Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mięsień brodawkowaty wyizolowany z serca dorosłej myszy może być używany do badania kurczliwości serca podczas różnych stanów fizjologicznych/patologicznych. Charakterystykę skurczową można ocenić niezależnie od wpływów zewnętrznych, takich jak tonus naczyniowy lub stan neurohumoralny. Przedstawiono w nim naukowe podejście do pomiarów pojedynczych komórek z izolowanymi miocytami serca i badań in vivo, takich jak echokardiografia. W związku z tym preparaty mięśni brodawkowatych służą jako doskonały model do badania fizjologii/patofizjologii serca i mogą być wykorzystywane do badań, takich jak modulacja za pomocą środków farmakologicznych lub eksploracja transgenicznych modeli zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania mysiego lewego przedniego mięśnia brodawkowatego w celu zbadania kurczliwości serca w konfiguracji kąpieli narządowej. W przeciwieństwie do preparatu paskowego wyizolowanego ze ściany komory, mięsień brodawkowaty może być przygotowany in toto bez poważnego uszkodzenia tkanki mięśniowej. Zestaw do kąpieli organowej składa się z kilku komór do kąpieli organowej o kontrolowanej temperaturze, gazowanych i wyposażonych w elektrody. Izolowany mięsień brodawkowaty jest mocowany w komorze kąpieli narządowej i stymulowany elektrycznie. Wywołana siła drgań jest rejestrowana za pomocą przetwornika ciśnienia i analizowane są takie parametry, jak amplituda siły drgania i kinetyka drgań. Można przeprowadzić różne protokoły eksperymentalne w celu zbadania kurczliwości zależnej od wapnia i częstotliwości, a także krzywych dawka-odpowiedź środków kurczliwych, takich jak katecholaminy lub inne farmaceutyki. Dodatkowo można symulować stany patologiczne, takie jak ostre niedokrwienie.
Wprowadzenie
Badanie białek takich jak kanały jonowe, określające ich rolę w kurczliwości serca, jest niezbędne do odkrycia różnych patomechanizmów i ustalenia nowych strategii terapeutycznych dla chorób serca, takich jak niedokrwienie i niewydolność serca.
Wiadomo, że funkcja kurczenia się kardiomiocytów ssaków jest modulowana przez różne kanały jonowe, transportery i inne białka. Potencjał czynnościowy wywołany aktywacją zależnych od napięcia sarkolemmalnych kanałów Ca2 + typu L prowadzi do napływu Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a następnie do indukowanego przez Ca2 + uwalniania Ca2 + (CICR)1, co wywołuje skurcz komórkowy2. Sygnalizacja Ca2 + odgrywa kluczową rolę w kurczliwości serca i adaptacji do stresu fizjologicznego lub patologicznego. Katecholaminy aktywują receptory β-adrenergiczne serca, stymulując w ten sposób cyklazę adenylową (AC), która syntetyzuje cAMP. Aktywowana kinaza białkowa A (PKA) fosforyluje różne białka wewnątrzkomórkowe i błonowe, takie jak kanały Ca2 + typu L, fosfalamban i receptory ryanodine, powodując modyfikację stanów przejściowych Ca2 + i kurczliwość serca1,3,4. cAMP jest degradowany przez fosfodiesterazę (PDE). Aktywacja receptorów sprzężonych z Gs innych niż β-adrenergiczne również prowadzi do akumulacji cAMP.
Technika pomiaru kurczliwości w izolowanych paskach mięśni komorowych jest dobrze znana dla większych gatunków ssaków5-8. Opierając się na możliwości celowania genów u myszy, ważne jest ustalenie metod analizy fizjologii serca myszy. Jednak istniejące dane dotyczące właściwości fizjologicznych izolowanych preparatów mięśniowych u myszy różnią się w zależności od warunków eksperymentalnych9-12.
Opisana metoda służy do analizy kurczliwości mięśni brodawkowatych lewej komory in vitro. Badanie kurczliwości serca przeprowadza się przy braku czynników modyfikujących kurczliwość serca in vivo, takich jak ciśnienie krwi, stymulacja neurohumoralna oraz stres fizyczny lub metaboliczny. Szybkość bicia preparatu mięśni kurczących się może być rygorystycznie zdefiniowana i dowolnie zmieniana. Siła drgań może być analizowana w kontekście konkretnych bodźców, takich jak stężenie wapnia, częstotliwość dudnień czy temperatura. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do zbadania różnych komponentów szlaku sygnałowego oraz do porównania wydajności serca genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy poprzez kontrolowanie warunków eksperymentalnych wymienionych powyżej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Podstawowe kroki procedury izolacji są pokazane na rysunku 1. Wszystkie kroki są szczegółowo opisane w poniższym protokole. Izolacja mięśni brodawkowatych, montaż w komorze kąpieli narządowej, akwizycja i analiza odbywa się w sekwencyjnym i obowiązkowym przedziale czasowym.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym ochrony zwierząt i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Heidelbergu.
