Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Podsumowanie

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Streszczenie

Oprócz hepatocytów miąższowych, wątroba składa się z komórek niemiąższowych (NPC), a mianowicie komórek Kupffera (KC), komórek śródbłonka wątroby (LEC) i komórek gwiaździstych wątroby (HSC). Dwuwymiarowa (2D) hodowla pierwotnych ludzkich hepatocytów (PHH) jest nadal uważana za "złoty standard" w testach in vitro metabolizmu leków i hepatotoksyczności. Powszechnie wiadomo, że monokultura 2D PHH cierpi na odróżnicowanie i utratę funkcji. Ostatnio wykazano, że wątrobowe NPC odgrywają kluczową rolę w fizjologii (pato-) wątroby i utrzymaniu funkcji PHH. Obecne badania koncentrują się na rekonstrukcji architektury tkanek in vivo za pomocą modeli 3D i kokultur w celu przezwyciężenia ograniczeń monokultur 2D. Wcześniej opublikowaliśmy metodę izolowania ludzkich komórek wątroby i badaliśmy przydatność tych komórek do stosowania w hodowlach komórkowych w Experimental Biology and Medicine¹. Ze względu na szerokie zainteresowanie tą techniką, celem tego artykułu było przedstawienie bardziej szczegółowego protokołu procesu izolacji komórek wątroby, w tym filmu, który pozwoli na łatwe odtworzenie tej techniki.

Ludzkie komórki wątroby zostały wyizolowane z próbek tkanek ludzkiej wątroby podczas zabiegów chirurgicznych za pomocą dwuetapowej techniki perfuzji EGTA/kolagenazy P. PHH oddzielono od NPC przez wstępne odwirowanie w dawce 50 x g. Do usunięcia martwych komórek zastosowano etapy wirowania w gradionym gradiencie gęstości. Poszczególne populacje komórek wątroby wyizolowano ze wzbogaconej frakcji NPC przy użyciu określonych właściwości komórek i procedur sortowania komórek. Oprócz izolacji PHH udało nam się wydzielić KC, LEC i HSC do dalszej uprawy.

Razem wzięte, prezentowany protokół pozwala na izolację PHH i NPC w wysokiej jakości i ilości z jednej próbki tkanki dawcy. Dostęp do oczyszczonych populacji komórek wątroby może pozwolić na tworzenie in vivo podobnych do modeli ludzkiej wątroby.

Wprowadzenie

Ludzka tkanka wątroby jest bardzo złożona i składa się z dwóch różnych jednostek komórkowych, komórek miąższowych i komórek niemiąższowych (NPC). Miąższowe komórki wątroby obejmują hepatocyty i cholangiocyty. Hepatocyty stanowią od 60 do 70% wszystkich komórek wątroby i odpowiadają za większość funkcji metabolicznych wątroby, np. syntezę kwasów żółciowych i czynnika dopełniacza, biotransformację i metabolizm energetyczny^2,3.

Mniejsza frakcja NPC stanowi 30-40% wszystkich komórek wątroby. NPC obejmują różne populacje komórek, a mianowicie komórki Kupffera (KC), komórki śródbłonka wątroby (LEC) i komórki gwiaździste wątroby (HSC). Ta heterogeniczna frakcja komórkowa odgrywa kluczową rolę w procesach fizjologicznych wątroby. Ponadto NPC uczestniczą w pośredniczeniu w ostrym uszkodzeniu wątroby, np. polekowym uszkodzeniu wątroby (DILI), a także w przewlekłych uszkodzeniach wątroby, takich jak marskość wątroby⁴.

W ostatnich latach ludzkie komórki wątroby stają się coraz bardziej niezbędne w badaniach i rozwoju testów leków, opracowywaniu leków i identyfikacji nowych szlaków biochemicznych w chorobach wątroby. W przypadku badań in vitro monokultury PHH są nadal uważane za "złoty standard"⁵. Głównym ograniczeniem obecnych homotypowych modeli wątroby jest odróżnicowanie i utrata funkcji hepatocytów w ciągu kilku dni⁴. Opracowanie technik hodowli trójwymiarowej (3D) wykazało, że ograniczenia te można skompensować^4,6. Jednak nawet nowoczesne techniki hodowli 3D nie są w stanie wyświetlić wszystkich hepatotoksycznych sposobów działania⁷. Brakujące populacje NPC w istniejących modelach in vitro są omawiane jako możliwa przyczyna tej rozbieżności w stosunku do sytuacji in vivo. Wykazano, że komunikacja komórka-komórka między różnymi populacjami komórek wątroby odgrywa kluczową rolę w homeostazie fizjologicznej, ale także w procesach patofizjologicznych⁸. Dlatego uwaga naukowców skupia się coraz bardziej na NPC i ich interakcjach międzykomórkowych. Ich celowe zastosowanie w systemach kohodowli i inżynierii tkankowej może stanowić rozwiązanie problemu wysokiego zapotrzebowania na modele wątroby in vitro ^8,9, które są jak najbardziej zbliżone do tych stosowanych in vivo.

Obecnie głównym wyzwaniem jest opracowanie ustandaryzowanego modelu kokultury ludzkiej wątroby, który zawiera jasno zdefiniowane części PHH i NPC. W związku z tym potrzebne są techniki izolacji bardzo heterogenicznych komórek wątroby, które muszą być zoptymalizowane, aby uzyskać czyste populacje komórek. Chociaż istnieją ustandaryzowane protokoły izolacji PHH¹⁰, standaryzowana izolacja ludzkich NPC jest nadal w fazie rozwoju. Większość opublikowanych protokołów izolacji NPC opiera się na eksperymentach na komórkach innych niż ludzkie^11,12. Tylko kilka publikacji opisuje proces izolacji ludzkich NPC, a większość obejmuje tylko metody izolacji pojedynczej komórki^{typu 11-16}. Najważniejszymi cechami komórek, które zostały wykorzystane do separacji komórek, są rozmiar, gęstość, zachowanie przyczepiania i ekspresja białek powierzchniowych. Na podstawie tych cech opracowaliśmy uproszczony protokół izolacji PHH, KC, LEC i HSC, który został opublikowany wcześniej w Experimental Biology and Medicine¹. Ze względu na szerokie zainteresowanie tą techniką, celem tego artykułu było przedstawienie bardziej szczegółowego protokołu procesu izolacji komórek wątroby, w tym filmu, który pozwoli na łatwiejsze odtworzenie tej techniki. Protokół zawiera również metody kontroli jakości w zakresie oceny plonu i żywotności, a także identyfikacji i oceny czystości przy użyciu specyficznych barwień immunologicznych.

Protokół

Uwaga: Wszystkie komórki zostały wyizolowane z wyciętej nienowotworowej tkanki ludzkiej wątroby, która pozostała po częściowej resekcji wątroby z pierwotnymi lub wtórnymi guzami wątroby. Świadoma zgoda pacjentów została uzyskana zgodnie z wytycznymi etycznymi Charité - Universitätsmedizin Berlin

.

1. Przygotowanie materiałów i rozwiązań

1. Wcześniej wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego podczas procesu izolacji.
2. Przygotować roztwory wymagane do perfuzji próbki tkanki wątroby, procesu izolacji hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby oraz hodowli pierwotnych ludzkich komórek wątroby zgodnie z tabelami 1 i 2, z wyjątkiem roztworu do trawienia, który jest przygotowywany świeżo przed użyciem. Wszystkie roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C i zaleca się zużyć je w ciągu 4 tygodni po przygotowaniu.
3. Wysterylizuj wszystkie roztwory za pomocą filtra butelkowego 0,22 μm.

2. Przygotowanie sprzętu do perfuzji

1. Ustawić sprzęt do perfuzji i trawienia próbki tkanki wątroby, jak pokazano na rysunku 1A.
2. Dostosować temperaturę łaźni wodnej do 39 °C, aby zapewnić optymalną aktywność kolagenazy P podczas perfuzji i trawienia.

3. Perfuzja i trawienie próbki tkanki wątroby (1,5 godziny)

1. Z wyciętej tkanki należy pobrać próbkę tkanki z nienaruszoną kapsułką Glissona. Podczas cięcia próbki tkanki staraj się uzyskać małą powierzchnię cięcia z dobrze widocznymi naczyniami. Unikaj ciepłych okresów niedokrwienia, transportując i manipulując próbką tkanki wątroby na lodzie aż do perfuzji.
2. Pobrać masę tkanki w sterylnych warunkach i umieścić próbkę tkanki wątroby na szalce Petriego w laminarnym przepływie powietrza. Oczyść powierzchnię próbki tkanki sterylnym kompresem z pozostałej krwi i przepłucz zestaw kaniul za pomocą 1x Perfusion-Solution I, aby upewnić się, że wszystkie kaniule są przepuszczalne.
3. Użyj kleju tkankowego, aby przymocować oliwki kaniul w niektórych większych naczyniach krwionośnych. W zależności od wielkości próbki tkanki wątroby i liczby naczyń na powierzchni należy użyć zestawu kaniuli z 3 do 8 kaniulami. Przetestuj perfuzję i sprawdź, czy nie ma wycieków. Zamknij wszystkie naczynia krwionośne, z których wycieka przezroczysty 1x Perfusion-Solution I, za pomocą kleju tkankowego.
4. Umieścić kaniulowaną próbkę tkanki wątroby w lejku Büchnera na perforowanym krążku filtracyjnym (ryc. 1A).
5. Ustaw natężenie przepływu pompy perystaltycznej w zakresie od 7,5 ml/min do 14,6 ml/min w zależności od liczby użytych kaniul i oporu tkanki wątroby. Dostosuj natężenie przepływu za każdym razem, aby upewnić się, że perfuzja jest aktualna, ale powolna. Perfaktorować tkankę, aż cała krew zostanie wypłukana, ale co najmniej 20 minut. Obserwuj, jak tkanka staje się jaśniejsza w obszarach o dobrej perfuzji.
   Uwaga: W niektórych przypadkach może być konieczne zaciśnięcie jednej z kaniul za pomocą plastikowych klamer lub zwiększenie wewnętrznego ciśnienia obszaru poprzez delikatne dociśnięcie szpatułką do torebki wątroby, aby zoptymalizować perfuzję. Całkowita zmiana koloru z jasnożółtego na jasnobrązowawy wskazuje na dobrą perfuzję.
6. Zmienić płyn perfuzyjny na roztwór trawiący zawierający kolagenazę P (Tabela 1).
7. Zmień ustawienie (Rysunek 1A) dla etapu mineralizacji. Dlatego należy wykonać okrężny przepływ roztworu mineralizującego zgodnie z rysunkiem 1B przez maksymalnie 15 minut
   Uwaga: Bardzo ważne jest, aby natychmiast przerwać perfuzję, gdy próbka tkanki wątroby jest wystarczająco strawiona. Dobre trawienie można zaobserwować, gdy tkanka nie wykazuje oznak elastyczności, co ocenia się na podstawie utrzymania deformacji torebki, gdy jest popychana szpatułką.

4. Izolacja hepatocytów (1 godz.)

1. Wyłącz pompę perystaltyczną i umieść próbkę tkanki wątroby w szklanym naczyniu. Przepłukać zewnętrzną część próbki tkanki lodowatym roztworem Stop-Solution (Tabela 1). Usuń kaniule z próbki tkanki wątroby. Użyj skalpela, aby otworzyć próbkę tkanki wątroby, nacinając ją w środku miejsca, w którym przymocowano kaniule. Uważaj, aby kapsułka Glissona pozostała nienaruszona.
2. Wypłucz wnętrze próbki tkanki, a następnie przykryj całą próbkę tkanki lodowatym roztworem Stop-Solution. Delikatnie potrząśnij tkanką, aby uwolnić komórki z tkanki.
3. Zebrać zawiesinę komórkową i przefiltrować ją przez lejek do patrzenia (plastikowy lejek wyłożony kompresem z gazy) do plastikowych probówek o pojemności 50 ml. Dodać więcej roztworu Stop-Solution do próbki tkanki wątroby, aż do zużycia końcowej objętości 500 ml.
4. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 50 x g, 5 min, 4 °C. Zebrać supernatant do późniejszej izolacji komórek niemiąższowych. Umyj osad komórkowy PBS (Rysunek 2A).
5. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 50 x g, 5 min, 4 °C. Zebrać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce do inkubacji hepatocytów (Tabela 2, Rysunek 2B).
6. Określić liczbę komórek i żywotność w powstałej zawiesinie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Policz żywe i martwe komórki w komorze liczącej Neubauera. Oblicz liczbę komórek, żywotność i wydajność PHH, korzystając z poniższych wzorów.
   
   Wydajność (zliczone komórki) = Zliczone komórki x Współczynnik rozcieńczenia x Objętość zawiesiny komórek (ml) x 10 000
   
   wydajność (hepatocyty/(g próbki tkanki wątroby)) = (wydajność (hepatocyty/(ml pożywki)) x Objętość zawiesiny komórkowej (ml))/(masa próbki tkanki wątroby (g))
   
   Żywotność (%) = 100% x (liczba żywych komórek)/(całkowita liczba komórek)

5. Oczyszczanie hepatocytów (1 godz.)

Uwaga: Ten etap oczyszczania jest zalecany, jeśli żywotność jest niższa niż 70%.

1. Wykonuj wszystkie kroki na lodzie. Przygotować gradient gęstości 25%, mieszając 5 ml roztworu gradientu gęstości i 15 ml PBS do wirowania w gradionym gradinie gęstości.
2. Umieść maksymalnie 50 komórek Mio w sumie z zawiesiny komórek bogatych w hepatocyty ostrożnie i powoli na wierzchu warstwy gradientu gęstości 25%, aby zapewnić wyraźne oddzielenie obu warstw (ryc. 2C). Ostrożnie włożyć probówki do wirówki i odwirować przy 1 250 x g, 20 min, 4 °C bez hamulca (rysunek 2D).
3. Odessać pozostałą zawiesinę komórek i martwe komórki w interfazie. W zależności od zawartości tłuszczu można również zassać roztwór gradientu gęstości.
   Uwaga: PHH o niskiej zawartości lipidów tworzy gęste osady, a gradient gęstości można całkowicie zassać. PHH o wysokiej zawartości lipidów tworzy bardziej rozproszoną osadówkę, a wiele żywotnych komórek może pozostać w roztworze gradientu gęstości nad osadem.
4. Ponownie zawiesić granulki hepatocytów za pomocą PBS i ponownie odwirować w temperaturze 50 x g, 5 min, 4 °C. Zebrać granulki, ponownie przemyć PBS i ponownie zawiesić oczyszczony PHH w pożywce do inkubacji hepatocytów. Zliczanie komórek należy przeprowadzić zgodnie z opisem w kroku 4.6.

6. Hodowla hepatocytów

1. Przygotuj szalki z kultur komórkowych do wysiewu PHH, pokrywając je macierzą zewnątrzkomórkową, na przykład kolagenem ze szczurzego ogona (kolagen typu I). Przygotuj kolagen z ogona szczura zgodnie z protokołem ustalonym przez Rajana i wsp.¹⁷
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy kolagenu z ogona szczura w stosunku 1:200 w PBS. Przenieść 100 μl^/cm2 roztwór kolagenu z ogona szczura do szalek hodowlanych, uważając, aby pokryć całą powierzchnię. Inkubować tworzywa sztuczne z kultur komórkowych przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pozostały roztwór kolagenu z ogona szczura.
3. Nasienie 15 x 10⁴ hepatocyty / cm² w pożywce do inkubacji hepatocytów na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem z ogona szczura. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez co najmniej 4 godziny. Po 4 godzinach hepatocyty przylegają i można zmienić podłoże.
4. Wykonaj badania w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Zalecany jest czas hodowli wynoszący 48 godzin, aby umożliwić komórkom odzyskanie sił po procesie izolacji.

7. Izolacja komórek wątroby niebędących miąższem (1,5-2 godziny)

1. Odwirować pobrany supernatant (etap 4.5 i 4.6) w temperaturze 72 x g, 5 min, 4 °C w celu wyeliminowania pozostałych erytrocytów i hepatocytów. Zebrać supernatanty i odwirować je dwukrotnie, aby uzyskać dwa granulki komórek: 300 x g, 5 min, 4 °C dla sedymentacji HSC, LEC i częściowo KC oraz 650 x g, 7 min, 4 °C dla sedymentacji pozostałej KC.
2. Zbierz oba granulki i ponownie zawieś je w HBSS. Przygotować gradienty gęstości 25% i 50%, mieszając roztwór gradientu gęstości i PBS do wirowania w gradimencie gęstości (roztwór gradientu gęstości 25%: 5 ml roztworu gradientu gęstości i 15 ml PBS, roztwór gradientu gęstości 50%: 10 ml roztworu gradientu gęstości i 10 ml PBS, patrz rysunek 2). Ostrożnie umieść roztwór gradientu gęstości 25% na warstwie roztworu gradientu gęstości 50%.
3. Zawiesinę NPC należy ostrożnie i powoli umieścić na wierzchu warstwy roztworu o gradiencie gęstości 25% w taki sposób, aby uzyskać wyraźne oddzielenie obu warstw.
4. Odwirować zawiesinę komórek na gradieniu gęstości przy 1 800 x g, 20 min, 4 °C bez hamulca (rysunek 2.2).
5. Odessać martwe komórki i szczątki komórek z najwyższej warstwy. NPC znajdują się na przecięciu między warstwą gradientu gęstości 25% i 50% (rysunek 2). Zebrać NPC, umyć je HBSS i odwirować zawiesinę komórkową, stosując opisany powyżej etap podwójnego wirowania (krok 7.2.).

8. Separacja komórek Kupffera (etap separacji adherencji) (1 godz.)

1. Wykonaj zliczanie komórek dla KC we frakcji NPC zgodnie z opisem w kroku 4.6. (W celu zapoznania się z występowaniem KC w zawiesinie, patrz rysunek 3B). Odwirować frakcję NPC za pomocą opisanego powyżej kroku podwójnego wirowania (krok 7.2) i ponownie zawiesić NPC w pożywce do wysiewu komórek Kupffera (Tabela 2).
2. Wysiewać frakcję zawierającą KC w plastikowych naczyniach do hodowli komórkowych o gęstości 5 x 10⁵ KC/cm². Inkubować kultury KC przez 20 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Pierwotne KC przylegają do tworzyw sztucznych z kultur komórkowych w krótkim czasie (rysunek 2.3).
3. Zbierz supernatant zawierający nieprzylegające NPC, składający się głównie z LEC i HSC. Połączyć supernatanty w celu późniejszego rozdzielenia LEC (patrz sekcja 9) i HSC (patrz punkt 10). Przemyć przylegający KC HBSS i wyhodować go w pożywce do hodowli komórkowych Kupffer (tabela 2) w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.

9. Separacja komórek śródbłonka (1,5 godziny)

1. Odwirować zebrany sklarowany sklarowany sklarent (etap 8.5) w temperaturze 300 x g, 5 min, 4 °C. Przepłukać osad PBS. Po odwirowaniu w sile 300 x g, 5 minut, w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić komórki w pożywce do separacji komórek gwiaździstych/komórek śródbłonka i przeprowadzić zliczanie pozostałych komórek zgodnie z opisem w kroku 4.6.
2. Ponownie zawiesić 1 x 10 komórek⁷ Mio w 1 ml pożywki do separacji komórek gwiaździstych/komórek śródbłonka, dodać 20 μl roztworu blokującego z MACS-KIT i 20 μl mikrokulek CD31 do znakowania immunologicznego i inkubować powstałą zawiesinę przez 15 minut w temperaturze 4 °C (rysunek 2.4).
3. Oddzielić LEC od HSC zgodnie z opisem w protokole producenta dla magnetycznie aktywowanego systemu sortowania komórek MACS (rysunek 2.5). Elutuj magnetycznie zatrzymane CD31-dodatnie LEC i zawiesij je w pożywce do hodowli komórek gwiaździstych / komórek śródbłonka (Tabela 2).
4. Wykonaj zliczanie komórek dla LEC zgodnie z opisem w kroku 4.6. Wysiew LEC o gęstości 1,25 x 10⁵ komórek/^cm2 w naczyniach do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem z ogona szczura (patrz krok 6.1). Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.

10. Separacja komórek gwiaździstych (0,5 godziny)

1. Nieoznakowane HSC przechodzą przez kolumnę separacyjną podczas procedury MACS. Zbierz frakcję HSC (patrz krok 9.5, rysunek 2.5). Zliczanie komórek należy przeprowadzić zgodnie z opisem w kroku 4.6.
2. Nasiona HSC o gęstości 5 x 10⁴ komórki/^cm2 w naczyniach do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem z ogona szczura (patrz krok 6.1) w pożywce do hodowli komórek gwiaździstych/komórek śródbłonka (tabela 2) i hodować je w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.

Tabela 1: Roztwór do perfuzji i izolacji.

Tabela 2: Pożywki do hodowli i izolacji.

Wyniki

Podział na frakcję miąższową i niemiąższową, przy użyciu wirowania w gradicynacji gęstości jako procedury oczyszczania w połączeniu z wykorzystaniem właściwości przylegania i MACS prowadzi do udanej izolacji PHH i NPC. PHH i NPC mogą być izolowane w wysokiej jakości i ilości. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny układ urządzeń do perfuzji i trawienia wątroby. 10% FCS dodano do kolagenazy P zawierającej Perfuzję - Roztwór II w celu zmniejszenia aktywności proteolitycznej ...

Dyskusja

Opublikowany protokół opisuje technikę izolowania jednocześnie czystych PHH i NPC, a mianowicie KC, HSC i LEC, w wysokiej jakości i czystości z tej samej próbki ludzkiej tkanki wątroby. Większość publikacji dotyczących izolacji komórek wątroby obejmuje tylko jedną z tych populacji komórek^18-20, a procedury izolacji wykonywane na tkankach ludzkich są rzadkie (przegląd Damm i wsp.)²¹. Adaptacja metod ustalonych na tkankach zwierzęcych (np. wątrobie szczura) do wątroby ludzkiej ujawni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
General Equipment
PIPETBOY	Pipety Eppendorf
	Mikroskop Eppendorf
Mikroskop	Carl Zeiss
	Olympus
CO2-inkubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Wirówka Varifuge 3.0R	Heraeus
Zlewka do moczu	Sarstedt	2041101
strzykawka z perfusorem 50 ml	B.Braun	12F0482022
Filtr butelkowy	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polipropylenowa probówka stożkowa	BD Biosciences	352096
Płytka do hodowli tkankowych	BD Biosciences	533047	24-dołkowe
pipety serologiczne	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
końcówki do pipet	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µ l, 200 i mikro; l, 1,000 &mikro; l
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Sprzęt izolacyjny
kąpiel wodna	Pompa
	Carl Roth
termostat	pH-metr Lauda
Drobne skale
Lejek chnera	Plastikowy
rurka
kaniule z oliwkowymi końcówkami
szklane kleszcze
skalpel	Pióro	12068760
	Podnośnik komórek optycznych Costar
Serweta chirurgiczna	Charit i ostra; Universitä tsmedizin Berlin	A2013027
kompres	Fuhrmann	40013331
sterylne rękawice chirurgiczne	Gammex PF	1203441104
Klej do tkanek	B. Braun	1050052
szklana butelka	Kolagenaza
P	Roche	13349524
Percoll Roztwór	separującyBiochrom	L6145	Gęstość 1,124 g/ml
Hank' s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco' s PBS	PAA	H15 - 002	bez Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumina	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1 064 041 000
KCl	Merck	49 361 000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Niski poziom glukozy (1 g/L) (bez L-glutaminy)
Roztwór buforowy HEPES 1  M	GIBCO	1135546
L-Glutamina	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicylina/streptomycyna	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	bez L-glutaminy
Pirogronian sodu	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Rozwiązanie	Sigma-Aldrich	T8154	0,4%
William' s E	GIBCO	32551-020
z GlutaMAX&handel;
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Insulina ludzka	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-acetylocysteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Surowica cielęca płodu (FCS)	PAA	A15-101
Nazwa	Firma<	strong>Numer katalogowy	Uwagi
Sprzęt do barwienia immunologicznego
CD 68	R& D Systems, Stany Zjednoczone		monoklonalny
CK 19	Santa Cruz	D2309	poliklonalny
CK18	Santa Cruz	K2105	monoklonalny
Vimentin	Santa Cruz		monoklonalny
GFAP	Sigma Aldrich		monoklonalny
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Kozia anty-mysia IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Kozia anty-królicza IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Metanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyd 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G