Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53070

⸱

15 lipca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Imaging and Metabolism, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy wysokoprzepustowy test wrażliwości na leki dla pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego. Polega ona na rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego (w tym macierzy zewnątrzkomórkowej i zrębu) na płytkach wielodołkowych oraz nieinwazyjnej metodzie podłużnego oznaczania żywotności komórek.

Streszczenie

W tej pracy opisujemy nowatorskie podejście, które łączy testy wrażliwości ex vivo na leki i cyfrową analizę obrazu w celu oszacowania chemowrażliwości i heterogeniczności komórek szpiczaka mnogiego (MM) pochodzących od pacjenta. Podejście to polega na wysiewaniu pierwotnych komórek szpica szpikowego świeżo wyekstrahowanych ze szpiku kostnego do komór mikroprzepływowych umieszczonych na płytkach wielodołkowych, z których każda składa się z rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego, w tym macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen lub macierz błony podstawnej) i zrębu (mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta) lub komórki śródbłonka pochodzenia ludzkiego (HUVEC). Komory są odurzane różnymi środkami i stężeniami i są obrazowane sekwencyjnie przez 96 godzin za pomocą mikroskopii jasnego pola, w zmotoryzowanym mikroskopie wyposażonym w kamerę cyfrową. Oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu wykrywa żywe i martwe komórki na podstawie obecności lub braku ruchu błony i generuje krzywe zmian żywotności w funkcji stężenia leku i czasu ekspozycji. Używamy modelu obliczeniowego do określenia parametrów chemowrażliwości populacji guza na każdy lek, a także liczby subpopulacji obecnych jako miara niejednorodności guza. Te dostosowane do potrzeb pacjenta modele można następnie wykorzystać do symulacji schematów terapeutycznych i oszacowania odpowiedzi klinicznej.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest scharakteryzowanie wrażliwości komórek pierwotnych szpiczaka mnogiego (MM) na panel czynników ex vivo, jak najbardziej zbliżonych do warunków fizjologicznych, oraz z wystarczającą precyzją, aby wyniki te mogły być wykorzystane do identyfikacji subpopulacji opornych na chemoterapię w obrębie obciążenia guzem i ostatecznie do parametryzacji modeli obliczeniowych zaprojektowanych do oszacowania odpowiedzi klinicznej.

Modele obliczeniowe są potężnymi narzędziami do analizy złożonych systemów, takich jak interakcje rak-gospodarz-terapia. Jednak modele są tylko tak dobre, jak dane używane do ich parametryzacji. Niestety, większość danych dostępnych w literaturze nie może być wykorzystana w obecnej formie do parametryzacji takich modeli, ponieważ często są one uzyskiwane w wzajemnie wykluczających się warunkach eksperymentalnych. W związku z tym często wymagane są nowe eksperymenty w celu uzyskania potrzebnego zestawu parametrów eksperymentalnych. Większość testów żywotności jest jednak destrukcyjna, a zatem ograniczona do niewielkiej liczby punktów czasowych, często tylko jednego. To znacznie utrudnia wykorzystanie testów chemowrażliwości do parametryzacji modeli obliczeniowych, ponieważ takie eksperymenty nie dostarczają informacji na temat czasowej dynamiki systemu. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku pierwotnych komórek rakowych, które często są ograniczone do kilku milionów na próbkę i mają krótką żywotność po biopsji, co ogranicza liczbę dostępnych warunków eksperymentalnych. Ponadto większość testów żywotności wymaga oddzielenia raka od komórek nienowotworowych (zrębu) w momencie kwantyfikacji, co dodaje dodatkową pracę do protokołu, dodatkowo zaburza działanie komórek i ogranicza liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić.

40 lat temu, Salmon i współpracownicy1 zaproponowali swój słynny test tworzenia kolonii in vitro do oceny chemowrażliwości komórek nowotworowych. Niestety, test ten okazał się mieszanym sukcesem ze względu na niewielką liczbę próbek pobranych od pacjentów ze szpiczakiem mnogim (MM), które były zdolne do tworzenia kolonii w warunkach kontrolnych: oszacowano, że tylko niewielka podgrupa od 0,001% do 0,1% komórek MM była zdolna do replikacji, określanej jako komórki macierzyste szpiczaka mnogiego2. To znacznie ograniczyło wskaźnik powodzenia testu i liczbę leków, które można było testować w tym samym czasie, nawet w nowszych modelach3. Kwestia ta jest o wiele ważniejsza teraz, gdy czynników szpiczakowatych (standardowych lub eksperymentalnych) jest więcej niż cztery dekady temu.

Głównym ograniczeniem tych wczesnych testów jest ich dychotomiczny wynik: albo pacjent jest "wrażliwy", albo "oporny" na dany lek. Nie podano informacji dotyczących stopnia wrażliwości i niejednorodności populacji nowotworów. W związku z tym pacjenci z małymi subpopulacjami szybko rosnących opornych komórek byliby klasyfikowani jako "wrażliwi" na terapię, ale wkrótce nastąpiłby nawrót, a zatem nie odnieśliby korzyści z leczenia. Biorąc pod uwagę znaczenie czasu trwania odpowiedzi w całkowitym przeżyciu (OS) pacjentów z rakiem4,5, jasne jest, dlaczego testy te nie były w stanie prawidłowo oszacować OS i konsekwentnie.

Aby obejść te ograniczenia i móc generować modele obliczeniowe specyficzne dla pacjenta, które szacowałyby spersonalizowaną odpowiedź kliniczną na panel leków, opracowaliśmy metodę nieniszczącego testowania wrażliwości na leki linii komórkowych szpiczaka mnogiego (MM) i pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego w rekonstrukcji ex vivo mikrośrodowiska szpiku kostnego, w tym macierz zewnątrzkomórkowa i zrąb6. Test ten miał jednak to ograniczenie, że polegał na konkretnym komercyjnym szkiełku mikroprzepływowym, którego wymiary i koszt ograniczały liczbę eksperymentów lub leków, które można było przeprowadzić jednocześnie w danym urządzeniu sprzętowym.

Opisany tutaj system rozszerza ten oryginalny test na wysokoprzepustową organotypową platformę dawka-odpowiedź, do badań przesiewowych in vitro leków, w oparciu o cyfrowy algorytm analizy obrazu w celu nieniszczącego ilościowego określenia żywotności komórek. Każda studzienka w płytkach 384 lub 1,536-dołkowych to rekonstrukcja 3D mikrośrodowiska szpiku kostnego, w tym pierwotnych komórek MM, macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zrębu i czynników wzrostu pochodzących od pacjenta. Mikroskopia na żywo i cyfrowa analiza obrazu są wykorzystywane do wykrywania zdarzeń śmierci komórek w różnych stężeniach leków, które są wykorzystywane do generowania powierzchni dawka-odpowiedź. Na podstawie danych in vitro model matematyczny identyfikuje wielkość i wrażliwość chemiczną subpopulacji w obrębie obciążenia guzem pacjenta i może być wykorzystany do symulacji, w jaki sposób guz zareagowałby na lek (leki) w warunkach fizjologicznych w schemacie klinicznym6 (Figura 1).

Główne innowacje tej platformy to: (a) mała wymagana liczba komórek rakowych (1 000-10 000 na stężenie leku); b) ocena skuteczności leku w warunkach fizjologicznych (macierz zewnątrzkomórkowa, zrąb, czynniki wzrostu pochodzące od pacjenta); c) brak toksyczności wynikającej z markerów żywotności7 , ponieważ stosuje się tylko obrazowanie w jasnym polu, a zatem nie ma potrzeby transfekcji komórek za pomocą fluorescencji8 lub bioluminescencji9; d) ciągłe obrazowanie zapewnia działanie leku w funkcji stężenia i czasu ekspozycji (farmakodynamika); oraz (e) integracja między modelami ewolucyjnymi in vitro a obliczeniowymi modelami ewolucyjnymi w celu oszacowania wyniku klinicznego6 (Silva i wsp., w przygotowaniu).

Kluczowym czynnikiem, który pozwala algorytmowi cyfrowej analizy obrazu odróżnić raka od komórek zrębu, jest ich odmienne powinowactwo do dna studni: komórki MM nie przylegają i pozostają w zawieszeniu w macierzy, podczas gdy komórki zrębu przylegają do dna studzienki, a następnie rozciągają się.

To rozdzielenie następuje, mimo że MM i zrąb są wysiewane w tym samym czasie, i występuje podczas procesu inkubacji O/N. Wirowanie w wirówce po wysianiu płytki dodatkowo przyspiesza ten proces. W konsekwencji komórki MM pojawiają się na obrazie jako okrągłe, jasne dyski otoczone ciemnym pierścieniem, podczas gdy zrąb zachowuje niski profil i ciemniejszy odcień (ryc. 2). W związku z tym test w swojej obecnej formie najlepiej nadaje się do nieprzylegających komórek nowotworowych, chociaż można dokonać korekt w algorytmie, aby oddzielić raka i zrąb w oparciu o inne cechy morfologiczne, takie jak rozmiar i kształt. W tym protokole opisujemy dwa typy macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen i macierz błony podstawnej), a także dwa typy kokultur, z (mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego) BMSC i HUVECS, reprezentującymi odpowiednio nisze śródmiąższowe i okołonaczyniowe szpiku kostnego.

Używając płytki 384-dołkowej, 5 stężeń na lek i dwóch powtórzeń, byliśmy w stanie przetestować do 31 różnych leków na próbce jednego pacjenta. W płytkach 1536-dołkowych liczba ta wynosi 127. Rysunek 3 przedstawia układ używany obecnie do ręcznego wysiewu komórek, podczas gdy rysunek uzupełniający 1 przedstawia optymalną dystrybucję przy użyciu pipetora zrobotyzowanego. W projekcie z rysunku 3 każda 384-dołkowa płytka może zawierać 3 próbki pacjenta z 7 różnymi lekami lub jedną próbkę pacjenta testowaną z 21 lekami. Każdy lek jest reprezentowany przez 5 stężeń, a każdy warunek jest umieszczany w duplikatach. Dla każdego zestawu 7 leków (np. dołki 36-39, 126-129 i 200-203) umieszcza się 4 studzienki kontrolne (bez dodatku leku). Aby zapewnić siłę działania stosowanych leków, ludzka linia komórkowa szpiczaka (np. H929 lub MM1. S) jest również wysiewany i odurzany w duplikatach w najwyższym stężeniu każdego z użytych leków (studzienki 76-89). Pozytywna kontrola linii komórkowych zapewnia, że stosowane leki mają odpowiednią siłę działania, ponieważ ich krzywe odpowiedzi na dawkę są porównywalne we wszystkich eksperymentach. W dwóch studzienkach umieszcza się linię komórkową szpiczaka w celu kontroli warunków środowiskowych, innymi słowy, w celu wykrycia ewentualnych problemów w inkubatorze laboratoryjnym podczas obrazowania (studzienki 75 i 90). Liczenie studzienek przebiega zygzakowato w celu zmniejszenia odległości pokonywanej przez zmotoryzowany stolik mikroskopu, co skraca czas akwizycji i zmniejsza zużycie sprzętu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie komórek ludzkich pochodzących z biopsji, jak opisano poniżej, zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Moffitt i przeprowadzone w ramach badania klinicznego MCC# 14745 przeprowadzonego w H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute.

1. Sortowanie komórek MM z aspiratów szpiku kostnego

  1. Pobrać aspiraty szpiku kostnego (20 ml) od pacjentów w strzykawce z heparyną sodową.
  2. Wyizolować komórki jednojądrzaste przez odwirowanie rozcieńczonego szpiku (1:1 ze sterylnym PBS) nad sterylnym gradientem wirowania w podłożu wodnym przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze otoczenia.
  3. Zbierz interfejs, który zawiera komórki jednojądrzaste. Umyć komórki zimnym PBS i policzyć za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, używając błękitu trypanowego do określenia żywotności.
  4. Przygotuj cienkowarstwowe szkiełko do przygotowania komórek10 i zabarwić barwieniem Wrighta-Giemsa, aby ocenić procent komórek plazmatycznych11.
  5. Oblicz ilość kulek CD138 do użycia na podstawie liczby komórek i procentowej zawartości komórek plazmatycznych. Jeśli próbka początkowa zawiera mniej niż 20% komórek plazmatycznych, należy ponownie zawiesić komórki, używając 90 μl buforu separacyjnego i 10 μl kulek CD138 na 5 x 106 komórek. Jeśli próbka wyjściowa zawiera więcej niż 20% komórek plazmatycznych, ponownie zawiesić przy użyciu 80 μl buforu separacyjnego i 20 μl kulek CD138 na 1 x 107 komórek.
  6. Inkubować komórki z kulkami w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  7. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 35 μm dodane do wstępnie zwilżonych kolumn rozdzielających (LS) umieszczonych w separatorze pola magnetycznego (patrz wykaz materiałów).
  8. Zdejmij kolumnę z magnesu. Zebrać wybrane komórki CD138, przemłukując kolumnę 3 razy 1 ml buforu separacyjnego.
  9. Oceń wzbogacenie CD138 za pomocą innego barwionego cienkowarstwowego preparatu komórkowego10.
  10. Przefiltruj osocze uzyskane z biopsji szpiku kostnego od każdego pacjenta za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Użyj świeżego osocza od tego samego pacjenta, co komórki CD138 +.
  11. Przygotuj pożywkę do eksperymentu, uzupełniając RPMI-1640 10% inaktywowaną płodową surowicą bydlęcą inaktywowaną na ciepło, 10% osocza pacjenta i 1% penicyliny-streptomycyny.
  12. Zebrać przepływ selekcji (CD138-) i postępować zgodnie z klasyczną metodą adhezji12, aby wybrać mezenchymalne komórki szpiku kostnego (BMSC). Ponieważ proces ten wymaga tygodni, zanim BMSC będą gotowe do użycia, konieczne jest przygotowanie BMSC od poprzednich pacjentów lub zdrowych dawców.

2. Wysiewanie komórek w płytkach (przy użyciu ręcznego pipetora wielokanałowego)

  1. Użyj płytki wielodołkowej (384 lub 1,536) z czarnymi ściankami i przezroczystym płaskim dnem, najlepiej zoptymalizowanej pod kątem zastosowań optycznych i hodowli komórkowych.
  2. Współhodowla BMSC z komórkami MM w kolagenie typu I lub macierzy błony podstawnej, jednak HUVEC wymagają macierzy błony podstawnej.
  3. Utrzymuj końcowe gęstości każdego typu komórek w następującym zakresie: 3 x 105 komórek/ml dla linii komórkowych MM, 2 x 105 komórek/ml dla HUVEC lub BMSC i 2 x 106 komórek/ml dla komórek MM pochodzących od pacjenta.
    Uwaga: Gęstości te są wynikiem eksperymentalnej optymalizacji, która pozwala na uzyskanie najwyższej możliwej jakości obrazu i najdłuższego możliwego czasu obrazowania przy jednoczesnym zachowaniu znaczenia biologicznego w testach. Linie komórkowe MM są wysiewane w mniejszej gęstości niż pierwotne komórki MM ze względu na ich szybsze tempo replikacji i większy rozmiar.
  4. Jednoczesna hodowla pierwotnych komórek MM z BMSC:
    1. Przygotować 100 μl podwielokrotności wstępnie zmieszanych pożywek składających się z 20 μl 10x MEM, 20 μl dejonizowanegoH2O, 10 μl 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 50 μl 1x RPMI 1,640 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. W czasie wysiewu płytek z komórkami MM wymieszać podwielokrotności wstępnie zmieszanej pożywki ze 150 μl 3,1 mg/ml kolagenu bydlęcego typu I do końcowej objętości 250 μl.
    3. Ponownie zawiesić 50 μl komórek w RPMI 1,640 przy sześciokrotności końcowej pożądanej gęstości.
    4. Wymieszać do zawiesiny komórkowej z mieszanką kolagenową, aby uzyskać końcową objętość 300 μl za pomocą pipety P200.
    5. Używając pipety ręcznej lub powtarzalnej, umieść 8 μl kropli końcowej mieszanki komórek/matryc na środku każdej studzienki na płytkach 384-dołkowych lub 2 μl w każdym dołku na 1,536 płytkich dołkowych (patrz krok 2.6, aby zapoznać się z przykładem przestrzennego rozmieszczenia studzienek).
    6. Odwirować płytkę przez 2 minuty przy 500 x g, aby skoncentrować wszystkie komórki w tej samej płaszczyźnie ogniskowej podczas obrazowania.
    7. Pozostawić płytkę w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 1 godzinę w celu polimeryzacji żelu.
    8. Dodaj 80 μl uzupełnionej pożywki wzrostowej (RPMI-1640, 10% FBS HI, 10% osocza pochodzącego od pacjenta, 1% P/S) do każdej studzienki na płytkach 384-dołkowych lub 8 μl w płytkach 1,536-dołkowych.
    9. Pozostawić płytkę O/N w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) w celu przylegania zrębu do dna płytki.
  5. Jednoczesna hodowla pierwotnych komórek MM z HUVEC:
    1. Przenieść matrycę membrany podstawnej z temperatury -80 °C do wiadra z lodem w celu rozmrożenia.
    2. Policz i ponownie zawiesić komórki pierwotne i HUVEC w pożywce RPMI-1640 o 4-krotności końcowej gęstości, każda w osobnej probówce.
    3. Wymieszaj komórki pacjenta i objętości HUVEC w proporcji 1:1.
    4. Po rozmrożeniu macierzy błony podstawnej, ale nadal nie spolimeryzowanej, wymieszaj 1:1 z mieszaniną komórek z poprzedniego etapu.
    5. Kropelki nasienne z odpowiednią objętością matrycy komórkowej mieszają się w środku każdej studzienki (8 μl dla płytek 384-dołkowych i 2 μl dla płytek 1,536-dołkowych, patrz krok 2.6 dla przykładu przestrzennego rozmieszczenia studzienek).
    6. Płytka wirowa o masie 500 x g przez 10 min.
    7. Umieścić płytkę w inkubatorze (5% CO2, 37 oC) na 1 godzinę w celu polimeryzacji matrycowej.
    8. Dodaj pożywkę wzrostową (RPMI-1640 uzupełnioną 10% FBS, 10% osocza pacjenta i 1% P/S) do każdej studzienki (80 μl dla płytek 384-dołkowych, 8 μl dla płytek 1,536-dołkowych).
    9. Pozostawić płytkę O/N w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) w celu przyklejenia HUVEC do dna płytki.
  6. Wysiew 384-dołkową płytkę. Rysunek 3 przedstawia typowy rozkład przestrzenny wysiewu.
    1. Zaczynając od dołka B2, wysiewaj tyle kolumn, ile leków ma być testowanych. W przykładzie przedstawionym na rysunku 3 użyj siedmiu leków.
    2. Powtórz siew tyle razy, ile stężeń, które mają być użyte. W przykładzie na rysunku 3 użyj pięciu stężeń.
    3. Zasiej jeszcze cztery dołki, aby uzyskać warunki kontrolne.
    4. Powtórz kroki 2.6.1 i 2.6.2 dla drugiej replikacji.
    5. Powtórzyć kroki od 2.6.1 do 2.6.4 dla każdej próbki pacjenta, która ma być badana na płytce.
    6. Zasiaj linię komórkową MM w dwóch liniach studzienek, z których każda zawiera tyle dołków, ile leków do przetestowania (w dwóch egzemplarzach). Każdy z tych dołków zostanie poddany działaniu najwyższego stężenia każdego narkotyku, aby zapewnić, że użyty zapas ma odpowiednią siłę działania (patrz na przykład rysunek 3).
    7. Wysiewaj dwie studzienki linią komórkową MM, aby służyły do kontroli warunków eksperymentalnych, takich jak prawidłowe funkcjonowanie inkubatora stołowego, pożywki wzrostowe itp.

3. Wysiewanie komórek w płytkach (za pomocą pipetora automatycznego)

Uwaga: Ta seria kroków wysiewa płytkę 384-dołkową za pomocą pipetora automatycznego. Konstrukcja płytki jest przedstawiona na rysunku uzupełniającym 1, na którym pierwotne komórki MM są testowane na panelu 31 różnych leków w pięciu różnych stężeniach w dwóch kontrpróbach, plus kontrola ujemna. Linia komórkowa jest również zasiewana jako kontrola pozytywna w celu oceny skuteczności leku i testowana przeciwko wszystkim 31 lekom w najwyższym stężeniu, w dwóch powtórzeniach. Dostarczone pliki są przeznaczone dla konkretnej marki i modelu (patrz tabela materiałów), ale algorytm można dostosować do dowolnych pipetorów zrobotyzowanych.

  1. Jednoczesna hodowla pierwotnych komórek MM z BMSC:
    1. Przygotować probówkę o pojemności 15 ml składającą się z 240 μl 10x MEM, 240 μl dejonizowanegoH2O, 120 μl 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu, 600 μl 1x RPMI 1,640 i 1,8 ml 3,1 mg/ml kolagenu bydlęcego typu I. Oznaczyć probówkę jako "wstępną mieszankę dla CD138+". Ułóż na lodzie do czasu użycia.
    2. Przygotować probówkę o pojemności 1,5 ml składającą się z 50 μl 10x MEM, 50 μl dejonizowanegoH2O, 25 μl 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu, 125 μl 1x RPMI 1,640 i 375 μl 3,1 mg/ml kolagenu bydlęcego typu I. Oznaczyć probówkę jako "wstępną mieszankę dla linii komórkowej". Ułóż na lodzie do czasu użycia.
    3. Ponownie zawieś 300 μl komórek CD138+ w RPMI 1,640 przy sześciokrotności końcowej pożądanej gęstości. Ponownie zawieś 300 μl komórek BMSC w RPMI 1640 przy sześciokrotności końcowej pożądanej gęstości. Wymieszaj obie objętości razem w probówce o pojemności 1,5 ml i oznacz etykietą "CD138+". Umieścić w inkubatorze do czasu użycia.
    4. Ponownie zawiesić 60 μl linii komórkowej w RPMI 1640 przy sześciokrotności końcowej pożądanej gęstości. Ponownie zawiesić 60 μl komórek BMSC w RPMI 1640 przy sześciokrotności końcowej pożądanej gęstości. Wymieszaj obie objętości razem w probówce o pojemności 1,5 ml i oznacz etykietą "Cell Line". Umieścić w inkubatorze do czasu użycia.
    5. Korzystając z oprogramowania dostarczonego z pipettorem automatycznym, załaduj pierwszy plik skryptu "cell_seedingPt47.PGM". Umieść pudełko na końcówki do pipet o pojemności 200 μl, płytkę do mikromiareczkowania i sterylną płytkę 384-dołkową odpowiednio w stacjach A, B i E robota.
    6. Wymieszaj zawartość probówek "pre-mix for CD138+" i "CD138+". Przenieść 1,5 ml jego zawartości do dołka #1 płytki do mikromiareczkowania. Umieść probówkę z pozostałą objętością na lodzie. Uruchom program. Robot zasieje pierwsze 176 dołków (11 skrajnych lewych kolumn) z 384-dołkowej płytki, a następnie zatrzyma się. Przenieść pozostałą część probówki na lodzie do dołka #2 płytki do mikromiareczkowania. Wznów program. Robot wysieje pozostałe 144 dołki z 384-dołkowej płytki i zrobi pauzę.
    7. Wymieszaj zawartość probówek "wstępna mieszanka dla linii komórkowej" i "linii komórkowej" i przenieś zawartość do dołka #3 płytki do mikromiareczkowania. Wznów program. Robot wysieje pozostałe 64 dołki z 384-dołkowej płytki.
    8. Umieścić 384-dołkową płytkę w wirówce na 10 minut w temperaturze 500 x g i 4 °C. Przenieść płytkę do inkubatora (5% CO2, 37 °C) na 1 godzinę w celu polimeryzacji kolagenu.
    9. Załaduj drugi plik skryptu "media_layer. PGM". Umieść pudełko z końcówkami do pipet o pojemności 120 μl, zbiornik na odczynnik z 31 ml RPMI-1640 uzupełnionym 10% FBS, 10% osocza pacjenta i 1% P/S oraz 384-dołkową płytkę z komórkami odpowiednio w stacjach A, B i E. Uruchom program. Robot przeniesie 81 μl pożywki do każdego dołka. Po zakończeniu przenieś 384-dołkową płytkę do inkubatora i pozwól zstromieniu przylgnąć do substratu O/N.

4. Przygotowanie leków i dozowanie płytek (przy użyciu ręcznego pipetora wielokanałowego)

  1. Przygotuj szablon podobny do rysunku 3, aby ułatwić proces dodawania leku do studzienek i zmniejszyć ryzyko pomyłki.
  2. Przygotuj, na płytce 96-dołkowej, seryjne rozcieńczenie każdego z leków, które mają być badane na płytce, na przykład dla pięciu stężeń przy użyciu 3-krotnego rozcieńczenia:
    1. Dodać 120 μl leku o 10-krotnym pożądanym stężeniu w studzience o najwyższym stężeniu. Na przykład użyj 500 μM melfalanu, jeśli najwyższe stężenie, jakie komórki zostaną wystawione na działanie płytki, wyniesie 50 μM.
    2. Dodać 80 μl pożywki wzrostowej (RPMI uzupełnione 10% FBS, 10% osocza pochodzącego od pacjenta i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S)) do czterech kolejnych studzienek.
    3. Przenieść 40 μl z pierwszego dołka do drugiego i wymieszać do całkowitej objętości 120 μl przy 1/3 stężenia leku w pierwszym dołku, czyli 167 μM.
    4. Powtórzyć krok 4.2.3 do pozostałych studzienek (np. przenieść 40 μl z drugiego do trzeciego, wymieszać, a następnie przenieść 40 μl z trzeciego do czwartego itd.).
  3. Przenieść 8 μl z każdej studzienki zawierającej lek do odpowiedniego dołka w płytce komórkowej. Każdy dołek zawierający lek powinien mieć wystarczającą objętość dla 10 dołków w płytce komórkowej. W przykładzie na rysunku 3 każde stężenie leku jest dodawane do 6 różnych studzienek, z wyjątkiem najwyższego stężenia, które jest dodawane do 8 studzienek.
  4. Dodać 8 μl pożywki wzrostowej (RPMI uzupełnionej 10% FBS, 10% osocza pochodzącego od pacjenta i 1% P/S) do studzienek kontrolnych.
  5. Umieść komórki w mikroskopie, gdy tylko będą gotowe i włącz inkubację na stole.

5. Przygotowanie leków i dozowanie płytek (za pomocą pipetora automatycznego)

  1. Pobierz pliki skryptów dla pipetora zrobotyzowanego z http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
  2. Załaduj skrypt "media_layer_DRUGPLATE. PGM" w interfejsie użytkownika pipetora zrobotyzowanego. Umieść pudełko na końcówki do pipet o pojemności 120 μl, zbiornik z 21 ml RPMI-1,640 uzupełniony 10% FBS, 10% osocza pacjenta i 1% P/S oraz pustą płytkę 384-dołkową odpowiednio w stacjach A, B i E. Uruchom program, zrobotyzowany pipeter doda 30 μl pożywki do wszystkich dołków w płytce 384-dołkowej.
  3. Postępując zgodnie z szablonem z rysunku uzupełniającego 2, dodać 200 μl leku o 20-krotnym maksymalnym stężeniu do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania. Ta konfiguracja może pomieścić do 31 leków. Do studzienki kontrolnej (CTRL) dodaj RPMI-1640 uzupełniony o 10% FBS, 10% osocza pacjenta i 1% P/S.
  4. Umieścić pojemnik na końcówki do pipet o pojemności 120 μl, płytkę do mikromiareczkowania z lekami o stężeniu 20X i 384-dołkową z pożywką (od kroku 5.1) odpowiednio w stacjach A, B i C. Załaduj program "drug_plate. PGM". Pipetor robotyczny utworzy szeregowe rozcieńczenie 1:3, zgodnie z rozkładem przestrzennym przedstawionym na rysunku uzupełniającym 1.
  5. Umieścić pojemnik na końcówki do pipet o pojemności 120 μl, płytkę 384-dołkową z rozcieńczeniem leku (z kroku 5.3) i płytkę 384-dołkową z komórkami (z kroku 3.1.9) odpowiednio w stacjach A, B i C. Załaduj i uruchom program "drug_add. PGM". Zrobotyzowany pipetor przeniesie 8 μl leku z każdej studzienki w płytce leku do jego odpowiednika w płytce komórkowej. Po zakończeniu należy jak najszybciej przenieść płytkę komórkową do inkubatora mikroskopu cyfrowego.

6. Obrazowanie komórek na płytce

Uwaga: Poniższa procedura dotyczy mikroskopu Evos Auto FL, ale może być łatwo dostosowana do innych zmotoryzowanych mikroskopów scenicznych z inkubacją stołową lub mikroskopami wbudowanymi w inkubator.

  1. Wyczyść wnętrze inkubatora stołowego wilgotną chusteczką z etanolem i ostrożnie zdejmij pokrywę płytki, jednocześnie zakładając pokrywę inkubatora.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby dodać sygnały nawigacyjne. Jest to termin używany w odniesieniu do punktów orientacyjnych dla obszarów zainteresowania, które mają być obrazowane kolejno podczas eksperymentu (szczegółowe informacje można znaleźć w podręczniku użytkownika oprogramowania).
  3. Użyj obiektywu o powiększeniu 5x lub 10x. Upewnij się, że ostrość jest podobna do tej na rysunku 2: komórki MM wyglądają jak jasne dyski otoczone ciemnym pierścieniem, a BMSC lub HUVEC są ledwo widoczne. Niektóre pierwotne komórki MM są bardzo małe i dlatego może być konieczne precyzyjne dostrojenie w celu znalezienia optymalnej ostrości.
  4. Dostosuj interwał akwizycji w zakresie od 10 do 30 minut i na czas co najmniej 96 godzin. Podczas gdy dłuższe odstępy między przejęciami są dopuszczalne, interwały wynoszące 45 minut lub więcej mogą znacznie zmniejszyć precyzję pomiaru żywotności.
  5. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby obrazy każdej studni były przechowywane w oddzielnych plikach o nazwach Beacon-1, Beacon-2 itp. Jeśli użyto pipetora zrobotyzowanego, ustaw sygnalizatory w kolejności przedstawionej na rysunku uzupełniającym 3.
  6. Upewnij się, że w inkubatorze, nawilżaczu i gazie jest wystarczająca ilość wody, aby komórki były w optymalnych warunkach.
  7. Po zakończeniu eksperymentu skopiuj foldery zawierające obrazy do komputera, na którym zostanie uruchomiona analiza.

7. Kwantyfikacja wrażliwości na leki

Uwaga: Poniższe instrukcje wskazują na korzystanie z analizy obrazu za pomocą klastra komputerowego, ponieważ analiza płytki wielodołkowej w komputerze osobistym jest niezwykle czasochłonna.

  1. Pobierz oprogramowanie ImageJ ze strony internetowej NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
  2. Pobierz skrypt i wtyczki na http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
  3. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf, aby uruchomić oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu. Wynikiem powinien być arkusz kalkulacyjny o nazwie Results.csv zawierający pomiary żywotności w regularnych odstępach czasu dla każdego dołka w płytce przez czas trwania eksperymentu (tj. 96 godzin).
  4. W przypadku korzystania z ręcznego pipetora wielokanałowego należy wykonać następujące czynności.
    1. Pobierz plik http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt i zmodyfikuj go tak, aby pasował do układu blachy zdefiniowanego w kroku 3.1 (np. Rysunek 3).
    2. Pobierz http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar oprogramowania i uruchom je, używając plików utworzonych w krokach 5.3 i 5.4 jako parametru wejściowego. Wynikiem będzie folder o nazwie Raport zawierający wiele arkuszy kalkulacyjnych, z których każdy grupuje wyniki dla określonego leku.
    3. Kopiowanie i wklejanie zawartości szablonu arkusza kalkulacyjnego http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Uwaga: Wynikiem powinny być wykresy, takie jak ten przedstawiony na rysunku 4, przedstawiające wrażliwość chemiczną próbki na różne leki w funkcji stężenia leku i czasu ekspozycji.
  5. W przypadku korzystania z pipetora zrobotyzowanego należy wykonać następujące czynności.
    1. Pobierz pliki szablonów z Pobierz pliki skryptów dla pipetora robotycznego z Files.zip szablonów http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic i wyodrębnij pliki w katalogu.
    2. Zmodyfikuj plik DrugList.csv zgodnie z listą leków i najwyższym stężeniem leku na płytce z komórkami. Postępuj zgodnie z układem z rysunku uzupełniającego 2.
    3. Uruchom program BuildExperimentalDesign.java przekazując jako parametr folder zawierający pliki wyodrębnione w kroku 7.5.1 oraz pliki Results.csv z kroku 7.3. Wynikiem powinny być dwa foldery o nazwie MM1_S i PtSample. Pierwsza zawiera opis studzienek (leków i stężeń) do kontroli pozytywnej linii komórkowej. Drugi zawiera te same informacje, ale dotyczące części płytki wysianej komórkami pacjenta.
    4. Skopiuj plik Results.csv do każdego z katalogów utworzonych w kroku 7.5.3. Pobierz oprogramowanie http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar i uruchom je, korzystając z plików utworzonych w krokach 7.5.3 dla obu folderów. Wynikiem będzie folder o nazwie Report w każdym z folderów utworzonych w wersji 7.5.3. Folder Raport zawiera wiele arkuszy kalkulacyjnych, z których każdy grupuje wyniki dla określonego leku.
    5. Uruchom program BuildGraphPadFile.java i przekaż jako parametr folder zawierający pliki wyodrębnione w kroku 7.5.1 oraz pliki Results.csv z kroku 7.3. Wynikiem będzie plik graficzny zawierający krzywe dawka-odpowiedź dla każdego z 31 leków i znormalizowany przez kontrolę. Każdy wykres będzie zawierał 5 stężeń leku dla pierwotnych komórek MM i jedno stężenie dla pozytywnej kontroli linii komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg eksperymentu został krótko opisany na Rysunku 1. Jeśli wszystkie kroki zostaną wykonane pomyślnie, obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu powinny odpowiadać Rysunkowi 2: żywe komórki MM powinny być wyraźnie widoczne jako jasne dyski, natomiast komórki BMSC lub HUVEC powinny być ledwo widoczne i dobrze rozłożone w tle. Jak widać na Rysunku 2A, rozmiar komórek MM różni się w zależności od pacjenta, ale ogólnie są one mniejsze niż linie komórkowe. Ponieważ praktyczni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podsumowując, jest to potężna i wysokoprzepustowa metoda ilościowego określania chemowrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka szpiczaka szpiczaka szpiku kostnego oraz farmakodynamiki ex vivo leków w rekonstrukcji szpiku kostnego. Krytycznymi krokami w ramach tego protokołu są prawidłowe wysiew dołków i odpowiednie ogniskowanie (patrz rysunek 2 w celu uzyskania oczekiwanych wyników): upewnij się, że komórki MM i zrębu są równomiernie rozmieszczone, że komórki zrębu przylegają do dna studzienki, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez State of Florida's Bankhead-Coley Team Science Grant (2BT03), National Institutes of Health/National Cancer Institute (1R21CA164322-01) oraz Moffitt Cancer Center's Team Science Grant. Prace te były częściowo wspierane przez Translational Research Core Facility w H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, wyznaczonym przez NCI jako Kompleksowe Centrum Onkologiczne (P30-CA076292). Dostęp do komórek pierwotnych był możliwy dzięki Protokołowi Całkowitej Opieki Onkologicznej w Moffitt Cancer Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EVOS FL AUTOAMGAMAFD1000 + AMC1000Mikroskop cyfrowy wyposażony w zmotoryzowany inkubator stołowy i
Płytka 384-dołkowa CellBindCORNING CLS3683SIGMACorning CellBIND 384
Płytka 384-dołkowa, polistyrenowa, powierzchnia CellBIND, sterylna, przezroczysta płaska płytka,, z pokrywką
Płytka 1 536-dołkowa CellBindCORNINGCLS3832 ALDRICHPłytki dołkowe Corning 1 536, niska podstawa, obróbka powierzchniowa CellBIND, sterylne
Ficoll-Paque Plus GE HealthcareGE17-1440-02 SIGMADo in vitro izolacji limfocytów z ludzkiej krwi obwodowej.
Koraliki magnetyczne CD138Miltenyi 130-051-301Kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałem do selekcji komórek CD138 +.
Kolumny LSMiltenyi   130-042-401Kolumna do separacji komórek.
Separator MidiMACSMiltenyi 130-042-302Magnes do kolumny separacyjnej.
MatrigelSigma-AldrichE6909 SIGMAECM Gel firmy Engelbreth-Holm-Swarm mysi mięsak
GetrexLife TechnologiesA1413201Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV
HUVECLife TechnologiesC-003-25P-BLudzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)
RPMI-1640 mediaGIBCO11875-093RPMI 1640 Medium + L-Glutamina + Czerwień fenolowa
FBS Inaktywowana termicznieGIBCO10082-147Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie amerykańskie
3,1 mg/ml Kolagen bydlęcy typu IBiomatrix5005-B, typ I, 3 mg/ml, 100 ml
Precyzyjnyzrobotyzowany system pipetowaniaBIOTEKPRC3841
stołowy. Płytki dołkowe Zaawansowany roztwór kolagenu bydlęcego XS

Bibliografia

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wra liwo ci na lekikomory mikroprzep ywoweaspirat szpiku kostnegokom rki zr bupolimeryzacja kolagenucyfrowa analiza obrazukrzywe prze ywalno cirodki chemioterapeutycznezmotoryzowany mikroskop
Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.