1. Przygotowanie oprzyrządowania
- Do pomiarów kurczliwości należy użyć wielokomorowej kąpieli organowej. Elementy zestawu do kąpieli narządowej z kurczliwością ex vivo przedstawiono na rysunku 2.
UWAGA: Aby zminimalizować czas między przygotowaniem mięśnia brodawkowatego a rozpoczęciem protokołu eksperymentalnego, przed pobraniem doświadczalnej tkanki należy ustawić sprzęt i przygotować. Zapewnia to największą ilość czasu, w którym tkanka pozostaje zdolna do przeprowadzania eksperymentów. - Uruchom komputer i sprzęt do akwizycji danych. Włącz podgrzewanie w łaźni organowej (ustawione na 32 °C) i pozwól urządzeniom ustawić temperaturę.
- Przygotuj sprzęt do akwizycji. Rozpocznij rejestrowanie danych zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania.
- Sprawdź i przeprowadź kalibrację (jeśli to konieczne) na każdym kanale i wyzeruj wszystkie kanały, aby ustandaryzować sygnał elektryczny dostarczany z odpowiedniego przetwornika siły (powiązanego z tym kanałem) na siłę 2 g dostarczaną przez certyfikowany wzorzec masy.
- Włączyć dopływ gazu (95% O2/5% CO2) do komór do kąpieli organowej. Ciągłe gazowanie wszystkich komór podczas całego protokołu pomiarów.
2. Przygotowanie i roztworów fizjologicznych
- Przygotować roztwór buforowy Krebsa-Henseleita w celu uzyskania końcowych stężeń 119 mM NaCl; 25 mM NaHCO3; 4,6 mM KCl; 11 mM glukozy; 1 mM Na-pirogronianu; 1,5 mM CaCl2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH2PO4 i dostosować pH do 7,4 (patrz Tabela 1 Roztwór fizjologiczny).
- Przygotować oddzielny roztwór buforowy Krebsa-Henseleita do użycia podczas izolacji, jak opisano w kroku 2.1, z dodatkowymi 30 mM monoksymu 2,3-butanodionu (BDM) i 50 IE heparyny/ml. Chłodny roztwór do 4°C (patrz Tabela 1 Roztwór przygotowawczy). Do symulacji niedokrwienia należy przygotować roztwór niedokrwienny zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Aby uzyskać protokół kurczliwości zależnej odCa2+, dodać Ca2+ do roztworu buforowego Krebsa-Henseleita do żądanego stężenia końcowego.
UWAGA: przygotować te roztwory bezpośrednio przed ich użyciem i gazować karbogenem, aby uniknąć wytrącania się węglanu wapnia. Przed użyciem podgrzej roztwór do 32°C.
3. Przygotowanie rurki gazowej i naczynia preparacyjnego używanych podczas procedury wycinania brodawek
- Podłącz miękką rurkę gazową (średnica zewnętrzna 2-4 mm) do przyłącza gazowego (100% tlenu, alternatywnie karbogen) z fachową pracą.
- Utworzyć zamknięty pierścień łącznika rurki gazowej wewnątrz naczynia rozwarstwiającego. Przekłuć rurkę gazową kilka razy, aby zapewnić ciągłe bulgotanie. Ta rurka gazowa może być używana kilka razy.
- Przygotuj naczynie preparacyjne z elastomerem silikonowym na dnie (o grubości 0,5 cm), tak aby można było w nie wbić szpilki. To danie może być używane kilka razy.
4. Izolacja lewego przedniego mięśnia brodawkowatego od myszy
UWAGA: Zanim rozpoczniesz izolację mięśnia brodawkowatego, sprawdź, czy przewody gazowe są wolne od zatorów.
- Przygotuj zestaw do kąpieli narządów, jak wspomniano w sekcji protokołu 1-3 przed rozpoczęciem przygotowania mięśni brodawkowatych. Przygotuj wszystkie roztwory w dniu eksperymentu.
- Złóż w ofierze mysz (w wieku około 8-12 tygodni) przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi ekspertów i instytucji.
- Zamocuj zwierzę w pozycji grzbietowej, mocując przednie i tylne łapy na desce rozdzielczej, otwórz klatkę piersiową boczną po obu stronach, przecinając żebra ostrymi nożyczkami do kości, a następnie przetnij przeponę cięciem poprzecznym. Usuń osierdzie. Teraz serce i aorta są dostępne.
