Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53062

⸱

11 listopada 2015

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

W tym artykule

Podsumowanie

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Streszczenie

Badania genetyczne u myszy oparte na fenotypie są potężną techniką odkrywania funkcji genów, ale często są utrudnione przez bardzo wysokie koszty, co poważnie ogranicza jej potencjał. Opisujemy tutaj zastosowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy (ES) jako komórek zastępczych do badań przesiewowych pod kątem fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie wprowadzania tych komórek do zarodka gospodarza, aby rozwinąć się w żywą mysz będącą nosicielem fenotypu. Metoda ta zapewnia (1) opłacalną, wysokoprzepustową platformę do genetycznych badań przesiewowych w komórkach ssaków; (2) szybki sposób identyfikacji zmutowanych genów i weryfikacji związku przyczynowego; oraz (3) skrót do opracowania mutantów myszy bezpośrednio z tych wybranych komórek ES do badań na całych zwierzętach. Wykazaliśmy zastosowanie parakwatu (PQ) do selekcji opornych mutantów i identyfikacji mutacji, które nadają odporność na stres oksydacyjny. Inne stresory lub związki cytotoksyczne mogą być również wykorzystywane do badań przesiewowych w poszukiwaniu opornych mutantów w celu odkrycia nowych genetycznych determinantów różnorodnej odporności komórkowej na stres.

Wprowadzenie

Długowieczność ma ścisły związek z odpornością na stres. Ogólnie rzecz biorąc, gatunki długowieczne często wykazują zwiększoną odporność na wiele czynników stresogennych, takich jak nadtlenek wodoru, parakwat (PQ), promieniowanie UV, ciepło i metale ciężkie 1,2. W przeciwieństwie do tego, zwiększona wrażliwość na stres ma tendencję do przewidywania skróconej długości życia i/lub bardziej podatnego na choroby fenotypu. Od dawna spekulowano, że szlak wymiatania przeciwutleniaczy odgrywa główną rolę w nadawaniu zwierzęciu odporności na stres. Jednakże, z nielicznymi wyjątkami, badania przeprowadzone na różnych transgenicznych zwierzętach z manipulacjami różnymi enzymami przeciwutleniającymi (np. SOD) wskazują, że zwiększenie poziomu enzymów wymiatających utleniacze nie zwiększa długości życia ani długości zdrowia. Dane te sugerują, że cecha odporności na stres konsekwentnie obserwowana u długowiecznych zwierząt jest pośredniczona przez inne szlaki komórkowe, które nie zostały jeszcze odkryte.

Przyjęliśmy bezstronne podejście genetyczne do identyfikacji genów, które po mutacji mogą nadać fenotyp odporności na stres w hodowanych embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Komórki ES oferują dwie główne zalety w tym badaniu: (1) dostępne są wyrafinowane manipulacje genetyczne w celu modyfikacji genomu komórek ES; oraz (2) wszelkie odporne na stres komórki ES odzyskane z ekranu mogą być bezpośrednio wykorzystane do produkcji myszy, co pozwala na szybkie przełożenie na badania na całych zwierzętach w celu pomiaru długości życia i długości zdrowia.

W tym raporcie opisaliśmy użycie linii komórkowej C9 ES, w której allele Blm były kontrolowane przez element reagujący na tetracyklinę. Leczenie doksycykliną (dox) przejściowo wyłączało ekspresję Blm, prowadząc do zwiększonej wymiany chromatyd siostrzanych. Ten krótkotrwały nokaut Blm pozwolił na wytworzenie homozygotycznych mutacji w populacji heterozygot, dzięki czemu mutacje recesywne dotyczące odporności na stres mogły zostać wychwycone w procesie badań przesiewowych. Opisaliśmy również zastosowanie transpozonu piggyBac (PB) jako mutagenu do losowego wstawiania kasety pułapki poli-A (PB-UPA) w celu mutacji genów w genomie. Komórki z przerwaniem genu przez pułapkę poli-A stały się odporne na G418 i mogły zostać odzyskane, dzięki czemu można było stworzyć kolekcję mutantów pułapek genowych (biblioteka pułapek genowych), a następnie przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem zmutowanych klonów, które były odporne na stres.

Odporne na stres klony odzyskane z selekcji można dość szybko scharakteryzować za pomocą technik molekularnych pod względem liczby insercji (qPCR), miejsca insercji (splinkerette PCR), tożsamości uszkodzonego genu (BLAST) i poziomu jego ekspresji (RT-qPCR). Insercja PB może zostać ponownie zmobilizowana przez przejściową ekspresję transpozazy mPB w klonie w celu przywrócenia sekwencji DNA typu dzikiego, a tym samym przetestowania utraty odporności na stres. Są to skuteczne sposoby na potwierdzenie przyczynowości mutacji, co powinno być wykonane przed kosztowną produkcją myszy. Wcześniejsze badania wykazały, że komórki wystawione na działanie stresorów utraciły pluripotencję 4,5. Tak więc w tym protokole zachowanie repliki zestawu zmutowanych komórek, które nie byłyby leczone stresorami, ma kluczowe znaczenie dla udanej produkcji myszy.

Nasze laboratorium zaprojektowało linię komórkową C9 ES i wektor PB-UPA, oba są dostępne dla innych badaczy na żądanie. Opisany tutaj protokół rozpocznie się od wygenerowania biblioteki de novo uwięzionych genowo komórek ES z PB-UPA (Figura 1A), a następnie posiewu replik i selekcji stresu w celu wyizolowania klonów odpornych na stres (Figura 1B). Pokazaliśmy selekcję za pomocą parakwatu, silnego generatora wolnych rodników wewnątrz komórek. Praktycznie każdy związek cytotoksyczny lub toksyna, na przykład stresory ER (np. Thapsigargin i tunikamycyna), utleniacz neuronalny (np. MPP+, 6-hydroksydopamina i rotenon), ciepło i metale ciężkie (np. Cd, Se), można dostosować do metody selekcji odpowiednich opornych mutantów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Budowa biblioteki komórek ES z pułapką genów za pomocą transpozonu piggyBac

  1. Przygotowanie pierwotnych mysich fibroblastów zarodkowych (PMEF) jako składników odżywczych do hodowli komórek ES
    1. Rozmrozić jedną fiolkę inaktywowanego przez C PMEF mitomycyny (5,0 x 10:6) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś komórki do 5 ml pożywki komórkowej ES (DMEM zawierającej 15% FBS, 1000 jednostek/ml czynników hamujących białaczkę, 100 μM aminokwasów endogennych, 2 mM glutaminy, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 25 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny) i odwiruj przy 100 x g przez 5 min.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 30 ml pożywki z komórek ES, a następnie rozprowadzić do dwóch kolb T25 (każda po 5 ml) i dwóch płytek o średnicy 100 mm (każda po 10 ml). Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  2. Hodowla i ekspansja komórek C9 ES
    1. Rozmrozić jedną fiolkę z komórkami C9 ES (2,5 x 106 komórek w 0,5 ml) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść komórki do 5 ml pożywki z komórek ES. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki ES w 5 ml pożywki dla komórek ES, a następnie posiać w kolbie zasilającej T25. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Codziennie wymieniaj pożywkę z ogniwami ES.
