Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Summary

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Abstract

Główną zaletą urządzeń mikroprzepływowych jest możliwość manipulowania małymi objętościami próbek, co zmniejsza ilość odpadów odczynników i pozwala zachować cenną próbkę. Jednak, aby uzyskać solidną manipulację próbką, konieczne jest zajęcie się integracją urządzenia ze środowiskiem makroskalowym. Aby zapewnić powtarzalną, czułą separację cząstek za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, protokół ten przedstawia kompletną, zautomatyzowaną i zintegrowaną platformę mikroprzepływową, która umożliwia precyzyjne przetwarzanie próbek o wielkości 0,15–1,5 ml za pomocą urządzeń mikroprzepływowych. Ważnymi aspektami tego systemu są modułowy układ urządzeń i solidny osprzęt, co skutkuje niezawodnymi i elastycznymi połączeniami między światem a chipami, a także w pełni zautomatyzowana obsługa płynów, która umożliwia pobieranie próbek w pętli zamkniętej, czyszczenie systemu i etapy zalewania w celu zapewnienia powtarzalnej pracy. Różne urządzenia mikroprzepływowe mogą być używane zamiennie z tą architekturą. W tym miejscu włączamy urządzenie akustofluidyczne, szczegółowo opisujemy jego charakterystykę, optymalizację wydajności i demonstrujemy jego zastosowanie do separacji wielkości próbek biologicznych. Dzięki wykorzystaniu informacji zwrotnych w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów separacji, pobieranie próbek jest zoptymalizowane w celu zachowania i zagęszczenia próbki. Chociaż wymaga to integracji wielu urządzeń, zalety tej architektury obejmują możliwość przetwarzania nieznanych próbek bez dodatkowej optymalizacji systemu, łatwość wymiany urządzeń oraz precyzyjne, niezawodne przetwarzanie próbek.

Introduction

Separacja i frakcjonowanie próbek to jeden z najbardziej obiecujących obszarów zastosowań technologii mikroprzepływowych. Takie etapy postępowania z próbkami są integralną częścią skutecznej diagnostyki klinicznej, opracowywania środków terapeutycznych, wysiłków w zakresie nadzoru biologicznego oraz postępu w badaniach i technologii w dziedzinie nauk przyrodniczych. Zademonstrowano niezliczone strategie separacji mikroprzepływowej dla cząstek zawieszonych w płynach i koloidów, a także dla związków chemicznych i biologicznych; Kilka przeglądów zawiera przegląd ostatnich postępów i osiągnięć w tych dziedzinach^1–9. Chociaż wiele z tych technologii separacji mikroprzepływowej (zwanych dalej "urządzeniami podstawowymi") zostało szczegółowo scharakteryzowanych, niewiele raportów uwzględniało problem separacji próbek na poziomie systemu. Podstawowe urządzenia to zazwyczaj pojedyncze chipy w skali centymetrowej, połączone z rurkami fluoropolimerowymi, z płynem dostarczanym przez pompę wyporową lub ciśnieniową. Jeśli jednak obietnica mikrofluidyki – w tym zwiększona automatyzacja, niezawodność i zmniejszenie objętości próbek – ma stać się rzeczywistością, należy włożyć co najmniej równy wysiłek w zaprojektowanie kompletnego systemu separacji, z którym zintegrowane jest urządzenie podstawowe.

Ponadto, głównym wyzwaniem dla mikroprzepływowych podejść do biodetekcji jest interfejs makro do mikro. Odnosi się to nie tylko do fizycznych połączeń "świat do chipa" urządzenia mikroprzepływowego z komponentami w makroskali oraz do niedopasowania między typowymi objętościami próbek klinicznych lub analitycznych (~0,1–10 ml) a wewnętrzną objętością chipów mikroprzepływowych (~0,01–10 μl), ale także do ograniczeń statystycznych wynikających z mostkowania tych skal wielkości. Kwestie te przyczyniają się do postrzegania, że wstępne przetwarzanie i przygotowanie próbek jest "słabym ogniwem" biodetekcji. ¹⁰ Platforma opisana w niniejszej pracy stanowi ważny krok w kierunku sprostania tym wyzwaniom.

Biorąc pod uwagę widok na poziomie systemu, ten protokół szczegółowo opisuje niezawodne przetwarzanie precyzyjnie mierzonych objętości w skali analitycznej (od 0,15 do 1,5 ml) w ~10-minutowych skalach czasowych. Jest to operacja "jednym przyciskiem": po umieszczeniu w systemie fiolki źródłowej zawierającej fiolkę z próbką i fiolki docelowe do pobierania frakcji, polecenie "uruchom" inicjuje procedurę, a wszystkie kroki są kontrolowane przez komputer. Pod koniec serii fiolki do pobierania mogą zostać wyjęte z systemu w celu dalszej analizy oddzielonych frakcji.

Podstawowym urządzeniem w tym systemie jest chip do akustoforezy, który ekstrahuje z próbki cząstki wielkości komórki ssaków (5-20 μm). Separacja akustoforetyczna jest tutaj wybierana przede wszystkim ze względu na wysoką przepustowość (do 100 μl/min), bezznacznikową i bezkontaktową, co daje korzyści w oddzielaniu żywych wirusów od komórek, z którymi może się równać niewiele innych technik mikroprzepływowych. Fizyka akustycznego ogniskowania cząstek została obszernie opisana11-13 i nie jest przedmiotem niniejszego protokołu, ale poniżej znajduje się krótkie podsumowanie podstawowych koncepcji, które pomogą w zrozumieniu zastosowania separacji mikroprzepływowej.

Ultradźwiękowe fale stojące rezonujące w wypełnionych płynem mikrokanałach wytwarzają pola ciśnienia, które powodują powstawanie sił kierujących cząstki w kierunku węzłów niskiego ciśnienia. Wielkość siły zależy od objętości cząstki oraz od współczynnika kontrastu akustycznego wyprowadzonego ze względnych gęstości i ściśliwości cząstki i zawieszonego płynu. ¹⁴ W związku z tym ogniskowanie akustyczne idealnie nadaje się do oddzielania cząsteczek wielkości komórki (~7–15 μm) od cząstek o rozmiarach wirusa (~50–200 nm). Większe cząstki migrują w kierunku węzła ciśnienia; Ponieważ jednak wielkość siły jest bardzo mała dla cząstek mniejszych niż 2–3 μm, te małe cząstki lub rozpuszczone cząstki prawie w ogóle się nie poruszają. Nasza specyficzna implementacja separacji akustycznej, jak opisano ^{wcześniej,15} zawiera cienką ściankę do podziału kanału płynu i umożliwia dostrojenie, asymetryczne rozmieszczenie pozycji ostrości. Zwiększa to elastyczność w projektowaniu urządzeń, a korzyści w zakresie wydajności — w tym zwiększona jakość i szybkość separacji — są w pełni opisane w innym miejscu. ^{Pytania z dnia 16,17}

na dzień

Jednak główną zaletą opisanego w tej pracy podejścia do projektowania na poziomie systemu jest to, że można je dostosować do wielu różnych mikroprzepływowych urządzeń rdzeniowych. Na przykład większość innych trybów separacji o ciągłym przepływie, w tym inercyjny, frakcjonowanie w polu przepływu, deterministyczne przemieszczenie boczne (DLD) i różne typy urządzeń elektrokinetycznych, można łatwo włączyć, dokonując odpowiednich korekt w celu uwzględnienia zmian w konfiguracji wlotu/wylotu, natężeniu przepływu i objętości próbki. Urządzenia z różnymi rodzajami pól na chipie (elektryczne, magnetyczne) lub gradientami (termiczne, chemiczne) mogą wymagać dodatkowych połączeń z chipem lub integracji dodatkowego sprzętu, który ta platforma obsługuje.

