Badania nad rozwojem podniebienia są motywowane występowaniem rozszczepu podniebienia, wady wrodzonej, która stanowi ogromne obciążenie dla zdrowia i może pozostawić trwałe zniekształcenie. Demonstrujemy tutaj technikę hodowli półek podniebiennych, którą można wykorzystać do badania różnych szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój i fuzję podniebienia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda badania fuzji podniebienia z wykorzystaniem statycznej hodowli narządów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozszczep wargi i podniebienia należą do najczęstszych wad wrodzonych. Podniebienie wtórne tworzy się z mezenchymalnych półek pokrytych nabłonkiem, który przylega, tworząc szew nabłonkowy linii środkowej (MES). Teorie sugerują, że komórki MES podążają za przejściem nabłonkowym do mezenchymalnego (EMT), apoptozą i migracją, tworząc połączone podniebienie 1. Całkowita dezintegracja MES jest ostatnią istotną fazą zbiegu podniebienia z otaczającymi komórkami mezenchymalnymi. Udostępniamy metodę hodowli narządów podniebienia. Opracowany protokół in vitro pozwala na badanie procesów biologicznych i molekularnych zachodzących podczas fuzji. Zastosowania tej techniki są liczne, w tym ocena reakcji na egzogenne czynniki chemiczne, wpływ czynników regulacyjnych i wzrostu oraz określonych białek. Hodowla narządów podniebiennych ma wiele zalet, w tym manipulację na różnych etapach rozwoju, która nie jest możliwa przy użyciu badań in vivo.
Wprowadzenie
Rozszczepy wargi i podniebienia są najczęstszymi wadami rozwojowymi czaszkowo-twarzowymi. Biorąc pod uwagę wszystkie możliwe wady czaszkowo-twarzowe, stanowią one drugą pod względem częstości występowania anomalię wrodzoną u noworodków 2. Rozszczepy podniebienia występują w Stanach Zjednoczonych (US) z częstotliwością około 1 na 700 urodzeń każdego roku; zapadalność na rozszczep podniebienia wynosi 475 dzieci urodzonych z tą wadą miesięcznie lub 15 dzieci z rozszczepem dziennie 3. Około 1% dzieci urodzonych na całym świecie każdego roku wykazuje jakąś formę dysmorfologii czaszkowo-twarzowej.
Rozszczepy podniebienia i warg wymagają bardzo kosztownego i skomplikowanego postępowania, które ma dożywotnie konsekwencje dla pacjentów z tą anomalią. Szacowany koszt leczenia każdego pacjenta z rozszczepem jamy ustnej wynosi około 100 000 $4. Leczenie pacjenta z rozszczepem wargi i podniebienia wymaga zespołu lekarzy, w skład którego wchodzą chirurdzy kraniofacialni, otolaryngolodzy, genetycy, anestezjolodzy, logopedzi, dietetycy, ortodonci, protetycy, psycholodzy, neurochirurdzy oraz okulistycy.
W procesie palatogenezy podniebienie wtórne powstaje jako sparowane wypustki, które początkowo rosną pionowo, a następnie ulegają uniesieniu półek podniebiennych powyżej grzbietu języka. Po uniesieniu sparowane półki podniebienne rosną w kierunku linii środkowej (u myszy w dniach E14.5–E15, a u ludzi w 9. tygodniu). Nabłonek brzegu przyśrodkowego (MEE) pokrywający wierzchołek półki przylega do drugiej półki, tworząc szew nabłonkowy linii środkowej.
Następnie następuje przejście epitelialno-mezenchymalne i/lub apoptoza, aby umożliwić zlanie się mezenchymy. Adhezja przeciwległych MEE jest kluczowym zdarzeniem, którego zaburzenie prowadzi do rozszczepu podniebienia. Jednakże tylko nieliczne badania analizowały początkową adhezję półek podniebiennych5. Podniebienie twarde powstaje w wyniku różnicowania się komórek mezenchymalnych w osteoblasty. Nieprawidłowy rozwój podniebienia może prowadzić do rozszczepów podniebienia z zajęciem warg lub bez niego.
Techniki hodowli organów podniebienia były szeroko stosowane w wielu laboratoriach przez ostatnie 30 lat6,7.
W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy metodę dysekcji podniebienia oraz statycznej hodowli organów. Zaletą nieruchomej hodowli organów jest to, że umożliwia ona zrost półek podniebiennych. Technika ta była z powodzeniem stosowana w naszym laboratorium w wielu eksperymentach dotyczących zrostu i sygnalizacji8,9. Zakres zastosowań tej metody jest jednak bardzo szeroki i może ona być wykorzystywana wszędzie tam, gdzie wymagany jest statyczny system hodowli organów, w tym do oceny odpowiedzi na egzogenne czynniki chemiczne, wpływu regulacyjnych czynników wzrostu w różnych szlakach oraz specyficznych białek.
Rycina 1. Palatogeneza u myszy. Etapy rozwoju podniebienia myszy. (B-F) Skaningowe mikrografie elektronowe (SEM) podniebienia wtórnego w reprezentatywnych momentach rozwoju. Czerwone strzałki: wskazują początkową część adhezji i zrastania się podniebienia. Żółte strzałki: wskazują przestrzeń między podniebieniem pierwotnym a wtórnym, która zniknie po zrośnięciu (przedrukowano z Kaufman11 za zgodą PLOS one).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane procedury muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystywania kręgowców, w tym po uzyskaniu wcześniejszej zgody lokalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).
1. Przygotowanie narzędzi do dyssekcji i pożywek hodowlanych
- Wstępnie umyj wszystkie narzędzia wykorzystywane podczas sekcji 3% nadtlenkiem wodoru, a następnie poddaj je autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 20 min. Przefiltruj pożywkę BGJb z roztworem antybiotyku i środka przeciwgrzybiczego, używając filtra o rozmiarze porów 0,22 µm i ssania próżniowego w dygestorium.
2. Przygotowanie sprzętu hodowlanego
- Wytnij małe trójkąty z filtrów membranowych z poliwęglanu, które będą stanowić podłoże dla organów podniebienia, spryskaj je 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia. Przygotuj naczynie do hodowli organów z centralnym wgłębieniem (60x15 mm), umieszczając czystą i wysterylizowaną równoboczną drucianą kratkę w kształcie trójkąta (20 mm) w płytce do hodowli organów. Następnie napełnij wgłębienie 1 ml pożywki BGJb. UWAGA: Ilość pożywki powinna być wystarczająca, aby osiągnąć poziom kratki, nie zalewając przy tym podniebień. Umieść filtry membranowe błyszczącą stroną do dołu na kratce (3-4 membrany na kratkę). W zależności od przebiegu eksperymentu do pożywki można dodać substancje traktujące (białka, przeciwciała lub inhibitory).
3. Pobieranie zarodków myszy i przygotowanie do hodowli
- Aby uzyskać zarodki myszy typu dzikiego, należy wykorzystać ciężarne myszy szczepu CD-1 w 13,5 dobie ciąży. Obszar sekcji należy oczyścić 70% etanolem.
UWAGA: Można stosować inne szczepy myszy. Preferujemy myszy CD-1 ze względu na większą liczebność miotów. - Ciężarne myszy w E13.5 dpc (dni po zapłodnieniu) należy uśmiercić przy użyciu 5% izofluranu, a następnie wykonać zwichnięcie szyi, aby upewnić się, że zwierzę nie żyje, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.
- Brzuszną powierzchnię brzucha należy spryskać 70% etanolem, aby zapobiec przyklejaniu się włosów do narzędzi. Następnie, używając ostrokończących się nożyczek chirurgicznych i pęsety do mikrosekcji, należy otworzyć jamę brzuszną od strony brzusznej i zlokalizować macicę. Za pomocą pęsety należy unieść całą macicę i oddzielić ją od ciała, przecinając trzon macicy oraz końce rogów macicy lekkimi nożyczkami chirurgicznymi.
- Macicę należy umieścić na czystym ręczniku papierowym na lodzie (zgodnie z przewodnikiem protokołów dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych). Macicę należy przykryć innym czystym ręcznikiem papierowym, aby zapobiec kontaminacji. Przed dalszym użyciem narzędzia należy wysterylizować, spryskując je 70% etanolem. Macicę i zarodki można transportować do laboratorium na lodzie.
- W otwartej komorze z laminarnym przepływem powietrza należy ostrożnie wykonać niewielki otwór w pęcherzyku żółtkowym, używając ostrokończących się nożyczek chirurgicznych i pęsety do mikrosekcji. Należy poszerzyć otwór, a następnie delikatnie go rozsunąć, aby wydobyć zarodek z pęcherzyka żółtkowego.
- Zarodki należy niezwłocznie przenieść do szalki Petriego z zimnym 1X roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) pH 7.4. Aby upewnić się, że zarodki są na właściwym etapie rozwoju, należy zbadać pod mikroskopem sekcyjnym wielkość ciała, głowy oraz morfologię kończyn.
UWAGA: Zarodki, które nie znajdują się na odpowiednim etapie rozwoju, nie są wykorzystywane w eksperymencie.
Rycina 2. Morfologia pączka kończyn. Kończyny przednie i tylne są sprawdzane pod kątem stopnia wcięcia błony między palcami. W stadium E13.5 wszystkie kondensacje palców są wyraźne, a błony oraz dystalne wcięcia między palcami są bardzo dobrze widoczne. Palce kończyn tylnych są opóźnione w rozwoju o pół doby. 12 Górny rząd: kończyna przednia, dolny rząd: kończyna tylna.
4. Disekcja podniebienia
- Umieść pojedyncze zarodki po kolei w szalce Petriego z PBS pod mikroskopem stereotypowym. Za pomocą małych nożyczek sekcyjnych i pęset oddziel głowę od ciała zarodków.
- Utrzymując ostrożnie czaszkę myszy pęsetą powyżej poziomu oczu (unikając wyrostka szczękowego), wykonaj dwa nacięcia po obu stronach linii warg. Następnie usuń żuchwę i język. Wyizoluj obszar wyrostka szczękowego, wykonując cięcie na wysokości oczu, a następnie usuń mózg, oczy, przegrodę nosową i przylegającą tkankę.
Rycina 3.Tkanka podniebienia pobrana z zarodków w 13,5 dniu rozwoju, gdy półki podniebienne uniosły się, ale nie zetknęły jeszcze ze sobą. Półki podniebienne umieszczono w hodowli organowej na filtrze na granicy fazy powietrze-pożywka przez 72 hr w modelu statycznym. (A) Poziom sekcji w zarodku E13.5. (B) Niebieskie gwiazdki wyznaczają obszary chwytania tkanki pęsetą podczas sekcji. (C) Widok wypreparowanych półek podniebiennych umieszczonych na trapezoidalnej membranie filtracyjnej. (D) Widok boczny naczynia hodowlanego po umieszczeniu wypreparowanych podniebień i dodaniu pożywki hodowlanej.
- Umieść podniebienie stroną jamową do góry, a następnie usuń przegrodę nosową oraz otaczające ją tkanki, pozostawiając przytwierdzone podniebienie pierwotne, aby ułatwić orientację w osi przednio-tylnej. Za pomocą szpatułki łyżkowej bardzo ostrożnie przenieś półki podniebienne (stroną nosową do dołu) na przygotowane filtry na siatkach w naczyniach hodowlanych. UWAGA: Dostosuj objętość medium, aby zapewnić odpowiedni kontakt fazy powietrze-medium.
- Pod mikroskopem stereoskopowym wypreparuj podniebienie pierwotne i za pomocą pęsety umieść półki podniebienne blisko siebie. Półki podniebienne nie zrosną się, jeśli nie zostaną ułożone w bezpośrednim kontakcie. Wytnij trójkątną część filtra membranowego w miejscu, gdzie znajduje się przednia część podniebienia. Kształt trapezu pomoże w lokalizacji przedniej części podniebienia.
- Hoduj półki podniebienne pojedynczo lub po dwie bądź trzy w jednym naczyniu do hodowli organów, stosując medium hodowlane BGJb.
5. Hodowla półek podniebiennych myszy
- Inkubować tkanki w temperaturze 37 °C w nawilżonej mieszaninie gazów (5% CO2 i 95% powietrza) przez 72 hr, wymieniając pożywkę co 24 hr.
6. Obróbka podniebienia do analizy histologicznej
- Po 72 h hodowli utrwalone podniebienia należy inkubować w 4% formaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym przez noc w temperaturze 4° C. Następnie, używając pipety transferowej, delikatnie wypłukać tkankę w naczyniu hodowlanym za pomocą PBS. Podniebienia należy owinąć kawałkiem ręcznika laboratoryjnego i umieścić w kasetkach do zatapiania.
UWAGA: Owinięcie podniebień w ręczniki laboratoryjne zapobiega ich zgubieniu podczas procesu odwodnienia. - Tkankę należy odwodnić, przeprowadzając 1-godzinne płukania w etanolu o stężeniach 70%, 80% i do 100%, a następnie zastosować standardową procedurę zatapiania w parafinie. Podczas zatapiania przednią część podniebienia należy skierować w stronę tacy.
- Wyciąć seryjne skrawki o grubości 6 µm w orientacji koronarnej, od przodu do tyłu. Pełne przekroje podniebienia dadzą od 350 do 450 skrawków. Skrawki należy zabarwić hematoksyliną i eozyną (H&E).10 Każdy 20ty skrawek należy ocenić zgodnie z wcześniej opisaną skalą średniego stopnia zrostu (Mean Fusion Score, MFS) (Tabela 1). 8
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tę technikę można zastosować w różnych rodzajach eksperymentów. Poniższe badanie zostało zaprojektowane w celu przetestowania teratogennego działania nikotyny in vitro na zrastanie się podniebienia. W eksperymencie wykorzystano dwa szczepy myszy: CD1 i C57. Tkankę podniebienia poddano działaniu hemisiarczanu nikotyny w stężeniach 0,06 i 6 mM. Zaobserwowano, że wzorce i czas zrastania się podniebienia różniły się w zależności od szczepu. U myszy CD1 półki podniebienne z grupy kontrolnej zrastały się w sposób zale...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół opisany w tym artykule przedstawia metodę preparowania półek podniebiennych z zarodków w 13,5 dniu embrionalnym. Półki podniebienne z zarodków myszy hodowano w pożywce hodowlanej bez surowicy w atmosferze 95%O2 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Pomyślne rozwarstwienie podniebienia zależy krytycznie od wielu czynników na każdym etapie procedury, od czasu embrionalnego myszy poddanych eutanazji do zakończenia hodowli. Jednym z najważniejszych czynników wpływających na fuzję podniebienia jest czas ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicylina/Streptomycyna | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| szalki Petriego | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Naczynie do hodowli organów z otworem centralnym | Falcon | #353037 | 60 x15 mm |
| Siatka trójkątna z drutu | Wykonane na zamówienie z siatki drucianej ze stali nierdzewnej, aby dobrze pasowała do naczynia do hodowli organów. | ||
| Filtr poliwęglanowy | GE& Technologie wodne i procesowe | K04BP04700 | 0,4 mikrona, 47 mm |
| Mikroskop stereoskopowy | ZEISS Stemi SR | ||
| Kaptur hodowlany | NUAIRE Kleszcze | ||
| Dumont Medical | #5 | ||
| Nożyczki do mikropreparacji | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Nożyczki Vannas, proste, 8 cm długości, końcówki 0,1 mm, ostrza 5 mm, niemieckie |
| nożyczki do mikropreparacji | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Nożyczki, proste, długość 8,5 cm, końcówki 0,025 mm x 0,015 mm, ostrza 7 mm |
| Nożyczki do mikropreparacji | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Nożyczki sprężynowe zakrzywione zakrzywione, długości 10,5 cm, ostrza 8 mm, produkcji niemieckiej |
| Currete chirurgiczna (szpatułka łyżkowa) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector | Inkubator Labconco | ||
| Płaszcz wodny Thermo Scientific | Farma | ||
| Series11 Inkubator | |||
| CO2 | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Światłowód Źródło światła | Światłowód Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Kaseta do zatapiania | Statlab | EC301 | |
| Kim chusteczki | VWR | 470173-504 |
Bibliografia
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653(2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