    3. Po 2 dniach hodowli komórki ES powinny stać się ~80% zlewające się i gotowe do przejścia. Umyj komórki 5 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+), a następnie dodaj 2,5 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Dodać 2,5 ml pożywki z komórek ES, aby zatrzymać trypsynę; Pipetuj w górę i w dół 15 razy, aby rozbić grudki komórek. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki z komórek ES. Przenieść 1 ml komórek na 100-milimetrową płytkę zawierającą 9 ml pożywki z komórek ES; Przygotuj dwie płytki o średnicy 100 mm. Jest to fragment z 1:8. Codziennie podawaj komórki 10 ml pożywki ES
      5. .
  3. Przygotuj 96-dołkowe płytki zasilające dla biblioteki
    1. Jak opisano w ppkt 1.1.1, rozmrozić trzy fiolki inaktywowanego PMEF mitomycyny-C (każda zawierająca 5 x 106 komórek) i ponownie zawiesić komórki z każdej fiolki za pomocą 33,3 ml pożywki z komórek ES. Połącz komórki, aby uzyskać 100 ml zawiesiny komórek.
    2. Umieść 100 μl komórek w basenie na dziesięciu 96-dołkowych płytkach. Te 96-dołkowe płytki zasilające powinny być przygotowane co najmniej jeden dzień przed transfekcją komórek C9 ES transpozonem PB.
  4. Elektroporacja ogniw C9 ES wektorem PB-UPA
    1. Trypsynizuj i policz rozszerzone komórki C9 ES za pomocą automatycznego licznika komórek. Umyć każdą 100-milimetrową płytkę z komórkami C9 ES 10 ml PBS. Dodać 8 ml podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Zatrzymaj trypsynę, dodając 2 ml pożywki z komórek ES. Przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i pipetuj w górę i w dół 15 razy, aby rozbić grudki komórek. Natychmiast odwirować przy 100 x g przez 5 minut, a następnie zasysać supernatant.
    3. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki ES i policzyć komórki ES za pomocą hemocytometru. Przygotować sześć 15-mililitrowych probówek z zawiesiną komórek, z których każda zawiera 5 x 106 komórek ES. Wirować przy 100 x g przez 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić każdą osad komórkowy w 0,8 ml PBS.
    4. Przygotuj sześć kuwet do elektroporacji (odstęp 4 mm), do których przenosi się ogniwa o pojemności 0,8 ml. Do każdej kuwety dodać 1 μg PB-UPA i 20 μg transpozazy mPB (mPBazy); Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół. Umieść kuwety na lodzie. Wykonaj elektroporację za pomocą elektroporatora przy ustawieniu wykładniczym na 250 V, 500 μF i nieskończoności omów.
      UWAGA: Zazwyczaj stała czasowa wynosi około 10 do 12 ms dla udanej elektroporacji, co daje około 1,500 do 2,000 transformantów odpornych na G418 na 5 x 106 ogniw
      5. .
    5. Pobrać i połączyć transfekowane komórki w kolbie T75 zawierającej 98 ml pożywki z komórek ES. Wymieszać komórki za pomocą delikatnego pipetowania, a następnie przenieść komórki do zbiornika (50 ml). Za pomocą 12-kanałowej pipety przenieś 100 μl komórek na studzienkę na wcześniej przygotowane 96-dołkowe płytki podajnika (w sumie 10). Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Po 24 godzinach codziennie karmić komórki świeżą pożywką komórkową ES zawierającą G418 (150 μg/ml), aby wybrać klony uwięzione w genach.
      UWAGA: Zazwyczaj każda studzienka zawiera około dziesięciu kolonii odpornych na G418. Kiedy te kolonie osiągną odpowiedni rozmiar (zwykle 5-7 dni), 96-dołkowe płytki (biblioteka) zostaną zreplikowane do 2 zestawów odpowiednio do przechowywania i selekcji. Każda tablica w bibliotece jest oznaczona jako "podbiblioteka", więc w tym przypadku jest 10 podbibliotek
      7. .

2. Replikacja biblioteki

  1. Powielanie płyt wzorcowych
    1. 24-48 godzin przed osiągnięciem przez kolonie oporne na G418 50-60% konfluencji, rozmrozić kolejne trzy fiolki PMEF inaktywowanego mitomycyną C na dziesięciu 96-dołkowych płytkach jako podajniki (patrz sekcja 1.3). Żelatynizować dziesięć 96-dołkowych płytek przez inkubację 0,1% żelatyny (100 μl/basenik) w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15–30 minut; Dopuszczalna jest inkubacja O/N.
    2. Przygotować zawiesiny jednokomórkowe na płytkach 96-dołkowych przez trypcynizację. Odessać pożywkę z płytek 96-dołkowych i przemyć raz równą objętością PBS (bez Ca2+, Mg2+). Dodać 50 μl podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA, inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 10 minut. Zatrzymaj trypsynę za pomocą 50 μl pożywki komórkowej ES. Rozbij grudki komórek, pipetując 15 razy w górę i w dół za pomocą pipety wielokanałowej.
    3. Przenieść 50 μl trypsynizowanej zawiesiny komórkowej do odpowiedniego rzędu płytki podającej (Master) zawierającej już 150 μl pożywki z komórek ES, a pozostałe 50 μl do odpowiedniego rzędu zżelowanej płytki (repliki) zawierającej już 150 μl pożywki z komórek ES. Przetwarzaj każdy rząd komórek na płytkę wzorcową i replikę. Inkubować płytki (obecnie zawierające 200 μl objętości kultury) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 O/N.
      UWAGA: Obecnie istnieje dwadzieścia płytek 96-dołkowych.
    4. Następnego dnia nakarm komórki 100 μl świeżej pożywki ES zawierającej 150 μg/ml G418. Wymieniaj pożywkę codziennie, aż studzienki zlewają się w 80-90%.
  2. Zamroź płytki główne
    1. Gdy płytki wzorcowe zlewają się w około 80%, trypsynizuj komórki zgodnie z opisem (patrz sekcja 2.1.2).
    2. Usuń płytki i zatrzymaj reakcję trypsyny z 50 μl 2x pożywki zamrażającej (60% pożywki komórkowej ES, 20% FBS, 20% DMSO). Pipetę należy odpipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety wielokanałowej, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie medium zamrażającego.
    3. Umieść 96-dołkowe płytki w szczelnie zamkniętym styropianowym pudełku i umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C na okres do czterech miesięcy. Cztery miesiące dadzą wystarczająco dużo czasu na dokończenie selekcji naprężeń i określenie, które studzienki z płyty głównej zawierają interesujące klony.
      UWAGA: Przechowywanie w temperaturze -80 °C dłużej niż 4 miesiące spowoduje spadek żywotności komórek. Można wykorzystać krioprobówki w formacie 96-dołkowym, które mogą być przechowywane w fazie gazowej ciekłego azotu przez dłuższy okres przechowywania.
  3. Przygotowanie tabliczek DNA i pul podbibliotecznych z replik płyt
    1. 24-48 godzin przed dalszą replikacją na płytkach DNA i pulach subbibliotek, przygotuj dziesięć 100-milimetrowych płytek z inaktywowanym mitomycyną C PMEF dla puli subbibliotecznej i dziesięć żelatynizowanych 96-dołkowych płytek dla replik płytek DNA. Patrz sekcja 1.3, aby zapoznać się z procedurą ogólną.
    2. Trypsynizować komórki w 96-dołkowych płytkach replik (patrz sekcja 2.1.2). Podczas 10-minutowego etapu trypsynizacji odessać żelatynę z płytek DNA i zastąpić 150 μl pożywki z komórek ES zawierającej G418 (150 μg/ml). Należy również przygotować zbiornik zawierający 5 ml pożywki z komórek ES w celu zebrania "podbibliotek" w 100-milimetrowej płycie podającej.
    3. Po trypsynizacji należy przerwać podawanie trypsyny za pomocą 50 μl pożywki z komórek ES po jednym rzędzie na raz za pomocą 12-kanałowej pipety. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby rozbić grudki komórek.
    4. Przenieść 50 μl zawiesiny komórkowej do odpowiedniego rzędu płytki DNA, a pozostałe 50 μl przenieść do zbiornika zawierającego 5 ml pożywki z komórek ES. Po wypełnieniu jednej pełnej płytki 96-dołkowej należy odessać pożywkę z płytki podającej o średnicy 100 mm, do której przenoszone są połączone komórki. Te połączone mutagenne komórki są oznaczone jako "podbiblioteka".
    5. Powtórzyć te czynności dla pozostałych dziewięciu płytek 96-dołkowych. Codziennie karmić 96-dołkowe płytki DNA i 100-milimetrowe płytki "podbiblioteczne" pożywką komórkową ES zawierającą G418 (150 μg/ml).
      UWAGA: Obecnie znajduje się tam dziesięć 96-dołkowych płytek "DNA" i dziesięć 100-milimetrowych płytek "subbibliotecznych".
  4. Zamrozić płytki DNA. Gdy komórki na płytce DNA są w 80-90% zlewne, odessać pożywkę, dwukrotnie przemyć komórki 100 μl PBS i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej izolacji genomowego DNA 6. Te płytki DNA zostaną poddane badaniom przesiewowym metodą PCR w celu określenia, która odpowiadająca im studzienka na płytce "Master" zawiera badany klon.

3. Homozygotyczne mutanty wywołane doksycykliną

  1. Zamrozić pule podbibliotek i komórki pasażowe do leczenia doksycykliną
    1. Na 24 godziny przed 100-milimetrowymi płytkami "podbibliotecznymi" z koloniami wystarczająco dużymi, aby uzyskać 70-80% konfluencji, należy przygotować zestaw dziesięciu żelatynizowanych 100-milimetrowych płytek do leczenia doksycykliną.
    2. Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek w każdej podbibliotece (szczegółowe informacje znajdują się w sekcjach 1.4.1 i 1.4.2). Przenieść 5 x 106 komórek na zżelowaną płytkę o średnicy 100 mm z doksycykliną (1 μg/ml); inkubować w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 . Zamrozić pozostałe pule podbibliotek traktowane niedoksycykliną w 5 x 106 komórek na fiolkę.
  2. Komórki pasażowe w obecności doksycykliny w celu wyeliminowania Blm
    1. Przejście przez podbiblioteki w stosunku 1:8 co 2-3 dni w obecności doksycykliny (1 μg / ml) przez okres do dwóch tygodni, w tym czasie indukowany doks nokaut Blm będzie sprzyjał utracie heterozygotyczności w populacji komórek, umożliwiając wytwarzanie homozygotycznych mutantów.

4. Selekcja naprężeń i izolacja odpornych klonów

  1. Badane komórki traktowane doksycykliną w celu selekcji stresu
    1. 24 godziny przed pasażowaniem komórek traktowanych doksycykliną w celu selekcji stresu, przygotować dziesięć zżelatynizowanych płytek o średnicy 150 mm, umieścić w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO2 .
    2. Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki w każdej podbibliotece przez trypsynizację (szczegółowe informacje znajdują się w sekcjach 1.4.1 i 1.4.2). Wysiewaj 6,6 x 106 komórek na każdej 150-milimetrowej płytce w 30 ml całkowitej objętości kultury, równomiernie rozprowadź komórki. Inkubuj komórki ze stresorem (10 μM parakwat lub pominięcie β-merkaptoetanolu, w pożywce komórkowej ES zawierającej 7,5% inaktywowanego termicznie FBS) przez 7 dni, po czym zastąp normalną pożywką komórkową ES, aby umożliwić komórkom, które przeżyły, wzrost w kolonie do pobrania.
    3. Opcjonalnie: Zamrozić pozostałe komórki poddane działaniu doksycykliny w ilości 5,0 x 106 komórek w fiolce.
  2. Zbieraj kolonie odporne na stres
    1. Po przywróceniu normalnej pożywki na tydzień obserwuj, ile jest obecnych kolonii odpornych na stres. W zależności od liczby kolonii, które mają zostać pobrane, należy przygotować wystarczającą ilość studzienek z PMEF inaktywowanym przez mitomycynę C na 96-dołkowych płytkach odpowiednio dzień wcześniej (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 1.1).  
    2. W dniu pobrania odessać i zastąpić pożywkę na 96-dołkowej płytce podającej 100 μl świeżej pożywki z komórek ES, umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% wilgotnościCO2. W tym czasie przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U z 50 μl 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę. Odessać pożywkę z płytki selekcyjnej o średnicy 150 mm i dodać równą objętość PBS.
    3. Ustawić mikropipetę na 2 μl i "wybrać" ocalałe kolonie do studzienek zawierających trypsynę na dnie U, wybierając po jednej kolonii na studzienkę. Dopuszczalne jest pozostawienie szalki w temperaturze pokojowej do momentu zebrania żądanej liczby kolonii. Następnie inkubować dolną płytkę U w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 10 min.
      UWAGA: Zazwyczaj wybieranie 96 kolonii zajmuje nam 1 godzinę.
    4. Zatrzymaj reakcję trypsyny rząd po rzędzie za pomocą 50 μl pożywki z komórek ES za pomocą pipety wielokanałowej. Pipetować w górę i w dół 15 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i przenieść 100 μl komórek do odpowiedniego rzędu płytki podającej, która zawiera już 100 μl pożywki komórkowej ES. Zakończ przenoszenie dla całego talerza. Hodowla komórek O/N w 200 μl. Następnego ranka odessać pożywkę i zastąpić pożywką komórkową ES o pojemności 100 μl.
  3. Powtórz płytki 96-dołkowe
    1. Gdy studzienki pobranych kolonii zlewają się w 80-90%, replikuj się na dwie pasujące płytki, jedną do izolacji DNA, a drugą do tworzenia kopii zapasowych komórek. Płytki te są żelatynizowane i nie zawierają mitomycyny C-inaktywowanej PMEF.
    2. Odessać pożywkę i przemyć 100 μl PBS. Dodać 50 μl 0,25% trypsyny-EDTA do każdego dołka, inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zatrzymać trypsynę za pomocą 150 μl pożywki z komórek ES, wymieszać pipetując i przenieść 100 μl zawiesiny komórek do odpowiedniego rzędu dwóch 96-dołkowych płytek. Zmieniaj medium codziennie.
    3. Gdy płytki zlewają się w 80-90%, należy zamrozić jeden zestaw płytek jako "zapasowy" (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 2.2). Drugi zestaw płyt jest dalej rozbudowywany w sposób opisany poniżej.
  4. Ekspandowanie komórek do izolacji genomowego DNA
    1. Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki w 96-dołkowej płytce DNA (szczegółowe informacje znajdują się w ppkt 2.1.2).
    2. Przenieść zawiesinę komórek z każdego pojedynczego dołka płytki 96-dołkowej do dołka płytki 24-dołkowej (łącznie 4) za pomocą mikropipety. Upewnij się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego żadnych komórek, ponieważ "wybrane" kolonie są pochodzenia "klonalnego". Hoduj komórki w 0,5 ml pożywki ES, zmieniając pożywkę codziennie, aż studzienki będą zlewające się w 80-90%.
      UWAGA: Płytka 24-dołkowa pozwoli na uzyskanie wystarczającej ilości genomowego DNA do analizy PCR.

5. Identyfikacja miejsc insercji PB i uwięzionych genów

  1. Izolacja genomowego DNA z płytki 24-dołkowej: Lizuj komórki na płytce 24-dołkowej i wyizoluj genomowe DNA wolne od RNA.
  2. Wykonać Splinkerette PCR (SpPCR) w celu wygenerowania fragmentów sekwencji otaczających miejsce integracji transpozonu PB zgodnie z opisem 7,8.
    UWAGA: SpPCR to pięciodniowy proces, chociaż czas pracy każdego dnia jest minimalny.

6. Analiza genetyczna zmutowanych klonów

  1. Zlokalizuj mistrza dobrze i oczyść klona, który Cię interesuje.
    1. Po zmapowaniu miejsca integracji PB należy zaprojektować starter do przodu przed miejscem integracji, który będzie używany z starterem odwrotnym PB (np. PB3'-1) 8 i przeprowadzić badanie przesiewowe płytki DNA odpowiadającej tej samej "podbibliotece", z której wybrano klon odporny na stres. Spodziewaj się, że znajdziesz tylko jedną dodatnią studnię na całej 96-dołkowej płytce DNA. Rozmrozić dokładnie tę studnię z płytki "Master" do płytki 24-dołkowej na karmnikach i hodować komórki do uzyskania 80-90% zgrywki.
      UWAGA: W tym momencie ta studnia zawiera mieszaninę klonów uwięzionych w genach.
    2. Gdy 24-dołkowa płytka jest w 80-90% zlewana, trypsynizuj komórki i umieść 1,000 komórek ES na 100-milimetrowej płytce zasilającej (zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki). Przenieść pozostałe komórki do kolby T25 na podajnikach w celu rozprężenia. Zamrozić komórki z kolby T25, gdy kolonie są w 80-90% zlewne. Zamrozić 4 fiolki na kolbę T25 jako zapasowe.
    3. Pozwól koloniom rosnąć przez 7 dni, a następnie zbierz 96 kolonii na 96-dołkową płytkę podającą. Patrz sekcja 4.2, aby zapoznać się z procedurą kompletacji. Zreplikować gotową płytkę na płytkę "DNA" i zamrozić drugą płytkę jako płytkę "2nd-master" (patrz sekcja 2.2 w przypadku zamrażania).
    4. Pozwól koloniom osiągnąć 80-90% konfluencji. Przebadaj płytkę DNA, aby znaleźć studzienki zawierające oczyszczony klon, który Cię interesuje. Rozwiń komórki z 96-dołkowej2-dołkowej płytki głównej do 24-dołkowej, a następnie do kolby T25 (wszystkie na podajnikach). Zamrozić 4 fiolki w kolbie T25.
      UWAGA: W tym momencie linia komórkowa uwięziona w genach jest klonalna, nie została wystawiona na działanie stresora i nadaje się do produkcji na myszach.
  2. Określ liczbę wkłuć PB: Rozmrozić jedną fiolkę odpornej na stres linii komórkowej i rozprężyć komórki w żelatynizowanej kolbie T25. Wyizolować genomowe DNA i sprawdzić liczbę kopii transpozonu PB. Można to osiągnąć za pomocą qPCR ukierunkowanego na gen neomycyny.
  3. Zmierz poziom ekspresji genu: Po potwierdzeniu, że w linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania występuje pojedyncze zdarzenie integracji PB, zmierz poziom ekspresji uwięzionego genu za pomocą RT-qPCR przy użyciu specyficznych sond Taqman dla każdego genu.
