Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Podsumowanie

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Streszczenie

Aktywności elektrycznej w mózgu towarzyszą znaczne strumienie jonów przez błony, co powoduje złożone zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu wszystkich głównych jonów. Ponieważ te przesunięcia jonów mają znaczące konsekwencje funkcjonalne, ich ilościowe określenie jest często wymagane do zrozumienia funkcji i dysfunkcji sieci neuronowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. W niniejszym badaniu demonstrujemy wytwarzanie i kalibrację dwulufowych mikroelektrod jonoselektywnych, które okazały się doskonałymi narzędziami do takich pomiarów w tkance mózgowej. Ponadto opisano tak zwane "koncentryczne" mikroelektrody jonoselektywne, które, w oparciu o swoją odmienną konstrukcję, oferują znacznie lepszą rozdzielczość czasową szybkich zmian jonów. Następnie pokazujemy, w jaki sposób te elektrody mogą być wykorzystane w ostrym przygotowaniu wycinków mózgu w hipokampie myszy. Za pomocą dwulufowych, selektywnych mikroelektrod potasowych wykazano zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu potasu ([K⁺]_o) w odpowiedzi na egzogenne zastosowanie agonistów receptora glutaminianu lub podczas aktywności padaczkowej. Ponadto ilustrujemy charakterystykę odpowiedzi elektrod wrażliwych na sód, dwulufowych i koncentrycznych oraz porównujemy ich wykrywanie zmian w zewnątrzkomórkowym stężeniu sodu ([Na⁺]_o) wywołanych kąpielą lub ciśnieniowym zastosowaniem leków. Pomiary te pokazują, że chociaż amplitudy odpowiedzi są podobne, koncentryczne mikroelektrody sodowe wykazują lepszy stosunek sygnału do szumu i czas reakcji w porównaniu z konstrukcją dwulufową. Ogólnie rzecz biorąc, zademonstrowane procedury będzie można łatwo przenieść do pomiaru innych gatunków jonów, w tym pH czy wapnia, a także będą miały zastosowanie do innych preparatów.

Wprowadzenie

Sygnalizacja elektryczna w mózgu opiera się na przepływie jonów przez błony plazmatyczne. Główne ruchy jonów do i z przestrzeni zewnątrzkomórkowej są nie tylko pośredniczone przez przejście przez kanały jonowe bramkowane napięciem, ale także przez postsynaptyczne receptory jonotropowe, a także transportery jonów. Aktywności neuronalnej towarzyszą zatem złożone zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu wszystkich głównych jonów ¹. Na przykład wykazano, że napływ sodu do neuronów podczas aktywności pobudzającej powoduje spadek zewnątrzkomórkowego stężenia sodu ([Na⁺]_o) ². To samo dotyczy zewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, ponieważ jony wapnia szybko wnikają zarówno do struktur pre-, jak i postsynaptycznych ³. W tym samym czasie potas porusza się w przeciwnym kierunku, co pośredniczy we wzroście zewnątrzkomórkowego stężenia potasu ([K⁺]_o) w niskim zakresie mM ^4,5. Aktywność synaptyczna powoduje również zmiany w pH zewnątrzkomórkowym, które są częściowo łagodzone przez współistniejące strumienie błony glejowej, które zmieniają pH wewnątrzglejowe ^6,7. Te związane z aktywnością zmiany w stężeniach jonów zewnątrzkomórkowych mają znaczące konsekwencje funkcjonalne. Na przykład, nawet niewielki wzrost [K⁺]_o depolaryzuje neurony, a także komórki glejowe, zmieniając w ten sposób pobudliwość neuronów, a istnieje kilka mechanizmów usuwania nadmiaru potasu ⁸. Ich niepowodzenie może skutkować epileptyczną aktywnością neuronów lub zjawiskami takimi jak rozprzestrzenianie się depresji ¹.

Ze względu na ich krytyczne znaczenie, ilościowe określenie stężeń jonów zewnątrzkomórkowych jest często konieczne i wymagane do zrozumienia funkcji i dysfunkcji sieci neuronowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Przez dziesięciolecia dwulufowe mikroelektrody jonoselektywne okazywały się doskonałymi narzędziami do takich pomiarów w tkance mózgowej ⁹. Dla wielu jonów dostępne są wysoce specyficzne czujniki o niskiej reaktywności krzyżowej dla innych jonów. Oprócz klasycznych elektrod dwulufowych wprowadzono ostatnio tak zwane elektrody koncentryczne. Te ostatnie zapewniają lepszą rozdzielczość czasową, ale wymagają trochę więcej czasu i wysiłku, aby zbudować ¹⁰.

W dalszej części opiszemy przygotowanie i kalibrację tych dwóch typów mikroelektrod jonoselektywnych. Następnie pokazujemy, w jaki sposób elektrody te mogą być wykorzystane w przygotowaniach do wycinków mózgu do pomiaru zmian w [K⁺]_o lub [Na⁺]_o wywołanych aktywnością pobudzającą zgodnie z różnymi paradygmatami stymulacji, w tym kąpielą i uciskiem leków.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Heinricha Heinego w Düsseldorfie (Niemcy), a także z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich (86/609/EWG). Wszystkie eksperymenty zostały zgłoszone do Biura Dobrostanu Zwierząt w Ośrodku Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Heinricha Heinego w Düsseldorfie (Niemcy) i uzyskały jego zatwierdzenie (numer aktu instytucjonalnego: O52/05). Zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (Tierschutzgesetz, artykuły 4 i 7), nie było wymagane formalne dodatkowe zezwolenie na pobranie tkanki mózgowej po śmierci.

1. Przygotowanie dwukanałowych mikroelektrod jonowo-selektywnych

1. Przygotować dwie kapilary szklane borokrzemowe z włóknem: jedną o długości 7,5 cm i średnicy zewnętrznej 1,5 mm, która posłuży jako rurka czuła na jony, oraz drugą o długości 6,5 cm i średnicy zewnętrznej 1,0 mm, która posłuży później jako rurka referencyjna.
2. Myć kapilary w acetonie przez 12 hr, a następnie kilkakrotnie przepłukać absolutnym etanolem i pozostawić do wyschnięcia. Elektrody można teraz przechowywać w eksykatorem.
3. Użyć kleju dwuskładnikowego lub małego paska folii aluminiowej, aby przymocować do siebie długą i krótką kapilarę na obu końcach. Podgrzewać taką podwójną kapilarę w piecu w temperaturze 60 °C przez 1 hr. Przyspieszy to proces utwardzania. Elektrody przechowywać teraz w eksykatorem.
4. Ustawić podwójną kapilarę centralnie w pionowej wyciągarce z obrotowym uchwytem. Delikatnie nagrzewać cewkę, aż szkło stanie się wystarczająco miękkie, aby umożliwić poziomy obrót uchwytu o 180°. Podczas tego kroku zapobiegać wydłużaniu się kapilary, stosując blokadę pod uchwytem.
5. Po ochłodzeniu usunąć blokadę mechaniczną i zastosować drugi protokół podgrzewania w celu wyciągnięcia kapilary, co pozwoli uzyskać dwie ostre kapilary dwukanałowe (Rysunek 1). Średnica końcówki jednej podwójnej kapilary powinna wynosić około 1 µm.

Rysunek 1. Budowa mikroelektrod selektywnych jonowo. (A) Zdjęcie mikroelektrody dwukanałowej. W celu ilustracji i lepszej widoczności ciecz w kanale odniesienia została zabarwiona. (B) Zdjęcie mikroelektrody koncentrycznej oraz odpowiadającej jej elektrody odniesienia. Po lewej stronie pokazano powiększenie końcówki mikroelektrody koncentrycznej. Na zdjęciach (A) i (B) obszar zajmowany przez czujnik jonowy w końcówkach pipet został pokolorowany w obróbce. Na dole schematycznie przedstawiono układ końcówek obu typów elektrod. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Jeśli pionowy wyciągacz z obrotowym uchwytem nie jest dostępny, przygotuj dwukanałową mikroelektrodę jonoselektywną w wyciągaczu poziomym, używając szkła theta.
   1. W tym celu wyciągnij szkło theta (średnica zewnętrzna 1,5 mm, długość 7,5 cm) tak, aby uzyskać dwie elektrody z dwoma kanałami każda. Zaznacz jeden z nich, który będzie pełnił funkcję przyszłego kanału referencyjnego. Pozostały kanał poddaj silanizacji zgodnie z procedurą opisaną poniżej, aby służył jako przyszły kanał jonoselektywny.
      UWAGA: Chociaż przygotowanie dwukanałowych elektrod ze szkła theta jest znacznie łatwiejsze niż przygotowanie skręcanych elektrod dwukanałowych, są one bardziej podatne na interferencję pomiędzy kanałami, ponieważ cienka szklana ścianka oddzielająca oba kanały ma tendencję do bycia porowatą w samym czubku.
      UWAGA: Ponieważ koktajl sensoryczny (patrz poniżej) jest hydrofobowy, wewnętrzna powierzchnia późniejszego kanału jonoselektywnego musi zostać również uczyniona hydrofobową poprzez proces zwany silanizacją. W tym celu stosuje się heksametylodysilazan (HMDS) (Rysunek 2), zgodnie z opisem w następnym kroku.

Rycina 2. Silanizacja pipet. (A) Heksametylodisilazan (HMDS) reaguje z grupami Si-OH wewnętrznej powierzchni szkła, nadając jej właściwości hydrofobowe. (B) Zdjęcie po lewej przedstawia całą jednostkę do silanizacji. Butelka o szerokim wlewie zawierająca HMDS została umieszczona na płycie grzewczej ustawionej na 40 °C. Na szczycie butelki zamontowano uchwyt (PH) utrzymujący kapilary (Cap). Zdjęcie po prawej przedstawia powiększenie uchwytu pipet (PH) z kapilarami (Cap). (C) Schematyczny widok z boku wykonanych na zamówienie uchwytów pipet (PH) dla kapilar dwukanałowych (lewo) lub koncentrycznych (prawo) zamontowanych na butelce o szerokim wlewie. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

7. Tuż przed wyciąganiem elektrod nalać ok. 20 ml HMDS do butelki z szerokim otworem. Uwaga: HMDS należy stosować wyłącznie w dygestorium, ponieważ jego opary są szkodliwe dla zdrowia! Zamknąć butelkę i postawić ją na płycie grzejnej ustawionej na 40 °C. Rozgrzać piec, również umieszczony w dygestorium, do 200 °C.
8. Napełnić kapilarę referencyjną do samego wierzchołka wodą destylowaną, aby zapobiec jej silanizacji podczas następnej procedury.
9. Umieścić kapilarę dwukanałową wierzchołkiem do góry w specjalnym, wykonanym na zamówienie uchwycie (Rysunek 2B, 2C). Tępy, otwarty koniec musi swobodnie przechodzić przez dno uchwytu (Rysunek 2C, lewa strona). Następnie umieścić ten uchwyt na butelce z szerokim otworem zawierającej uprzednio podgrzany HMDS na 70 min.
   UWAGA: Należy upewnić się, że opary HMDS mogą swobodnie przepływać przez kapilary. Podczas jednego procesu silanizacji 20 ml HMDS nie odparowuje całkowicie, zatem butelka może być wykorzystana wielokrotnie.
10. Następnie przenieść kapilary na metalowy stojak i do rozgrzanego pieca na dwie godziny. Pozwoli to na wysuszenie obu kanałów.
11. Po silanizacji przechowywać kapilary w stanie suchym do momentu użycia. Choć powyższa procedura trwa łącznie około 3,5 godz., elektrody mogą być teraz przechowywane w eksykatorem przez kilka tygodni.
12. W dniu planowanego eksperymentu przygotować elektrody jonoselektywne, napełniając wierzchołek silanizowanego kanału 1-2 µl sensora jonoselektywnego (Rysunek 1A). W przypadku mikroelektrod czułych na potas należy użyć walinomycyny jako nośnika, a w przypadku mikroelektrod czułych na sód — ETH 157 jako nośnika.
13. Należy zwrócić uwagę, że sensor jonoselektywny jest dość lepki, co utrudnia prawidłowe napełnienie wierzchołka.
14. Napełnić kanał referencyjny solą fizjologiczną buforowaną HEPESem (patrz poniżej).
    UWAGA: Choć można by użyć innej, prostszej izoosmotycznej soli fizjologicznej, preferujemy stosowanie soli o składzie zasadniczo podobnym do soli perfuzyjnej (ACSF, patrz 3.6.), ponieważ może ona wyciekać i przenikać do tkanki podczas eksperymentów. Dlatego kluczowe jest również, aby ta sól nie zawierała wyższego stężenia jonu poddawanego oznaczeniu niż stosowana ACSF.
15. Wypełnić sensor od tyłu solą zawierającą wysokie stężenie wykrywanego jonu. W ten sposób napełnić sensor solą 100 mM NaCl (dla mikroelektrod czułych na sód) lub 100 mM KCl (dla mikroelektrod czułych na potas). Należy uważać, aby podczas tej procedury nie wprowadzić dodatkowych pęcherzyków powietrza.
16. Jeśli silanizacja przebiegła pomyślnie i sensor został prawidłowo napełniony, na powierzchni sensora, w kontakcie z wypełnieniem tylnym, powinna utworzyć się wyraźnie widoczna powierzchnia wklęsła (Rysunek 1A). W przeciwnym razie sensor mógł cofnąć się od ścianki kapilary i wierzchołek nie zostanie napełniony. Takie elektrody nie będą funkcjonalne.
17. Wprowadzić chlorowane druty srebrne do obu kanałów (uważając, aby nie dotknąć sensora) i uszczelnić każdy kanał woskiem dentystycznym (Rysunek 1A).

