Artykuł metodologiczny

Generowanie i analiza ilościowa pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53060

⸱

22 lipca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

W tym artykule

Podsumowanie

Selektywne uszkodzenie ludzkich komórek białaczkowych można osiągnąć dzięki nowatorskiemu podejściu polegającemu na stosowaniu ultradźwięków o niskiej częstotliwości, zarówno z chemioterapeutycznym leczeniem białaczkowym i prawidłowymi komórkami krwiotwórczymi, jak i bez niego.

Streszczenie

Ultradźwięki o niskiej częstotliwości w zakresie od 20 do 60 kHz to nowatorska metoda fizyczna, za pomocą której można wywołać selektywną lizę i śmierć komórek w komórkach nowotworowych. Ponadto metoda ta może być stosowana w połączeniu ze specjalistycznymi środkami znanymi jako sonosensybilizatory w celu zwiększenia zakresu preferencyjnych uszkodzeń wywieranych przez ultradźwięki na komórki nowotworowe, podejście określane jako terapia sonodynamiczna (SDT). Przedstawiono metodologię generowania i stosowania ultradźwięków o niskiej częstotliwości w warunkach przedklinicznych in vitro, aby wykazać, że można osiągnąć powtarzalne niszczenie komórek w celu zbadania i porównania wpływu sonikacji na komórki nowotworowe i prawidłowe. Oferuje to środki, za pomocą których można niezawodnie sonikować komórki nowotworowe na poziomie spójności wymaganym do przedklinicznej oceny terapeutycznej. Ponadto omówiono wpływ środków zubożających poziom cholesterolu i skierowanych do cytoszkieletu na zwiększenie wrażliwości ultradźwiękowej w komórkach nowotworowych w celu opracowania mechanizmów działania sprzyjających podejścium sonochemoterapeutycznym.

Wprowadzenie

Ultradźwięki odnoszą się do każdej oscylującej fali ciśnienia akustycznego o częstotliwości większej niż górna granica ludzkich zdolności słuchowych (~ 20 kHz)1. Ultradźwięki o niskiej częstotliwości w zakresie 20-60 kHz zostały wykorzystane w laboratorium jako sposób generowania emulsji, przygotowywania próbek komórkowych do ekstrakcji kwasów nukleinowych, do rozbijania tkanek i do wielu innych testów. Użyteczność ultradźwięków o niskiej częstotliwości została również rozszerzona na środowisko przemysłowe do spawania, czyszczenia różnych materiałów i obróbki materiałów. Dostępne na rynku generatory ultradźwięków są dostępne w zakresie częstotliwości od 18 do 60 kHz i pełnej mocy od 100 do 1 200 W.

Chociaż ultradźwięki od dawna są używane w warunkach klinicznych do diagnostyki obrazowej, dopiero niedawno zostały zastosowane jako metoda terapeutyczna. Ultradźwięki ≥1 MHz są w stanie bezpiecznie zakłócić kamicę moczową (kamienie nerkowe) i kamienie żółciowe (kamienie w woreczku żółciowym lub wątrobie) u pacjentów w celu zmniejszenia objawów2,3. To podejście, znane jako pozaustrojowa litotrypsja falą uderzeniową (ESWL), jest obecnie szeroko stosowane w klinice (ponad milion pacjentów jest leczonych rocznie za pomocą ESWL w samych Stanach Zjednoczonych4) i oferuje modalność, dzięki której nieinwazyjne rozbijanie kamieni nazębnych przy minimalnych uszkodzeniach ubocznych poprzez zastosowanie zewnętrznie stosowanych, skoncentrowanych impulsów akustycznych o wysokiej intensywności2-4.

Ze względu na unikalne bezpośrednie siły ścinające, jak również pęcherzyki kawitacyjne generowane przez ultradźwięki o wysokiej intensywności, te metodologie zostały zbadane w terapii raka w leczeniu opornego na kastrację raka prostaty i gruczolakoraka trzustki w podejściu znanym jako skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU)5-8. W sposób bardzo podobny do ESWL, HIFU wykorzystuje wiele wiązek ultradźwiękowych i skupia je na wybranym obszarze ogniskowym, aby wygenerować temperaturę 60 °C lub wyższą poprzez wykorzystanie energii akustycznej, wywołując martwicę koagulacyjną w tkance docelowej5. Chociaż obecnie istnieją inne metody ablacji termicznej (ablacja prądem o częstotliwości radiowej i ablacja mikrofalowa), HIFU oferuje wyraźną przewagę nad tymi metodami, ponieważ jest to jedyna nieinwazyjna modalność hipertermiczna5. HIFU osiągnął mieszane wyniki w klinice i jest obecnie dostępny tylko w badaniach klinicznych8-11. Niemniej jednak ograniczony sukces, jaki osiągnięto, oraz bardzo obiecujące dane in vivo uzyskane z przedklinicznych modeli ssaków wykazały potencjał ultradźwięków w terapii nowotworów.

W celu ulepszenia HIFU, naukowcy próbowali połączyć ultradźwięki z odpowiednimi środkami przeciwnowotworowymi, aby stworzyć formę sonochemoterapii. Terapia sonodynamiczna (SDT) jest obiecującą nową metodą leczenia, która wykazała imponującą aktywność przeciwnowotworową zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo1. Wykazano, że ultradźwięki preferencyjnie uszkadzają komórki nowotworowe w oparciu o różnicę wielkości między takimi komórkami a komórkami o prawidłowej histologii1,5. SDT zawiera specjalistyczne środki znane jako sonosensybilizatory w celu zwiększenia zakresu preferencyjnych uszkodzeń wywieranych przez ultradźwięki na komórki nowotworowe. Podczas gdy terapeutyczne zastosowania SDT były już wcześniej badane, stosowane systemy ultradźwiękowe zazwyczaj wykorzystują ultradźwięki o wyższej częstotliwości (≥1 MHz), a skutki ultradźwięków o niskiej częstotliwości kHz nie zostały jeszcze w pełni zbadane. Niższe częstotliwości ultradźwięków są często bardziej sprawne w wytwarzaniu kawitacji bezwładnościowej, zjawiska, które powoduje zniszczenie komórek z powodu szybkiego zapadania się mikropęcherzyków, wywołując uszkodzenia fizykochemiczne12-14. Ta różnica w generowaniu kawitacji bezwładnościowej między ultradźwiękami MHz a ultradźwiękami o niskim kHz została przypisana faktowi, że niższe częstotliwości fal umożliwiają mikropęcherzykom więcej czasu na wzrost przez rektyfikowaną dyfuzję w połowie cyklu rozprężania, co w konsekwencji powoduje gwałtowniejsze zapadnięcia podczas następnego cyklu kompresji12.

Wcześniej wykazaliśmy, że ludzkie komórki białaczki monocytowej U937 są wrażliwe na ultradźwięki o niskiej częstotliwości (23,5 kHz), i że ta czułość może być znacznie zwiększona poprzez zastosowanie środków przeciwnowotworowych, które zaburzają cytoszkielet15. Ponadto wykazaliśmy, że komórki są preferencyjnie uszkadzane w zależności od wielkości, przy czym większe komórki wykazują wyższą czułość ultradźwiękową. Ponadto normalne ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (hHSC) i leukocyty o porównywalnych rozmiarach komórek są znacznie bardziej odporne na sonikację niż ich nowotworowe odpowiedniki15, co wstępnie sugeruje, że ultradźwięki o niskiej częstotliwości mogą być stosowane do preferencyjnego uszkadzania komórek nowotworowych w obecności normalnej tkanki.

Aby dokładniej zbadać unikalne właściwości ultradźwięków o niskiej częstotliwości do potencjalnego zastosowania terapeutycznego, opracowaliśmy procedury czyszczenia i stabilizacji, aby zwiększyć skuteczność i niezawodność jednego z naszych obecnych systemów sonikacji, Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, wyposażonego w tubę o średnicy 20 mm umieszczoną w miseczce o średnicy 7,62 cm. Ponadto udało nam się określić dokładne energie kawitacji próbki, a także spójne przebiegi i amplitudę w zakresie 40 kHz za pomocą miernika kawitacji i oscyloskopu z hydrofonem. Udoskonalając i systematyzując nasze protokoły, byliśmy w stanie ustalić spójność w naszych eksperymentalnych sonikach, co pozwoliło nam ilościowo porównać wrażliwość soniczną komórek nowotworowych i normalnych z różnych linii histogenetycznych. Nasz protokół dla systemu 40 kHz jest przedstawiony bardzo szczegółowo, aby zainteresowane laboratoria były w stanie przeprowadzić porównywalne eksperymenty i ocenić nasze wyniki dotyczące efektów przeciwnowotworowych wywołanych przez ultradźwięki o niskiej częstotliwości. Ponadto badamy zależne od dawki działanie metylo-β-cyklodekstryny (MeβCD; Ryc. 1), środek zubożający poziom cholesterolu, na zwiększenie czułości ultradźwiękowej ludzkich komórek białaczki monocytowej U937 i THP1.

Protokół

1. System sonifiera do czyszczenia komórek

  1. Wyczyść złącze między klaksonem a konwerterem za pomocą chloroformu i wacika bawełnianego. Nałóż lekki olej lub olej mineralny na gwinty klaksonu i konwertera, aby dodatkowo usunąć nagromadzone wióry metalowe, rdzę lub utlenianie.
  2. Użyj chloroformu, aby usunąć olej i wszelkie inne zanieczyszczenia ze złącza po przetarciu gwintów olejem.

2. Ponowny montaż sonifiera komórkowego i konfiguracja systemu

  1. Ponownie podłącz klakson do konwertera. Aby prawidłowo dokręcić system, wyjmij zmontowany konwerter i klakson z zespołu miseczki, wyciągając klakson z dolnej części miseczki (Rysunek 2A). Umieść klucz płaski w jednym z trzech małych otworów w górnej części konwertera (Rysunek 2B). Następnie umieść klucz dynamometryczny wyposażony w kurzą stopkę 1/2 cala na szczelinowej części klaksonu (Rysunek 2B). Dokręcaj w standardowym kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, aż miernik momentu obrotowego wskaże 54.23 N.m (Rysunek 2C), moment obrotowy zalecany przez producenta16. Zamontuj dokręcony konwerter i klakson z powrotem w miseczce, a następnie zamontuj klakson i konwerter na stojaku pierścieniowym w pozycji pionowej. Ponownie podłącz przetwornicę do zasilania przed ustawieniem systemu na eksperymentalne dozowanie impulsowe.
  2. Ustaw system do dozowania impulsowego za pomocą 1 sekundy sonikacji z 1 sekundą między impulsami. W innych warunkach doświadczalnych można stosować różne modele dawkowania. Wiele zmiennych, takich jak objętość wody i średnica rogu, potencjalnie wymagałoby zmian w tym dawkowaniu. Korzystając z wyżej wymienionych typów próbek komórek, objętości i stężenia, dane empiryczne i obserwacje doprowadziły do sformułowania tego schematu dawkowania.
  3. Dostosuj system do żądanej amplitudy. W tym protokole należy użyć amplitudy 33% i 50%, aby zapobiec całkowitemu zniszczeniu komórek, co utrudniłoby lub uniemożliwiłoby ocenę skuteczności sonosensybilizatorów.
    UWAGA: W tym badaniu amplitudy są porównywane.

3. Ocena intensywności i funkcji systemu

  1. Trzymaj miernik kawitacji na wysokości 1.5 cm, co jest poziomem sonikacji próbki. Zanotuj odczyty, aby ocenić, czy system działa z oczekiwaną intensywnością. Korzystając z obecnego systemu i poziomów wody, spodziewaj się od 100 do 110 W/cm2 dla 33% amplitudy i 115-125 W/cm2 dla 50% amplitudy. Zwróć uwagę na odczyty miernika kawitacji z wyświetlacza licznika, które reprezentują energię kawitacji bezpośrednio w W/cm2. Wykonaj te odczyty na powierzchni wody i upewnij się, że na powierzchni sondy mierników nie ma pęcherzyków.
    UWAGA: Należy pamiętać, że te procedury są wykonywane bez nasadki umożliwiającej dostęp nad klaksonem. Nie trzeba ich powtarzać po każdej sonizacji. Raczej należy je wykonywać dopiero po wyczyszczeniu, ponownym montażu i skonfigurowaniu systemu.
  2. Umieścić hydrofon w fiolce z próbką zawierającej 12,5 ml wody, aby całkowicie zanurzyć czujnik hydrofonu. Zawieś hydrofon za pomocą stojaka na pierścień.
  3. Podłącz hydrofon do wejścia oscyloskopu, aby ocenić charakterystykę przebiegu. Sprawdź oscyloskop pod kątem czystej fali sinusoidalnej, ponieważ fale nienormalne mogą zmieniać częstotliwość systemu w stosunku do specyfikacji producenta. Zarówno miernik kawitacji, jak i oscyloskop podają odczyt częstotliwości, ale tylko oscyloskop pokaże nieprawidłowe fale, które wskazują na wadliwy system lub nieprawidłowy montaż.

4. Przygotowanie komórek i podłoża

  1. Przygotować pożywkę, używając 240 ml zmodyfikowanego podłoża Dubecco's Medium (IMDM) firmy Iscove i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej. Nie należy rozmrażać płodowej surowicy bydlęcej w gorącej kąpieli wodnej, ponieważ gwałtowny wzrost temperatury może prowadzić do pogorszenia stabilności surowicy. Połączyć 240 μl gentamycyny 50 mg/ml i 5 ml penicyliny/streptomycyny 100x w standardowej kolbie hodowlanej i dodać do pożywki. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C.
  2. Wysiewaj komórki U937 w ilości ~4 x 104 komórek/ml w kolbie o średnicy 25cm2 przy użyciu przygotowanej pożywki. Oceń komórki pod kątem koncentracji i żywotności za pomocą licznika komórek TC20 i wykluczenia błękitu trypanowego, umieszczając 15-20 μl komórek i 15-20 μl błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki i mieszając zawartość. Odpipetować 15-20 μl tej mieszaniny do szkiełka do pobierania próbek TC20 i rozpocząć liczenie, umieszczając szkiełko w liczniku komórek TC20.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i sprawdzić żywotność komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i licznika komórek TC20. Gdy komórki osiągną odpowiednie stężenie i/lub były poddawane działaniu środków sonosensybilizujących przez odpowiedni okres czasu, przenieść 3 ml komórek z kolby hodowlanej do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. W tym protokole hoduj komórki U937 przez 48 godzin, a następnie traktuj 0,5, 1 lub 5 mM MeβCD przez 30 minut, aby wystarczająco zubożyć cholesterol w komórkach przed sonikacją.

5. Sonikacja komórek

  1. Odgazowuje dejonizowaną wodę destylowaną za pomocą próżni i kolby Buchnera. Przelej wodę do rogu kubka i napełnij do poziomu 15 mm powyżej górnej części klaksonu. Proces sonikacji powoduje dalsze odgazowanie wody przez okres kilku minut i może prowadzić do niespójności w trakcie eksperymentu, jeśli system nie zostanie uruchomiony przed sonikacją próbki. Dlatego należy uruchomić system na ~7 minut przed sonikacją próbki.
  2. Podłączyć fiolkę scyntylacyjną zawierającą komórki do urządzenia przytrzymującego. Następnie przymocuj urządzenie przytrzymujące do górnej części rogu kubka i ustaw na wysokości 15 mm od górnej części klaksonu (na powierzchni wody za pomocą mechanizmu przesuwnego).
  3. Komórki są zazwyczaj sonikowane za pomocą trzech 1-sekundowych impulsów ultradźwiękowych, z 1-sekundowym odstępem między każdym z tych impulsów. W przypadku tego protokołu należy sonikować komórki o amplitudzie 33% i 50% przy użyciu wyżej wymienionego dawkowania impulsowego.

6. Ocena komórek pod kątem uszkodzeń po sonikacji

  1. Oceń zawieszone ogniwa pod kątem uszkodzeń i żywotności za pomocą błękitu trypanowego i licznika komórek TC20. Ponadto należy przeanalizować próbkę za pomocą licznika Z2. W celu analizy licznika Z2 należy odpipetować zawiesinę komórek o objętości 100 μl do 20 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej (w stosunku 200:1). Przed analizą należy przepłukać otwór analizatora cząstek Z2 co najmniej dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej. Umieść próbkę Z2 w uchwycie licznika i podnieś platformę do otworu przed rozpoczęciem liczenia.
  2. Pozyskaj dane z liczników TC20 i Z2 za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta. Przeanalizuj te dane pod kątem uszkodzenia komórek, żywotności i tworzenia się szczątków komórkowych w wyniku sonikacji.

7. Test XTT do określenia żywotności komórek i aktywności mitochondrialnej leczonych komórek U937 i THP1

  1. Przed testami XTT hoduj komórki U937 i THP1 w tych samych warunkach. Wstępnie potraktuj komórki tym samym zakresem stężeń MeβCD przez 30 minut przed sonikacją. Użyj tych samych parametrów ultradźwiękowych, co poprzednio, z wyjątkiem tego, że komórki są teraz sonikowane przy użyciu zakresu 1-3 impulsów jednosekundowych w odstępach jednej sekundy, aby rozwinąć zakres uszkodzeń, które zestaw XTT może ocenić.
    Uwaga: Wiele z tych kroków pochodzi bezpośrednio z instrukcji zestawu XTT i są powtarzane tylko dla wygody zainteresowanych laboratoriów.
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce wzrostowej opisanej wcześniej. Ponownie zawiesić komórki przy ~ 1 x 105 komórkach / ml. Komórki U937 należy zasiać w ilości 100 μl na studzienkę na płaskodenną 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania w trzech powtórzeniach, a następnie powtórzyć dla komórek THP1 przy użyciu oddzielnej płytki 96-dołkowej. Uwzględnij 3 studzienki kontrolne zawierające 100 μl samego kompletnego podłoża wzrostowego jako odczyty absorbancji ślepej próby. Następnie inkubować zaszczepione płytki przez 24 godziny.
  3. Przed użyciem rozmrozić dwie porcje odczynnika XTT i odczynnika aktywacyjnego w temperaturze 37 °C. Delikatnie mieszać porcje, aż do uzyskania klarownych roztworów. Dodać 0,1 ml odczynnika aktywacyjnego do 5,0 ml odczynnika XTT, który tworzy wystarczającą ilość aktywowanego roztworu XTT do jednego 96-dołkowego testu na mikromiareczkowaniu. Powtórz ten proces dla drugiej płytki.
  4. Dodać 50 μl aktywowanego roztworu XTT do każdej studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO2 do hodowli komórkowych na 2 godziny. Po okresie inkubacji delikatnie wstrząsnąć płytką, aby równomiernie rozprowadzić pomarańczowy kolor w dołkach dodatnich. Zmierzyć absorbancję studzienek testowych zawierających komórki i studzienek kontrolnych ślepej próby tła przy długości fali od 450 do 500 nm za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.
  5. Albo wyzerować czytnik płytek do mikromiareczkowania za pomocą ślepej próby kontrolnej, albo odjąć ich średnią wartość od konkretnych wyników. Ponownie zmierzyć absorbancję wszystkich studzienek testowych przy długości fali między 630-690 nm i odjąć wartości od uzyskanych wartości 450-500 nm. Uwaga: To drugie oznaczanie absorbancji pomaga wyeliminować niespecyficzne odczyty z wyników testu. Test XTT powtórzono czterokrotnie dla obu linii komórkowych.

Wyniki

Stabilność systemu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych i wiarygodnych wyników. Prawidłowy moment dokręcania wynoszący 54.23 N.m zapewnił właściwe połączenie przetwornika i sonotrody2, a spójność przebiegu fali została oceniona przy użyciu oscyloskopu i hydrofonu (Rysunek 3A). Rysunek 3B przedstawia pomiary wewnątrz fiolki z próbką, a Rysunek 3C ocenia stabilność wewnątrz tuby akustycznej. Zgodnie z oczekiwaniami, amplituda była nieco zredukowana ze względu na pochłanianie części energii przez szkło. Jednakże przebieg fali nie był zaburzony ani zniekształcony ani na panelu B, ani na panelu C, co jest niezbędne do wiarygodnego dostarczania energii sonicznej do próbki. Przebieg fali, który nie ma postaci wyraźnej, pojedynczej sinusoidy, wskazuje na uszkodzony przetwornik lub nieprawidłową konfigurację. Jest to przedstawione na Rysunku 3D, który pokazuje liczne fale aberrantne, wyraźny brak sinusoidy oraz odczyt częstotliwości nieoczekiwany w prawidłowo funkcjonującym systemie. Kawitometr użyty do pomiaru generowanej energii kawitacji (Rysunek 4) wykazał, że natężenie dźwięku wynosiło 100-110 W/cm2 przy amplitudzie 33% oraz 125-130 W/cm2 przy amplitudzie 50%.

Po odpowiedniej kalibracji i całkowitym złożeniu systemu 40 kHz (Rysunek 5), łatwo osiągnięto niezawodną destrukcję komórek, co potwierdzono za pomocą liczników TC20 i Z2 (Rysunek 6). Zgodnie z oczekiwaniami, bardziej rozległe uszkodzenia komórek zaobserwowano w populacjach poddanych sonikacji przy amplitudzie 50% niż przy 33%. Niemniej jednak, amplituda 33% jest użytecznym punktem wyjścia do wykrywania potencjalnych efektów uwrażliwiających na działanie dźwięku przez podawane środki, ponieważ powoduje ona zauważalne uszkodzenia, ale pozostawia możliwość wykrycia dalszych uszkodzeń po zastosowaniu substancji w celu oceny ich potencjału zwiększania wrażliwości na ultradźwięki. Zostało to zademonstrowane na Rysunku 7A, gdzie przedstawiono zależne od dawki efekty MeβCD w zakresie potęgowania wrażliwości komórek U937 na ultradźwięki. Choć przeżywalność komórek traktowanych MeβCD, które nie były poddane sonikacji, była bardzo zbliżona do przeżywalności komórek nietraktowanych i niepoddanych sonikacji, żywotność gwałtownie spadła po zastosowaniu trzech impulsów ultradźwięków 40 kHz o czasie trwania 1 s. Dodatkowo, spadek przeżywalności po sonikacji wydawał się być zależny od dawki, ponieważ 5 mM MeβCD spowodowało największy spadek liczby komórek, następnie 1 mM, a potem 0,5 mM MeβCD.

Podobne efekty w zakresie żywotności komórek i aktywności mitochondrialnej zaobserwowano w komórkach U937 i THP1 traktowanych przed sonikacją różnymi stężeniami MeβCD, co oceniono za pomocą zestawu XTT (Ryc. 7B). Chociaż komórki THP1 wydają się być nieco bardziej odporne na sonikację niż komórki U937, obie linie białaczki ludzkiej ulegają uszkodzeniu w sposób zależny od dawki. Wyższe stężenia MeβCD oraz większa liczba impulsów ultradźwięków spowodowały najniższą redukcję XTT do rozpuszczalnej, jaskrawopomarańczowej pochodnej w obu liniach komórkowych (U937 i THP1), co odpowiadało niższej żywotności komórek i mniejszej aktywności mitochondrialnej.

Schemat struktury cyklodekstryny; pierścienie chemiczne, wiązania glikozydowe; wzór sumaryczny.
Rycina 1. Struktura cząsteczkowa metylo-β-cyklodekstryny. (A) Pełna struktura metylo-β-cyklodekstryny (MeβCD). (B) MeβCD jest polimerem składającym się z siedmiu powtarzających się jednostek z grupą R będącą wodorem H lub grupą CH3. Wzór sumaryczny: C56H98O35. Masa cząsteczkowa = 1331,36.

Układ do pomiaru momentu obrotowego; klucz dynamometryczny, klucz szczelinowy; schemat montażu mechanicznego.
Rysunek 2. Prawidłowe dokręcanie systemu ultradźwiękowego 40 kHz z określonym momentem obrotowym. (A) Przed dokręcaniem tubator i przetwornik zostają wyjęte z kubka. (B) Ustaw klucz szczelinowy i klucz dynamometryczny w odpowiednich pozycjach. (C) Zastosuj moment obrotowy 54.23 N.m w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara przed ponownym zamocowaniem tubatora i przetwornika do kubka.

Oscyloskop wyświetlający analizę kształtu fali; elektroniczne przetwarzanie sygnałów; wykres przedstawiający wzorce falowe.
Rycina 3. Wykorzystanie oscyloskopu do charakterystyki kształtu fali w systemie ultradźwiękowym. (A) Oscyloskop z hydrofonem może być wykorzystany do oceny amplitudy i spójności kształtu fali. (B) Zapis wykonany z kubkiem znajdującym się bezpośrednio nad tubą w odległości 1.5 cm, przy ustawionej amplitudzie 33%. (C) Przedstawiony tutaj kształt fali pochodzi z odczytu uzyskanego, gdy hydrofon został umieszczony w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Fiolka znajduje się w odległości 1.5 cm nad tubą, przy ponownie ustawionej amplitudzie 33%. (D) Zrzut ekranu z oscyloskopu przedstawiający system z aberrantnymi częstotliwościami, co jest spodziewane w przypadku uszkodzonego systemu lub nieprawidłowego sprzężenia złącza przetwornika tuby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Konfiguracja miernika energii UEM-001-ITI z sondą pomiarową i rejestracją danych do badań elektrycznych.
Rysunek 4. Wykorzystanie miernika kawitacji do charakterystyki natężenia dźwięku systemu ultradźwiękowego. Przedstawiony tutaj miernik kawitacji służy do określania energii kawitacji w W/cm2. Jest to bardzo ważny instrument do oceny spójności energii w odniesieniu do próbki.

Ustawienie równowagi statycznej ze wskaźnikiem poziomu wody; aparatura do eksperymentu z mechaniki płynów.
Rysunek 5. Kluczowe komponenty systemu ultradźwiękowego 40 kHz. Przedstawiono kompletny system ultradźwiękowy z tubą w kształcie kubka (A), urządzeniem grzewczym (B), przetwornikiem (C) oraz mechanizmem pozycjonowania próbki (D). Taka konstrukcja umożliwia łatwe ustawienie próbki (E) nad tubą (F).

Żywotność i liczba komórek pod wpływem obróbki ultradźwiękowej; wykres przedstawia wpływ amplitudy w porównaniu do próbek niesonikowanych.
Rysunek 6. Wpływ różnych poziomów amplitudy na lizę ultradźwiękową komórek U937 z wykorzystaniem liczników TC20 i Z2. Komórki poddano sonikacji za pomocą dezintegratora komórkowego 40 kHz przy amplitudzie 33% (100-110 W/cm2) lub amplitudzie 50% (125-130 W/cm2), stosując trzy 1 s impulsy ultradźwiękowe z 1 s przerwą między każdym impulsem. (A) Zrzut ekranu z oprogramowania licznika Z2 demonstruje wpływ sonikacji na komórki U937. (B) Dane z licznika TC20 zostały przedstawione na wykresie w celu wykazania powtarzalności wyników. Dane te obejmują całkowitą i żywą liczbę komórek, a także żywotność komórek ocenianą za pomocą błękitu trypanu. Słupki odzwierciedlają standardowy błąd średniej (SEM) dla 4 niezależnych populacji komórek. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wpływ ultradźwięków na wielkość komórek; wykresy słupkowe i liniowe; traktowanie MeBCD; analiza absorbancji; 40 kHz.
Rysunek 7. Wpływ metylo-β-cyklodekstryny na potęgowanie wrażliwości ultradźwiękowej komórek U937 i THP1. (A) Komórki U937 traktowano różnymi stężeniami MeβCD przez 30 min przed poddaniem działaniu ultradźwięków o częstotliwości 40 kHz (105 W/cm2) za pomocą trzech impulsów o czasie trwania 1 s w odstępach 1 s. Populacje komórek podzielono na grupy ≥12 µm i ≥17 µm. (B) Komórki U937 lub THP1 ponownie traktowano różnymi stężeniami MeβCD przez 30 min przed sonikacją systemem 40 kHz przy użyciu 1-3 impulsów ultradźwięków o czasie trwania 1 s w odstępach 1 s. Żywotność komórek i aktywność mitochondrialną oceniano za pomocą zestawu XTT. Do każdego dołka płaskodنnej płytki mikrotiterowej z 96 dołkami zasiano 100 µl komórek. Płytkę inkubowano przez 24 h przed dodaniem roztworu XTT. Następnie komórki inkubowano przez dodatkowe 2 h przed odczytem długości fali. Słupki przedstawiają SEM dla 4 niezależnych populacji komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zwrócić szczególną uwagę na staranne ustawienie próbki i oczyszczenie złącza konwertor-róg. Umieszczenie próbki w tubie jest ważne dla uzyskania spójnego niszczenia komórek, ponieważ zmiana odległości od rogu zmieni ogniska akustyczne, a tym samym zmieni energię, na którą narażona jest próbka. Energię akustyczną w tubie kubka można odwzorować za pomocą miernika kawitacji, aby znaleźć pozycję maksymalnej kawitacji. Ponadto miernik kawitacji wraz z oscyloskopem są niezbędne do określenia natężenia dźwięku, na które narażone są komórki, a także jednorodności kształtu fali. W związku z tym przyrządy te powinny być używane do wykrywania problemów z systemem i pomagania w określaniu, jakie rozwiązywanie problemów może być potrzebne do skorygowania niestabilności systemu.