Ten protokół zapewnia kroki wymagane do zaprojektowania urządzenia do separacji mikroprzepływowej oraz do wytwarzania chipów krzemowo-szklanych metodą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego (DRIE, proces plazmowo-trawiony dostępny w wielu zakładach mikrofabrykacji, który wykorzystuje naprzemienne cykle trawienia i pasywacji w celu uzyskania głębokich cech z pionowymi ścianami bocznymi¹⁸). Następnie opisujemy charakterystykę urządzenia akustofluidycznego w celu określenia optymalnych parametrów pracy separacji, a na koniec szczegółowo opisujemy w pełni zintegrowany system separacji i procedurę przetwarzania próbek biologicznych. Następnie prezentowane i omawiane są typowe wyniki charakterystyki urządzeń i dane przetwarzania próbek, a także podkreślane są kluczowe zalety tego podejścia, w tym modułowość, solidność, precyzja i automatyzacja.

Protocol

1. Projekt urządzenia akustycznego i układ maski fotograficznej

UWAGA: Ogólne uwagi i wskazówki dotyczące projektowania procesu mikrofabrykacji i układu maski można znaleźć w tekstach na temat mikrofabrykacji i samouczkach projektowania fotomasek. ^19–21

1. Ułóż Maskę 1, warstwę płynów (strona przednia), za pomocą odpowiedniego oprogramowania CAD. Wybierz geometrię, która umożliwia wstrzykiwanie i rozdzielanie próbek, odpowiednią dla żądanego zastosowania.
   1. W przypadku ogniskowania akustycznego należy ustawić szerokość kanału fluidycznego w tak, aby zapewnić częstotliwość rezonansową f_n większą niż 1 MHz zgodnie z równaniem f_n = nc/2w, gdzie c jest prędkością dźwięku w odpowiednim płynie, a n jest liczbą węzłów fali stojącej (np. dla kanału o szerokości 900 μm rezonans dwuwęzłowy jest oczekiwany przy f₂ = 1,65 MHz).
      UWAGA: Cząstki zajmujące wyraźne pozycje boczne w pobliżu końca kanału rozdzielającego powinny wydostawać się z różnych wylotów. W tym protokole cząstki są oddzielone według wielkości, więc wyloty są oznaczone jako SPO i LPO, odpowiednio dla wylotu małych i dużych cząstek, jak pokazano na rysunku 1.
   2. Ustaw długość kanału płynu, aby kontrolować czas, przez jaki cząstki są wystawione na działanie pola separacji przy określonym natężeniu przepływu. Dłuższy czas przebywania cząstek w układzie scalonym w celu migracji z powodu sił separacji musi być równoważony z większą wymaganą powierzchnią chipa.
      UWAGA: W naszych akustycznych urządzeniach do ustawiania ostrości kanał przepływowy wykonuje trzy przejścia w dół chipa, aby wydłużyć czas przebywania (ilustracja 2a). Przy typowym całkowitym natężeniu przepływu wynoszącym 200 μl/min cząstki przepływające przez kanał separacyjny o przekroju 300 x 200 μm i długości 117 mm spędzają w polu akustycznym średnio 2,1 sekundy.
2. W układzie maski należy uwzględnić porty płynów do połączeń ze standardowymi rurkami ułożonymi na znormalizowanej siatce (raster 5 mm). Dołącz odpowiednie znaki odniesienia do wyrównania masek względem siebie podczas wytwarzania i krojenia poszczególnych urządzeń w kostkę.
3. Ułóż Maskę 2, warstwę przelotową (tylna strona), która zawiera tylko porty fluidyczne. Dołącz znaczniki odniesienia w celu wyrównania do maski 1.

Rysunek 1. Urządzenie akustyczne. Schematyczne szkice architektury urządzenia akustycznego. (a) Widok z góry, pokazujący ogólną konfigurację filtra H (bez skali). (b) Schemat przekroju poprzecznego kanału w miejscu oznaczonym czarną przerywaną linią w (a), pokazujący pole ciśnienia (niebieskie przerywane linie), oraz wyczucie akustycznych sił promieniowania pierwotnego (PRF) które kierują cząstki w kierunku płaszczyzn węzłowych (czerwone strzałki). Przekrój kanału wynosi 900×200 μm ze ścianką o grubości około 10 μm oddzielającą kanał główny (o szerokości 300 μm) i bocznikowy. (c) Reprezentacja 3D separacji cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Produkcja mikroprzepływowych chipów do akustoforezy w pomieszczeniach czystych

1. Ułóż wzór tylnych portów płynu za pomocą Mask 2 na dwustronnie polerowanej płytce krzemowej o grubości 0,5 mm i średnicy 100 mm <100> za pomocą standardowej fotolitografii o dodatniej rezystancji. Wytraw tę geometrię za pomocą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego (DRIE) na głębokość 350–400 μm.
2. Odwróć płytkę na drugą stronę i ułóż geometrię kanału płynu po przedniej stronie za pomocą maski 1 za pomocą standardowej fotolitografii o dodatnim rezystancie po drugiej stronie krzemu. Następnie zamontuj płytkę urządzenia na drugiej (czystej krzemowej) płytce nośnej za pomocą fotorezystu.
3. Wytrawić kanały, również za pomocą DRIE, na głębokość 200 μm, poprzez wytrawienie krzemu w miejscach portów (płytka nośna chroni powierzchnię narzędzia DRIE). Zdemontuj płytkę urządzenia z pustej płytki Si, mocząc ją w roztworze do usuwania oporu.
4. Wyczyść płytkę urządzenia i pozbawioną cech charakterystyczną płytkę ze szkła borokrzemianowego o grubości 0,5 mm za pomocą roztworu Piranha (kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1).
5. Uszczelnij kanały płynu poprzez anodowe łączenie płytek szklanych i krzemowych przy użyciu następujących parametrów: ciśnienie w komorze przy 3 mTorr, ciśnienie tłoka przy 1 000 N, temperatura przy 350 °C i przyłóż 750 V, aż prąd spadnie poniżej 0,2 mA.
6. Odetnij poszczególne wióry za pomocą diamentowego ostrza na piłce do krojenia w kostkę.

3. Końcowy montaż urządzenia

1. Nasadka przetwornika piezoelektrycznego
   UWAGA: Ultradźwięki są generowane w chipie mikroprzepływowym przez przetwornik piezoceramiczny przymocowany po stronie krzemu.
   1. Z dwuskładnikowego zestawu epoksydowego o niskiej lepkości odważ zalecane proporcje obu składników i dokładnie je wymieszaj.
   2. Dozuj mieszaninę epoksydową za pomocą pipety i równomiernie rozprowadź na piezoceramice z tytanianu ołowiowo-cyrkonianu (PZT), aby utworzyć cienką, równą warstwę (około 10 μl mieszanki epoksydowej na piezo o wymiarach 37,5 × 10 × 0,5 mm).
   3. Za pomocą odpowiedniego przyrządu lub uchwytu wyrównaj stronę epoksydową piezoceramiki z chipem mikroprzepływowym, zapewniając wystający obszar z jednej strony do późniejszego mocowania drutu (patrz rysunek 2a) i doprowadź oba elementy do zetknięcia. Zacisnąć zespół w imadle, uważając, aby nie pęknąć żadnego z elementów, i utwardzić w temperaturze i czasie zalecanym przez producenta żywicy epoksydowej.
   4. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej przymocuj cienkie przewody druciane z każdej strony piezoceramiki, lutownicą z cienką końcówką, zachodząc jak najkrótsza kontakt z piezoelektrycznym, aby uniknąć jego termicznej depolaryzacji. Alternatywnie użyj kleju przewodzącego do przyklejenia przewodów do piezo.