2. Przygotowanie koncentrycznych mikroelektrod jonoselektywnych

1. W przypadku zewnętrznej rurki należy zastosować cienkościenne kapilary szklane z włóknem (średnica zewnętrzna 2,0 mm) o długości 7,5 cm. W przypadku rurki wewnętrznej należy użyć cienkościennych kapilar z włóknem o średnicy zewnętrznej 1,2 mm i długości 10 cm.
2. Kapilary należy myć w acetonie przez 12 h, a następnie kilkakrotnie przepłukać absolutnym etanolem i pozostawić do wyschnięcia. Elektrody można teraz przechowywać w eksykatorze.
3. Do butelki z szerokim otworem należy wlać ok. 20 ml HMDS. UWAGA! HMDS należy stosować wyłącznie w dygestorium, ponieważ jego opary są szkodliwe dla zdrowia. Butelkę należy zamknąć i postawić na płycie grzewczej ustawionej na 40 °C. Piec, również umieszczony w dygestorium, należy wstępnie rozgrzać do 200 °C.
4. Kapilarę 2,0 mm należy włożyć do poziomego wyciągacza i wyciągnąć tak, aby otrzymać kapilary z krótkimi zwężeniami i średnicą końcówki ok. 4 µm (Ryc. 1B).
5. Wyciągniętą kapilarę 2,0 mm należy umieścić końcówką do góry w specjalnym uchwycie (Ryc. 2B, Ryc. 2C) w taki sposób, aby tępy koniec otwierał się do wnętrza butelki (Ryc. 2C, po prawej). Następnie uchwyt ten należy umieścić na butelce z szerokim otworem zawierającej wstępnie podgrzany HMDS na 70 min. Należy upewnić się, że opary HMDS mogą przepływać przez wszystkie kapilary.
6. Następnie kapilary należy przenieść na metalowy stojak i umieścić w rozgrzanym piecu na dwie godziny.
7. Po silanizacji kapilary należy przechowywać w suchym miejscu do momentu użycia. Choć powyższa procedura trwa łącznie około 3,5 h, elektrody można teraz przechowywać w eksykatorze przez kilka tygodni.
8. Bezpośrednio przed użyciem do silanizowanej kapilary należy wlać niewielką ilość sensora (0,2 µl) (Ryc. 1B).
9. Aby przygotować kapilarę wewnętrzną, należy włożyć do wyciągacza kapilarę o małej średnicy i wyciągnąć ją tak, aby otrzymać dwie kapilary z długimi zwężeniami i ostrymi końcówkami (Ryc. 1B). Należy je napełnić roztworem soli 100 mM NaCl (mikroelektrody czułe na sód) lub 100 mM KCl (mikroelektrody czułe na potas).
10. Kapilarę wypełnioną sensorem oraz kapilarę wypełnioną roztworem soli należy umieścić w jednej linii na specjalnym korku wykonanym z szkiełek nakrywkowych. Mniejszą kapilarę należy wsunąć na niewielką odległość do większej kapilary.
11. Kapilary należy przymocować do innego szkiełka nakrywkowego za pomocą plasteliny, przenieść na stolik mikroskopu i zobrazować przy powiększeniu 100x. Za pomocą szklanego pręta zamontowanego na mikromanipulatorze oraz obracając mikrometryczną śrubą stolika mikroskopu, należy powoli przesuwać kapilarę zewnętrzną nad kapilarą wewnętrzną, aż odległość między ich końcówkami wyniesie około 5 µm (Ryc. 1B).
12. Otwarty koniec kapilary zewnętrznej należy przymocować do kapilary wewnętrznej za pomocą wosku dentystycznego. Alternatywnie, zamiast wosku można nanieść małą kroplę cyjanoakrylanu (Kropelka).
    UWAGA: Dodanie małej kropli wody spowoduje polimeryzację kleju i unieruchomienie elektrod. Do rurki wewnętrznej należy wsunąć chlorowany drut srebrny i uszczelnić go woskiem dentystycznym (Ryc. 1B).
13. Aby przygotować elektrodę odniesienia, należy wziąć kapilarę z włóknem o długości 7,5 cm i średnicy zewnętrznej 1,5 mm i wyciągnąć ją w wyciągaczu pionowym. Należy dopilnować, aby końcówki były stosunkowo długie, ale nie zbyt ostre (średnica końcówki ~1 µm).
14. Należy odrzucić górną pipetę, otworzyć dolny zacisk i unieść dolną pipetę o około 5 mm. Ponownie zamknąć zacisk i unosić go, aż końcówka dolnej elektrody znajdzie się około 5 mm nad grzałką. Należy rozgrzać grzałkę i za pomocą pęsety zgiąć końcówkę o około 45° na bok. Następnie należy obniżyć pipetę o około 1-2 mm i ponownie zgiąć ją o około -45°, aby skierować końcówkę z powrotem równolegle do głównego trzonu (Ryc. 1B). Procedura ta jest niezbędna, aby umożliwić bliskie ustawienie końcówki elektrody odniesienia względem elektrody koncentrycznej.
15. Rurkę odniesienia należy wypełnić roztworem soli buforowanym HEPES (patrz poniżej), wsunąć chlorowany drut srebrny i uszczelnić rurkę woskiem dentystycznym (Ryc. 1B).

3. Roztwory soli

1. Przygotować roztwór soli do napełnienia elektrod czułych na potas (patrz pkt 1.15.) o stężeniu 100 mM KCl. Roztwór soli do napełnienia elektrod czułych na sód składa się ze 100 mM NaCl.
2. Przygotować roztwór soli do napełnienia kapilar referencyjnych (roztwór soli buforowany HEPES, patrz pkt 1.16.) w składzie (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 2 MgSO₄, 1,25 NaH₂PO₄ oraz 25 HEPES, mianowany NaOH do uzyskania pH 7,4.
3. Przygotować roztwory soli do kalibracji elektrod czułych na potas, składające się z 25 mM HEPES oraz łącznie 150 mM NaCl i KCl, z pH skorygowanym do 7,4 za pomocą NMDG-OH (N-metylo-D-glukaminy). W tym przypadku kalibrację przeprowadzano przy użyciu roztworów soli zawierających 1, 2, 4 lub 10 mM KCl; ACSF zawierał 2,5 mM KCl (Rycina 5).
4. Przygotować roztwór soli do kalibracji elektrod czułych na sód w następujący sposób: (w mM) 25 HEPES, 3 KCl, łącznie 160 NaCl i NMDG-Cl, pH skorygowane do 7,4 za pomocą NMDG-OH. Kalibrację przeprowadzić przy użyciu roztworu soli zawierającego (w mM) 70, 100, 130 lub 160 NaCl; ACSF zawierał 152 NaCl (Rycina 6).
5. W celu oznaczenia reakcji krzyżowej sensora z innymi jonami, np. pH, przygotować dodatkowe kalibracyjne roztwory soli o stałych stężeniach jonów, ale zmiennym pH.
   UWAGA: Chociaż procedura ta nie została przedstawiona w niniejszym badaniu, należy odnieść się do wcześniejszych prac podejmujących ten problem (np. ^11,12).
6. Przygotować świeże skrawki tkanki mózgowej w roztworze soli w składzie (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 6 MgCl₂, 1,25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃ oraz 20 glukozy, napowietrzanym mieszaniną 95% O₂ i 5% CO₂, co daje pH 7,4.
7. Doświadczenia na skrawkach mózgu przeprowadzić w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) w składzie (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 1,25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃ oraz 20 glukozy, napowietrzanym mieszaniną 95% O₂ i 5% CO2, co daje pH 7,4.
8. Do stymulacji neuronów i komórek glejowych przygotować roztwory zawierające 0,2, 0,3, 0,4 lub 0,5 mM glutaminianu lub 10 mM L-asparaginianu rozpuszczonego w ACSF. Do aplikacji ciśnieniowej rozpuścić 10 mM glutaminianu w roztworze soli buforowanym HEPES.
9. Przygotować pipetę aplikacyjną do aplikacji ciśnieniowej. Cienkościenne kapilary szklane z filamentem (średnica zewnętrzna 2,0 mm) o długości 7,5 cm wprowadzić do poziomego wypalacza i wyciągnąć tak, aby średnica końcówki wynosiła ~ 1 µM.
10. Do indukcji aktywności epileptiformnej przygotować ACSF pozbawiony magnezu, zawierający 10 µM metjodku bikukuliny.
11. Aby zahamować generowanie potencjałów czynnościowych, przygotować 10 mM roztwór zapasu tetrodotoksyny (TTX) w wodzie destylowanej. Podczas eksperymentów TTX dodaje się bezpośrednio do ACSF do uzyskania stężenia końcowego 0,5 µM.
12. Aby zapobiec aktywacji receptorów AMPA, przygotować 50 mM roztwór zapasu cyjano-nitrochinoksalin-dionu (CNQX) w dimetylosulfoksydzie (DMSO). Podczas eksperymentów dodaje się go bezpośrednio do ACSF do uzyskania stężenia końcowego 100 µM.
13. Aby zablokować aktywację receptorów NMDA, przygotować 50 mM roztwór zapasu aminofosfonopentanianu (APV) w 70 mM NaHCO₃. Podczas eksperymentów dodaje się go bezpośrednio do ACSF do uzyskania stężenia końcowego 100 µM.

4. Kalibracja mikroelektrod jonoselektywnych

1. Kalibrować mikroelektrodę jonowo-selektywną bezpośrednio przed i po każdym eksperymencie.
2. Przymocować elektrody do mikromanipulatorów i wprowadzić je do komory eksperymentalnej perfundowanej ACSF, umieszczonej pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 3, 4). Umieścić elektrodę odniesienia w przedkomorze (Rysunek 4A, B). Włączyć perfuzję kąpieli, upewniając się, że przepływ wynosi około 2 ml/min.

Rycina 3. Przestrzeń robocza eksperymentu. Stanowisko rejestracyjne składa się z stołu wibroizolacyjnego, na którym znajduje się stolik translacyjny x/y z kąpielą eksperymentalną, mikromanipulatory oraz stereomikroskop z wysokiej jakości optyką. Stereomikroskop jest również wyposażony w kamerę CCD do celów dokumentacji. Dodatkowo zastosowano urządzenie do aplikacji ciśnieniowej w celu ogniskowego podawania leku. Elektrody rejestrujące są połączone za pomocą przedwzmacniacza głowicowego z wzmacniaczem różnicowym. Zdigitalizowane dane (przetwornik A/D) są rejestrowane za pomocą komputera. Perfuzja kąpieli jest realizowana przez mikro pompę perystaltyczną (nie pokazano). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

3. Włącz przetwornik A/D, wzmacniacz różnicowy oraz komputer, a następnie uruchom oprogramowanie do rejestracji danych (Rycina 3, 4). Ze względu na bardzo wysoką rezystancję beczek wrażliwych na jony (10-20 GΩ; patrz poniżej), należy zastosować specjalny wzmacniacz elektrometryczny o wysokiej impedancji wejściowej (R_in= 10 TΩ) i małym prądem polaryzacyjnym (I_bias= 50 fA - 1 pA).

Rysunek 4. Projekt elektroniczny i przestrzenny układu eksperymentalnego. (A) Schematyczna budowa układu rejestracyjnego. Końcówki mikroelektrody dwukanałowej (niebieska) i mikroelektrody koncentrycznej (czerwona) znajdują się w kąpieli eksperymentalnej wypełnionej solą fizjologiczną. Schematycznie zaznaczono elektrodę odniesienia kąpieli. Potencjał wykrywany przez kanały selektywne jonowo (V₁) składa się z potencjału pola elektrycznego (V_ref) i potencjału jonowego (V_ion), podczas gdy kanały odniesienia (V₂) wykrywają tylko V_ref. Aby wyizolować V_ion, V_ref jest odejmowany od V₁ za pomocą wzmacniacza różnicowego (D.A.). (B) Topografia stanowiska eksperymentalnego z zainstalowaną mikroelektrodą koncentryczną. Centrum stanowiska eksperymentalnego stanowi kąpiel eksperymentalna zawierająca preparat skrawka tkankowego. W celu uziemienia kąpieli, elektroda odniesienia kąpieli jest zanurzona w przedkomorze, w której znajduje się również wlot perfuzyjny. Samo stanowisko jest uziemione za pomocą osobnego złącza uziemiającego. Mikroelektroda koncentryczna oraz jej elektroda odniesienia są zamocowane w osobnych uchwytach do pipet sterowanych przez mikromanipulatory. Mikroelektroda i elektroda odniesienia są sprzężone elektronicznie z przedwzmacniaczem głowicowym wzmacniacza. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

4. Podłącz srebrne druty chlorkowane do odpowiednich wejść przedwzmacniacza wzmacniacza różnicowego (Rysunek 4). Wyznacz oporności elektrod. Upewnij się, że oporność kapilary referencyjnej mieści się w zakresie 30-100 MΩ, a oporność kapilary czułej na jony w zakresie 10-20 GΩ.
5. Wyzeruj sygnały napięcia i rozpocznij pomiar.
6. Należy pamiętać, że potencjał wykrywany przez kapilary selektywne jonowo (V₁) składa się z potencjału elektrycznego pola (V_ref) oraz potencjału jonowego (V_ion), podczas gdy kapilary referencyjne (V₂) wykrywają jedynie V_ref. Aby wyizolować V_ion, wartość V_ref jest odejmowana od V₁ za pomocą wzmacniacza różnicowego (D.A.) (Rysunek 4A).
7. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej przełącz się na roztwory kalibracyjne zawierające określone stężenia mierzonego jonu.
   UWAGA: Rysunek 5A przedstawia kalibrację dwukanałowej mikroelektrody czułej na potas. Na Rysunku 6A pokazano kalibrację zarówno dwukanałowej, jak i koncentrycznej mikroelektrody czułej na Na⁺. Choć nie opisujemy tutaj tej procedury, należy pamiętać, że przed użyciem konkretnego jonoforu należy sprawdzić możliwe interferencje z innymi jonami (patrz również 3.4.).

Rysunek 5. Kalibracja dwukanałowych mikroelektrod selektywnych wobec potasu.(A) Zmiana napięcia kanału referencyjnego (V_ref) oraz potencjału K⁺ (V_K+) w odpowiedzi na wskazane zmiany stężenia K⁺ w kąpieli ([K⁺]_b). (B) Półlogarytmiczny wykres [K⁺]_b w funkcji V_K+. Liniowy wykres danych wykazuje nachylenie wynoszące około 56 mV. W celach ilustracyjnych przebiegi zostały wygładzone filtrem Sawitzky-Golay (szerokość 20). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Wyznacz odpowiedź napięciową tubulki selektywnej wobec jonów w odpowiedzi na znaną zmianę stężenia jonów. Przedstaw dane na pojedynczym wykresie logarytmicznym (Rysunek 5B, 6B) i wyznacz nachylenie. Idealny sensor spełnia zależność opisaną równaniem Nernsta (patrz np. ¹³):

V: zmierzony potencjał elektrody;
V₀: standardowy potencjał elektrody, np. dla drutu AgCl w temperaturze 298.15 K i ciśnieniu parcjalnym 101.325 kPa (absolutnym)
R: stała gazowa (8.314 dżuli/stopień Kelvina/mol)
T: temperatura bezwzględna (w Kelvinach)
z: ładunek jonu (+ 1 dla potasu i sodu)
F: stała Faradaya (96.500 kulombów)
c’: pozakomórkowe stężenie jonów
c’’: wewnątrzkomórkowe stężenie jonów

W celach praktycznych logarytmy naturalne są przeliczane na nachylenie Nernsta s, które jest następnie aktualne dla danego jonu i temperatury:

UWAGA: W przypadku elektrod potasowych i sodowych idealna odpowiedź napięciowa czujnika wykazuje zatem liniowy nachylenie wynoszące około -58 mV w temperaturze pokojowej. Dopuszczalne jest pewne odchylenie od tej wartości (Rysunek 5B, 6B). Niezbędne jest jednak, aby charakterystyka odpowiedzi danej elektrody nie zmieniała się znacząco (o więcej niż 10%, patrz poniżej) przed i po eksperymencie.

Rysunek 6. Kalibracja mikroelektrod selektywnych wobec sodu i porównanie elektrod dwukanałowych z koncentrycznymi. (A) Górne przebiegi: Zmiana napięcia kanałów referencyjnych (V_ref) elektrody dwukanałowej (czarna kropkowana linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) w odpowiedzi na wskazane zmiany stężenia Na⁺ w kąpieli ([Na⁺]_b). Zauważmy, że odpowiedzi napięciowe obu elektrod są praktycznie identyczne. Dolne przebiegi: Zmiany napięcia potencjału Na⁺ (V_Na+) elektrody dwukanałowej (czarna linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) w odpowiedzi na zmiany [Na⁺]_b. (B) Wykresy półlogarytmiczne zależności [Na⁺]_b od V_Na+ dla obu elektrod. Linearne wykresy danych wykazują nachylenie wynoszące około 48 mV dla obu elektrod. (C) Odpowiedź V_Na+ elektrody dwukanałowej (czarna linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) na szybką zmianę [Na⁺]_b z 152 mM do 70 mM. Zauważmy, że czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej jest znacznie krótszy. W celach ilustracyjnych przebiegi zostały wygładzone filtrem Sawitzky-Golay (szerokość 20). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

9. Wyznaczyć czas odpowiedzi elektrod, który zależy od średnicy końcówki, kształtu końcówki oraz grubości fazy sensora w końcówce elektrody.
   UWAGA: W tej konfiguracji eksperymentalnej i przy zastosowaniu szybkiej zmiany różnych soli perfuzyjnych (wymiana zakończona w końcówce elektrody w ciągu 500 msec), dwukanałowe mikroelektrody wrażliwe na sod zmieniły potencjał na stabilny w ciągu 9,7 ± 4,5 sec podczas przełączania z 152 mM na 70 mM [Na⁺] (n=6). W tych samych warunkach koncentryczne mikroelektrody wrażliwe na sod osiągnęły stabilny potencjał w ciągu zaledwie 0,8 ± 0,3 sec (n=6) (Rycyna 6C). Podkreśla to wyższą rozdzielczość czasową mikroelektrod koncentrycznych w porównaniu do dwukanałowych.

5. Disekcja tkanki

1. W celu przygotowania świeżych przekrojów, myszy w wieku od 16. do 20. dnia po urodzeniu znieczulono CO₂, a następnie szybko zdekapitowano (zgodnie z zaleceniem Komisji Europejskiej opublikowanym w: Euthanasia of experimental animals, Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 1997; ISBN 92–827-9694-9).
2. Przygotowano przekroje tkanki hipokampa (grubość 250 µm), stosując standardową procedurę (patrz np. ¹⁴).

6. Procedury eksperymentalne

1. Przenieś skrawek do komory eksperymentalnej i przymocuj go za pomocą siatki.
2. Obniż skalibrowaną mikroelektrodę jonoselektywną na powierzchnię skrawka i wprowadź ją do stratum radiatum obszaru CA1 na głębokość około 50 µm.
   UWAGA: Dotknięcie powierzchni skrawka mikroelektrodą powoduje charakterystyczne fluktuacje w czujniku jonowym. Ponadto uszkodzenia komórek podczas wprowadzania elektrody do tkanki również wywołują fluktuacje. Odczekaj do czasu stabilizacji linii bazowej.
3. W przypadku aplikacji agonistów przekaźników pod ciśnieniem, napełnij pipetę aplikacyjną związkiem (np. 0,5 mM glutaminianu). Przymocuj pipetę do mikromanipulatora i podłącz ją do urządzenia do aplikacji ciśnieniowej.
4. Wprowadź pipetę aplikacyjną do tkanki i ostrożnie umieść ją w pobliżu końcówki mikroelektrody jonoselektywnej (~20-40 µm). Rozpocznij aplikację ciśnieniową (np. 10 s, 40 mbar) i rejestruj zmiany napięcia monitorowane przez mikroelektrodę jonoselektywną.
5. W przypadku aplikacji leków do kąpieli, przełączaj pomiędzy różnymi roztworami soli perfuzyjnymi przez określony czas.
6. Aby zakończyć eksperyment, ostrożnie wycofaj mikroelektrodę jonoselektywną z tkanki i zarejestruj wszelkie dryfty potencjałów od pierwotnej wartości zerowej, które mogły wystąpić podczas długotrwałych okresów rejestracji.
7. Wyjmij preparat skrawka z kąpieli i przeprowadź drugą kalibrację mikroelektrody jonoselektywnej.
   UWAGA: Jest to konieczne, ponieważ końcówka elektrody może zostać zatkana podczas przemieszczania się przez tkankę. Należy zatem upewnić się, że elektroda nadal prawidłowo reaguje na zmiany stężeń jonów. Eksperymenty należy odrzucić, jeśli odpowiedź elektrody na dziesięciokrotną zmianę stężenia jonów spadła o więcej niż 10%. Dobrze działające elektrody mogą co do zasady być ponownie wykorzystane w kilku eksperymentach. Dotyczy to zwłaszcza elektrod koncentrycznych, które mogą wytrzymać nawet kilka dni. Niezbędne jest jednak powtarzanie procedur kalibracyjnych przed i po każdym pojedynczym eksperymencie, aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie elektrod.

7. Analiza danych

1. Aby przeliczyć odpowiedź napięciową elektrody jonoselektywnej na zmiany stężenia jonów pozakomórkowych, w pierwszej kolejności należy przekształcić równanie 2, aby wyznaczyć zmianę potencjału ΔV_ion (mV) w następujący sposób (zademonstrowano tutaj dla elektrod czułych na K⁺, analogiczna procedura obowiązuje dla elektrod czułych na Na⁺):

V_K+: zmiany potencjału kanału walinomycynowego (mV)

s: nachylenie krzywej Nernsta

K⁺]_B: stężenie bazowe potasu (w naszym przypadku 2.5 mM K⁺)

K⁺]_o: zmiany [K⁺]_o podczas eksperymentu

2. Oblicz średnią arytmetyczną nachyleń wyznaczonych z pojedynczych wykresów logarytmicznych kalibracji przed i po eksperymencie (por. rycina 5B, 6B; patrz punkt 4.8), aby wyznaczyć wartość „s”.
3. Aby obliczyć zmiany [K⁺]_o (Δ[K⁺]_o, w mM), przekształć równanie 3 w następujący sposób:

Wyniki

Aby monitorować [K⁺]_o oraz zmiany zachodzące w odpowiedzi na aktywność pobudzeniową, do stratum radiatum obszaru CA1 wprowadzono dwukanałową mikroelektrodę selektywną w stosunku do potasu. Kilka minut po wprowadzeniu, kanał elektrody selektywny względem jonów osiągnął stabilną wartość bazową (Rysunek 7A), odpowiadającą [K⁺]_o na poziomie około 2,8 mM, co jest wartością bliską [K⁺] stosowanego ACSF (2,5 mM). Aplikacja do kąpieli 0,5 mM glutaminianu przez 10 s wywołała odwracalny wzrost [K⁺]_o o około 4 mM, po którym nastąpił spadek poniżej poziomu bazowego o około 0,7 mM (Rysunek 7A). Obniżenie stężenia glutaminianu do 0,4, 0,3 i 0,2 mM spowodowało odpowiedni spadek amplitudy zarówno przejściowego wzrostu, jak i spadku [K⁺]_o (Rysunek 7A).

Rycina 7. Zewnątrzkomórkowe przejściowe zmiany stężenia potasu wodpowiedzi na aktywność pobudzeniową. (A) Przejściowe zmiany [K⁺]_o, składające się ze wzrostu, po którym następuje spadek poniżej poziomu bazowego, wywołane aplikacją do kąpieli różnych stężeń glutaminianu przez 10 sec, jak wskazano. (B) Wpływ perfuzji blokerami receptorów glutaminianu (CNQX, 100 µM; APV, 100 µM) i tetrodotoksyną (TTX; 0,5 µM) na przejściowe zmiany [K⁺]_o wywołane aplikacją do kąpieli 0,5 mM glutaminianu przez 10 sec. (C) Spontaniczne przejściowe zmiany [K⁺]_o w obecności 0Mg²⁺/BIC. Eksperymenty przedstawione w A-C zostały przeprowadzone przy użyciu elektrod dwukanałowych. W celach ilustracyjnych ślady zostały wygładzone filtrem Savitzky-Golaya (szerokość 20). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że takie sygnały [K⁺]_o indukowane glutaminianem nie ulegają znaczącym zmianom podczas aplikacji TTX i są zatem w dużej mierze niezależne od otwierania napięciowo zależnych kanałów sodowych oraz generowania potencjałów czynnościowych neuronów ^15,16. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw obserwowanych zmian [K⁺]_o w odpowiedzi na glutaminian, zastosowano blokery receptorów glutaminianowych, mianowicie CNQX (100 µM; bloker receptorów AMPA) oraz APV (100 µM; bloker receptorów NMDA) w obecności TTX (0.5 µM). Po perfuzji kąpieli z tymi blokerami zmiany [K⁺]_o indukowane glutaminianem zostały praktycznie zniesione, co potwierdziło ich zależność od otwierania kanałów jonotropowych receptorów glutaminianowych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (np. ¹⁷; Rycyna 7B).

Aby dalej wykazać znaczenie pobudzenia glutaminergicznego dla generowania sygnałów pozakomórkowego [K⁺], skrawki perfundowano nominalnie beztlenkowym z Mg²⁺ roztworem soli zawierającym 10 µM metjodydku bikukuliny (0Mg²⁺/BIC). Pozwala to na zniesienie woltażowej blokady receptorów NMDA przez Mg²⁺ oraz osłabia inhibicję poprzez blokowanie receptorów GABA_A, co wywołuje spontaniczną, nawracającą aktywność epileptiformną w sieci (np. ^18,19). Zgodnie z oczekiwaniami ²⁰, w roztworze 0Mg²⁺/BIC wykryto spontaniczne, nawracające przejściowe wzrosty [K⁺]_o o wartości około 1,5 mM (Rysunek 7C). Pomiędzy tymi odpowiedziami występowały mniejsze przejściowe wzrosty [K⁺]_o o średniej amplitudzie około 0,2 mM (Rysunek 7C).

W drugim zestawie eksperymentów wykorzystano mikroelektrody wrażliwe na [Na⁺], aby określić zmiany [Na⁺]_o wywołane aplikacją agonistów glutaminianu. Porównano również charakterystykę odpowiedzi mikroelektrod dwukanałowych oraz koncentrycznych przy zastosowaniu dwóch różnych paradygmatów aplikacji. Mikroelektrody wrażliwe na [Na⁺] umieszczono w stratum radiatum na głębokości około 50 µM. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej aplikowano agonistę glutaminianu, L-asparaginian, poprzez perfuzję kąpieli (10 mM, 120 sec, perfuzja kąpieli z prędkością 2,5 ml/min). Jak zaobserwowano wcześniej ²¹, aplikacja asparaginianu spowodowała powolny spadek [Na⁺]_o o około 15 mM, który trwał około 5 min, a następnie zaczął powracać do poziomu bazowego (Rysunek 8A). Warto zauważyć, że choć amplitudy szczytowe i kinetyka sygnałów [Na⁺]_o wyznaczonych przez obie elektrody były w tych warunkach praktycznie identyczne, elektrody koncentryczne wykazały bardziej stabilną linię bazową i niższy poziom szumów (Rysunek 8A).

Aby przetestować charakterystykę odpowiedzi różnych elektrod w warunkach szybszego podawania substancji, zastosowano aplikację glutaminianu pod ciśnieniem za pomocą cienkiej szklanej pipety umieszczonej w stratum radiatum w odległości 20-40 µm od końcówki mikroelektrody selektywnej jonowo. Zgodnie z oczekiwaniami ²¹, podawanie glutaminianu (10 mM) przez 200 ms spowodowało spadek stężenia [Na⁺]_o (Rysunek 8B). Amplitudy szczytowe spadku [Na⁺]_o znajdowały się w tym samym zakresie dla obu typów elektrod (podwójne: 4,5 - 13,5 mM, n=14; koncentryczne: 2,0 - 19,1 mM, n=15). Jednakże, w przeciwieństwie do wyników uzyskanych podczas powolnej perfuzji kąpieli (patrz. powyżej), różniły się istotnie nie tylko stosunek sygnału do szumu, ale także przebieg czasowy sygnałów [Na⁺]_o wykrywanych przez oba typy elektrod. Średni czas do osiągnięcia szczytu wynosił 3,5 s dla mikroelektrod podwójnych i zaledwie 1,3 s dla mikroelektrod koncentrycznych.

Zatem wyniki te wykazują i potwierdzają szybszą kinetykę odpowiedzi mikroelektrod selektywnych względem Na⁺ o konstrukcji koncentrycznej w porównaniu do mikroelektrod dwukanałowych (por. Rysunek 6C i 8B), co odnotowano również w przypadku ich odpowiedników selektywnych względem Ca²⁺ i pH ¹⁰. W przeciwieństwie do poprzedniego badania, w którym zastosowano krótkie serie stymulacji synaptycznej w celu wywołania szybkich, indukowanych synaptycznie przejściowych zmian stężenia jonów, w naszym schemacie aplikacyjnym zaobserwowano jedynie tendencję, ale nie stwierdzono istotnej różnicy w średnich amplitudach szczytowych między elektrodami koncentrycznymi a dwukanałowymi. Wynikało to prawdopodobnie z faktu, że odległość pipety aplikacyjnej od wierzchołka mikroelektrody selektywnej względem jonów różniła się dwukrotnie (20-40 µm), a w konsekwencji maksymalne stężenie glutaminianu w obszarze docelowym nie było takie samo w różnych eksperymentach, co uniemożliwiło wykazanie istniejących różnic w amplitudach szczytowych.

(A) Górne przebiegi: Zmiana napięcia elektrod odniesienia (V_ref) w elektrodzie dwukanałowej (czarna kropkowana linia) i elektrodzie koncentrycznej (szara linia) w odpowiedzi na wskazane zmiany stężenia Na⁺ w kąpieli ([Na⁺]_b). Należy zauważyć, że odpowiedzi napięciowe obu elektrod są praktycznie identyczne. Dolne przebiegi: Zmiany napięcia potencjału Na⁺ (V_Na+) elektrody dwukanałowej (czarna linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) w odpowiedzi na zmiany [Na⁺]_b. (B) Wykresy półlogarytmiczne zależności [Na⁺]_b od V_Na+ dla obu elektrod. Liniowe wykresy danych wykazują nachylenie wynoszące około 48 mV dla obu elektrod. (C) Odpowiedź V_Na+ elektrody dwukanałowej (czarna linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) na szybką zmianę [Na⁺]_b z 152 mM do 70 mM. Zauważalny jest znacznie szybszy czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej. W celach ilustracyjnych przebiegi zostały wygładzone filtrem Sawitzky'ego-Golaya (szerokość 20).

Rycina 8: Zewnętrzne przejścia sodowe wykryte za pomocą elektrod dwukanałowych i koncentrycznych.
(A) Przejściowe zmiany V_ref i [Na⁺]_o wywołane perfuzją kąpieli 10 mM aspartatem przez 120 sec, zaznaczone paskiem. Górne ślady przedstawiają pomiar wykonany elektrodą dwukanałową, dolne ślady zarejestrowano za pomocą elektrody koncentrycznej. (B) Przejściowe zmiany V_ref i [Na⁺]_o wywołane lokalną aplikacją pod ciśnieniem 10 mM glutaminianu przez 0,2 sec, zaznaczone grotem strzałki. Górne ślady przedstawiają pomiar wykonany elektrodą dwukanałową, dolne ślady zarejestrowano za pomocą elektrody koncentrycznej. Czerwone linie przerywane reprezentują dopasowania liniowe okresu od początku sygnału do jego maksimum. Należy zauważyć, że czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej w tych warunkach jest znacznie krótszy. W celach ilustracyjnych ślady zostały wygładzone filtrem Sawitzky-Golay (szerokość 20). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Elektrody jonoselektywne oparte na nośnikach cieczy są z powodzeniem stosowane od dziesięcioleci, a dla wielu jonów dostępne są wysoce specyficzne czujniki ^22-26. W przypadku stosowania w przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ECS) preparatów mózgu kręgowców należy jednak pamiętać, że jest to technika dość inwazyjna: o ile szerokość ECS wynosi tylko około 20-50 nm, o tyle średnica mikroelektrod jonoselektywnych wynosi około 1 μm (elektrody dwulufowe) lub większe (elektrody koncentryczne). Końcówki mikroelektrod jonoselektywnych nie tylko uszkadzają tkankę podczas nabijania tkanki, ale także powiększają ECS, sprzyjając niedoszacowaniu stanów przejściowych jonów. Pomimo tych pułapek, zewnątrzkomórkowe stany przejściowe jonów w odpowiedzi na aktywność neuronalną są niezwykle spójne między różnymi laboratoriami ^7,8, co świadczy o niezawodności tej metody.

Wydajność i przydatność elektrod jonoselektywnych zależy od ich czułości i selektywności, która jest określana przez zastosowany koktajl czujników ("jonofor z ciekłą membraną"). Koktajle sensoryczne zawierają specjalną cząsteczkę nośnikową, np. walinomycynę dla mikroelektrod selektywnych K⁺, która wykazuje wysoką selektywność dla potasu ²⁷. Niezależnie od tego może wystąpić reaktywność krzyżowa z innymi jonami i musi być testowana. Walinomycyna wykazuje znaczącą reaktywność krzyżową w stosunku do amonu, co należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników (np. ^11,12). Ponadto, ponieważ odpowiedź napięciowa jonoforów przebiega zgodnie z zachowaniem Nernsti'a (por. równanie 1), stosunek sygnału do szumu i próg detekcji zależą od stężenia mierzonego jonu. Tak więc, podczas gdy małe stany nieustalone [K⁺]_o wywołują duże zmiany napięcia w stosunku do niskiej linii podstawowej [K⁺]_o, małe stany nieustalone [Na⁺]_o są znacznie trudniejsze do wykrycia w stosunku do wysokiej linii podstawowej [Na⁺]_o (por. rysunek 5 i 6).

Wydajność elektrod jonoselektywnych zależy również od rozdzielczości czasowej, która jest w dużej mierze regulowana przez elektryczną stałą czasową. Ta ostatnia zależy głównie od rezystancji osiowej czujnika oraz od pojemności rozłożonej na całej długości pipety, między jej roztworami wewnętrznymi a płynem zewnętrznym. W konfiguracji dwulufowej rezystancja jest wysoka dzięki długiej kolumnie czujnika jonów z zasypką. Dla danego dielektryka izolacyjnego (w tym przypadku szkła borokrzemianowego) pojemność zależy od grubości dielektryka. W elektrodach dwulufowych szerokość dielektryka jest równa szklanej ściance pipety. Gdy szkło cienkie zbliża się do końcówki, szerokość dielektryka spada, a pojemność wzrasta. Czynniki te łączą się, aby wytworzyć elektrody o czasach reakcji wahających się od kilkuset milisekund do kilku sekund, ponieważ czynniki te są zróżnicowane.

Główną zaletą konstrukcji koncentrycznej jest to, że zarówno opór osiowy, jak i pojemność kąpieli są znacznie zmniejszone. Koncentryczna pipeta bocznikuje większość rezystancji zasypanego wymiennika jonowego, pozostawiając tylko pozostałość w ostatnich kilku mikrometrach przed końcówką. Ponadto roztwór napełniający w pipecie koncentrycznej jest fizycznie oddalony od wanny, oddzielony grubością dwóch szklanych ścianek, co znacznie zmniejsza pojemność. Jak pokazano wcześniej ¹⁰, połączonym efektem zmniejszonej rezystancji i pojemności jest poprawa rozdzielczości czasowej o dwa rzędy wielkości. W przypadku koncentrycznych mikroelektrod^Ca2+ i pH 90% czasy odpowiedzi wynosiły zaledwie 10-20 ^ms10. Istotną zaletą konstrukcji koncentrycznej jest niższy poziom hałasu (por. rysunek 8). Dzięki znacznie zmniejszonej rezystancji, stany przejściowe napięcia wynikające z jakiegokolwiek hałasu otoczenia są zminimalizowane. Co więcej, powrót do zdrowia po takich stanach nieustalonych jest szybki ze względu na szybką stałą czasową. Takie artefakty są zatem małe i szybkie oraz mają mniej destrukcyjny wpływ na zapisy fizjologiczne (por. ryc. 8).

Istnieją również wady techniki koncentrycznej. Po pierwsze, ich montaż jest bardziej złożony i czasochłonny. Drugą wadą jest konieczność umieszczenia oddzielnej mikroelektrody referencyjnej wraz z końcówką, co wiąże się z użyciem oddzielnego mikromanipulatora lub specjalistycznego podwójnego manipulatora. Wreszcie, mikroelektrody dwulufowe można rozszerzyć do konstrukcji trzylufowej, co pozwala na wykrywanie dwóch różnych gatunków jonów w tym samym czasie ²⁸, co nie jest możliwe w przypadku elektrod koncentrycznych.

Najczęstsze pułapki

Nieefektywna silanizacja.

Najważniejszym krokiem i główną przeszkodą w wytwarzaniu jakiejkolwiek mikroelektrody jonoselektywnej opartej na czujniku cieczy jest procedura silanizacji. Gdy elektrody nie reagują na zmiany stężenia jonów specyficznych lub reagują odpowiedzią sub-Nernstiańską (tj. znacznie mniej niż 58 mV na dziesięciokrotną różnicę stężeń), przyczyną jest zwykle słaba skuteczność silanizacji. Z naszego doświadczenia wynika, że może się to zdarzyć, gdy wilgotność powietrza jest zbyt wysoka lub zbyt niska, typowa dla warunków panujących odpowiednio w środku lata lub zimy. Jeśli możliwe jest wywarcie pewnej kontroli nad wilgotnością w pomieszczeniu, problemy te można przezwyciężyć.

Rezystancja elektrody jest zbyt wysoka.

W razie potrzeby rezystancję cylindra wrażliwego na jony można zmniejszyć poprzez ukosowanie. W tym celu należy na kilka sekund wystawić jego końcówkę na działanie silnego strumienia ścierniwa zawieszonego w wodzie. Spowoduje to złamanie jego najwyższej końcówki i obniżenie oporu do pożądanej wartości.

Mosty solne.

Mostki solne między beczkami jonowymi i referencyjnymi skutkują słabą reakcją elektrod lub ich brakiem, a tym samym mogą znacznie zakłócić ich działanie podczas kalibracji. Jak wspomniano powyżej (patrz punkt 1.6.), jest to głównie problem, gdy wybierane jest dwulufowe szkło theta, ale jest rzadkim zjawiskiem w przypadku stosowania opisanej tutaj techniki offsetowej, skręconej lufy.

Mając na uwadze łatwość produkcji, oryginalna dwulufowa konstrukcja Lux ²⁹ może być często wykorzystywana z zyskiem. Metoda ta wykorzystuje wstępne napełnianie beczek jonowych i referencyjnych roztworami soli, szybką ekspozycję na roztwór silanu poprzez jego zasysanie i wydalenie z końcówki, a następnie wprowadzanie jonitariusza, również przez końcówkę (patrz ^30,31). Elektrody te można wytworzyć w około 10 minut, ale ich rozmiar końcówki wynosi zwykle 4 μm lub więcej i są bardziej podatne na awarie podczas eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, metody silanizacji, które obejmują wystawienie na działanie oparów silanu i ogrzewanie, mogą wytwarzać elektrody z mniejszymi końcówkami, które wystarczają na dni, a czasem tygodnie.

Podsumowując, istnieje kilka protokołów i podejść do przygotowania mikroelektrod jonoselektywnych. W tym miejscu opisaliśmy dwie główne procedury wytwarzania skręconych, dwulufowych i koncentrycznych mikroelektrod, które działają dobrze i niezawodnie w naszych laboratoriach, a ogólny wskaźnik sukcesu jest bliski 100%. Co ważne, techniki te będzie można zastosować do pomiaru innych rodzajów jonów, w tym pH czy wapnia, a także będą miały zastosowanie do innych preparatów niż mózg, w tym jam wypełnionych płynem lub płynów w ogóle. Wreszcie, co nie mniej ważne, mikroelektrody jonoselektywne umożliwiają określenie stężenia jonów wewnątrz komórek. Ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar końcówki (~ 1 μm) będzie to jednak możliwe tylko w komórkach o dużym korpusie komórkowym, np. takich jak znalezione w preparatach bezkręgowców ^28,32.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ścierniwo	MikroPolskie	Buehler GmbH	rozpuszczona w A.dest
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	1405059	Hilgenberg	Pipeta aplikacyjna; 75 mm x 2 mm, grubość ścianki 0,3 mm
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Do czujnika mikroelektrod dwulufowych
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Dla odniesienia mikroelektrod dwulufowych
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem	GB-200TF-15	Science Products	Koncentryczny, kanał zewnętrzny. Średnica zewnętrzna 2,0 mm
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem	GB-120TF-10	Science Products	Koncentryczny, kanał wewnętrzny. O.D. 1,2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Wzmacniacz elektrometryczny ze sceną		Wykonane na zamówienie	Rin = 10 TΩ i Ibias=50 fA-1pA (dostępne w handlu  alternatywy: np. Dagan IX2-700, ze sceną czołową (rezystor sprzężenia zwrotnego 10 Gig) lub EPMS-07, NPI, Tamm, Niemcy)
Komora		Wykonana na zamówienie	Komercyjnie dostępna od np.   Warner Instruments, Stany Zjednoczone;   Scientifica, Wielka Brytania
Piec		Heraeus	Musi pozostać stały na poziomie 200 ° C
Twardy lepki wosk / wosk dentystyczny	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
	grzejna	na zamówienie Musi	pozostać na stałym poziomie 40 & stopni; C
Uchwyt mikroelektrod wykonany z pleksi		Wykonany na zamówienie	Podwójna: O.D.   kapilary 1,5 mm, koncentryczne: O.D.  kapilary 2 mm
Mikromanipulator		Leitz
Mikromanipulator	MD4R	Mikroskop stereoskopowy Leica
	M205C	obiektywu Leica
	0.8xLWD	Leica
	Model PP-830	Mikroelektrody koncentryczne Narishige
Ściągacz do pipet	model P-97	Sutter Instruments	Czujnik koncentrycznych mikroelektrod
Pneumatyczny system wyrzucania leków	Picospritzter Typ II	Zawór ogólny TM Corporation
Stopień jazdy na jaskółczy ogon	DT 25/M	Thorlabs
Klej dwuskładnikowy	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	Można również użyć małego paska folii aluminiowej do sklejenia naczyń włosowatych
Drut srebrny	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Oprogramowanie	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Ściągacz pionowy	Typ PE-2	Narishige Scientific Instruments	Z obrotowym uchwytem do  dwulufowych mikroelektrod
x/y stopień			na zamówienie
1(S),9(R)-(−)-Metocydek bicukuliny	Sigma aldrich	14343	Kompetycyjny antagonista receptorów GABAA (wrażliwy na światło); UWAGA toksyczny
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/antagonista receptora kainianowego; UWAGA toksyczny
dimetylosulfotlenku (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	Antagonista receptora NMDA; UWAGA toksyczny
Hexamethyldisilazan (HMDS)	Sigma aldrich	440191	UWAGA: Łatwopalna, ostra toksyczność (doustna, skórna, wdychanie) i dla metali i skóry
Kwas L-asparaginowy	Sigma aldrich	A9256	Aktywuje NMDA i nie-NMDA oraz EAATs
Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowego	Sigma aldrich	G1626	Aktywuje NMDA-R, AMPA-R, QA-R i KA-R),  mGluRs i EAAT
Jonofor potasowy I - koktajl B	Fluka	60403	Na bazie walinomycyny; UWAGA toksyczny
Jonofor sodowy II - koktajl A	Fluka	71178	Oparty na ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor kanałów Na+ zależnych od napięcia; UWAGA toksyczna
Woda, ultra czysta	Sigma aldrich	W3500