Badania naprężeń ścinających w systemie emulsji olejowo-wodnej skutkują rozpadem kropli w czasie eksperymentu. Aby zliczyć wielkość kropli w procesach pompowania, w protokole tym z powodzeniem wykazano przydatność endoskopii inline.
Artykuł metodologiczny
Badania naprężeń ścinających w systemie emulsji olejowo-wodnej skutkują rozpadem kropli w czasie eksperymentu. Aby zliczyć wielkość kropli w procesach pompowania, w protokole tym z powodzeniem wykazano przydatność endoskopii inline.
Pompy są głównie używane do przenoszenia sterylnych bulionów hodowlanych w procesach produkcji biofarmaceutycznej i biotechnologicznej. Jednak podczas procesu pompowania występują siły ścinające, które mogą prowadzić do jakościowych i/lub ilościowych strat produktu. Aby obliczyć naprężenia mechaniczne przy ograniczonych kosztach eksperymentalnych, użyto systemu emulsji olejowo-wodnej, którego przydatność wykazano do wykrywania wielkości kropli w bioreaktorach1. Ponieważ rozpad kropli w układzie emulsji olej-woda jest funkcją naprężeń mechanicznych, rozmiary kropli muszą być liczone w czasie doświadczalnym badań naprężeń ścinających. W poprzednich badaniach wykazano, że endoskopia inline jest dokładną i niezawodną techniką pomiarową do wykrywania wielkości kropli w dyspersjach ciecz/ciecz. Celem tego protokołu jest wykazanie przydatności techniki endoskopii inline do pomiaru wielkości kropli w procesach pompowania. Aby wyrazić wielkość kropli, jako reprezentatywną średnicę kropli w emulsji olej-woda użyto średniej średnicy Sautera d32. Wyniki wykazały niewielką zmienność średnich średnic Sautera, które zostały określone ilościowo za pomocą odchyleń standardowych poniżej 15%, co wskazuje na wiarygodność techniki pomiaru.
Pompy są używane do przenoszenia kultur komórkowych w przemyśle farmaceutycznym i biotechnologicznym. Podczas procesu pompowania naprężenia mechaniczne mogą spowodować nieodwracalne uszkodzenie komórek, co może pogorszyć ilość i jakość produktu1-4. Poziom naprężeń mechanicznych zależy od typu pompy i jej ustawień, jak wykazano w poprzednich badaniach5-6. Powszechnie pompy perystaltyczne, strzykawkowe i membranowe są używane do zastosowań opartych na technologii jednorazowego użytku (SU). Pompy te powodują duże lokalne siły ścinające spowodowane ściskaniem rurki pompy i pulsującym przepływem7.
Aby przezwyciężyć te wady, magnetycznie lewitujące pompy odśrodkowe (pompy odśrodkowe MagLev) stanowią obiecującą alternatywę. Silnik jest napędzany magnetycznie, aby uniknąć wąskich szczelin między wirnikiem a korpusem pompy (ilustracja 1). W poprzednim badaniu zbadano pompy odśrodkowe MagLev i wykazano mniejsze naprężenia mechaniczne w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) w porównaniu z pompami perystaltycznymi i 4-tłokowymi membranowymi5. Ponadto analizy hemolizy nie wykazały znaczącego urazu krwi i tworzenia się skrzeplin w różnych warunkach pracy przy użyciu tych pomp8-11. Wyniki pokazują, że zastosowanie tych specjalnie zaprojektowanych pomp powoduje mniejsze obciążenie mechaniczne systemów biologicznych w porównaniu z pompami perystaltycznymi i membranowymi. Do zbadania naprężeń mechanicznych przy ograniczonych kosztach eksperymentalnych zaleca się model emulsji olejowo-wodnej ze względu na jego koszt (ok. 99,8%) i skrócone czasowo (ok. 99,5%) zastosowanie w porównaniu z biologicznymi systemami hodowli komórkowych.
