Method Article

Zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP lubH2O2w nerkach

DOI:

10.3791/53059

⸱

October 12th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe umożliwiają pomiary w czasie rzeczywistym zewnątrzkomórkowej sygnalizacji komórkowej w biologicznie istotnych stężeniach. Poniższe protokoły rozszerzają zastosowania bioczujników na wykrywanie ex vivo i in vivo ATP iH2O2w nerkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe są powszechnie używane do pomiaru sygnalizacji zewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym. Większość ich zastosowania ogranicza się do wycinków mózgu i kultur komórek neuronalnych. Ostatnio technologia ta została zastosowana do całych narządów. Postępy w projektowaniu czujników umożliwiły pomiar sygnalizacji komórkowej w nerkach z perfuzją krwi in vivo. Niniejsze protokoły wymieniają kroki potrzebne do pomiaru sygnalizacji ATP i H2O2 w śródmiąższu nerki szczura. W protokołach ex vivo i in vivo stosowane są dwie oddzielne konstrukcje czujników. Oba typy czujników są pokryte cienką enzymatyczną biowarstwą na warstwie permselektywności, aby zapewnić szybko reagujące, czułe i selektywne bioczujniki. Warstwa permselektywności chroni sygnał przed zakłóceniami w tkance biologicznej, a warstwa enzymatyczna wykorzystuje sekwencyjną reakcję katalityczną kinazy glicerolowej i oksydazy glicerolowo-3-fosforanowej w obecności ATP do produkcji H2O2. Zestaw czujników wykorzystanych do badań ex vivo wykrył ponadto analit poprzez utlenianieH2O2na elektrodzie drutowo-platynowo-irydowej (Pt-Ir). Czujniki do badań in vivo opierają się natomiast na redukcjiH2O2na złotej elektrodzie pokrytej mediatorem, przeznaczonej do tkanek perfundowanych krwią. Końcowe stężenie zmiany są wykrywane przez amperometrię w czasie rzeczywistym, a następnie kalibrację do znanych stężeń analitu. Dodatkowo specyficzność sygnału amperometrycznego można potwierdzić poprzez dodanie enzymów, takich jak katalaza i apiraza, które odpowiednio rozkładająH2O2i ATP. Czujniki te również w dużym stopniu opierają się na dokładnych kalibracjach przed i po każdym eksperymencie. Poniższe dwa protokoły ustanawiają badanie wykrywania ATP iH2Ow czasie rzeczywistym w tkankach nerek i mogą być dalej modyfikowane w celu rozszerzenia opisanej metody do stosowania w innych preparatach biologicznych lub całych narządach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe (również określane jako czujniki w niniejszym manuskrypcie) były cennym narzędziem do badania dynamicznych procesów sygnalizacyjnych w żywych komórkach i tkankach. Czujniki zapewniają zwiększoną rozdzielczość czasową i przestrzenną komórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych w biologicznie istotnych stężeniach. Zamiast pobierać próbki i analizować płyny pozakomórkowe pobierane w odstępach czasu przez długi czas, czujniki te reagują tak szybko, jak ich enzymy reagują na analit, zapewniając w ten sposób pomiary w czasie rzeczywistym1,2. Szybkie wykrywanie śródmiąższowych stężeń czynników autokrynnych i parakrynnych, takich....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące procedury dla zwierząt są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Uprzednią zgodę uzyskano od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC).
UWAGA: Review instrukcji producenta czujnika należy wykonać podczas projektowania eksperymentu i przed ich użyciem. Postępowanie zgodnie z tymi instrukcjami zapewni optymalne wyniki podczas korzystania z czujników.

1. Kalibracja czujnika

  1. Przygotować świeże roztwory podstawowe przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Utwórz bufor A zawierający 10 mM buforu NaPi, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstrukcja biosensora enzymatycznego mikroelektrody pozwala na wykrywanie analitów w czasie rzeczywistym w całych nerkach. Ogólny plan eksperymentu dla badań ex vivo lub in vivo zilustrowano na rysunku 1. Stosowane czujniki i zabiegi chirurgiczne różnią się w zależności od tego, czy badanie odbywa się ex vivo, czy in vivo.

Aby uzyskać powtarzalne wyniki, kluczowe znaczenie mają dokładne kalibracje wstępne i końcowe. Rysunek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne protokoły zostały opracowane w celu zapewnienia zwiększonej rozdzielczości czasowej i przestrzennej sygnalizacji ATP iH2O2 dla nerek izolowanych, perfundowanych i perfundowanych in vivo krwią. Różnice między zastosowanymi tutaj protokołami i czujnikami zapewniają optymalne pozyskiwanie danych zarówno dla środków farmakologicznych, jak i badań fizjologicznych. Protokoły składają się z 1) kalibracji czujnika, 2) zabiegu chirurgicznego, 3) konfiguracji akwizycji danych i 4) ana.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czujniki do nagrania wideo tego manuskryptu zostały dostarczone przez Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Wielka Brytania).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy Sarissa Biomedical za ich pracę w rozwoju czujników użytych w niniejszym manuskrypcie. Badania te były wspierane przez granty Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) i HL 122662 (A. Staruschenko i A. Cowley), projekt finansowany przez Medical College of Wisconsin Research Affairs Committee #9306830 (O. Palygin) oraz Advancing a Healthier Wisconsin Research and Education Program #9520217, oraz Young Investigator Grant przyznany przez National Kidney Foundation (O. Palygin).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestawczujników Sarissa BiomedicalSBK-ATP-05-125Zestaw zawiera butelkę do przechowywania, komorę nawadniającą, przewody elektrod i elektrody referencyjne. W zestawie znajduje się również wybór czujników przez użytkownika.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μ mSarissa BiomedicalSBS-ATP-05-125przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem
Sarissagold ATP Biosensor 50 μ mSarissa BiomedicalSGS-ATP-10-50przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem
Sarissaprobe null sensor 125 μ mSarissa BiomedicalSBS-NUL-20-125przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem
Sarissagold null sensor 50 μ mSarissa BiomedicalSGS-NUL-10-50przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem
Instrukcja obsługi Sarissaprobe ATPSarissa Biomedicalhttp://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Klatka Faradaya TMC
Dwukanałowy potencjostatDigi-IvyDY2021Typ II Klatka Faradaya
Program do akwizycji danychDigi-IvyDY2000
Pompa perfuzyjnaRazel Scientific InstrumentsModel R99E
Oświetlacz światłowodowyMikromanipulator SchottACE 1
NarishigeMM-3
mikromanipulator stojak magnetycznyNarishigeGJ-8
TMC63-500
wentylator izofluranowyLEI MedicalM2000
3 ml szalka PetriegoFisher ScientificS3358OA
igłaSanta Cruz26-30 G
szpilkido rozwarstwiania Standardowe szpilki preparacyjne
cewnikRurka polietylenowa (PE50)
cewnik klej tkankowyVetbond1469SB
szewWyglądSP117
gumkidowolne gumki o szerokości 2-4 mm
silikonoweMomentiveRTV-615 Clear 1#
clampFine Science Tools18052-03
do preparacjiZestaw powinien zawierać skalpel i sissory do sekcji 
MiseczkaWłasnego projektu
standardowe chemikaliaSigma-Aldrich
ATPSigma-AldrichA6559-25UMO100 mM roztwór ATP
Nadtlenek wodoruSigma-Aldrich216763
glicerolSigma-AldrichG9012
ApyraseSigma-AldrichA7646
KatalazaSigma-AldrichC40
izofluranowamaszynka do strzyżenia10250
inaktynaSigma-AldrichT133
maszynka do strzyżeniaketaminy2010012
Hanks Zrównoważony roztwór soli Gibco14025092
stół powietrzny standardowy zestaw nerkowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
  2. Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for con....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzymatic BiosensorsATP DetectionH2O2 DetectionKidney InterstitiumEx Vivo SensorsIn Vivo SensorsReal time AmperometrySensor CalibrationGlycerol KinasePlatinum Iridium Electrode

Related Articles