Jak wspomniano wcześniej, system niskiej częstotliwości może działać w celu dalszego odgazowania wody przez cały czas trwania eksperymentu, jeśli nie zostanie uruchomiony przez kilka minut przed sonikacją próbki. Ten początkowy przebieg musi być przeprowadzony, aby uzyskać stosunkowo odgazowaną pożywkę sonikacyjną, a tym samym spójne wyniki podczas eksperymentów. Ponadto, komórki nie powinny być sonikowane na poziomie lub w pobliżu maksymalnej amplitudy podczas oceny skuteczności sonosensybilizatorów, ponieważ prawdziwy zakres uczulenia byłby trudny do oceny. Użycie amplitudy 33% w systemie 40 kHz jest idealnym ustawieniem, ponieważ powoduje zauważalne uszkodzenia, ale zapewnia sonosensybilizatorom dużo miejsca na wykazanie swojej skuteczności, jak wykazano w przypadku MeβCD przeciwko komórkom U937 i THP1 (Figura 7). Dane te potwierdzają również, że MeβCD uwrażliwia wiele linii białaczkowych na ultradźwięki o niskiej częstotliwości w sposób zależny od dawki.

Przeprowadzono szereg eksperymentów z wyższą częstotliwością w zakresie od 0,75 MHz do 8 MHz, które wykazały dowody na generowanie wewnątrzbłonowych pęcherzyków kawitacyjnych w wyniku sonikacji17-19. Jednak nadal pozostają pytania dotyczące dokładnego mechanizmu lizy komórek indukowanej ultradźwiękami18. Wykazaliśmy związek między fluidyzacją cytoszkieletu a zwiększoną czułością dźwiękową za pomocą ultradźwięków o niskiej częstotliwości15, zjawisko zademonstrowane przez inne laboratoria20, 21. Ponadto odkryliśmy, że środki zaburzające mikrofilamenty, takie jak cytochalazyna B, zwiększają wrażliwość ultradźwiękową w wielu liniach białaczkowych, ale nie hHSC lub leukocytów22, co sugeruje, że hamowanie polimeryzacji aktyny może być szczególnie interesującym mechanizmem sonosensytyzującym. Zaobserwowaliśmy również, że winkrystyna, środek zaburzający mikrotubule, który hamuje polimeryzację tubuliny23, 24, znacznie zwiększa czułość ultradźwiękową różnych typów białaczki in vitro , w tym ostrej białaczki szpikowej, przewlekłej białaczki szpikowej i ostrej białaczki limfatycznej. Natomiast środki skierowane na cytoszkielet, które stabilizują składniki cytoszkieletu (paklitaksel i jasplakinolid) wydają się uodparniać komórki na sonikację, co znajduje odzwierciedlenie w niższych wskaźnikach lizy komórek22. Podsumowując, dane te wspierają hipotezę, że fluidyzacja składników cytoszkieletu komórek nowotworowych jest rzeczywiście ważnym czynnikiem zwiększającym skuteczność SDT25. Niniejsze badanie pokazuje również, że wyczerpanie cholesterolu może być kolejną metodą dalszego wzmacniania wrażliwości ultradźwiękowej komórek nowotworowych, ponieważ komórki U937 traktowane MeβCD są znacznie uwrażliwione na ultradźwięki 40 kHz.

Podczas gdy nasze protokoły sonikacji wykazały wyraźną aktywność przeciwnowotworową in vitro, obecna metodologia ogranicza się do pracy w hodowlach i modelach małych kręgowców, które są w stanie zmieścić się w fiolkach używanych do sonikacji. Wykazaliśmy, że danio pręgowany może być bezpiecznie sonikowany za pomocą pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości (20 kHz) i że ich tolerancja na chemioterapeutyki jest ilościowo porównywalna z dawkami tolerowanymi przez modele mysie26, co sugeruje, że danio pręgowany z guzem może być stosowany we wstępnych badaniach w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej in vivo tych protokołów. Niemniej jednak, podawanie środków chemoterapeutycznych przed sonikacją modeli ssaków zostało zgłoszone w zakresie MHz1, a takie protokoły mogą być prawdopodobnie rozszerzone o ultradźwięki o niskiej częstotliwości, a także środki zubożające poziom cholesterolu i skierowane na cytoszkielet.

Potencjalne zastosowania kliniczne tej postaci SDT mogą obejmować pozaustrojową sonikację krwi, w której leki przeciwnowotworowe są podawane dożylnie (iv) przed pobraniem krwi do sonikacji25. Metoda ta usuwa potencjalne bariery dźwiękowe stwarzane przez ludzką anatomię i może być skutecznym sposobem na uszkodzenie blastów białaczkowych, a także przerzutów z guzów litych. Możliwe jest również, że środki zubożające poziom cholesterolu i skierowane na cytoszkielet mogą być stosowane w protokołach HIFU, które są już badane w klinice, w celu poprawy skuteczności tej metody leczenia.

Metody opisane w niniejszym badaniu są w stanie ocenić wartość potencjalnych sonosensybilizatorów, a dalsze udoskonalanie systemu może zwiększyć tę użyteczność. Istnieje jednak wiele zmiennych, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu takich urządzeń ultradźwiękowych, w tym jakość zasilania, ogniska akustyczne i indywidualne różnice między konwerterami. Dlatego przyszłe badania będą koncentrować się na wizualizacji fal dźwiękowych i zrozumieniu ich wpływu na wyniki. Wykazano, że SDT zwiększa lizę komórek in vitro i może okazać się klinicznie wykonalne, jeśli uzyska się więcej danych in vivo w modelach ssaków. W naszym laboratorium kontynuowane są eksperymenty badające inne potencjalnie możliwe do wykorzystania cechy komórek nowotworowych, a także różne połączone modalności z udziałem wielu czynników i ultradźwięków.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować pracownikom warsztatów Wydziału Fizyki Uniwersytetu w Syracuse za ich innowacyjną pomoc w sprawach związanych z projektowaniem naszego systemu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowany Ilbecco's Medium firmy Iscove z NaHCO3 i 25mM Hepes Technologie życiowe12440079
roztwór amfoterycyny B Sigma-AldrichA2942 
Penicylina/Streptomycyna 100x Roztwór Life Technologies10378-016
Surowica bydlęcapłodu Sigma-Aldrich12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor z urządzeniemsonicznymBranson Ultrasonics101-063-726
Brisk Heat SDC Benchtop Cyfrowy regulator temperatury z podgrzewaczem zlewki 1000 mlGrzałka Brisk HeatSDCJF1A-GBH1000-1służąca do kontroli temperatury
Sortownik komórek Beckman-Coulter Z2 z AccuComp® OprogramowanieBeckman-Coulter6605700
Bio-Rad TC20 Automatyczny licznik komórekBio-Rad145-0102
Gentamycyna 50 mg/mlSigma-AldrichG1397 
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154
Falcon 50 ml i 25 ml Wentylowane kolbyhodowlane Fisher Scientific353082
Lonza L-Glutamina 200 mM 0,85% NaClLonza17-605C 
Probówki do mikrowirówek Seal-Rite 1,5 mlUSA Scientific1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Fiolki i nakrętkiBeckman-Coulter  A35473
Automatyczny pipet AccuJet Pro BrandTech Scientific26330
USA Scientific 10 ml Jednorazowe pipety serologiczneUSA Scientific1071-0810
Tip One 100 μ l oraz 1,000 μ l Końcówki filtrówUSA Scientific1120-1840, 1126-7810
100 μ l Mikropipeta Wheaton851164
1,000 μ l MikropipetaWheaton851168
BioRad Dwukomorowe szkiełka licząceBio-Rad145-0015
Forma Scientific Dwukomorowy inkubator z płaszczem wodnymFormaScientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Cyfrowy oscyloskop fosforowyTektronixDPO2002Bsłuży do pomiaru przebiegu ultradźwiękowego
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultradźwiękowy licznik energiiPPB MegasonicsPB-500 służy do oceny natężenia dźwięku w W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 HydrofonTeledyneTC4013-1 łączy się z oscyloskopem 
Wheaton 250 ml KolbySigma-AldrichZ364827
20 ml Szklane fiolki scyntylacyjne Sigma-AldrichZ190527
Beckman-Coulter Izotoniczny roztwór soli fizjologicznej Beckman-CoulterN/Ado licznika Z2
Chloroform 99%Sigma-AldrichC2432
Etanol 200 Proof Bezwodny Sigma-Aldrich459836
Olej mineralnyN/A
XTT Zestaw do oznaczania proliferacji komórekATCC30-1011K
96-dołkowy czytnik mikropłytekCole-Palmer  EW-13055-54
U937 Ludzkie komórki białaczki monocytowejATCCCRL­ 1593.2
THP1 Ludzkie komórki białaczki monocytowejATCCTIB-202
Cuphorn Rozcieńczalnik

Bibliografia

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. , Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11 (95), 20140071(2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Terapia sonodynamicznarodek usuwaj cy cholesterolmetylo beta cyklodekstrynaocena ywotno ci kom rektest XTTautomatyczny licznik kom rekkawitometrczujnik hydrofonicznykalibracja klucza dynamometrycznego
Generowanie i analiza ilościowa pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.