Ponieważ rozpad kropli w systemie emulsji olejowo-wodnej jest funkcją naprężeń mechanicznych, rozmiary kropli muszą być liczone w czasie eksperymentalnym badań naprężeń ścinających. Dostępnych jest wiele technik doboru rozmiaru, które można podzielić na techniki dźwiękowe, laserowe i fotograficzne12. W szczególności zastosowanie endoskopii inline z sondą fotooptyczną wykazuje prawie identyczne rozmiary kropli dla detekcji ręcznej i automatycznej (odchylenie standardowe poniżej 10%) i umożliwia wykrywanie 250 kropli na minutę13. Ze względu na swoją dokładność i niezawodność, technika endoskopowa okazała się skuteczną standardową techniką pomiaru rozkładu wielkości kropli w dyspersjach ciecz/ciecz w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi sondami (np. światłowodowym czujnikiem stosunku przód-tył (FBR), metodą odbicia skupionej wiązki (FBRM) i dwuwymiarową techniką pomiaru odbicia optycznego (2D-ORM))12,14. Co więcej, przydatność endoskopii inline do pomiaru wielkości kropel w naczyniu z mieszadłem została kilkakrotnie wykazana w poprzednich badaniach15-18.
Na podstawie wcześniejszego badania6, ten protokół opisuje użycie endoskopii inline do określania wielkości kropli (średnia średnica Sautera) systemu emulsji olej-woda w pompach. Średnia średnica Sautera została wykorzystana jako kryterium porównawcze w celu oszacowania naprężeń mechanicznych wielofunkcyjnych (MU) pomp odśrodkowych MagLev, perystaltycznej i jednorazowej (SU) 4-tłokowej pompy membranowej.

Rysunek 1. Magnetycznie lewitowany system pomp odśrodkowych. (A) Zasada działania silnika bezłożyskowego i (B) PuraLev 200MU są pokazane jako przykład. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Badania zostały przeprowadzone przy użyciu instalacji pompowej (Rys. 2), która umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z naprężeniami mechanicznymi przy natężeniach przepływu do 60 L min-1 i spadkach ciśnienia do 2 barów. Jak pokazano na rys. 2, układ eksperymentalny składa się z naczynia magazynowego, obwodu pompy i sprzętu do techniki endoskopii na linii. Wirnik zbiornika magazynowego służył wyłącznie do mieszania środka powierzchniowo czynnego. Elementy peryferyjne zostały zintegrowane z zamkniętą pętlą w celu monitorowania natężenia przepływu V̇ i spadku ciśnienia p przy różnych ustawieniach pompy. Badania były urozmaicone za pomocą zaworu ręcznego.
1. Konfiguracja eksperymentalna
2. Pomiar i analiza obrazu

Rysunek 2. Konfiguracja eksperymentalna. Obwód pompy do konfiguracji pompy rurowej przy użyciu endoskopii liniowej jako techniki pomiaru: (1) naczynie magazynowe, (2) port strzykawki, (3) pompa, (4) czujnik ciśnienia, (5) czujnik przepływu, (6) stroboskop, (7) komputer z oprogramowaniem dostarczonym przez producenta oraz (8) sonda endoskopowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Ocena optyczna
Rys. u re 3 pokazuje obrazy rozpoznawania cząstek po czasie pompowania wynoszącym 1 godzinę. Cztery górne obrazy pokazują krople przed rozpoznaniem, a dolne cztery obrazy pokazują krople zaznaczone przez oprogramowanie do rozpoznawania. Wykryte krople są podświetlone zieloną obwódką. Porównanie górnego i dolnego obrazu pokazuje, że krawędzie spadku zostały precyzyjnie wykryte przez oprogramowanie do rozpoznawania obrazu. Zdjęcia po lewej stronie pokazują rozkład kropli dla pomp odśrodkowych MagLev PuraLev 200MU i PuraLev 600MU, a te po prawej pokazują 4-tłokową membranę i pompę perystaltyczną. Ocena optyczna pozwoliła na wstępną klasyfikację naprężeń mechanicznych w modelowym układzie emulsyjnym. Okazało się, że pompy odśrodkowe MagLev generowały większe rozmiary kropli i mniejszą liczbę kropli w porównaniu z 4-tłokową pompą membranową i perystaltyczną. W związku z tym pompy odśrodkowe MagLev, zwłaszcza PuraLev 200MU, wykazały zmniejszone pękanie kropli, co wskazuje na mniejsze naprężenia mechaniczne.

Rysunek 3. Obrazy endoskopii w linii. Krople emulsji przed (A, B, C, D) i po (E, F, G, H) rozpoznaniu cząstek po 1 godzinie pompowania przy użyciu (A, E) PuraLev 200MU, (B, F) PuraLev 600MU, (C, G) 4-tłokowej pompy membranowej i (D, H) pompy perystaltycznej w identycznych warunkach pracy (3,4 l min-1 i 0,03 bara). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Średnia średnica Sautera
Dalsze badania wykazały odchylenia standardowe poniżej d32 ± 0,4 μm i gwarantowały powtarzalne wyniki przy użyciu inline endoskopii19. W związku z tym w przypadku tego podejścia nie było wymagane przeprowadzanie wielu badań, co dodatkowo zmniejszyło koszty eksperymentu.
Aby wyrazić wielkość kropli, średnia średnica Sautera d32 (patrz Równanie 1) została użyta jako reprezentatywna średnica kropel w emulsji olej-woda dla tego podejścia. Ogólnie rzecz biorąc, średnia średnica Sautera zmniejszała się z czasem dla wszystkich typów pomp i ustawień pompy, aż do osiągnięcia stanu ustalonego12. Badania przeprowadzone w tym badaniu potwierdziły przykładowo omówioną w niniejszym protokole progresję średniej średnicy Sautera (rys. u re 4A do D), krzywych PuraLev 200MU (rys. u re 4A) i pompy perystaltycznej (rys. u re 4D).
W przeciwieństwie do PuraLev 200MU, średnie średnice Sautera były do 40% mniejsze dla pompy perystaltycznej w tych samych warunkach pracy (natężenie przepływu = 3,4 L min-1; spadek ciśnienia = 0,03 bara). W konsekwencji większe naprężenia mechaniczne skutkowały zwiększonym rozpadem kropli, a tym samym mniejszymi rozmiarami kropli. Co więcej, średnia średnica Sautera zmniejszała się wraz ze wzrostem spadku ciśnienia w PuraLev 200MU (rys. u re 4A), co wskazywało na zależność wielkości kropli od spadku ciśnienia. Natomiast pompa perystaltyczna wykazała średnią średnicę Sautera wynoszącą d32,60 min = 10 μm na końcu doświadczenia dla wszystkich parametrów procesu (rys. u re 4D). W związku z tym stwierdzono, że średnia średnica Sautera jest niezależna od spadku ciśnienia. Wyniki odzwierciedlają jednak fizyczne zrozumienie rozpadu kropli: przy większych naprężeniach mechanicznych wyznaczono mniejsze średnie średnice Sautera (patrz również rys. u re 5).
Dla każdego punktu pomiarowego wyznaczono co najmniej 300 kropli, aby zagwarantować pewność statystyczną. Maksymalne odchylenie standardowe zmniejszyło się dla PuraLev 200MU z d32,4 min ± 42 μm, a dla PuraLev 600MU z d32,6 min ± 21 μm do około d32 ± 0,5 μm na końcu procesu pompowania. Zmniejszone odchylenie standardowe wynikało ze zwiększonego jednorodnego rozkładu wielkości kropli aż do osiągnięcia stanu ustalonego. W porównaniu z pompami odśrodkowymi MagLev, pompy perystaltyczne i 4-tłokowe membranowe wykazały odchylenia standardowe poniżej d32 ± 10 μm.
(1)

Rysunek 4. Typowe profile średnich średnic Sautera d32 w czasie i wyznaczenie zmierzonych średnich średnic Sautera d32,m. Porównanie średnich średnic Sautera d32 (A) dla PuraLev 200MU, (B) dla PuraLev 600MU, (C) dla 4-tłokowej pompy membranowej i (D) dla pompy perystaltycznej. Średnie średnice Sautera d32 wyznaczono przy natężeniu przepływu 3,4 L min-1 i spadkach ciśnienia w zakresie od 0,03 do 0,61 bara. Zmierzona średnia średnica Sautera d32,m została obliczona dla ostatnich 10 minut (granica). Pokazano wynikowe odchylenie standardowe średnich średnic Sautera d32 (N ≥ 300). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Zmierzona średnia średnica Sautera jako system porównawczy
Jak opisano powyżej, średnia średnica Sautera zmniejszała się z czasem, aż rozmiary kropli osiągnęły stan ustalony. W ciągu ostatnich 10 minut czasu doświadczenia obliczono średnią wartość średniej średnicy Sautera w celu wyznaczenia zmierzonej średniej średnicy Sautera, która została wykorzystana jako kryterium porównawcze (patrz granica rys. 4A-D). Zmierzone średnie średnice Sautera d32,m przedstawiono na rys. 5 dla natężenia przepływu 3,4 L min-1 i zakresu spadku ciśnienia od 0,03 do 0,61 bara. Większe zmierzone średnie średnice Sautera wyznaczono zarówno dla pomp odśrodkowych MagLev (200 MU i 600 MU), jak i 4-tłokowej pompy membranowej przy niższych spadkach ciśnienia i prędkościach wirnika. Pompa perystaltyczna ujawniła zmierzone średnie średnice Sautera wynoszące d32,m = 10 μm dla wszystkich parametrów procesu. Jak wspomniano wcześniej, siły tnące były niezależne od spadku ciśnienia w pompie perystaltycznej.
Największe zmierzone średnie średnice Sautera wynoszące d32,m = 36 μm dla PuraLev 200MU i d32,m = 34 μm dla PuraLev 600MU uzyskano przy spadku ciśnienia 0,03 bara. W porównaniu z ich odpowiednikami, pompy odśrodkowe serii MagLev uzyskały do 59% większe zmierzone średnie średnice Sautera. Wyniki te wskazują na mniejszą szybkość rozpadu kropli, a tym samym mniejsze naprężenia mechaniczne wynikające z zastosowania pomp odśrodkowych.
Odchylenie standardowe zmierzonych średnich średnic Sautera w stanie ustalonym było poniżej 15%, potwierdzając tym samym wiarygodne i dokładne wartości dla wielkości kropli.

Rysunek 5. Porównanie zmierzonych średnich średnic Sautera d32,m. Zmierzone średnie średnice pomp odśrodkowych MagLev i ich odpowiedników przy 3,4 l min-1 i spadkach ciśnienia 0,03, 0,30 i 0,61 bara. Przedstawiono wynikowe odchylenia standardowe zmierzonych średnich średnic Sautera d32,m w stanie ustalonym.
Skróty Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
T użytku| 2D-ORM | dwuwymiarowy pomiar odbicia optycznego |
| Ccd | Urządzenie sprzężone z ładunkiem |
| Cho | Jajnik chomika chińskiego |
| Cmc | Krytyczne stężenie miceli |
| FBR (Urząd Zarządzania | stosunek przód-tył |
| FBRM (Mechanizm zarządzania rybami) | Metoda odbicia skupionej wiązki |
| MU | Wielozadaniowy |
| Su | Jednorazowego |
Nomenklatura
| [m3 sek-1] | Przepływ | |
| c | [m3 m-3] | koncentracja |
| D32 | [m] | Średnia średnica Sautera |
| d32,m | [m] | zmierzona średnia średnica Sautera |
| ds | [m] | Średnica powierzchni |
| d v | [m] | średnica objętości |
| Z | [Hz] | częstotliwość |
| n | [sek-1] | prędkość obrotowa wirnika |
| N | [-] | Liczba kropli |
| p | tatuś | Spadek ciśnienia |
| t | S | Godzina |
| β | [kg m-3] | stężenie masowe |
| ρ | [kg m-3] | gęstość |
| ω | [m3 m-3] | Ułamek masowy |
Tabela 1. Tabela skrótów i nomenklatury.