Rysunek 2. Płytka stykowa Fluidic, montaż chipów i interfejs World-to-Chip. Zdjęcia (a) akustycznego układu mikroprzepływowego (wymiary zewnętrzne 70×9×1 mm) z dołączonymi przewodami przetwornika piezoelektrycznego, pokazujące trzy przejścia kanału separacyjnego w dół chipa, (b) niestandardowych złączek śrubowych do płynów i obrabianych maszynowo elementów rurek dla interfejsu chip-to-world, (c) Układ scalony zamontowany na spodzie płytki stykowej Fluidic za pomocą uchwytów zaciskowych, obejmujący otwór w płytce stykowej umożliwiający chłodzenie wentylatora, (d) widok z góry płytki stykowej z dołączonymi połączeniami rurek i wentylatorem chłodzącym oraz (e) przekrój poprzeczny złączek śrubowych, które łączą rurkę z zamontowanym chipem mikroprzepływowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Montaż urządzeń i interfejs World-to-Chip
   1. Przymocuj chip do "płytki stykowej fluidic" (płytki z siatką regularnie rozmieszczonych gwintowanych otworów przelotowych) za pomocą clamfixtures. Podłącz wentylator chłodzący do płytki stykowej, aby regulować temperaturę podczas eksperymentów akustycznych (patrz rysunek 2).
      UWAGA: Praca bez wentylatora chłodzącego przy typowych napięciach napędu podnosi temperaturę urządzenia do 70–80 °C. To znacznie zmienia częstotliwość rezonansową ze względu na zmienioną prędkość dźwięku w płynie i może negatywnie wpłynąć na żywotność wszelkich przetwarzanych cząstek biologicznych.
   2. Przykręć złącza typu chip-to-world, wcześniej opisane w innym miejscu²² i pokazane na rysunku 2. Połącz te rurki interfejsowe z dodatkowymi rurkami na wlotach i wylotach za pomocą standardowych złączek 1/4"-28 dla przewodów 1/16".

4. Charakterystyka akustyki ogniskowania

UWAGA: Komponenty systemu wymagane do charakterystyki ostrości akustycznej są zgrupowane razem na liście materiałów. Kroki 4.1 i 4.2 poniżej mają zastosowanie do każdego urządzenia podstawowego używanego z tą platformą, podczas gdy kolejne kroki opisują operacje specyficzne dla omawianego tutaj urządzenia akustycznego.

1. Konfiguracja systemu
   1. Zmontuj chip mikroprzepływowy za pomocą połączeń świat-chip na płytce stykowej fluidycznej, jak opisano w rozdziale 3. Wykonaj połączenia za pomocą rurki (takiej jak rurka fluoropolimerowa o średnicy zewnętrznej 1/16") z pompą płynu i fiolkami do zbierania. Zamontuj zespół płytki stykowej na stoliku mikroskopu zdolnego do obrazowania fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD.
   2. Podłącz odcinki rurek o małej średnicy wewnętrznej (ID) (zalecane jest 0,006") bezpośrednio za chipem (patrz rysunek 4), aby służyły jako ograniczniki przepływu, które stabilizują system i kontrolują podział przepływu między wylotami chipów. Używaj większych rurek średnicowych, takich jak 0,01" lub 0,03", do wszystkich innych połączeń.
      1. Oszacuj hydrodynamiczny opór przepływu R_h każdego elementu rurki o długości L i średnicy wewnętrznej D, używając równania R_h = 128 μL/πD⁴, gdzie μ jest lepkością dynamiczną płynu. Spadek ciśnienia ΔP spowodowany każdą długością przewodu przy danym natężeniu przepływu Q jest określony wzorem ΔP = QR_h.
      2. Wybierz stosunek długości ograniczników, aby podzielić przepływ między wylotami zgodnie z zastosowaną metodą separacji. Optymalna separacja z chipami akustycznymi w tym protokole wymaga współczynnika przepływu SPO:LPO wynoszącego około 65:35%.
      3. Długość ograniczników przepływu wylotowego należy dobrać tak, aby ich opór przepływu był co najmniej 3–4 razy większy niż całkowity opór w pozostałej części układu (odpowiednio zsumowany szeregowo lub równolegle). Do urządzenia do akustoforezy stosowanego w tej pracy odpowiednie są przewody o długości 35 i 65 cm dla LPO i SPO.
         UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na wilgotność względną każdego mikroprzepływowego urządzenia rdzeniowego. W przypadku naszego układu ogniskowania akustycznego w tej pracy, wilgotność względna jest niska ze względu na stosunkowo duże wymiary kanału, więc rezystancje podłączonych rurek z łatwością je przekraczają. W przypadku urządzeń o mniejszych wymiarach kanału, rezystancja chipa może dominować nad resztą rurek systemu, w którym to przypadku projekt i sterowanie kanałem R_h na chipie jest dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę podczas kroku 1 tego protokołu. Szczegółowe zasady projektowania i wytyczne są dostępne w literaturze. ^{Pytania z dnia 23,24}
      na drugi guzik
2. Weryfikacja systemu
   1. Sprawdź, czy nie ma wycieków, aby upewnić się, że urządzenie mikroprzepływowe nie ma wad, a wszystkie połączenia rurek są uszczelnione. W razie potrzeby dozuj wodę przez rurki wlotowe za pomocą strzykawki i monitoruj, czy nie ma wycieków płynu w głównym kanale.
   2. Dozuj znaną objętość przez chip i zmierz objętości zebrane z wylotów, aby upewnić się, że stosunek przepływu jest zgodny z oczekiwaniami. Odchylenia od oczekiwanego stosunku objętości mogą wskazywać na zatkanie jednego z gniazd lub nieszczelne połączenia.
      1. Aby utrzymać system w czystości i zapobiec zatykaniu, przepłucz cały system (rurki fluidyczne i chip) odpowiednimi roztworami czyszczącymi (np. wybielaczem, etanolem, wodą) przed i po przeprowadzeniu jakichkolwiek eksperymentów.
      2. W przypadku zatkania lub zatkania jednego z gniazdek, przepłucz system, jednocześnie podłączając przezroczysty wylot, aby usunąć blokadę. Jeśli to się nie powiedzie, odwróć kierunek przepływu podczas płukania, opcjonalnie stosując szybkie impulsy przepływu wstecznego (za pomocą strzykawki uruchamianej ręcznie). Na koniec, jeśli nadal nie można usunąć blokady, w razie potrzeby wymień rurkę lub chip.
3. Konfiguracja skanowania częstotliwości dla ogniskowania akustycznego
   1. Napełnij kanał obejściowy (patrz rysunek 1) płynem, takim jak woda dejonizowana, etanol lub sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) przez ręczne wstrzyknięcie za pomocą strzykawki. Należy pamiętać, że płyn ten nie wchodzi w kontakt z przetwarzaną próbką. Szczegóły regulacji położenia węzła przy użyciu różnych płynów obejściowych opisano w innym miejscu^16,17. Krótko mówiąc, jeśli węzeł musi znajdować się bliżej ściany działowej, użyj płynu obejściowego o mniejszej gęstości, takiego jak etanol; W przypadku umieszczenia węzła bliżej strumienia próbki wejściowej należy wybrać gęstszy płyn, taki jak roztwór glicerolu.
   2. Przygotować roztwór kulek składający się z około 0,01% (w/v) 5–8 μm fluorescencyjnych kulek polimerowych zawieszonych w buforze, takim jak PBS, z 0,05% Tween-20 i napełnić strzykawkę wlotową próbki roztworem kulek. Napełnić strzykawkę wlotową buforu tym samym buforem (nie musi to być ten sam płyn, co w kanale obejściowym). Należy pamiętać, że ogólnie rzecz biorąc, bufor jest wybierany tak, aby pasował do aplikacji (patrz krok 5.1).
   3. Z płytką stykową fluidyczną na stoliku mikroskopu, ustaw ostrość mniej więcej do połowy głębokości kanału w prostym obszarze kanału tuż przed wylotem z obydwoma kanałami (separacja i obejście) w polu view. Dodatkowe zewnętrzne źródło światła pod kątem ukośnym może być wymagane, aby ściany kanału były widoczne, w celu pomyślnego przetwarzania końcowego danych obrazu.
4. Automatyczne skanowanie częstotliwości i przechwytywanie obrazu
   1. Za pomocą ekranowanych (np. RG-58 wyposażonego w złącza BNC) należy wykonać połączenia elektryczne z generatorem funkcyjnym ze wzmacniaczem częstotliwości radiowej (RF) w celu dostarczenia sygnału wzbudzenia do przetwornika piezoelektrycznego. Opcjonalnie można podłączyć oscyloskop do wyjścia generatora funkcyjnego w celu monitorowania rzeczywistego napięcia przyłożonego do przetwornika.
   2. Włącz wentylator chłodzący i ustaw generator funkcyjny tak, aby wyjście wzmacniacza RF do przetwornika piezoelektrycznego mieściło się w zakresie 12–25 woltów międzyszczytowych (V_pp).
   3. Ustawić obie strzykawki na to samo natężenie przepływu w zakresie od 50 do 200 μl/min. Zaleca się użycie jednej pompy strzykawkowej do napędzania obu strzykawek tym samym silnikiem, aby zminimalizować zakłócenia przepływu.
   4. Wykonaj procedurę skanowania częstotliwości, określając częstotliwość początkową i końcową, wielkość kroku między wartościami częstotliwości oraz napięcie napędu piezoelektrycznego za pomocą zestawu narzędzi do automatyzacji laboratorium, takiego jak National Instruments LabVIEW.
   5. Przy każdym kroku częstotliwości należy przyłożyć napięcie na 15 sekund, aby umożliwić układowi zrównoważenie, a następnie uchwyć 10 obrazów kulek przepływających przez chip w celu późniejszej analizy (zalecane czasy ekspozycji od 10 do 100 ms).
   6. Pomiędzy każdym zastosowanym krokiem częstotliwości wyłącz napięcie na około 20 sekund, aby koraliki mogły równomiernie rozprowadzić się w kanale i usunąć odchylenie w ustawianiu ostrości z poprzednio zastosowanego kroku częstotliwości.
5. Analiza obrazu w celu określenia częstotliwości rezonansowej i pozycji ostrości
   1. Uruchom skrypt do analizy obrazu (taki jak skrypt AF_freqScanPlotter.m MATLAB dostarczony z tym protokołem) i wprowadź wymagane informacje w monicie: wybierz listę plików graficznych wygenerowanych w kroku 4.4, wprowadź częstotliwości rozpoczęcia i zakończenia skanowania oraz rozmiar kroku, pełną szerokość kanału, lokalizację ściany, a na koniec wybierz obszar obrazu do analizy, w tym zarówno kanały separacyjne, jak i obejściowe.
   2. Obserwuj, jak skrypt analizy uśrednia zestaw obrazów zarejestrowanych w każdym kroku częstotliwości i uśrednia wartości intensywności wzdłuż kierunku przepływu. W ten sposób uzyskuje się skan linii przekroju poprzecznego o intensywności fluorescencji.
      UWAGA: Częstotliwość odpowiadająca najwyższemu natężeniu jest zdefiniowana jako częstotliwość rezonansowa (rysunek 3, środkowy rząd), a pozycja w kanale, w której występuje najwyższe natężenie, to pozycja ostrości (rysunek 3, dolny rząd).

Rysunek 3. Reprezentatywne skanowanie częstotliwości. Przykład danych skanowania częstotliwości dla dobrze sprzężonych (A) i słabo sprzężonych (B) piezoelektrycznych i chipowych. Górny rząd: natężenie fluorescencji koralików (czerwony oznacza wysoki, a niebieski oznacza niską intensywność). Środkowy rząd: maksymalna intensywność przy każdej częstotliwości. Dolny rząd: miejsce o maksymalnym natężeniu, gdzie czerwona przerywana linia wskazuje przewidywaną pozycję ostrości, a czerwone romby wskazują częstotliwość rezonansową określoną przez maksymalne natężenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Automatyczna separacja

UWAGA: Eksperyment z automatyczną separacją jest przeprowadzany w celu oddzielenia dużych cząstek od małych cząstek dzięki zależnym od wielkości akustycznym siłom skupiającym zastosowanym w mikroprzepływowym chipie. Wymagane komponenty systemu są zgrupowane razem na liście materiałów.

1. Konfiguracja systemu i przygotowanie próbki
   1. Podłącz chip mikroprzepływowy do pompy strzykawkowej, sterowanych komputerowo wieloportowych zaworów selekcyjnych, przepływomierzy z interfejsem PC i przewodów, jak pokazano na rysunku 4. Taka konfiguracja umożliwia automatyczne przetwarzanie próbek za pomocą mikroprzepływowego układu separacji, a także automatyczne etapy czyszczenia między eksperymentami w celu usunięcia zanieczyszczenia krzyżowego i przeniesienia próbki.
   2. Należy użyć buforu do próbek odpowiedniego dla komórek lub cząstek, które mają zostać rozdzielone, lub zgodnie z wymaganiami testu analitycznego, który ma być użyty po rozdzieleniu. Podobnie jak w kroku 4.3.2, bufor odzysku (ale niekoniecznie płyn obejściowy) musi być zgodny z płynem próbki.
      UWAGA: Wszelkie wodne zwykle stosowane w próbkach biologicznych (np. PBS) mają właściwości akustyczne podobne do wody i nie zmienią znacząco działania urządzenia akustycznego. Możliwe jest stosowanie płynów próbnych o gęstości i lepkości znacznie różniącej się od wody, ale zalecane tylko dla operatorów z dużym doświadczeniem w akustoforezie.

 

