Inżynieria tkankowa często obejmuje ekspansję in vitro w celu stworzenia autoprzeszczepów do regeneracji tkanek. W tym badaniu opracowano metodę rozbudowy, regeneracji i rekonstrukcji tkanek in vivo w celu zminimalizowania przetwarzania komórek i materiałów biologicznych poza organizmem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tkanka mielona w skompresowanym kolagenie: bioprzeszczep zawierający komórki do jednoetapowej naprawy rekonstrukcyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konwencjonalne techniki ekspansji komórek i przeszczepiania komórek autologicznych do celów inżynierii tkankowej mogą odbywać się w specjalnie wyposażonych obiektach do hodowli komórek ludzkich. Metody te obejmują izolację komórek w zawiesinie pojedynczej komórki oraz kilka pracochłonnych i czasochłonnych zdarzeń przed przeszczepem z powrotem do pacjenta. Wcześniejsze badania sugerują, że samo ciało może być wykorzystywane jako bioreaktor do ekspansji komórek i regeneracji tkanek w celu zminimalizowania manipulacji ex vivo tkanek i komórek przed przeszczepem pacjentowi. Celem pracy było zademonstrowanie metody pobierania tkanek, izolacji nabłonka ciągłego, rozdrabniania nabłonka na drobne kawałki i włączania ich do trójwarstwowego biomateriału. Trójwarstwowy biomateriał służył następnie jako pojazd porodowy, aby umożliwić chirurgiczną obsługę, wymianę składników odżywczych w całym przeszczepie i kontrolowaną degradację. Biomateriał składał się z dwóch zewnętrznych warstw kolagenu oraz rdzenia ze stabilnego mechanicznie i wolno degradowalnego polimeru. Zmielony nabłonek został wkomponowany w jedną z warstw kolagenu przed przeszczepem. Mieląc tkankę nabłonkową na małe kawałki, kawałki można było rozprowadzać, a tym samym stymulować rozmnażanie komórek. Po początkowym pobraniu przeszczepów nastąpiłaby ekspansja i reorganizacja komórek, a macierz zewnątrzkomórkowa dojrzeje, aby umożliwić wrastanie naczyń włosowatych i nerwów oraz dalsze dojrzewanie macierzy zewnątrzkomórkowej. Technika ta minimalizuje manipulacje ex vivo i umożliwia pobieranie komórek, przygotowanie autoprzeszczepu i przeszczep pacjentowi jako prostą, jednoetapową interwencję. W przyszłości ekspansja tkanek może być inicjowana wokół formy 3D wewnątrz samego ciała, zgodnie z konkretnymi potrzebami pacjenta. Ponadto technika ta może być wykonywana w zwykłych warunkach chirurgicznych bez konieczności korzystania z zaawansowanych urządzeń do hodowli komórek.
Wprowadzenie
Większość badań z zakresu inżynierii tkankowej dotyczących transplantacji do skóry i układu moczowo-płciowego obejmuje pobieranie autologicznych komórek z tkanki zdrowej oraz ich ekspansję w specjalistycznych ośrodkach hodowli komórkowych1,2.
Po ekspansji komórek są one zazwyczaj przechowywane do późniejszego użycia, gdy pacjent będzie przygotowany do przyjęcia autoprzeszczepu. Zamrażarki azotowe umożliwiają długoterminowe przechowywanie w niskich temperaturach -150 °C lub niższych. Proces zamrażania musi być ostrożny i kontrolowany, aby nie doprowadzić do utraty komórek. Jednym z zagrożeń dla przeżycia komórek jest krystalizacja wody wewnątrzkomórkowej podczas procesu rozmrażania, co może prowadzić do przerwania błon komórkowych. Zamrażanie komórek wykonuje się zazwyczaj poprzez powolne i kontrolowane chłodzenie (-1 °C na min), stosując wysoką koncentrację komórek, płodową surowicę bydlęcą oraz dimetylosulfoksyd. Po rozmrożeniu komórki muszą zostać ponownie poddane obróbce poprzez usunięcie medium do zamrażania i hodowlę na plastiku do hodowli komórkowej lub biomateriale przed ponownym przeszczepieniem pacjentowi.
Wszystkie wyżej wymienione etapy są czasochłonne, pracochłonne i kosztowne3. Ponadto wszelkie procesy przetwarzania komórek in vitro przeznaczonych do transplantacji pacjentom są ściśle regulowane i wymagają dobrze przeszkolonego i akredytowanego personelu oraz laboratoriów4. Podsumowując, aby zapewnić bezpieczny i niezawodny proces wytwarzania, technikę tę można było wdrożyć jedynie w bardzo niewielkiej liczbie zaawansowanych technicznie ośrodków, a jej szersze zastosowanie w powszechnych schorzeniach chirurgicznych pozostaje wątpliwe.
Aby przezwyciężyć ograniczenia hodowli komórkowych w środowisku laboratoryjnym, wprowadzono koncepcję transplantacji posiekanej tkanki w celu ekspansji komórek in vivo, wykorzystując organizm jako bioreaktor. W tym celu autotrasplantaty byłyby preferencyjnie wszczepiane na formę 3D o kształcie wymaganym do końcowej rekonstrukcji interesującego narządu5-7.
Pierwotnie koncepcja przeszczepiania posiekanego nabłonka została zaprezentowana przez Meeka w 1958 roku, kiedy opisał on sposób, w jaki nabłonek narasta z brzegów rany. Wykazał on, że niewielki fragment skóry zwiększy swoje krawędzie, a tym samym potencjał do proliferacji komórek o 100%, poprzez dwukrotne przecięcie fragmentu w kierunkach prostopadłych (Rycina 1)8. Teoria ta znalazła potwierdzenie w zastosowaniu siatkowanych przeszczepów skóry o częściowej grubości w transplantologii skóry9 oraz w modelach gojenia ran skórnych10.
Rysunek 1: Teoria Meeka. Zgodnie z teorią Meeka nabłonek narasta z brzegów rany. Dzięki zwiększeniu powierzchni odsłoniętej przez technikę rozdrabniania, rozdrobniona tkanka epitelizuje rany w wielu miejscach.
Niniejsze badanie opiera się na hipotezie, że tę samą zasadę można zastosować w odniesieniu do tkanki podskórnej, umieszczając posiekane nabłonki wokół formy. Komórki nabłonkowe miałyby zmobilizować się z posiekanych przeszczepów (reorganizować się), pokryć obszary rany (migrować) i dzielić się (ekspandować), aby utworzyć ciągły neoepithelium, który pokryje obszar rany i oddzieli ciało obce (formę) od wnętrza organizmu (Rycina 2).
Rysunek 2: Schemat trójwymiarowej formy z posiekanym nabłonkiem do wewnątrzciałowej ekspansji tkanki in vivo zgodnie z teorią Meeka. Dzięki zastosowaniu posiekanej tkanki umieszczonej na formie, a następnie przeszczepionej do tkanki podskórnej, wysunięto hipotezę, że komórki nabłonkowe migrują z krawędzi posiekanej tkanki, reorganizują się i rozprzestrzeniają w taki sposób, aby utworzyć ciągły neonabłonek, który pokrywa obszar rany i oddziela ciało obce (formę) od wnętrza organizmu.
Chociaż poprzednie badania in vivo wykazują obiecujące wyniki, dalszą poprawę można by osiągnąć poprzez wzmocnienie autoprzeszczepów, tak aby zregenerowany nabłonek był bardziej odporny na urazy mechaniczne7. W tym celu zidentyfikowano istotne warunki niezbędne dla skutecznego biomateriału, takie jak: łatwa dyfuzja składników odżywczych i produktów przemiany materii, możliwość formowania w trzech wymiarach (3D) oraz łatwość manipulacji chirurgicznej. Wyciągnięto wnioski, że potrzeby te można zaspokoić poprzez dodanie kompozytowego biomateriału do rozdrobnionej tkanki.
Celem niniejszego badania było opracowanie rusztowania składającego się z rozdrobnionej tkanki w kolagenie poddanym kompresji plastycznej, zawierającego wzmacniający rdzeń z biodegradowalnej tkaniny. Dzięki temu żywe komórki mogły migrować z cząsteczek rozdrobnionej tkanki i proliferować, wykazując cechy morfologiczne charakterystyczne dla oryginalnego nabłonka (skóry lub urothelium). Dzięki zastosowaniu kompresji plastycznej rozmiar rusztowania został zredukowany z 1 cm do około 420 µm, podczas gdy rozdrobnione cząsteczki zostały zamknięte w górnej warstwie kolagenu. Rdzeń z tkaniny może być wykonany z dowolnego polimeru, jednak musi on posiadać zmodyfikowaną hydrofilową powierzchnię, aby mógł powiązać się z pokrywającymi go warstwami kolagenu11.
Zastosowana metoda pozwoliła na uzyskanie zwiększonej integralności rusztowania poprzez wbudowanie dzianej siatki z poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) pomiędzy dwa plastycznie prasowane żele kolagenowe, wykorzystując je jako rusztowanie do hodowli posiekanej śluzówki pęcherza lub posiekanej skóry świni. Konstrukt utrzymywano w warunkach hodowli komórkowej do 6 tygodni in vitro, co wykazało pomyślne utworzenie warstwowego, wielowarstwowego urothelium lub płaskiego nabłonka skóry na powierzchni dobrze skonsolidowanego konstruktu hybrydowego. Konstrukt był łatwy w manipulacji i mógł zostać przyszyty w celu augmentacji pęcherza lub pokrycia ubytków skóry. Wszystkie elementy rusztowania tkankowego są zatwierdzone przez FDA, a technikę tę można zastosować w procedurach jednotapowych poprzez pobranie tkanki, posiekanie, prasowanie plastyczne i przeszczepienie z powrotem pacjentowi w ramach jednej interwencji. Procedurę tę można przeprowadzić w celu ekspansji i rekonstrukcji tkanek w warunkach sterylnych w każdej oddziale chirurgii ogólnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały wstępnie zatwierdzone przez Komitet Okręgowy ds. Zwierząt w Sztokholmie, a wszystkie procedury były zgodne z przepisami dotyczącymi wykorzystywania zwierząt, a także odpowiednimi ustawami federalnymi.
1. Procedury na zwierzętach
- Przygotowanie zwierzęcia do operacji
- Przygotuj stół operacyjny ze wszystkimi materiałami i narzędziami potrzebnymi do operacji w sterylnych warunkach. Operację należy wykonywać wyłącznie w sterylnych warunkach, aby zmniejszyć ryzyko infekcji i zoptymalizować warunki w chirurgii przetrwania.
- Pościć zwierzę przez 12 godzin przed zabiegiem i zmierzyć jego wagę. Należy podać domięśniowe wstrzyknięcie azaperonu (2 mg/kg) w celu premedykacji. Znieczulić zwierzę domięśniowymi wstrzyknięciami hipochlorku tiletaminy (2,5 mg/kg), hipochloranu zolazepamu (2,5 mg/kg), medetomidyny (25 μg/kg) i atropiny (25 μg/kg).
- Wstrzyknąć fenobarbituran (15 mg/kg) przed intubacją dotchawiczą i kontynuować znieczulenie ogólne 0,8%-2% izofluranem. Wprowadzić cewnik do żył obwodowych do jednego ucha i podać dożylnie glukozę (25 mg/ml) podczas zabiegu, aby utrzymać dobre samopoczucie zwierzęcia.
- Umieść urządzenia monitorujące na uchu lub ogonie, aby sprawdzić temperaturę, ciśnienie krwi, saturację i puls obwodowy. Kontroluj znieczulenie poprzez stymulację bólu uszu lub kopyt. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Wycięcie próbki z biopsji pęcherza moczowego
- Cewnikuj pęcherz moczowy za pomocą 10-francuskiego cewnika silikonowego, wprowadzając wziernik, aby zobaczyć cewkę moczową i wprowadzić cewnik przez cewkę moczową do pęcherza moczowego, aby opróżnić mocz w warunkach półsterylnych. Napełnić pęcherz sterylnym roztworem soli fizjologicznej do ciśnienia 20–25 cmH2O, około 100–300 ml, a następnie opróżnić do 20 cmH2O(ok. 8 ml/kg masy ciała).
- Gdy świnia jest ostrożnie obrócona do pozycji bocznej, należy wykonać podstawową przedoperacyjną sterylizację skóry za pomocą glukonianu chlorheksydyny. Nałóż płytkę diatermiczną na ramię po usunięciu sierści za pomocą nożyc do golenia.
- Ostrożnie obróć świnię do pozycji leżącej na plecach i usuń sierść brzuszną za pomocą nożyc do golenia i wykonaj podstawową przedoperacyjną sterylizację skóry brzucha za pomocą glukonianu chlorheksydyny.
- Osadź kończyny miękką odzieżą, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia stawów w kończynach przez przeprost. Wysterylizuj skórę brzucha zwierzęcia za pomocą kolejnych aplikacji glukonianu chlorheksydyny i umieść sterylne zasłony wokół pola operacyjnego.
- Przed nacięciem skóry należy zastosować dożylny lek przeciwbólowy składający się z buprenorfiny (45 μg/kg), karprofenu (3 mg/kg) i miejscowego wstrzyknięcia lidokainy w linię środkową poniżej pępka. Sprawdź, czy nie ma reakcji na ból, chwytając skórę kleszczami. Wykonaj dolne nacięcie linii środkowej przez powięź i otrzewną, używając diatermii w celu opanowania krwawienia. Zlokalizuj pęcherz, który ma całkowicie dootrzewnową pozycję u świni i może być swobodnie odsłonięty, mobilizując go przez ranę chirurgiczną.
- Chwyć pęcherz kleszczami i zmierz go wysterylizowaną miarką i oznacz eliptyczną próbkę biopsji około 2 cm wzdłuż i 1 cm poprzecznie lub mniejszą, za pomocą wysterylizowanego długopisu (świnia bardzo dobrze toleruje zmniejszenie rozmiaru pęcherza o jedną czwartą). Wyciąć zaznaczony obszar za pomocą skalpela i umieścić próbkę biopsji pęcherza moczowego w DMEM w sterylnych warunkach.
- Wykonaj autotransplantację z bioprzeszczepem lub zamknij pęcherz moczowy, zszywając go 5-0 Vicryl w dwóch warstwach. Ostrożnie zamknij powięź brzuszną za pomocą 2-0 lub 3-0 running Vicryl. Zamknij tkankę podskórną za pomocą 3-0 Vicryl, a skórę za pomocą 3-0 Ethilon. Umieść opatrunek na ranie i ostrożnie opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie dojdzie do siebie po znieczuleniu i nie będzie odczuwać bólu.
- Przenieś zwierzę do placówki opieki nad zwierzętami, aby zapewnić warunki do opieki pooperacyjnej. Umieść zwierzę w pojedynczej klatce z lampą grzewczą i zajmij się zwierzęciem, aż do pełnego wyzdrowienia ze znieczulenia, a następnie pozwól zwierzętom utknąć w parach.
- Zapewnij spokojną rekonwalescencję w zakresie bólu i dobrego samopoczucia oraz podawaj domięśniowo buprenorfinę (45 μg/kg) w celu znieczulenia pooperacyjnego oraz trimetoprim (4 mg/kg) i sulfonamid (20 mg/kg) dwa razy dziennie przez trzy dni i raz dziennie przez pięć dni w celu zmniejszenia ryzyka zakażeń pooperacyjnych.
- Wycięcie próbki biopsji skóry
- Przygotuj stół operacyjny ze wszystkimi niezbędnymi materiałami. Znieczulić zwierzę w sposób opisany wcześniej w ppkt 1.1. Usuń skórę za pomocą wosku, umyj i wysterylizuj obszar nacięcia betadyną i 70% alkoholem, a następnie umieść sterylne drapowanie wokół obszaru nacięcia.
- Użyj dermatomu, aby pobrać próbkę z biopsji skóry o częściowej grubości 0,3 mm. Umieścić próbkę skóry w DMEM przed rozdrobnieniem, jak opisano w ppkt 2.2. Przykryj obszar rany tłustą maścią i opatrunkiem.
2. Przygotowanie tkanek mielonych
- Błona śluzowa pęcherza moczowego
- Dwukrotnie umyć biopsję pęcherza moczowego w DMEM. Umieść próbkę biopsji pęcherza moczowego na wysterylizowanej płytce preparacyjnej z błoną śluzową skierowaną do góry i przymocuj jeden z boków do płytki za pomocą szpilek do wypreparowania.
- Oddziel tkankę błony śluzowej od mięśnia wypieracza za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy (ryc. 3) i utrzymuj błonę śluzową wilgotną, polewając ją solą fizjologiczną lub DMEM.
- Użyj urządzenia do mielenia mięsa, umieszczając je na błonie śluzowej, a następnie przełóż urządzenie z jednego końca na drugi pionowo i poziomo, wywierając ręczny nacisk, aby uzyskać kawałki tkanki mielonej o wymiarach 0,8 mm x 0,8 mm (0,8 mm to odległość między obracającymi się ostrzami tnącymi).
- skóra
- Jeśli biopsja skóry jest gruba: umieść skórę na sterylnej płytce preparacyjnej i użyj nożyczek chirurgicznych, aby oddzielić naskórek od podskórnej tkanki tłuszczowej i skóry właściwej. Naskórek jest cienki i półprzezroczysty (ok. 0,3 mm), gdy jest gotowy do mielenia.
- Użyj urządzenia do mielenia mięsa, umieszczając je na naskórku. Pod naciskiem przełóż urządzenie z jednego końca na drugi pionowo i poziomo, aby uzyskać kawałki tkanki mielonej o wymiarach 0,8 mm x 0,8 mm.
3. Przygotowanie autoprzeszczepów PCL/kolagenu z tworzywa sztucznego
- Umieść wszystkie składniki na lodzie, aby pozostały zimne. Potrzebne przybory: probówka Falcon, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH i kolagen z ogona szczura typu 1.
- Wymieszaj 2 ml 10x DMEM (ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków) z 12 ml kolagenu typu 1. Dodaj 1 N NaOH, kropla po kropli, aby doprowadzić pH do 7,4–8 (kolor w pożywce powinien wskazywać na pH, zmieniając się z intensywnie żółtego na różowy). Ponadto użyj paska pH.
- Ostrożnie dodaj 2 ml 1x DMEM i wymieszaj roztwór. Rozlać około 2 ml kolagenu do każdego dołka stalowej prostokątnej formy (20x30x10 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 10 min.
UWAGA: Stężenie kolagenu powinno wynosić 2,06 mg/ml w 0,6% kwasie octowym, a ilość kolagenu 1 ml/cm2. - Gdy kolagen osadzi się w formie, umieść biomateriał (PCL) na żelu kolagenowym (20 mm x 30 mm) i wlej na niego pozostały kolagen (około 6 ml). Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 20 min.
- Umieść zmieloną tkankę (do ekspansji 1:6) na wierzchu żelu kolagenowego. Wyciśnij wodę z konstrukcji za pomocą siły mechanicznej, używając ściskania tworzywa sztucznego w następujący sposób (rysunki 3 i 4).
- Umieść grubą warstwę gazików na sterylnej powierzchni. Umieść jedną siatkę ze stali nierdzewnej (o grubości 400 μm) na gazikach, a następnie arkusz siatki nylonowej (o grubości 110 μm). Ostrożnie przenieś żel kolagenowy/tkankę mieloną na nylonową siatkę i ostrożnie wyjmij prostokątną stalową formę.
- Umieść nową warstwę nylonowej siatki na wierzchu żelu kolagenowego / tkanki mielonej. Umieść drugą stalową siatkę na górze nylonowej siatki. Umieść na miejscu płytkę dociskową lub załadowczą o wadze co najmniej 120 g (tj. szklaną płytkę) na 5 minut.
- Usuń obciążnik, nylonowe i stalowe siatki. Autoprzeszczepy są teraz gotowe do przyszycia do pęcherza moczowego świni w ranach skóry o pełnej grubości lub hodowli in vitro.
- W przypadku hodowli in vitro pokrój cienką konstrukcję na małe kawałki pasujące do płytek 12-dołkowych. Dodać 1 ml pożywki z keratynocytami. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i hodowli do 6 tygodni i zmieniać podłoże 3 razy w tygodniu.
4. Szew autoprzeszczepów
- Szew autoprzeszczepu z mieloną błoną śluzową pęcherza moczowego do pęcherza świni
- Utrzymuj autoprzeszczep wilgotny w DMEM w czasie oczekiwania. Zszyj autoprzeszczep za pomocą cienkich schodzących szwów monofilamentowych. Do celów badawczych należy stosować niewchłanialny 5-0 Ethilon.
- Sprawdź, czy jest wodoszczelny, napełniając pęcherz solą fizjologiczną przez cewnik moczowy na stałe. Jeśli to możliwe, przykryj autoprzeszczep warstwą większej sieci zębów. Zamknąć ścianę jamy brzusznej, tkankę podskórną i skórę zgodnie z opisem w ppkt 1.2.6. Założyć opatrunek na rany.
- Zszycie autoprzeszczepu z mielonym naskórkiem skóry do rany o pełnej grubości
- Utrzymuj autoprzeszczep wilgotny w DMEM w czasie oczekiwania.
- Zszyj autoprzeszczep do dolnej części rany skóry o pełnej grubości za pomocą przerywanych szwów w rogach i w środku autoprzeszczepu, aby autoprzeszczep był ściśle przymocowany do powierzchni znajdującej się pod spodem.
- Przykryj ranę plastikowym opatrunkiem, który utrzymuje ranę w wilgoci.
5. Zakończenie
- Przed zakończeniem leczenia należy uspokoić zwierzę poprzez domięśniowe wstrzyknięcie podchlorynu zolazepamu (2,5 mg/kg) i medetomidyny (25 μg/kg) i zastosować urządzenia monitorujące do ucha lub ogona w celu sprawdzenia tętna i ciśnienia krwi.
- Poddaj zwierzę eutanazji, podając dożylnie śmiertelną dawkę pentobarbitalu sodu (60-140 mg/kg). Sprawdzaj puls i ciśnienie krwi do momentu śmierci.
6. Kultura in vitro
UWAGA: Aby ocenić histologicznie postęp tkanki mielonej w konstruktach PCL/kolagen in vitro, plastry kolagenu/PCL/mielone hoduje się na 12-dołkowych płytkach przy użyciu pożywki keratynocytowej.
- Przygotowanie pożywki keratynocytowej:
- Wysterylizuj szklaną butelkę o pojemności 500 ml.
- Wymieszaj 400 ml DMEM ze 100 ml Ham's F12 (mieszanka 4:1). Suplement zawierający 10% płodową surowicę bydlęcą, 5 μg/ml insuliny, 0,4 μg/ml hydrokortyzonu, 21 μg/ml adeniny, 10-10 mol/L toksyny, 2 x 10-9 mol/L trójjodotyroniny, 5 μg/ml transferyny, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
- Sterylizować przez filtrację przez filtr 0,2 μm i zebrać filtrat do sterylnej butelki o pojemności 500 ml.
7. Immunohistochemia
UWAGA: Protokół immunohistochemiczny jest zazwyczaj podzielony na następujące etapy: (1) utrwalanie i zatapianie parafiny, (2) mikrocięcie do plastrów 5 μm, umieszczanie na szkiełkach, deparafinacja i ponowne nawodnienie, (3) demaskowanie, barwienie i montowanie antygenu. Przed przystąpieniem do ostatnich kroków procedury immunohistochemicznej należy przygotować myjące i roztwór demaskujący antygen (patrz szczegółowe informacje na temat materiału). Przygotować złożony roztwór ABC co najmniej 30 minut przed użyciem.
- Fixation
UWAGA: Pod koniec hodowli in vitro utrwalić plastry w następujący sposób:- Przygotuj probówki Eppendorfa z 1 ml 4% buforowanego formaldehydu (PFA) (Uwaga: formaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zapoznanie się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych przed rozpoczęciem pracy z tą substancją chemiczną. Nosić rękawice i okulary ochronne i przygotować roztwór w okapie).
- Przenieś każdy z plastrów kolagenowych do probówki Eppendorfa zawierającej 4% PFA. Napraw przez noc w temperaturze pokojowej.
- Próbki należy umieścić w 70% etanolu w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C. Próbki są teraz gotowe do odwodnienia i zatopienia w blokach parafinowych przed cięciem.
- Rehydracja
- Umieść szkiełka w słoiku do barwienia z X-tra solv na 15 minut. Powtórz tę czynność, używając nowego słoika do barwienia z X-tra solve. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia z absolutnym etanolem na 10 minut. Powtórz tę czynność, używając nowego słoika do barwienia z absolutnym etanolem. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia z 95% etanolem na 10 minut, a następnie w słoiku do barwienia z 70% etanolem na 10 minut. Na koniec umyj szkiełka dwukrotnie przez 5 minut wodą destylowaną.
- Demaskowanie antygenu
- Umieść szkiełka w słoiku Coplin z roztworem TE i włóż słoik do łaźni wodnej, aby gotować przez 20 minut. Ostrożnie wyjmij słoik z łaźni wodnej. Schłodzić szkiełka do temperatury pokojowej przez 30 minut i umyć dwukrotnie przez 5 minut w buforze Tris. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia z 3% nadtlenkiem wodoru na 10 minut. Umyj szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w buforze Tris. Narysuj okrąg wokół próbek za pomocą wodoodpornego pisaka do znakowania.
- Zablokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciała za pomocą 100–300 μl roztworu blokującego. Usunąć roztwór blokujący i dodać 100–300 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozpuszczonego w zalecanym stężeniu w buforze Tris. Inkubować przez noc. Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć skrawki w buforze Tris dwukrotnie przez 5 minut.
- Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Myć dwukrotnie przez 5 minut w buforze Tris. Inkubuj 30 minut za pomocą zestawu ABC Elite Kit (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta). Umyć dwukrotnie w buforze Tris.
- Rozwiń reakcję przeciwciał za pomocą zestawu Vector VIP, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (1-7 minutowa inkubacja zwykle daje wyraźną fioletową intensywność). Umieść szkiełka w wodzie destylowanej. Barwienie przeciwstawne hematoksyliną Mayera przez 30 sek.
- Myć pod bieżącą wodą przez 5 minut. Umieścić szkiełka w słoiku do barwienia z 70% etanolem na 1 minutę. Powtórz tę czynność, używając nowego słoika do barwienia z 70% etanolem. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia z 95% etanolem na 1 minutę. Powtórz tę czynność, używając nowego słoika do barwienia z 95% etanolem.
- Umieść szkiełka w słoiku do barwienia z X-tra solve na 5 minut. Wyjmuj pojedynczo, aby pozostały wilgotne. Umieść kroplę podłoża montażowego na każdym szkiełku i połóż na nim szklankę nakrywkową (rób to ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza). Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc i view szkiełka pod mikroskopem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym badaniu przedstawiono metodę wytwarzania biomateriału do transplantacji z wykorzystaniem plastycznej kompresji kolagenu i rozdrobnionej tkanki.
Śluzówkę pęcherza moczowego oraz skórę można pobrać, a następnie mechanicznie posiekać na małe cząsteczki (Rysunek 3). Poprzez kompresję plastikiem posiekane cząsteczki zostają włączone w kompozytowy rusztowanie składający się z centralnie umieszczonego biodegradowalnego polimeru o wysokiej wytrzymałości mechanicznej, otoc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przedstawiono łatwe w użyciu podejście do wytwarzania plastrów na ścianach pęcherza moczowego z tkanką autologiczną do przeszczepu na stole operacyjnym. Plastry powstają w wyniku połączenia biodegradowalnej dzianiny polimerowej w środku i kolagenu z tkanką mieloną i bez niej na zewnętrznych powierzchniach w połączeniu z kompresją z tworzywa sztucznego. Kompresja plastyczna jest metodą opisaną wcześniej przez innych autorów i można ją zdefiniować jako szybkie wydalanie płynu z żeli kolagenowych12...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Szwedzkiemu Towarzystwu Badań Medycznych, Fundacji Promobilia, Fundacji Księżnej Lovisy, Fundacji Masońskiej na rzecz Opieki nad Dziećmi, Szwedzkiemu Towarzystwu Medycznemu, Fundacji Solstickan, Instytutowi Karolinska oraz Radzie Miasta Sztokholmu za wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cewnik silikonowy 10-francuski | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, sekcja 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Sekcja uciskowa z tworzywa sztucznego 4 |
| Płytki 24-dołkowe | Falcon | 08-772-1 | Sekcja uciskowa z tworzywa sztucznego 4 |
| 3',3',5-Trijodotyronina | Sigma-Aldrich | IRMM469 | Hodowla in vitro; Sekcja 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| 70% etanol | Histolab | Immunocytochemia; Sekcja 6 | |
| Zestaw ABC Elite: Zestaw do wykrywania biotyny i streptawidyny | Wektor | PK6102 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Etanol bezwzględny | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | in vitro hodowla; Sekcja 5 |
| Atropina 25 μ g/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Wielka Brytania | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Azaperon 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 kaptur | Kompresja z tworzywa sztucznego; Sekcja 4 | ||
| Rozwiązanie blokujące: Wytworzono normalną surowicę tego samego gatunku co drugorzędowe przeciwciało. | Wektor | Roztwór blokujący zależy od pochodzenia pierwszego przeciwciała | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Buprenorfina 45 μ g/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Karprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Szwecja | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Glukonian chlorheksydyny | Hibiscrub 40&cienkie; mg/mL, Regent Medical, Anglia | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Toksyna | Sigma-Aldrich | C8052 | in vitro hodowla; Sekcja 5 |
| Słoik z kopeliny: słoik do barwienia do gotowania | Histolab | 6150 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Forma ze stali nierdzewnej (33 mm x 22 mm x 10 mm) wykonana | Kompresja z tworzywa sztucznego; Sekcja 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Sekcja kompresji tworzywa sztucznego 4. Trzymaj na lodzie podczas stosowania go w kompresji plastycznej |
| Naskórkowy czynnik wzrostu | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro hodowli; Sekcja 5 |
| Ethilon (niewchłanialna żyłka do szwów skórnych) | Ethicon | Surgery, Sekcja 1 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Gibco | 10437-036 | Sekcja ucisku plastycznego 4 |
| Kleszcze (Adison z zębem) | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | ||
| Gaza (Gazin Mullkompresse) | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, sekcja 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Sekcja ucisku plastycznego 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Komora wilgotnościowa | DALAB | Immunocytochemia; Sekcja 6 | |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H0888 | in vitro hodowla; Sekcja 5 |
| Roztwór nadtlenku wodoru 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Posiewy insuliny | Sigma-Aldrich | I3536 | in vitro; Sekcja 5 |
| Izofluran | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Lidokaina 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Szwecja | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Marker pen pap | pen Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Medetomidyna 25 μ g/kg | Domitor, Orion Pharma, Szwecja | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Urządzenie do mielenia | Applied Tissue Technologies LLC | Przygotowanie tkanek mielonych, sekcja 2 | |
| Monocryl (wchłanialna żyłka) | Ethicon | Surgery, sekcja 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Sekcja kompresji z tworzywa sztucznego 4 i hodowla komórkowa |
| Siatka nylonowa, 110 μ M gruby rozmiar porów 0,04 mm² | Kompresja z tworzywa sztucznego; Sekcja 4 | ||
| Oculentum simplex APL: maść do ochrony oczu | APL | Vnr 336164 | Chirurgia, sekcja 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Sekcja ucisku plastycznego 4 |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140-122 | Sekcja uciskowa z tworzywa sztucznego 4 |
| Fenobarbituran 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Szwecja | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| PCL Dzianina | Kompresja z tworzywa sztucznego; Sekcja 4 | ||
| Kolagen ze szczurzego ogona | First LINK, Ltd, Wielka Brytania | 60-30-810 | Sekcja uciskowa z tworzywa sztucznego 4, trzymaj na lodzie |
| Ostrze skalpela - 15 | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | ||
| Nożyce | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | ||
| Siatka ze stali nierdzewnej, 400 μ M gruby rozmiar | Kompresja z tworzywa sztucznego; Sekcja 4 | ||
| Sterylne rękawiczki | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | ||
| Sterylne fartuchy | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | ||
| Sterylne obłożenia | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Nici do szwu Ethilon | Przygotowanie zwierzęcia do zabiegu chirurgia, Sekcja 1 | ||
| Roztwór TE (roztwór demaskujący antygen) składa się z 10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 9,0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, dostosować pH do 9,0 | ||
| Podchloryn tyletyminy 2,5 mg/kg | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | ||
| Transferyna | Sigma-Aldrich | T8158 | in vitro hodowla; Sekcja 5 |
| Podstawa Trizma, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Zestaw Vector VIP: Enzym zestaw substratów peroksydazy | Vector | SK4600 | Immunocytochemia; Sekcja 6 |
| Vicryl (wchłanialny sztyftowany) | Ethicon | Surgery, Sekcja 1 | |
| Bufor Tris pH 7,6 (bufor myjący) | Roztwór TE: Przygotować 10x (0,5 M Tris, 1,5 M NaCl) przez zmieszanie: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121,14 g/mol), dodać 800 ml wody destylowanej, dostosować pH do 7,6, dodać 87,7 g NaCl i napełnić do 1000 ml wodą destylowaną. Rozcieńczyć do 1x wodą destylowaną. | ||
| X-tra solv (rozpuszczalnik) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemia; Sekcja 6. Stosować pod wyciągiem |
| Zolazepam hipochlor | Zoletil, Virbac, Francja | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Paski wosku do depilacji | Veet | Przygotowanie zwierzęcia do operacji, Sekcja 1 | |
| Pentobarbital sodu | Zakończenie Lundbecka | , sekcja 3 |
Bibliografia
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734(2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
