  17. Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
  18. Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021(2014).
  19. Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
  20. Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
  21. Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
  22. Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
  23. Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
  24. Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modyfikacja powierzchniadhezja kom rekna wietlanie UVwzorcowanie kolagenukom rki PC12napylanie magnetronoweoktadecyltrichlorosilanblokowanie albumin surowiczmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły