Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Summary

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Abstract

Zdolność mózgu do przetwarzania informacji sensorycznych opiera się zarówno na rosnących, jak i opadających zestawach projekcji. Do niedawna jedynym sposobem na zbadanie tych dwóch układów i ich interakcji było stosowanie preparatów in vivo. Duże postępy poczyniono w przypadku ostrych wycinków mózgu zawierających szlaki wzgórzowo-wzgórzowe i korowo-wzgórzowe w układzie somatosensorycznym, wzrokowym i słuchowym. Dzięki kluczowym udoskonaleniom naszej niedawnej modyfikacji wycinka^{słuchowego korowo-wzgórzowego 1}, jesteśmy w stanie bardziej wiarygodnie uchwycić projekcje między większością głównych słuchowych struktur śródmózgowia i przodomózgowia: wzgórkiem dolnym (IC), ciałem kolankowatym przyśrodkowym (MGB), jądrem siatkowatym wzgórza (TRN) i korą słuchową (AC). Mając zachowane fragmenty wszystkich tych połączeń, jesteśmy w stanie odpowiedzieć na szczegółowe pytania, które uzupełniają pytania, na które można odpowiedzieć za pomocą preparatów in vivo. Zastosowanie obrazowania autofluorescencji flawoprotein pozwala nam szybko ocenić łączność w dowolnym wycinku i pokierować wynikającym z tego eksperymentem. Korzystając z tego wycinka w połączeniu z technikami nagrywania i obrazowania, jesteśmy teraz lepiej przygotowani do zrozumienia, w jaki sposób przetwarzanie informacji zachodzi w każdym punkcie przodomózgowia słuchowego, gdy informacje docierają do kory mózgowej, oraz jaki jest wpływ zstępującej modulacji kory mózgowej. Druk 3D do budowy komponentów komory plastrowej umożliwia dwustronną perfuzję i szeroki dostęp do sieci w obrębie plastra oraz utrzymuje szerokie połączenia kluczowe dla pełnego wykorzystania tego preparatu.

Introduction

W systemie słuchowym, mimo że między peryferiami sensorycznymi a wzgórkiem dolnym dochodzi do znacznego przetwarzania dodatkowego, zanim dotrze ono do kory słuchowej, następuje znaczne dodatkowe przetwarzanie. Wiemy bardzo mało o tym, jak odbywa się to przetwarzanie, a zatem niewiele o tym, jak ta transformacja pozwala mózgowi interpretować napływające informacje sensoryczne. Z wyjątkiem węchu, każdy ze zmysłów ma bardzo podobną organizację, przy czym sygnały peryferyjne są początkowo przekazywane z wysoką wiernością, która maleje, gdy sygnał wznosi się do kory. Następnie kora mózgowa wysyła projekcje do niższych struktur, aby dalej modulować napływające informacje. Ten złożony system był badany na różne sposoby in vivo, a także w wielu preparatach in vitro. W pierwszym przypadku wszystkie połączenia są nienaruszone, co umożliwia badaczowi zbadanie dowolnego zestawu połączeń, przy jednoczesnej kontroli wejścia sensorycznego i wyjścia pomiarowego w dowolnym obszarze. Przy takim podejściu kontrola nad dużą różnorodnością innych bodźców, w tym innymi bodźcami sensorycznymi, pobudzeniem i uwagą, jest niewielka lub żadna, co prowadzi do intensywnie złożonego wyjścia. In vitro wycinki mózgu zostały pocięte w celu uchwycenia pojedynczego zestawu projekcji lub dwóch połączonych obszarów mózgu, co pozwala naukowcom stymulować i oceniać różne aferenty lub obszary mózgu. Często są to plastry wzgórzowo-korowe lub tektowzgórzowe, w których zachowane są dane wejściowe do wzgórza lub wzgórza i jego wyjście do kory^2-5. Preparaty te pozwalają na szeroką gamę manipulacji farmakologicznych, elektrycznych i optogenetycznych. Jednak mając tylko dwa regiony mózgu, przede wszystkim oceniają przekazywanie informacji i nie mają możliwości oceny transformacji informacji podczas jej przechodzenia przez wzgórze. Również projekcja siateczkowo-wzgórzowa, która może odgrywać rolę w modulacji uwagi^6-9, jest obecna w tym wycinku. W tym miejscu demonstrujemy ulepszenia w stosunku do naszego poprzedniego przygotowania¹, które pozwala badaczowi kontrolować różne dane wejściowe do wzgórza, aby dać unikalną perspektywę tego, jak wzgórze bramkuje i filtruje informacje. Łączymy ten nowatorski preparat plastrów z obrazowaniem autofluorescencji flawoprotein w celu oceny połączenia plastrów i analizy aktywacji na dużą skalę, obrazowaniem wapnia we wzgórzu do analizy populacji neuronów oraz rejestracją pojedynczych komórek w celu zmierzenia wpływu różnych danych wejściowych na poziomie pojedynczej komórki.

Aby pomóc w utrzymaniu tych rozległych połączeń, opracowaliśmy również szereg modyfikacji normalnej kotwicy wycinka (a.k.a. "harfy") do utrzymywania wycinka mózgu w miejscu oraz mostka do podnoszenia wycinka w celu zwiększenia perfuzji. Harfa została zaprojektowana w zmodyfikowanym kształcie podkowy, aby otaczać plasterek i umożliwiać dostosowywanie punktów mocowania strun harfy. Trzy sznurki są przymocowane w taki sposób, że i) jeden leży poziomo wzdłuż przyśrodkowej krawędzi wycinka, ii) jeden rozciąga się od krawędzi ogonowej IC do ogonowej krawędzi AC i iii) jeden rozciąga się po przekątnej od przyśrodkowej krawędzi wycinka do obszaru rostralnego do AC (patrz rysunek 1A). Małe wgłębienia w ramie do klejenia (klejem cyjanoakrylowym) strun harfy pozwalają na zmniejszenie nacisku na plaster, aby pomóc w utrzymaniu integralności plastra (patrz rysunek 1B). Korzystając z druku trójwymiarowego, jesteśmy w stanie zaprojektować harfy na zamówienie zgodnie z naszymi unikalnymi specyfikacjami, a także mosty, które pozwalają na idealny przepływ sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) powyżej i poniżej tkanki. Utrzymuje to również duże obszary, na których światło przenika do tkanki w elektrofizjologii klamry krostowej.

Protocol

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Illinois. Wszystkie zwierzęta były trzymane w placówkach opieki nad zwierzętami zatwierdzonych przez American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i zmniejszyć cierpienie na wszystkich etapach badania.

1. Przygotowanie i usunięcie mózgu myszy do krojenia

1. Przygotuj się do inkubacji perfuzji i plastrów.
   1. Około 30 minut przed krojeniem należy przygotować roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i aCSF o niskiej zawartości wapnia do inkubacji plastra przed zapisem lub obrazowaniem.
   2. Rozłóż wszystkie niezbędne narzędzia (duże nożyczki z końcem, małe nożyczki sprężynowe, kleszcze anatomiczne, duże nożyczki lub gilotyna, nożyczki do tęczówki, kleszczyki jubilerskie, strzykawka 10 ml z igłą 27G x 1/2 cala, mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 2 cm i pipeta Pasteura ze złamaną końcówką do przenoszenia plastrów) do perfuzji i krojenia, i przygotuj tacę perfuzyjną.
   3. Ustawić komorę inkubacyjną z natlenionym aCSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 ^oC i naczyniu hodowlanym wypełnionym roztworem tnącym.
2. Przygotuj etap krojenia do krojenia.
   1. Wytnij mały kawałek 3% agaru o wymiarach około 1 cm³, aby użyć go jako zabezpieczenia dla mózgu i 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm jako guz, który zostanie użyty do podparcia układu scalonego.
   2. Przyklej backstop do sceny za pomocą kleju cyjanoakrylowego, a także wybrzuszenie po prawej stronie backstopu tak, aby tworzyły kąt 80o.
3. Usuń mózg.
   1. Głęboko znieczulić mysz p12-p20 (najlepiej p14-18) ketaminą 100 mg/kg i ksylaksyną 3 mg/kg (lub porównywalną procedurą zatwierdzoną przez komisję etyczną).
      Uwaga: Potwierdź prawidłowy poziom znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Ponieważ zwierzę jest krótko pod narkozą, maść okulistyczna nie jest konieczna.
   2. Używając nożyczek z końcami, odsłoń klatkę piersiową od wyrostka mieczykowatego do szyi.
      1. Znajdź wyrostek mieczykowaty i wykonaj poziome cięcie o długości około 1,5 cm.
      2. Wykonaj dwa pionowe nacięcia od końców poprzedniego cięcia poziomego do ramion, każde o około 1,5 cm.
   3. Przetnij przeponę i połączenia żebrowo-chrzęstne, aby odsłonić serce.
   4. Małymi nożyczkami sprężynowymi wykonaj małe, 2-5 mm nacięcie w prawym przedsionku, od brzusznej do grzbietowej strony serca.
   5. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 cala wstrzyknąć lewą komorę i szybko przelać zwierzętom roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy.
   6. Gdy krew się oczyści, użyj większych nożyczek, aby usunąć głowę.
      Uwaga: Nie ocenialiśmy systematycznie użyteczności perfuzji. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że perfuzja przezsercowa u tak młodych myszy może być wykonana z prawie 100% sukcesem i ma tę zaletę, że eliminuje czerwone krwinki, które mogą fluoryzować i zakłócać obrazowanie.
   7. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
   8. Za pomocą nożyczek do wygiętej tęczówki przeciąć czaszkę między oczami, a następnie zaczynając od nacięcia między oczami, ostrożnie przeciąć od przodu do tyłu wzdłuż szwu linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić mózgu pod spodem.
      Uwaga: Opona twarda zwykle odpada wraz z czaszką. Jeśli to konieczne, usuń oponę twardą przed ostrożnym usunięciem mózgu.
   9. Za pomocą kleszczy jubilerskich podważ czaszkę i ostrożnie usuń mózg, a następnie umieść mózg w roztworze do cięcia. Uważaj, aby nie uszkodzić kory mózgowej.

2. Przygotowanie mózgu do krojenia

1. Przygotowanie mózgu do montażu na scenie wibratomu.
   1. Za pomocą szkiełka oznaczonego dwiema liniami o temperaturze 90^o i ukośną linią o godzinie 17^o od góry po lewej do prawej strony, przecinającej się w miejscu, w którym spotykają się dwie linie, umieść mózg grzbietową stroną do góry, za pomocą żyletki usuń 2-4 mm rostralnego końca mózgu, tworząc płaską powierzchnię.
   2. Umieść ogonową stronę mózgu do góry na nowo utworzonej płaskiej powierzchni i wyrównaj grzbietową powierzchnię mózgu z poziomą, a linię środkową mózgu z linią pionową.
   3. Dopasuj żyletkę do linii 17^o, przechyl maszynkę pod kątem 30^o i usuń około 3 mm prawej kory w podwójnym ukośnym cięciu (17^o od płaszczyzny poziomej i 60^o od koronalnej).
2. Montaż mózgu na etapie wibratomowym.
   1. Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 2 cm po brzusznej stronie mózgu tak, aby długi wymiar był prostopadły do linii środkowej.
   2. Ostrożnie nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na obszar przed ogranicznikiem (i po lewej stronie wybrzuszenia).
   3. Umieść podwójnie ukośnie przyciętą powierzchnię mózgu do kleju tak, aby część ogonowa mózgu i tyłomózgowie były oparte o guz, a prawa strona mózgu była oparta o backstop.
   4. Delikatnie dociśnij mózg, upewniając się, że cała powierzchnia styka się z komorą krojenia.

3. Uzyskanie warstwy koliculo-wzgórzowo-korowej

1. Szybko przejdź do etapu cięcia i umieść w wibratomie, wypełnij stolik roztworem do cięcia.
2. Dopasuj ostrze do górnej (brzusznej strony) mózgu.
3. Usuń 1-1,5 mm z wierzchołka mózgu, usuń plastry 300-500 μm i oceń głębokość po usunięciu.
   Uwaga: Gdy IC, MGB i jądro kolankowate boczne (LGN) są widoczne, a zakręt zębaty tworzy kształt litery "C", weź od jednego do dwóch plasterków o grubości 600 μm. Zobacz rysunek 3A.
4. Plastry umieścić w nagrzanej (32 ^oC) komorze do przechowywania.

4. Obrazowanie wycinka

1. Preparat do obrazowania autofluorescencji flawoprotein.
   1. Przygotować aCSF do perfuzji plastra w standardowej elektrofizjologicznej komorze rejestracyjnej, pęcherzyk aCSF z 95% O₂/5% CO_{2 .}
   2. Pociągnij szklaną elektrodę do stymulacji. Należy pamiętać, że wiele różnych elektrod stymulujących i konfiguracji (szkło, wolfram, włókno węglowe, monopolarne, bipolarne) działa bardzo dobrze w połączeniu z obrazowaniem autofluorescencji flawoprotein.
   3. Włącz komputer, kamerę, mikromanipulator, źródło światła, oprogramowanie do stymulacji, oprogramowanie do przechwytywania obrazu.
   4. Wykonaj perfuzję komory nagraniowej za pomocą natlenionego aCSF, umieść niestandardowy mostek (projekt dostępny w materiałach uzupełniających), aby podnieść plaster w komorze.
      Uwaga: Szybkość perfuzji może się różnić w zależności od indywidualnej konfiguracji; Stosuje się tutaj 5-15 ml/min.
   5. Umieść plasterek w komorze, obniż poziom płynu w komorze, aby zapobiec oderwaniu się plastra od mostu, jednocześnie umieszczając specjalnie skonstruowaną harfę na warstwie, uważając, aby nie umieszczać strun harfy nad interesującymi ścieżkami (Rysunek 1A). Zwiększ poziom cieczy do około 1-2 mm powyżej plasterka, aby utrzymać przepływ płynu CSF powyżej i poniżej plasterka.
      Uwaga: Jeśli konieczna jest zmiana położenia, użyj pipety Pasteura ze złamanym końcem lub pozwól, aby poziom płynu mózgowo-rdzeniowego wzrósł i używaj kleszczy z najwyższą ostrożnością.
   6. Włóż elektrodę chlorku srebra do szklanej elektrody wypełnionej CSF, włóż szklaną elektrodę do mikromanipulatora i podłącz do izolatora bodźca, a następnie ostrożnie umieść szklaną elektrodę w IC / istocie białej, prowadząc do wzgórza (patrz rysunek 1A).
2. Akwizycja obrazu autofluorescencji flawoprotein.
   1. Zbieraj obrazy z częstotliwością 4 Hz (przy użyciu obiektywu makro 2X z korekcją do nieskończoności (NA 0,13)) i aparatu przez 105 sekund, jednocześnie stymulując elektrycznie (każda stymulacja składa się z 1 sekundy 40 Hz, 2 ms pulsuje tkankę przy 0,05 Hz pięć razy), oświetlając tkankę niebieskim światłem 470-490 nm i rejestrując powyżej 515 nm. Upewnij się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani przepalony, patrz Rysunek 3 w lewej kolumnie w celach informacyjnych.
      Uwaga: Czas zbierania, częstotliwość zbierania i częstotliwość stymulacji można zmienić, aby dopasować do eksperymentu, niestandardowy program zawarty w materiałach uzupełniających można modyfikować jako taki.
   2. Eksportuj obrazy do Matlaba i korzystaj z niestandardowego programu dostępnego w materiałach uzupełniających do analizy mocy spektralnej obrazów przy 0,05 Hz. Wynikowy obraz będzie pokazywał połączone ścieżki.
      Uwaga: Program niestandardowy wykorzystuje szybką transformację Fouriera wartości pikseli w szeregach czasowych do wytworzenia obrazu.
3. Preparat do obrazowania wapnia.
   1. Przygotować małą komorę inkubacyjną, używając 3 cm naczynia hodowlanego i podniesionej membrany hodowlanej, aby umożliwić CSF dotarcie zarówno do góry, jak i do dołu plastra, a następnie umieścić na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę na poziomie około 32 ^oC.
   2. Napełnij małą komorę inkubacyjną ciepłym aCSF i powoli bąbelkuj 95% O₂/5% CO_{2 .}
   3. Zmieszać 2 μl kwasu pluronowego F-127 i 50 μg Fura-2AM rozpuszczonych w 48 μl DMSO.
   4. Umieść plasterek w małej komorze inkubacyjnej na podniesionej membranie i ostrożnie za pomocą mikropipety dodaj mieszaninę barwiącą bezpośrednio nad MGB (lub inną strukturą będącą przedmiotem zainteresowania).
   5. Przykryj plastry, aby zapobiec bieleniu przed obrazowaniem i pozostaw plastry do inkubacji przez 45 minut - 1 godzinę.
   6. Wyjmij plastry do podgrzewanej komory na 10-15 minut, aby zmyć nadmiar materiału.
   7. Wykonaj kroki od 4.1.1 do 4.1.6, aby przygotować się do stymulacji i obrazowania wycinka kolikulologiczno-wzgórzowo-korowego.
4. Akwizycja obrazu wapnia.
   1. Zbieraj obrazy z częstotliwością 10 Hz (przy użyciu obiektywu 20X zanurzonego w wodzie) przez 25 sekund, jednocześnie stymulując elektrycznie (każda stymulacja składa się z jednego impulsu o długości 2 ms) tkankę przy 0,2 Hz pięć razy, jednocześnie oświetlając tkankę światłem 365 nm i rejestrując fluorescencję powyżej 510 nm.
   2. Eksportuj obrazy do Matlaba i korzystaj z niestandardowego programu dostępnego w materiałach uzupełniających do analizy mocy spektralnej obrazów przy 0,2 Hz. Wynikowy obraz pokaże aktywne komórki.

Results

Przykład kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy uzyskanego u myszy P15 pokazano na rysunku 2. Idealny wycinek będzie zawierał cztery główne struktury słuchowe śródmózgowia i przodomózgowia IC, MGB, TRN i AC, które są aktywowane, gdy IC jest stymulowany (ryc. 2A). Korzystając z analizy Fouriera, moc spektralna jest mierzona przy częstotliwości stymulacji elektrycznej, przy czym połączone obszary mózgu wykazują aktywność, która jest okresowa i porywana przy częstotliwości stymulac...

Discussion

Protokół ten opisuje ulepszenia w stosunku do wcześniej opisanego kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu u myszy p12-20 w celu zbadania przepływu informacji w układzie słuchowym¹. Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi, podobnymi preparatami do wycinków mózgu, ponieważ utrzymuje połączenia między większą liczbą obszarów mózgu w jednym wycinku, co daje badaczom nowe narzędzia do zrozumienia interakcji i wzajemnych oddziaływań między jądrami słuchowymi w przodomózgowiu. W tym protokole wprowadzono kil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy	w mM: 206 sacharoza, 10,0 MgCl2, 11,0 glukoza, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0,5 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
Niski poziom wapnia aCSF			w mM: 126 NaCl, 3,0 MgCl2, 10,0 glukoza, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
aCSF			w mM: 126 NaCl, 2,0 MgCl2, 10,0 glukoza, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4
Izolator bodźców	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Partia: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Partia: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Partia: 1499369
Duże naczynie hodowlane	Fisherbrand	08-757-13	Naczynie hodowlane 100 x 15 mm
Małe naczynie	hodowlane Falcon	353001	35 x10 mm Naczynie
hodowlane Podwyższona membrana hodowlana	Millicell	PICMORG50	Służy do utrzymania natlenionej perfuzji płynu po obu stronach plastra.
Kostka fluorescencyjna do obrazowania flawoprotein	Olympus	UMNIB	470– Wzbudzenie 490 nm, dichroiczne 505 nm, długie przejście emisji 515 nm. Odkryliśmy, że sprawdzi się tu praktycznie każda kostka filtra białkowego z zieloną fluorescencją.
Kostka fluorescencyjna do obrazowania wapnia	Omega Optical	BX-18	XF1005 wyjście 365 nm, XF2001 400 nm dichroiczne, XF3080 emisja 510 nm
Agar do blokowania mózgu			3% wagowo w wodzie
Viper si Stereo Lithium Apparatus	3D Systems