Rysunek 4. Konfiguracja systemu akustycznego do eksperymentów z automatyczną separacją. Niebieskie linie wyznaczają główną ścieżkę przepływu w systemie. Wszystkie zielone i czarne linie to rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 0,03 cala, a wszystkie niebieskie i szare linie to rurki o średnicy wewnętrznej 0,01 cala, z wyjątkiem cewek podtrzymujących, które mają średnicę 0,03 cala i ograniczników przepływu, które mają średnicę 0,006 cala. Strzykawki są wypełnione buforem, a cewki przytrzymujące mają wystarczającą objętość (550 μl), aby zapobiec przedostawaniu się jakichkolwiek próbek lub odczynników czyszczących do strzykawek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Procedura separacji
   1. Stan przed uruchomieniem. Przed przeprowadzeniem separacji należy upewnić się, że zbiorniki odczynników czyszczących (wybielacz, etanol, bufor) mają wystarczającą ilość płynu, zbiorniki na odpady nie są pełne, a przewody płynu są zalane (tj. wypełnione roztworem). Jeśli ten ostatni warunek jest niepewny lub jeśli system jest uruchamiany po raz pierwszy po pracy na biegu jałowym (np. po raz pierwszy w danym dniu), uruchom procedurę automatycznego czyszczenia (patrz krok 5.3 poniżej). Ustaw zawory 3 i 4 na wylotach wiórów tak, aby początkowo przepływały do zbiorników na odpady.
   2. Włącz wentylator chłodzący i ustaw generator funkcyjny na częstotliwość rezonansową dla używanego chipa akustycznego, jak określono w kroku 4.5. Dostosuj nastawę napięcia w generatorze funkcyjnym tak, aby wzmacniacz RF wychodził z zakresu od 12 do 25 V_pp, odpowiednio do żądanej separacji.
   3. Podłączyć do systemu fiolkę z próbką wejściową, fiolkę z buforem wejściowym i odpowiednie fiolki do pobierania. Tuż przed podłączeniem fiolki z próbką wejściową do rurki odbiorczej, należy krótko obrócić fiolkę w wir, aby ponownie zawiesić wszelkie cząstki, które mogły się osiąść. Następnie należy podłączyć fiolkę i niezwłocznie rozpocząć procedurę separacji.
      UWAGA: Jeśli próbka przeznaczona do przetworzenia zawiera potencjalnie zakaźne czynniki, fiolki powinny być typu zakręcanego, aby utrzymać szczelny system i zapobiec aerozolowaniu próbki. Ponadto podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi biologicznie należy obchodzić się ze wszystkimi fiolkami i rurkami, nosząc niezbędny sprzęt ochronny i stosując wymagane środki kontroli zagrożeń i procedury dla grupy ryzyka biologicznego i poziomu bezpieczeństwa biologicznego odpowiedniego dla materiału. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości należy zapoznać się z zasadami i protokołami instytucjonalnymi.
   4. Użyj programu z zestawu narzędzi do automatyzacji laboratorium, aby sterować zaworami, czujnikami przepływu i pompą, aby przeprowadzić w pełni automatyczną procedurę separacji.
      UWAGA: Rutyna przełącza zawory, uruchamia wyjmowanie i infuzję pompy strzykawkowej oraz monitoruje dane z czujnika przepływu w celu prawidłowego zsynchronizowania pobierania wyjściowych frakcji próbki. Główne kroki są podsumowane poniżej w 5.2.4.1 do 5.2.4.3, tak jakby były wykonywane ręcznie.
      1. Zalać rurkę odbiorczą. Pobrać około 15 μl z fiolki wprowadzającej próbkę, aby całkowicie napełnić probówkę łączącą ją z zaworem 1. Jednocześnie zalać rurkę łączącą fiolkę wprowadzającą bufor z zaworem 2. W podobny sposób zalać wlot powietrza zaworu 1, aby upewnić się, że nie zawiera płynu. Na koniec przełącz zawory 1 i 2, aby usunąć nadmiar płynu lub powietrza, które dostało się do cewki ładującej, aby zmarnować go.
      2. Załaduj cewkę próbki, jak pokazano na rysunku 5a. Typowa sekwencja ładowania próbki o objętości 250 μl polega na pobraniu 25 μl powietrza przy 50 μl/min, następnie 250 μl próbki przy 200 μl/min, następnie 35 μl buforu wiodącego przy 200 μl/min, a na końcu kolejne 25 μl powietrza przy 50 μl/min.
         UWAGA: Wszystkie objętości i natężenia przepływu są wybierane przez użytkownika. Należy pamiętać, że ta sekwencja ładowania jest odwrotna do kolejności, w jakiej korki płynu będą przepływać przez urządzenie separujące.
      3. Rozpocznij infuzję próbki. Ustawić pompy strzykawkowe tak, aby wlewały załadowane korki płynu z żądaną szybkością (zwykle 100 μl/min). Monitorować natężenia przepływu w SPO i LPO za pomocą czujników przepływu, aby upewnić się, że przepływ jest stały i w stosunku określonym w kroku 4.1 oraz że nie doszło do zatkania.
      4. Zbierz oddzielone frakcje. Gdy czujniki przepływu wykryją skok natężenia przepływu, wskazujący przejście pierwszej szczeliny powietrznej, przełącz odpowiedni zawór wyjściowy z odpływu (w miejscu, w którym rozpoczął się w kroku 5.2.1) na fiolkę do pobierania próbek.
      5. Po przejściu próbki z chipa obserwuj, jak czujnik przepływu wykrywa drugą szczelinę powietrzną. W tym momencie przełącz zawory wyjściowe z powrotem na odpływ. Po dozowaniu pełnej objętości załadowanej z kroku 5.2.4.2 należy zatrzymać infuzję pompy strzykawkowej i zakończyć procedurę automatyzacji, gdy natężenie przepływu osiągnie zero.
   5. Po zakończeniu eksperymentu rozdzielania odłączyć fiolki do pobierania próbek SPO i LPO i przechowywać je w odpowiedni sposób do późniejszej analizy.
3. Automatyczne czyszczenie i odkażanie
   UWAGA: Przed przetworzeniem każdej próbki należy przepłukać i odkazić cały układ fluidyczny, postępując zgodnie z następującą zautomatyzowaną procedurą.
   1. Zabezpiecz probówki z fiolkami do pobierania SPO i LPO, a także probówkę do pobierania próbek w pustych fiolkach, aby zebrać nadmiar roztworów czyszczących, które zostaną przepłukane przez probówki.
   2. Rozpocznij procedurę automatycznego czyszczenia systemu. Podobnie jak w przypadku procedury automatycznego rozdzielania w kroku 5.2, program powinien sterować zaworami i pompą strzykawkową, aby sekwencyjnie załadować cewkę podtrzymującą odczynnikami czyszczącymi i przepłukać je przez system.
   3. Wykonaj następującą procedurę czyszczenia: przepłukać 10% wybielaczem, następnie 70% etanolem, a na koniec wodą lub odpowiednim buforem soli fizjologicznej (np. 1x PBS lub buforem używanym do przetwarzania próbki). Użyj następujących objętości spłukiwania: 450 μl dla wybielacza i etanolu oraz 1 000 μl dla wody/buforu.
   4. Podczas etapów płukania należy przepłukać każdy odczynnik do SPO, gdy zawór wylotowy LPO jest ustawiony na port, który jest zablokowany, a następnie odwrotnie, aby usunąć wszelkie potencjalne zatkane ograniczniki przepływu wylotowego. Utrzymuj natężenie przepływu pobierania i infuzji na poziomie 300–500 μl/min, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków w przewodach i wzrost ciśnienia wstecznego, gdy SPO lub LPO jest zablokowane.
   5. Usunąć nadmiar roztworów płuczących i fiolki, w których się zebrały, postępując zgodnie z odpowiednimi procedurami postępowania z odpadami biologicznymi lub chemicznymi.

Results

Kluczowe cechy konstrukcji akustyczno-mikroprzepływowego urządzenia są wyróżnione na rysunku 1 i szczegółowo opisane gdzie indziej. ¹⁵ Krótko mówiąc, dwa strumienie płynu przepływają obok siebie w kanale separacyjnym, oddzielonym od równoległego kanału obejściowego cienką ścianką krzemową. Ponieważ wielkość pierwotnej siły promieniowania skaluje się wraz z objętością cząstek, duże cząstki migrują ze strumienia wejściowego próbki mieszanej w kierunku węzła ciśnienia akustycznego znajdującego się w sąsiednim strumieniu płynu regeneracyjnego, podczas gdy małe cząstki pozostają w strumieniu pierwotnym (rysunek 1B, C). Podzielona architektura dwukanałowa poprawia separację cząstek¹⁷ i umożliwia regulację położenia węzła poprzez zastosowanie różnych płynów z kanału obejściowego. ¹⁶ Płytka stykowa i osprzęt fluidyczny stanowią solidną platformę do połączeń między układami scalonymi, a modułowa konstrukcja umożliwia szybką wymianę układów scalonych (ilustracja 2). Taka konfiguracja umożliwia również szybkie i niezawodne wykonanie odwracalnych połączeń płynów, które uszczelniają do 1 000 psi (rysunek 2B, E).

Częstotliwość rezonansowa chipa może być oszacowana za pomocą prostych obliczeń analitycznych 1D (patrz Krok 1.1.1). Z bardziej kompletnego modelu 2D elementów skończonych o przekroju poprzecznym naszego ^{urządzenia16} oczekiwana pozycja ogniskowania dla rezonansu 2-węzłowego wynosi 225 μm od ściany, a oczekiwana częstotliwość to 1,68 MHz. Jednak _{częstotliwość} rzeczywistych urządzeń może różnić się o ±100 kHz, w zależności od temperatury pracy i sprzężenia rezonansów podłużnych i bocznych. W związku z tym, po zmontowaniu urządzenia, _{f res} musi zostać empirycznie zweryfikowany przy odpowiednich natężeniach przepływu i napięciach napędu piezoelektrycznego, jak opisano w kroku 4 protokołu. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne skany częstotliwości wykonane przy 200 μl/min, z wodą w kanale głównym i obejściowym oraz napięciem 20 V_pp dostarczanym do piezo. Gdy sprzężenie między urządzeniem piezoelektrycznym i mikroprzepływowym jest dobre, cząstki będą ściśle skupiać się na częstotliwości rezonansowej, co spowoduje wyraźny szczyt intensywności fluorescencji i migrację do oczekiwanej pozycji ogniskowania (rysunek 3A). W przeciwieństwie do tego, gdy występuje słabe sprzężenie, cząstki nie będą dobrze skupiać, a wyniki skanowania częstotliwości będą podobne do tych na rysunku 3B. W takich urządzeniach może być konieczne ponowne zamontowanie przetwornika piezoelektrycznego, jeśli zastosowano odwracalny klej; W przeciwnym razie to urządzenie nie jest odpowiednie, gdy wysokiej jakości ustawianie ostrości lub szybki przepływ mają kluczowe znaczenie dla wymaganego zastosowania. Dane przedstawione na rysunku 3 informują o wyborze częstotliwości roboczej dla kolejnych eksperymentów oraz o zakresie napięcia i natężenia przepływu dostępnym dla efektywnej separacji cząstek.