Celem tego protokołu jest wykazanie przydatności techniki endoskopii inline do pomiaru wielkości kropli w procesach pompowania. W tym celu określono wielkości kropli w układzie emulsyjnym olej-woda i obliczono zmierzoną średnią średnicę Sautera, aby scharakteryzować naprężenia mechaniczne pomp odśrodkowych MagLev, a także ich odpowiedników, pompy perystaltycznej i 4-tłokowej pompy membranowej. Wyniki wykazały niewielką zmienność zmierzonych średnich średnic Sautera, które zostały określone ilościowo za pomocą odchyleń standardowych poniżej 15%, co wskazuje, że wielkości kropli zostały zmierzone wiarygodnie i dokładnie. W związku z tym zmierzona średnia średnica Sautera może być z powodzeniem wykorzystana jako kryterium porównawcze do oceny naprężeń mechanicznych badanych pomp. Pompy odśrodkowe MagLev wykazały większe zmierzone średnie średnice Sautera, co wskazuje na mniejsze naprężenia mechaniczne przy kroplach emulsji w porównaniu z pompami perystaltycznymi i 4-tłokowymi membranowymi. W dotychczasowych badaniach wykazano, że endoskopia inline jest solidną i prostą techniką wiarygodnego pomiaru wielkości kropli1,6,12-14,20-21, co również zostało potwierdzone w tym badaniu. W porównaniu z alternatywnymi technikami pomiarowymi, takimi jak światłowodowy czujnik FBR, FBRM i technika 2D-ORM, technika endoskopowa może być stosowana jako standardowa metoda uzyskiwania precyzyjnych danych w zastosowaniach ciecz/ciecz12,14.
Łatwa obsługa endoskopii inline i prosta produkcja niebiologicznego systemu emulsji olejowo-wodnej umożliwia prostą procedurę wykrywania wielkości kropli zgodnie z tekstem protokołu (patrz wyżej). Niemniej jednak należy wspomnieć, że położenie sondy endoskopowej zależy od przepływu płynu w naczyniu magazynowym. Dalsze badania (dane nie zostały pokazane) wykazały, że soczewka sondy powinna znajdować się bezpośrednio pod rurą wlotową dla niższych natężeń przepływu do 5 L min-1 , aby uniknąć wielokrotnego wykrywania jednej kropli19. Aby uzyskać ostre obrazy przy natężeniu przepływu powyżej 5 L min-1, zaleca się umieszczenie sondy w odległości co najmniej 10 cm od rurki wlotowej. Niezależnie od parametrów procesu, uchwyt endoskopii inline powinien być stabilny, aby uniknąć przesuwania się sondy, co może skutkować rozmyciem obrazu.
Ponadto należy zwrócić szczególną uwagę na to, że wykryta wielkość kropli jest bliska dolnej granicy wykrywalności zastosowanego systemu fotooptycznego, gdzie minimalna wykrywalna średnica kropli wynosi 6,5 μm. Ponieważ oprogramowanie dostarczone przez producenta zostało ulepszone, techniki endoskopii inline mogą niezawodnie wykrywać minimalny rozmiar kropli wynoszący 1 μm. Co więcej, przetwarzanie obrazu będzie dalej rozwijane, aby umożliwić monitorowanie aplikacji przemysłowych online.
Podczas gdy obecne badanie koncentrowało się na stosunkowo niskich natężeniach przepływu do 3,4 l min-1, przyszłe badania powinny uwzględniać szerszy zakres warunków pracy. Pierwsze badania przeprowadzono przy natężeniach przepływu do 20 L min-1 (dane nie pokazane). Zaleca się jednak rozcieńczenie 1:2 (cśrodek powierzchniowo czynny = 0,09 ml L-1, colej = 0,64 ml L-1) układu emulsji olej-woda przy natężeniach przepływu powyżej 10 L min-1 19, ponieważ w przeciwnym razie zwiększony rozpad kropli spowodowany większymi naprężeniami mechanicznymi wpłynąłby na wykrywanie kropli i zmniejszyłby liczbę wykrywanych kropli. Testy przeprowadzono w rozcieńczeniu 1:2 i porównano z wynikami nierozcieńczonego układu emulsji olej-woda. W przypadku obu podejść średnie średnice Sautera zostały wiarygodnie zmierzone (odchylenie standardowe poniżej 5%). W związku z tym zmniejszona frakcja objętościowa (rozcieńczenie 1:2) nie miała wpływu na zmierzone średnie średnice Sautera, a zatem rozpad kropla-kropla był znikomy.