  4. Sekwencjonowanie zmutowanego mRNA: Wygeneruj amplikon cDNA metodą PCR przy użyciu startera wyżarzającego do eksonu i startera znajdującego się poniżej wyżarzającego do sekwencji akceptora splicingu kasety pułapki genowej. Zsekwencjonuj fragment cDNA, aby potwierdzić, że oczekiwany splicing występuje w uwięzionym genie.
  5. Ponownie zmobilizuj transpozon piggyBac, aby przetestować związek przyczynowo-skutkowy między uwięzionym genem a odpornością na stres.
    1. 24-48 godzin przed rozmrożeniem komórek do remobilizacji PB, rozmrażanie i płytkowanie podajników DR4 na jednej kolbie T25 i dwóch płytkach 100 mm. Co najmniej jeden dzień po umieszczeniu podajników DR4 w kolbie T25 rozmrozić jedną fiolkę linii komórkowej zawierającej insercję PB i umieścić komórki w kolbie T25 zawierającej podajniki DR4. Hoduj komórki na pożywce ES przez 48 godzin, zmieniając podłoże codziennie.
    2. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek komórek ES. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i przenieś 5,0 x 106 komórek ES do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować przy 100 x g i ponownie zawiesić komórki w 800 μl PBS. Przenieść zawiesinę do kuwety 4 mm.
    3. Dodać 20 μg mPBazyPuro do kuwety, wymieszać przez pipetowanie i elektroporować ogniwa (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 1.4). Rozprowadź transfekowane komórki na dwóch 100-milimetrowych płytach podajnika DR4. Hodowla komórek O/N w pożywce ES.
    4. Następnego ranka nakarm komórki pożywką ES z 1 μg/ml puromycyny i hoduj komórki przez 48 godzin. Wycofaj selekcję puromycyny i kontynuuj hodowlę komórek przez 5 dni. Gdy kolonie są wystarczająco duże do zebrania, wybierz je do 96-dołkowej płytki podającej (patrz sekcja 4.2).
    5. Gdy wybrane komórki osiągną 80-90% zbieżności, podziel 1/6 płytki na płytkę DNA i 1/6 płytki na płytkę G418, pozostawiając 2/3 części komórek na oryginalnej płytce do zamrożenia (patrz sekcja 2.2 w przypadku zamrażania).
    6. Hodować płytkę DNA w pożywce komórkowej ES w celu późniejszej izolacji DNA, a płytkę G418 w 150 μg/ml G418 w celu zbadania utraty oporności na neomycynę. Studzienki bez żywotnych komórek po 72-96 godzinach w hodowli zawierającej G418 wskazują na udaną remobilizację transpozonu PB wychwytującego geny.
    7. Odpowiednie studzienki w płytce "DNA" zostaną przesiane metodą PCR w celu potwierdzenia, że transpozon PB został usunięty. Gdy płytka DNA jest w 90% zlewana, wyizoluj genomowe DNA na 96-dołkowej płytce w formacie 4 do badań przesiewowych PCR w celu przywrócenia sekwencji typu dzikiego i braku neo-IRES jako sposobu na potwierdzenie rewersji.
    8. Rozmrozić pasujące studzienki z płytki głównej do płytki 24-dołkowej i rozszerzyć do kolby T25 (wszystkie z podajnikami). Zamrozić cztery fiolki na kolbę T25 jako zapasowe.

7. Generacja mutantów myszy

  1. Odzyskaj oporne komórki ES z płytek wzorcowych i użyj ich do wstrzyknięcia zarodka w celu wytworzenia chimery. Około 15-20 komórek ES jest wstrzykiwanych do pojedynczej blastocysty C57BL/6. Przenieś 15 blastocyst na mysz do macicy samicy w ciąży rzekomej (szczep ICR). Samiec chimery (wskazywany przez specyficzny kolor sierści agouti komórek ES) odzyskany z miotu należy połączyć z kilkoma młodymi dziewiczymi samicami C57BL / 6J w celu przetestowania transmisji linii zarodkowej i zbudowania kolonii zmutowanych myszy.
  2. Wyizoluj i przetestuj fibroblasty skóry ogona od zmutowanych myszy F1 i rodzeństwa z miotu typu dzikiego pod kątem poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) i odporności na parakwat9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W typowym eksperymencie mutagenezy transfekcja obejmuje łącznie 3 x 107 komórek ES z PB-UPA i transpozazą mPB. Liczba komórek ES z pułapką genową wygenerowanych w dwóch niezależnych eksperymentach została podsumowana w Tabeli 1. Wydajność pułapkowania genów wynosi około 0,04%. Połączone biblioteki pułapek genowych zawierają 22 400 niezależnych mutantów, co stanowi niemal pełne pokrycie genomu myszy (23 000 genów kodujących). Nadmiarowe pokrycie można osiągnąć poprzez wygenerowanie większej lic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Postępowa analiza genetyczna pozwala na bezstronne zbadanie genomu w poszukiwaniu genów odpowiedzialnych za określony fenotyp. Ta metoda jest bardzo skuteczna w odkrywaniu nowych funkcji genów. Jest szeroko stosowany u organizmów niższych, ale nie u ssaków, takich jak myszy, głównie ze względu na niezwykle wysokie koszty związane z infrastrukturą i logistyką, które by się z tym wiązały. W tym przypadku przenieśliśmy proces badań genetycznych na platformę hodowli komórek ES, znacznie zwiększając wydajność i przepustowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Wellcome Trust Sanger Institute za dary w postaci transpozonu piggyBac i transposa piggyBac. Praca ta była wspierana przez Butcher Grant of Colorado i NIH R01 AG041801 (WSC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Kultura tkankowa
500-ml Filtry StericupEMD MilliporeSCGPU05RE
250-ml Filtry StericupEMD MilliporeSCGPU02RE
50-ml Filtry Steriflip-GVEMD MilliporeSE1M179M6
KO DMEMLife Technologies10829-018
DMEMSigma-AldrichD6429
FBSHodowla tkankowa Biologiczne104
Inaktywowany termicznie FBSSigma-AldrichF4135-500
LIFEMD MilliporeESG1107
Aminokwasy endogenneLife Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Pen/StrepLife Technologies15140148
β-merkaptoetanolLife Technologies21985-023
Dichlorek metylu viologenu ( Paraquat)Sigma-Aldrich856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAXSigma-AldrichD2650
EmbryoMAX 0,1% żelatynyEMD MilliporeES006B
DPBS/ZmodyfikowanyHyklonSH30028,02
0,25% Trypsyna-EDTALife Technologies25200-056
T25 KolbaCorning353108
Kolba T75Corning353135
100 mm  płytaCorning353003
150 mm  płytaCorning430599
96-dołkowa  płytaCorning3585
96-dołkowa płyta dolnaCorning3799
Płytka 24-dołkowaCorning3526
Zbiornik 50 ml Corning4870
15-ml probówkiVWR International, LLC82050-276
Pierwotne fibroblasty embrionalne myszyEMD MiliporePMEF-NL
DR4 Mysie fibroblasty embrionalneZastosowane StemCellASF-1001
Mitomycyna CBioReodczynniki Fisher 
Geneticin (G418)Life Technologies11811-023
DoksycyklinaFisher BioReagent 
CryotubesThermo ScientificWirówka 377267
 EppendorfCentrifuge 5702
TC10 licznik komórekBio-Rad
Counting Slides (dla TC10)Bio-Rad1450011
Electroporation
Gene Pulser XcellBio-Rad1652611
Kuwety Gene Pulser (4  mm gap)Bio-Rad1652088
Biologia molekularna
Thermal CyclerEppendorfMastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit BQiagen158745
Zestaw do klonowania Topo-TALife Technologies 450030
Zestaw do syntezy cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems4368814
NaClFisher BioReagents BP358-212
100% etanolDecon Laboratories, Inc.2716
Podwójnie przetworzona kultura tkankowa WodaSigma-AldrichW3500
Sau3A1New England BioLabsR0169L
T4 DNA LigazaNowa Anglia BioLabsM0202T
EcoRVNowa Anglia BioLabsR3195S
96-dołkowy bufor do lizy (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Odczynniki Fisher z kwasem solnym A144-212
EDTASigma-AldrichE5134
N-sól sodowa lauroilosarkozynySigma-AldrichL5777
Proteinaza-KBioodczynniki Fisher BP1700
Electroforeesis
Mini-Sub Cell GTBio-Rad170-4469EDU
LE Agarose GeneMateE3120500
Bromek etydyny Odczynniki Fisher BP1302
100 BP Drabinka DNANew England BioLabsN3231S
1 Kb Drabinka DNANew England BioLabsN3232S
2-logarytmiczna drabinka DNANew England BioLabsN3200L
BP25312BP26531

Bibliografia

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310(2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przesiew genetyczny w kierunku w przódembrionalne komórki macierzysteselekcja paraquatemstrategia płytowania replikacyjnegogenerowanie mutantów mysichprzesiew wysokoprzepustowyproces pułapkowania genówodporność na stres oksydacyjnybiblioteki komórek ES
Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.