Rysunek 5. Zautomatyzowane przetwarzanie próbek. (A) Schemat próbki załadowanej do cewki próbki. (B) Reprezentatywny profil przepływu udanego eksperymentu z separacją. (C) Profil przepływu z przebiegu separacji, podczas którego wylot SPO zatkał się na około 220 sek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po zidentyfikowaniu układów, które są skutecznymi separatorami, są one włączane do systemu przedstawionego na rysunku 4. Całkowita objętość skokowa systemu jest zminimalizowana dzięki zastosowaniu przewodów o średnicy wewnętrznej 0,01 cala wzdłuż głównej ścieżki przepływu (niebieskie linie). Rysunek 5A ilustruje budowę typowego wkładu do próbki podawanego przez system. Niewielka ilość "buforu wiodącego" (~35 μl) jest wymagana, aby poprzedzić próbkę w przepływie, aby wyeliminować wahania przepływu, gdy próbka przepływa przez układ separacyjny. Rysunek 5B przedstawia dane dotyczące przepływu wynikające z udanego eksperymentu z automatyczną separacją akustyczną. Kluczowe cechy udanego przebiegu obejmują: (1) przejściowy wzrost natężenia przepływu zarówno w LPO, jak i SPO w miarę wzrostu ciśnienia i przepływu płynu przez układ, (2) ostry skok wskazujący na przejście pęcherzyka powietrza (wstawka pokazuje rozszerzony profil pojedynczego pęcherzyka), który powinien dotrzeć do SPO przed LPO ze względu na nierówny przepływ z dwóch wylotów, (3) stabilny przepływ przez oba wyloty między dwoma pęcherzykami powietrza, gdy próbka przepływa przez system, oraz (4) stopniowy spadek natężenia przepływu w obu wylotach po dostarczeniu pełnej objętości próbki do systemu. Problematyczne przebiegi są natychmiast widoczne w profilach przepływu podobnych do rysunku 5C, gdzie wydaje się, że SPO zatkał się po około 220 sekundach. W takim przypadku należy uruchomić procedurę czyszczenia podobną do opisanej w kroku 5.3, aby odblokować kanał.

Rysunek 6. Przestrajalność urządzenia: wpływ wielkości cząstek i napięcia. Procent mikrosfer polistyrenowych ekstrahowanych w LPO zależy od wielkości cząstek i napięcia dostarczanego do piezoceramiki. Każda linia odpowiada innemu napięciu roboczemu o częstotliwości rezonansowej, określonemu zgodnie z opisem w kroku 4. Całkowite natężenie przepływu przez urządzenie wynosi 200 μl/min, przy zastosowanych częstotliwościach sterowania od 1,62 do 1,64 MHz. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe co najmniej trzech oddzielnych eksperymentów. Przedruk i modyfikacja za zgodą The Royal Society of Chemistry z http://pubs.rsc.org /en/Content/ArticleLanding/ 2014/AN/c4an00034j. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6 pokazuje skompilowane wyniki separacji przy użyciu różnych rozmiarów cząstek polistyrenu i napięć sterowania piezoelektrycznego, które pokazują parametry operacyjne niezbędne do efektywnej separacji. Ogólnie rzecz biorąc, wyższe napięcia (tj. większe siły akustyczne) są wymagane do ekstrakcji mniejszych cząstek, zgodnie z oczekiwaniami. Napięcia napędowe nie mogą być jednak zwiększane w nieskończoność, ze względu na większe rozpraszanie ciepła i narastające efekty strumieniowania akustycznego. ¹³ Wykres służy jako ogólny przewodnik po separacji cząstek – cząstki o rozmiarach, które wykazują znacznie różny odzysk przy określonym napięciu sterującym (np. cząstki 10- i 2 μm przy 8,8 V_pp) będą dobrze oddzielane. Ogólnie rzecz biorąc, populacje cząstek o dużej różnicy wielkości, takie jak wirusy (~100 nm) i komórki (~10 μm), można szybko i skutecznie oddzielić, podobnie jak komórki o różnych rozmiarach (np. 6–8 μm dyskoidalnych erytrocytów i 8–15 μm leukocytów). Specyficzne warunki wymagane do pracy z innymi typami komórek muszą być określone empirycznie, ponieważ kształt, gęstość i ściśliwość komórki wpływają na jej kontrast akustyczny, oprócz wielkości komórki. W tym celu procedury opisane w kroku 4 są przydatne do określenia użytecznych warunków separacji dla każdego nowego typu komórki lub cząstki, a nie tylko do oceny jakości konkretnego urządzenia do akustoforezy.

Rysunek 7. Skuteczność separacji próbek wzbogaconych wirusem komórkowym. Separacja wynika z (A) komórek Raji wzbogaconych wirusem dengi (DENV) oraz (B) komórek Raji i komórek nerkowych Boa wzbogaconych wirusem Golden Gate (GGV). Zebrane wartości procentowe są definiowane jako frakcja wirusów lub komórek wydostających się z określonego ujścia w porównaniu z całkowitą ilością opuszczającą chip. Słupki błędu dla (A) są odchyleniem standardowym dla 3 prób, podczas gdy próbki w (B) zostały przetworzone tylko raz ze względu na małe dostępne ilości. 1x PBS był używany jako bufor próbki i płyn odzysku, z wodą w kanale obejściowym do wszystkich eksperymentów. Częstotliwości pracy układu wahały się od 1,60 do 1,64 MHz, przy napięciach sterowania od 16 do 20 V_pp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zademonstrować użyteczność tej platformy do biologicznej separacji cząstek, najpierw użyliśmy jej do przetwarzania dobrze scharakteryzowanych próbek biologicznych: ludzkich komórek Raji (10^{5 komórek}/ml, średnia średnica 8-10 μm²⁵) wzbogaconych wirusem dengi (DENV, 10⁵ pfu/ml, przybliżona średnica 50 nm²⁶). Rysunek 7A przedstawia procent komórek Raji i DENV zebranych zarówno w SPO, jak i LPO (zdefiniowanych jako frakcja każdego typu cząstek zebranych z każdego wylotu w porównaniu z całkowitą ilością każdej cząstki zebranej z chipa). Eksperyment powtórzono w trzech egzemplarzach, a komórki Raji oznaczono ilościowo za pomocą licznika Coultera, podczas gdy DENV oznaczono ilościowo za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).

Następnie, wydajność systemu została przetestowana w scenariuszu, który jest bardziej realistyczny dla przetwarzania próbek klinicznych, w którym dokładne cechy fizyczne cząstek mogą być nieznane, a dostępne ilości próbek są niższe. W tym przypadku oceniliśmy oddzielenie niedawno zidentyfikowanego wirusa golden gate (GGV), patogenu węża infekującego komórki nerkowe boa constrictor. ²⁷ Wielkość cząsteczki wirusa GGV nie została jeszcze zmierzona, ale ponieważ GGV należy do rodziny Arenaviridae, prawdopodobnie ma podobną wielkość, między 100 a 150 nm. ²⁸ Przetworzyliśmy próbki z dodatkiem GGV (10⁴ pfu/ml) do komórek ludzkich Raji (nie jest celem infekcji wirusa) i komórek nerki boa (cel infekcji dla GGV, przybliżony rozmiar 10 μm²⁷), przy czym oba typy komórek miały 10⁴ komórki / ml. Ponieważ próbki te były dostępne w małych ilościach, w niniejszej pracy przedstawiono wyniki separacji tylko z jednej serii eksperymentalnej. Rysunek 7B przedstawia procent komórek Raji, komórek Boa i GGV pobranych z SPO i LPO. Komórki oznaczono ilościowo w tych eksperymentach, licząc za pomocą hemacytometru, a wirusy oznaczono ilościowo za pomocą RT-qPCR.

Discussion

Protokół ten przedstawia integrację na poziomie systemu urządzeń mikroprzepływowych ze sprzętem w makroskali w celu zautomatyzowanego przetwarzania próbek biologicznych. Modułowość tej platformy pozwala na dostosowanie jej do dowolnego urządzenia o ciągłym przepływie, a na przykład prezentowany protokół koncentruje się na charakterystyce i optymalizacji wydajności akustycznie przepływowego urządzenia do separacji cząstek. Podkreślono trzy główne zalety tego protokołu: (i) modułowość i interfejs chip-to-world, (ii) solidną charakterystykę wydajności urządzenia oraz (iii) zautomatyzowane przetwarzanie precyzyjnie odmierzonych objętości próbek w celu separacji cząstek.

i. Modułowość i interfejs chip-to-world

Jak pokazano na rysunku 2, chip mikroprzepływowy jest zamontowany na niestandardowej płytce stykowej, aby łatwo dopasować się do stolika mikroskopowego w celu bezpośredniej obserwacji. Płytka stykowa zawiera gwintowane otwory #6-40 UNF na siatce o rastrze 5 mm, umożliwiające zabezpieczenie chipa i wykonanie płynnych połączeń. Połączenia płynów to rurki PEEK z obrobionymi maszynowo końcami, które uszczelniają się przed wiórem płynnym za pomocą gumowej uszczelki uszczelniającej powierzchnię czołową i kołnierza ze stali nierdzewnej. Ten schemat interfejsu umożliwia łatwą wymianę chipów i szybkie przeprojektowanie urządzeń, wymagając niewielu lub żadnych zmian w innych komponentach systemu, pod warunkiem, że ślady chipa są zgodne z formatem siatki. Na przykład użyliśmy tej platformy z chipami mikroprzepływowymi do elektroforezy o ciągłym przepływie, termicznej lizy ^komórek29 , szybkiego mieszania odczynników do syntezy chemicznej oraz wychwytywania i badania pojedynczych komórek.

ii. Solidna charakterystyka działania urządzenia

Aby zoptymalizować wydajność każdego urządzenia do separacji mikroprzepływowej, należy najpierw dokładnie scharakteryzować jego działanie. Opisany tutaj system wspiera rozwój szybkich i zautomatyzowanych protokołów w tym celu. W przypadku konkretnego przykładu akustycznych urządzeń do ustawiania ostrości, jakość ogniskowania, częstotliwość robocza i położenie skupionych cząstek w kanale mikroprzepływowym muszą być mierzone dla każdego urządzenia z osobna. Pomiary te wymagają przeszukania szeregu częstotliwości napędów piezoceramicznych, napięć i natężeń przepływu, aby zidentyfikować optymalne kombinacje parametrów dla wysokiej jakości separacji. Prezentowany protokół automatycznie zmienia te regulowane parametry i rejestruje odpowiednie dane, tj. fluorescencyjne obrazy cząstek przepływających w kanale, które są przetwarzane w celu wygenerowania wymaganych pomiarów jakości, częstotliwości i położenia ogniskowania cząstek (rysunek 3).

Pełna charakterystyka działania urządzenia akustycznego wymaga powtórzenia kroków 4.4 i 4.5 w zależności od potrzeb w różnych warunkach eksperymentalnych. Na przykład bezwzględna pozycja ostrości chipa jest ustalana poprzez uruchomienie skanowania częstotliwości przy stosunkowo niskich natężeniach przepływu i wysokich napięciach, aby zapewnić pełną migrację do lokalizacji węzła. Dodatkowo, takie skany częstotliwości mogą ocenić jakość montażu urządzenia (gdy są uruchamiane z kulkami polistyrenowymi o znanej wielkości) lub określić, jak nieznany wcześniej typ cząstek będzie zachowywał się w systemie (po scharakteryzowaniu chipa za pomocą kulek). Chip o dobrym transferze energii z kanału piezoceramicznego do mikroprzepływowego spowoduje ścisłe ogniskowanie przy wysokich natężeniach przepływu (>1 ml/min) i niskich napięciach (12–15 V_pp), podczas gdy te o słabym transferze energii nie będą skupiać się nawet przy niskich natężeniach przepływu (<100 μl/min) i wysokich napięciach (>20 V_pp). Odkryliśmy, że bliski kontakt między chipem mikroprzepływowym a piezoceramiką ma kluczowe znaczenie dla efektywnego transferu energii do płynu. Dalsze badania nad optymalną metodą łączenia chipa mikroprzepływowego i piezoceramiki umożliwią niezawodną produkcję urządzeń o wysokiej wydajności.

Wreszcie, pełny obraz działania urządzenia akustycznoforetycznego można uzyskać, łącząc pomiary częstotliwości oparte na obrazie z kroku 4 (i rysunku 3) ze zliczeniami cząstek zebranymi z SPO i LPO w funkcjach odpowiednich parametrów roboczych, z eksperymentów separacji przeprowadzonych na mikrosferach, jak opisano w kroku 5. Jak pokazano na rysunku 6, taka seria zautomatyzowanych eksperymentów może szybko scharakteryzować wydajność i możliwość dostrajania pojedynczego urządzenia, informując użytkownika o optymalnej przestrzeni parametrów do obsługi urządzenia do separacji cząstek.

iii. Zautomatyzowane przetwarzanie małych próbek w celu separacji cząstek

Aby zapewnić udane i dokładne przetwarzanie próbek opartych na chipach mikroprzepływowych, kluczowe znaczenie ma niezawodne i precyzyjne odmierzanie, ładowanie, dostarczanie i zbieranie objętości płynu podczas ich przepływu. Ta precyzja jest szczególnie ważna, gdy objętość próbki jest mała (~0,1–1 ml), co jest powszechne w warunkach klinicznych lub laboratoryjnych. ³⁰ Precyzyjna obsługa próbki jest wyzwaniem w tradycyjnych eksperymentach mikroprzepływowych, które polegają na ręcznym pobieraniu próbki do strzykawki i infuzji do urządzenia bez informacji zwrotnej o tym, kiedy próbka została oddzielona i kiedy należy ją pobrać. Prezentowany protokół wykorzystuje zautomatyzowane ładowanie i dozowanie cewek próbek w połączeniu z informacją zwrotną w czasie rzeczywistym z czujników przepływu, aby umożliwić powtarzalne oddzielanie małych objętości próbek.

Rysunek 5 przedstawia profile przepływu zmierzone w SPO i LPO z typowego eksperymentu separacji. Po pierwsze, ładowany jest bufor wiodący o pojemności co najmniej 35 μl, aby zapewnić stabilny przepływ, zanim próbka dotrze do chipa akustycznego. Objętości próbek mniejsze niż 100 μl nie są zalecane dla tej konfiguracji systemu, ponieważ rozcieńczenie próbki spowodowane buforem prowadzącym staje się nadmierne. Korek z powietrzem jest używany na początku wtrysku przed buforem prowadzącym w celu oddzielenia korka próbki od płynu, który następuje po nim, zapobiegając mieszaniu i rozcieńczaniu próbki i służąc jako wskaźnik dla czujników przepływu. Po początkowym stanie przejściowym, gdy płyn zaczyna przepływać przez układ, ostre sygnały skokowe w obu wylotach wskazują na przejście pierwszego pęcherzyka powietrza. Po tych stanach nieustalonych następuje długi okres stabilnego przepływu, gdy próbka przepływa przez system, następnie kolejny skok, gdy przechodzi drugi pęcherzyk powietrza, a na końcu ostateczny spadek natężenia przepływu do zera po zatrzymaniu pompy strzykawkowej.

Przejście korków powietrznych przez czujniki przepływu jest wykorzystywane jako punkty wyzwalania do przełączania zaworów w celu rozpoczęcia i zatrzymania pobierania próbki, minimalizując w ten sposób utratę próbki i rozcieńczenie przez objętości płynu niebędące próbką. Dozowanie objętości przetwarzanej próbki w pętli zamkniętej eliminuje konieczność ponownego programowania tych wartości przed rozpoczęciem eksperymentu za każdym razem, gdy próbka wejściowa jest zmieniana. Cecha ta jest szczególnie istotna, gdy objętość próbki jest ograniczona, na przykład w przypadku wielu próbek klinicznych. Monitorowanie przepływu w czasie rzeczywistym pomaga również w rozwiązywaniu problemów; słaby przebieg (np. zatkanie tworzące się w jednym z wylotów) jest natychmiast widoczne na podstawie wynikowych profili przepływu, jak na rysunku 5b.

Aby zademonstrować elastyczność i skuteczność separacji akustofluidycznej przy użyciu zaprezentowanej architektury systemu, oczyszczone zapasy wirusów DENV i GGV zostały wzbogacone do zapasów komórkowych i oddzielone przez przetwarzanie przez chip mikroprzepływowy. Rycina 7a pokazuje, że komórki Raji były dobrze oddzielone od wirusów, ponieważ okazało się, że 97% komórek Raji opuszczających chip znajduje się w LPO, pozostawiając w ten sposób wysoce wzbogaconą próbkę DENV w SPO. Dla porównania, wydajność separacji DENV była niższa, przy czym 70% DENV wychodziło z chipa znajdującego się w SPO. Można to przypisać lekkiemu mieszaniu konwekcyjnemu indukowanemu przez zwoje kanału separacji, ale bardziej prawdopodobne jest, że niektóre cząstki DENV migrują wraz z komórkami Raji do LPO. Komórki migrujące poprzecznie przez strumienie ciągną ze sobą trochę płynu, nawet przy niskiej liczbie Reynoldsa. Dzięki temu mechanizmowi, a także niespecyficznej adsorpcji powierzchniowej, cząsteczki wirusa przenoszą się do LPO. Niemniej jednak wysoce wzbogacona próbka DENV w SPO jest znaczącą korzyścią, na przykład gdy sekwencjonowanie de novo jest stosowane do wykrywania i identyfikacji wirusów.

Rysunek 7b pokazuje, że w jednym z eksperymentów tylko około 70% komórek Boa opuszczających chip zostało znalezionych w LPO, w porównaniu z prawie 100% skutecznością separacji w przypadku komórek Raji. Różnica w wydajności separacji między tymi dwoma typami komórek może wynikać z mniejszego średniego rozmiaru lub mniejszej gęstości komórek Boa w porównaniu z komórkami Raji, co skutkuje mniejszymi siłami akustycznymi. Aby potwierdzić lub obalić te przypuszczenia, należy dokładnie zmierzyć wielkość, gęstość i morfologię komórek Boa w zawiesinie (które normalnie rosną przylegają) komórek Boa, co stanowi próbę dalszych badań. W tych samych eksperymentach, podobnie jak w eksperymentach z DENV, większość odzyskanego GGV opuściła SPO, co wskazuje na wzbogacenie frakcji wirusowej.

Przedstawione dane podkreślają nieodłączne wyzwania związane z inżynierią platform o szerokim zastosowaniu do przetwarzania różnorodnych próbek biologicznych. Co ważne, interakcje biologiczne mogą zacząć odgrywać równie dużą rolę, jak efekty fizyczne i mechaniczne. Jednak te wstępne eksperymenty pokazują również moc i obietnicę wykorzystania tej architektury systemu do przetwarzania próbek w zastosowaniach klinicznych i badawczych. Jako solidny, dobrze scharakteryzowany system inżynieryjny, platforma ta zapewnia możliwość poszukiwania odpowiedzi na nowe pytania naukowe.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiały wymagane do Kroków 1-3: Projektowanie, Produkcja i Montaż
Urządzenia Dwustronnie polerowany wafel krzemowy	Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA	100 mm < 100>  Płytka podstawowa	1-20 Ohm-cm, 495 ± 25  &mikro; m Dwustronnie polerowany
szklany wafel	Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA	100 mmx0,5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518	MicroChemicals GmbH, Ulm, Niemcy	AZ 1518	Photoresist służy do przyklejania wafla do pustej płytki do wytrawiania DRIE
Photoresist, AZ 4620	MicroChemicals GmbH, Ulm, Niemcy	AZ 4620	Photoresist do definiowania wzorów płynnych i za pomocą masek
Wytrawiacz plazmowy DRIE	STPS, Newport, NP, Wielka Brytania	Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) System
Wafer Bonder	Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria	EVG 501
Piła do krojenia w kostkę	Kulicke & Soffa Industries, Singapur	K& S 982
Zestaw epoksydowy	Technologia epoksydowa, Billerica, MA, USA	EPO-TEK 301	Żywica epoksydowa służąca do łączenia chipów piezoelektrycznych i mikroprzepływowych
PZT piezoceramicznych	Piezo Systems, Woburn, MA, USA	PSI-5A4E	37,5 &razy; 10 &razy; 0,5 mm
28 AWG Drut lity w izolacji Kynar	Squires Electronics, Cornelius, OR, USA	UL1422
2-częściowa srebrna żywica epoksydowa	MG Chemicals, Surrey, BC, Kanada	8331	Klej przewodzący do mocowania przewodów drucianych do PZT
L-edit	Tanner EDA, Monrovia, CA, USA	Ledit v15.1 64-bitowe	oprogramowanie CAD do układu
Materiały wymagane do kroku 4: Charakterystyka ostrości akustycznej
Dual Pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	Phd Ultra Series, 703007
5  ml strzykawki	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA	309646
Adapter z gwintowanym portem Luer	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	P-659	Łączy strzykawkę z rurką
Union	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	P-623	Łączy świat z połączeniami chipowymi z rurkami fluoropolimerowymi.  Może również korzystać z taśmy
Tuleja 1/4-28 z płaskim dnem	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	P-200	Używana z nakrętką do wykonywania połączeń między rurką a strzykawką, czujnikami przepływu i światem do osprzętu chipowego
Nakrętka  1/4-28 płaskie dno	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	P-202	Używany z tulejką do wykonywania połączeń między rurką a strzykawką, sessorami przepływu i światem do sprzętu do chipowania
1/16" OD Rurki fluoropolimerowe	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	1912L	Rurka do łączenia pomp strzykawkowych ze światem do połączeń chipowych.  Rozmiar rurki nie ma znaczenia podczas etapów klamracji (zwykle używane ID .01-.03", inne odpowiednie numery części: 1907L, 1902L).
Rurka fluoropolimerowa o małej średnicy wewnętrznej	IDEX, Oak Harbor, WA, USA	1476-20	Używana do ograniczników przepływu: 0,006" ID, 1/16" OD FEP
Rurka			Łączy rurkę z chipa z rurką fluoropolimerową.
Wentylator chłodzący	Multicomp, Leeds, Anglia	MC19663
Generator funkcyjny	Agilent, Santa Clara, CA, USA	33220A
Wzmacniacz RF	ENI, Rochester, NY	325 LA	Musi być w stanie wzmocnić sygnały z < 1  V w zakresie 1-2  MHz do 25  Vpp do piezo.
Kamera CCD	Fotometria, Tucscon, AZ, USA	CoolSnap HQ
Mikroskop odwrócony	Zeiss, Oberkochen, Niemcy	Axiovert S100
FITC	Chroma Tech, VT, USA	Obiektyw SP101
, 10X	Zeiss, Oberkochen, Niemcy	Oscyloskop ACHROPLAN
	Tektronix, Beaverton, OR, Stany Zjednoczone	TDS3014B	Do monitorowania napięcia wyjściowego przez wzmacniacz RF
MatLab	Mathworks, Natick, MA, USA	R2014a Oprogramowanie interfejsu sterownika
do integracji kamery fotometrycznej z oprogramowaniem LabVIEW	R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA	SITK
Tween 20	Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA	P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 lub 7.32  &mikro; m Beads	Bangs Laboratory, IN, USA	FS06F
Dodatkowe materiały wymagane do kroku 5: Automatyczne
rozdzielanie zaworów wieloportowych	VICI, Houston, TX, USA	C25Z-3180EUHA	W obecnej konfiguracji potrzebne są 4 zawory
Czujniki przepływu	Sensirion, Westlake Village, CA, USA	SLI-1000
Rurki fluoropolimerowe, .01 i .03" ID	IDEX, Dąb Harbor, WA, USA	1902L i 1912L	Preferowana nakrętka PFA o wysokiej czystości
	VICI, Houston, TX, USA	ZN1PK-10	Używana z tulejką do wykonywania połączeń między rurkami a zaworami. Alternatywne numery części: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Tuleja	VICI, Houston, TX, USA	ZGF1PK-10	Używana z nakrętką do wykonywania połączeń między rurkami a zaworami.
LabVIEW	National Instruments, Austin, Teksas, Stany Zjednoczone	System rozwoju zawodowego LabVIEW	Oprogramowanie do automatyzacji laboratoriów
PBS	Teknova, Hollister, CA, USA	P0200
Raji Cells	ATTC, Manassas, VA, USA
	Uprzejmie dostarczone przez Laboratorium DeRisi w UCSF
			Uprzejmie dostarczone przez Laboratorium DeRisi na UCSF
DENV			Uprzejmie dostarczone przez Jose Pena w LLNL
Coulter Counter Z2	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Hemacytometr Z2
	Fisher Scientific, Waltman, MA, USA	0267151B