Te potężne podejścia eksperymentalne stanowią dobrą podstawę do ulepszenia techniki endoskopii, a także powiązanego oprogramowania do akwizycji, rozpoznawania i analizy wyników. Ponadto z powodzeniem wykazano przydatność techniki endoskopii do klasyfikowania typów i serii pomp w zależności od ich naprężeń mechanicznych. Uzyskane wyniki są niezbędne do opracowania konstrukcji pomp i optymalizacji pomp w celu zmniejszenia uszkodzeń ogniw.
Wolfgang Dornfeld i Reto Schöb są pracownikami firmy Levitronix, Ltd., producenta pomp odśrodkowych MagLev.
Autorzy chcieliby podziękować Komisji ds. Technologii i Innowacji (CTI, Szwajcaria) za wsparcie finansowe (nr 13236.1 PFFLI-LS).
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kamera CCD | Allied Vision Technologies GmbH | GX2750 | Sprzęt do endoskopii inline |
| C-Flex Rurki biofarmaceutyczne | Saint-Gobain Performance Plastics | 374-375-4 | Rurka Wybierz długość rurki około 45 cm przed pompą. |
| Rurki biofarmaceutyczne C-Flex | Saint-Gobain Performance Plastics | 374-375-3 | Rurka Wybierz długość rurki około 45 cm za pompą i zacisk na czujniku przepływu do tej rurki. |
| Złącze CLAVE | Victus | 011-C2000 | Port próbkowania |
| Kontroler LPC-200.1-02 | Levitronix GmbH | 100-30030 | Sterownik PuraLev 200MU |
| Kontroler LPC-600.1-02 | Levitronix GmbH | 100-30033 | Sterownik PuraLev 600MU |
| Czujnik zaciskowy LeviFlow LFSC-12 | Levitronix GmbH | 100-30329 | Czujnik przepływu dla natężeń przepływu poniżej 5 L min-1 |
| LeviFlow Konwerter LFC-1C-CS | Levitronix GmbH | 100-30328 | Urządzenie wyjściowe czujnika przepływu |
| Masterflex I/P Easy Load | Fisher Scientific AG | EW-77963-10 | Pompa perystaltyczna |
| Zawór swobodnego przepływu | Mitos Parker Hannifin Europe Sà rl | FFLQR16S6S6AM | Zawór |
| Mobil Eal Arctic | Exxon Mobil Corporation | Mobil EAL Arctic 22 | Oil Przygotować emulsję bezpośrednio przed eksperymentem. |
| Silnik | Elektromotorenwerk Brienz AG | 7WAC72N4THTF | Silnik do wału mieszadła |
| Silnik BSM-1.4 | Levitronix GmbH | 100-10005 | Silnik PuraLev 200MU |
| Silnik LPM-600.4 | Levitronix GmbH | 100-10038 | Silnik PuraLev 600MU |
| Norm-Ject 10 ml Luer Lock | Restek Corporation | 22775 | strzykawkowej |
| LPP-200.5 | Levitronix GmbH | 100-90525 | Głowica pompy PuraLev 200MU |
| Głowica pompy LPP-600.18 | Levitronix GmbH | 100-90548 | Głowica pompy PuraLev 600MU |
| Quattroflow 1200-SU | Almatechnik AG | QF 1200 | 4-tłokowa pompa membranowa |
| SciPres Sensor | SciLog | 080-695PSX | Czujnik |
| SciPres Sensor Monitor | SciLog | 080-690 | Urządzenie wyjściowe czujnika ciśnienia |
| Sonda endoskopowa SOPAT-VF Inline | SOPAT GmbH | Endoskopia inline | |
| Stroboskop | Drello GmbH & Co KG | Drelloscop 255-01 | Sprzęt do endoskopii inline |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Surfaktant Handle z rękawicami i okularami. (ostra toksyczność, podrażnienie oczu) |
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie