Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

DOI:

10.3791/53047

⸱

28 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Pacific University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Oregon State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amfifilowe kopolimery blokowe, takie jak kwas polimlekowy (PEG-b-PLA) mogą samoorganizować się w micele powyżej ich krytycznego stężenia micelarnego, tworząc hydrofobowe rdzenie otoczone hydrofilowymi powłokami w środowisku wodnym. Rdzeń tych miceli może być wykorzystany do ładowania hydrofobowych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków, takich jak docetaksel (DTX) i ewerolimus (EVR). Systematyczna charakterystyka struktury miceli i możliwości ładowania leku jest ważna przed przeprowadzeniem badań in vitro i in vivo. Celem opisanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zapewnienie niezbędnych etapów charakterystyki w celu uzyskania standaryzowanych produktów micelarnych. DTX i EVR mają rozpuszczalność wewnętrzną odpowiednio 1,9 i 9,6 μg/ml Przygotowanie tych miceli można osiągnąć poprzez odlewanie rozpuszczalnikiem, które zwiększa rozpuszczalność wodną DTX i EVR odpowiednio do 1,86 i 1,85 mg/ml. Stabilność leku w micelach oceniana w temperaturze pokojowej przez 48 godzin wskazuje, że 97% lub więcej leków jest zatrzymywanych w roztworze. Wielkość miceli oceniono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i wskazano, że wielkość tych miceli wynosiła poniżej 50 nm i zależała od masy cząsteczkowej polimeru. Uwalnianie leku z miceli oceniano za pomocą dializy w warunkach zlewu przy pH 7,4 w temperaturze 37 oC przez 48 godzin. Wyniki dopasowania krzywej wskazują, że uwalnianie leku jest napędzane przez proces pierwszego rzędu, co wskazuje, że jest ono napędzane dyfuzją.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amfifilowe kopolimery blokowe o powtarzalnej strukturze złożonej z hydrofilowych i hydrofobowych domen mogą spontanicznie samoorganizować się, tworząc trójwymiarowe zespoły makromolekularne znane jako micele polimerowe. Struktury te mają wewnętrzny hydrofobowy rdzeń otoczony hydrofilową powłoką. Rdzeń hydrofobowy ma zdolność włączania leków hydrofobowych albo poprzez fizyczne uwięzienie poprzez interakcje hydrofobowe, albo przez sprzężenie chemiczne ze szkieletem polimerowym. 1 Istnieje wiele zalet stosowania tych kopolimerów blokowych do tworzenia miceli do dostarczania leków. Obejmują one włączenie słabo rozpuszczalnych leków, poprawę farmakokinetyki włączonych leków, a biokompatybilność i/lub biodegradowalność polimerów sprawia, że są one bezpieczną alternatywą dla konwencjonalnych solubilizatorów. 2 Kolejną zaletą stosowania miceli polimerowych jest ich koloidalna wielkość cząstek, wynosząca od 15 do 150nm3, co czyni je atrakcyjnymi do podawania pozajelitowego. Dlatego w ciągu ostatnich 20 lat micele polimerowe stały się realnymi systemami dostarczania leków słabo rozpuszczalnych w wodzie, zwłaszcza w terapii raka. 3,4

Obecnie istnieje pięć polimerowych preparatów micelarnych do terapii nowotworów w trakcie badań klinicznych. 4 Cztery micele w badaniach klinicznych to kopolimery diblokowe na bazie PEG, podczas gdy ostatni to kopolimer triblokowy zawierający tlenek etylenu. Wielkość tych miceli wahała się od 20 nm do 85 nm. Zaletą stosowania polimerów na bazie PEG jest ich biokompatybilność i w zależności od drugiego bloku mogą być również biodegradowalne. Ostatnio opracowano nowe systemy dostarczania leków oparte na micelach polimerowych glikolu polietylenowego i kwasu polimlekowego (PEG-b-PLA) do jednoczesnego dostarczania wielu leków przeciwnowotworowych. Micele PEG-b-PLA są zarówno biokompatybilne, jak i biodegradowalne. Te wielolekowe micele wykazały synergiczne hamowanie różnych modeli nowotworów in vitro i in vivo2,5,6 i wpisują się w obecny paradygmat stosowania wielu leków w chemioterapii w celu zapobiegania oporności i obniżania toksyczności. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie przygotowaniem i scharakteryzowaniem tych systemów dostarczania leków micelarnych do stosowania w nowotworach i innych stanach chorobowych.

W poniższej pracy opisaliśmy krok po kroku proces, dzięki któremu takie micele mogą być przygotowane i scharakteryzowane przed oceną ich w interesujących stanach chorobowych. Do celów niniejszej pracy wybrano dwa słabo rozpuszczalne leki przeciwnowotworowe: docetaksel (DTX) i ewerolimus (EVR). Zarówno DTX, jak i EVR są związkami słabo rozpuszczalnymi w wodzie o wewnętrznej rozpuszczalności w wodzie odpowiednio 1,9 i 9,6 μg/ml. 7,8 W tym protokole zastosowano dwa polimery PEG-b-PLA o różnych masach cząsteczkowych jako elementy budulcowe dla sformułowanych miceli polimerowych, polimery te to PEG2000-b-PLA 1800 (3,800 Da) i PEG 4000-b-PLA 2200 (6,200 Da). Micele PEG-b-PLA mogą zatem stanowić unikalną platformę jako nanonośnik dla DTX i EVR pojedynczo lub w połączeniu. Wymagane odczynniki/materiały i sprzęt potrzebne do przygotowania i scharakteryzowania tych miceli są wymienione w Tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie indywidualnych i wielolekowych miceli metodą odlewania rozpuszczalnikowego

  1. Odważyć DTX 1 mg lub EVR 1 mg lub oba leki w dawce 1 mg każdy dla miceli dwulekowych (DDM).
  2. Odważyć 15 mg PEG2000-b-PLA 1800 lub PEG 4000-b-PLA 2200 dla osób lub DDM.
  3. Rozpuścić lek/leki i polimer w 0,5 ml acetonitrylu i umieścić w kolbie okrągłodennej o pojemności 5 ml.
  4. Utworzyć cienką warstwę polimerową rozprowadzaną przez odparowanie roztworu acetonitrylu polimeru leku (leków) pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej. Ustawić parownik obrotowy na 100 obr./min, temperaturę łaźni wodnej na 40 oC i podciśnienie 260 mbar na 5 min, a następnie redukcję do 100 mbar na kolejne 3 min.
  5. Ponownie uwodnić film polimerowy za pomocą 0,5 ml wody dejonizowanej o temperaturze 50 oC i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby utworzyć micele.
  6. Przefiltruj otrzymany roztwór micelarny przez nylonowy filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie nierozpuszczone leki lub zanieczyszczenia do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.

2. Ocena obciążenia i stabilności leku w micelach za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC)

  1. Przeprowadzić analizę RP-HPLC przy użyciu kolumny C8 o temperaturze 40 °C w trybie izokratycznym z fazą ruchomą acetonitryl/woda (62/38) zawierającą 0,1% kwasu fosforowego i 1% metanolu przy natężeniu przepływu 1 ml/min i objętości wtrysku 10 μl.
  2. Rozcieńczyć świeżo przygotowane micele (sekcja 1) w stosunku 1:100 w fazie ruchomej przed analizą za pomocą RP-HPLC w celu określenia początkowego obciążenia lekiem. Przechowywać nierozcieńczone pojedyncze micele i DDM w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 48 godzin i przygotować świeże próbki rozcieńczone w skali 1:100 w fazie ruchomej w celu ponownej oceny za pomocą RP-HPLC i określenia stabilności leku (leków) w micelach przez 24 godziny.
  3. Monitoruj szczyty DTX i EVR odpowiednio przy 227 i 279 nm z czasami retencji odpowiednio 1,7 i 5,7 min. Wykonaj wszystkie pomiary w trzech egzemplarzach. Przedstaw dane jako średnie obciążenie ± SD leków.

3. Ocena wielkości cząstek miceli za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)

  1. Rozcieńczyć świeżo przygotowane micele (zgodnie z opisem w sekcji 1) w wodzie dejonizowanej w stosunku 1:20, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru 1,5 mg/ml.
  2. Zmierz intensywność lasera He-Ne (633 nm) pod kątem 173°, aby określić rozpraszanie. Wszystkie pomiary należy wykonać w temperaturze 25 °C po osiągnięciu równowagi wstępnej przez 2 minuty.
  3. Wykonaj wszystkie pomiary w trzech egzemplarzach. Przedstaw dane jako średnią wielkość Z ± SD wraz ze wskaźnikiem polidyspersyjności (PDI) rozkładu.

4. Ocena uwalniania leków in vitro z poszczególnych miceli i DDM

  1. Przygotuj poszczególne micele i DDM zgodnie z opisem w punkcie 1. Załadować 2,5 ml miceli do kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml z punktem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 7 000 g/mol.
    UWAGA: To MWCO zostało wybrane, aby umożliwić swobodną dyfuzję wolnych leków wraz z niepowiązanymi cząsteczkami polimeru z kasety, a tym samym zapewnić warunki zlewu.
  2. Umieść kasety w 2,5 l 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,4 (przygotowanym przez rozcieńczenie roztworu podstawowego 200 mM) i zmieniaj bufor co 3 godziny, aby zapewnić warunki zlewu. Utrzymywać temperaturę buforu na poziomie 37 °C przez cały czas trwania doświadczenia.
  3. Po 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 i 48 godzinach pobrać 150 μl roztworu z kaset i zastąpić 150 μl świeżego buforu.
  4. Analizować próbki za pomocą RP-HPLC, jak ustalono w sekcji 2, w celu określenia stężenia leku. Dopasuj krzywą dane o uwalnianiu leku (leków) w oparciu o prosty model dyfuzji z jednofazowym asocjacją wykładniczą za pomocą oprogramowania statycznego.
  5. Oblicz czas potrzebny do osiągnięcia 50% uwalniania leku (t1/2) każdego leku w poszczególnych micelach lub DDM na podstawie dopasowania krzywej. Wszystkie pomiary wykonuj w kwadransu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indywidualne micele DTX lub EVR oraz DTX i EVR DDM w micelach PEG-b-PLA są z powodzeniem formułowane w PEG4000-b-PLA 2200 lub PEG 2000-b-PLA 1800 (Rysunek 1).

DTX, EVR i DDM wykazały podobną stabilność w PEG4000-b-PLA 2200 lub PEG 2000-b-PLA 1800 przez 48 godzin (Rysunek 2). Początkowe obciążenie lekiem EVR w PEG4000-b-PLA

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie miceli polimerowych do dostarczania leków stale się rozwija ze względu na ich wszechstronność i zdolność do dostarczania leków hydrofobowych w różnych stanach chorobowych. Dlatego techniki potrzebne do przygotowania i scharakteryzowania tych preparatów przed zastosowaniem w hodowlach komórkowych lub u zwierząt są krytycznym pierwszym krokiem do określenia najlepszego parowania między lekiem a polimerem. PEG-b-PLA są doskonałymi amfifilowymi kopolimerami blokowymi do celów dostarczania leków. Jedn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant z AACP New Pharmacy Faculty Research Award Program, Medical Research Foundation of Oregon New Investigator Grant, Oregon State University-Startup fund, oraz Pacific University, School of Pharmacy Start-up fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PEG2000-b-PLA1800Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA/2000PLA MW można określić przy zamówieniu
PEG4000-b-PLA2200Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA/4000PLA MW można określić przy zamówieniu
DocetaxelLC LaboratoriesD-1000100 mg
EverolimusLC LaboratoriesE-4040100 mg
AcetonitrylEMD/VWREM-AX0145-1Klasa HPLC; 4 L
Kolba okrągłodenna Glassco/VWR89426-4965 ml
RV 10 Sterujące parowniki obrotoweIKA Works8025001Parownik rotacyjny
Shimadzhu HPLC z detektorem DADShimadzhuRP-HPLC
Slide-a-lyzer MWCO 7000Thermo Scientific, Inc663703 ml
Bufor fosforanowy pH 7,4, 200 mMVWR100190-870500 ml
Malvern NanoZSMalvern Instruments, Wielka BrytaniaDLS
Filtr nylonowyAcrodisc/VWR28143-24213 mm; 0,2&mikro; M
Kwas fosforowy, NFSpectrum Chemical/VWR700000-626100 ml
GraphPad Prismwww.graphpad.comOprogramowanie analityczne
Zorbax SB-C8 Rapid Resolution Agilent Technologies866953-9064,6 i razy; 75 mm, 3.5 μ mln
Kaseta dializacyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
  2. Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
  3. Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
  4. Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
  5. Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
  6. Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
  7. Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
  8. Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
  9. Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
  10. Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).
  11. Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drug LoadingSolvent CastingDynamic Light ScatteringReverse Phase HPLCDialysis ReleaseDrug StabilityMicelle SizeFirst Order ReleasePEG b PLA

Powiązane artykuły