- Przymocuj serce kleszczami do truncusa naczyniowego w pobliżu serca i szybko oddziel serce nożyczkami od płuc i otaczających tkanek.
- Przenieść bijące serce na szalkę Petriego wypełnioną schłodzonym roztworem preparatu zagazowanym tlenem (krok 2.2). Pozwól sercu bić i delikatnie stymuluj skurcze serca, dotykając wierzchołka serca kleszczami.
- Gdy tylko serce będzie całkowicie wykrwawione, przenieść je do naczynia rozwarstwiającego wypełnionego schłodzonym roztworem przygotowawczym (krok 2.2) i zagazowaćO2. Od tego kroku użyj mikroskopu stereoskopowego.
- Zamocuj serce za pomocą małej szpilki przez prawą komorę tak, aby serce było widoczne od strony grzbietowej (prawa komora znajduje się po prawej stronie z punktu widzenia operatora).
- Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych oddziel oba przedsionki na poziomie przedsionkowo-komorowym, odetnij tkankę łączącą z komór i wyrzuć. Wykonaj przecięcie ściany komory od poziomu zastawki przedsionkowo-komorowej do wierzchołka serca, unikając jakiegokolwiek nacisku mechanicznego.
- Otwórz komorę i przymocuj lewą wolną ścianę kleszczami, przyglądając się w ten sposób obu mięśniom brodawkowatym lewej komory.
- Lekko odetnij tkankę komorową boczną po obu stronach lewego przedniego mięśnia brodawkowatego, zachowując część żagla zastawkowego na przygotowaniu mięśnia brodawkowatego i unikaj dotykania lub rozciągania mięśnia brodawkowatego tak bardzo, jak to możliwe. Wypreparuj pozostałą tkankę ściany komory z mięśnia brodawkowatego.
- Przymocować nici jedwabne (7/0, metryczne 0,5) po obu stronach preparatu mięśni brodawkowatych, jedną na żaglu zastawkowym i jedną na części mięśniowej. Preparat utrwalić w komorze do kąpieli narządowej wypełnionej roztworem do kąpieli narządowej i zagazowanej karbogenem, zgodnie z sugerowaną temperaturą 32 °C.
5. Równowaga i stymulacja mięśnia brodawkowatego
- Bezpośrednio po utrwaleniu w kąpieli narządowej stymulować preparat mięśni brodawkowatych impulsami prostokątnymi (czas trwania 2 ms i prąd 100 mA) o częstotliwości stymulacji 1 Hz.
- Należy zapewnić częstą wymianę roztworu do kąpieli narządowej, albo poprzez ciągłą wymianę, albo przez częstą ręczną wymianę (co 5 minut), w zależności od konfiguracji stosowanego rodzaju kąpieli organowej.
- Stopniowo zwiększaj napięcie wstępne, aż do osiągnięcia maksymalnej siły drgania. Maksymalna siła drgania jest osiągana, gdy po wzroście napięcia wstępnego nie następuje dalsze zwiększenie siły skurczu.
- Po 45-60 minutach równoważenia rozpocznij protokół eksperymentalny.
6. Sugerowane protokoły eksperymentalne do pomiarów kurczliwości
UWAGA: Opisany poniżej protokół eksperymentalny zawiera standardowe manewry do scharakteryzowania kurczliwości serca w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. W części dotyczącej reprezentatywności szczegółowo opisujemy te protokoły, podając również reprezentatywne wyniki (zob. również Tabela 2).
- Rejestrowanie i analiza protokołów eksperymentalnych
- Do nagrywania należy użyć odpowiedniego oprogramowania o odpowiedniej rozdzielczości czasowej (szybkość akwizycji ≥ 1kHz).
- Przeanalizuj parametry, w tym amplitudę siły drgania (wysokość), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (TTP) i połowę maksymalnego czasu relaksacji (odpowiednio R50/TFall), jak wspomniano w oprogramowaniu (jako przykład wykres 5.5 przyrządów ADI, patrz rysunek 4).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie dla pomiarów kurczliwości izolowanych preparatów mięśnia brodawkowego myszy został dostrojony do warunków optymalnych, aby uzyskać powtarzalne wyniki eksperymentalne w warunkach fizjologicznych. W celu zdefiniowania optymalnych warunków eksperymentalnych przeprowadzono badania pilotażowe, w których zmieniano temperaturę kąpieli organowej oraz stężenie wapnia pozakomórkowego (patrz również12). Opisany tutaj protokół wykonano przy stężeniu wapnia pozakomórkowego 1.5 mM ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie opisujemy metodę badania kurczliwości mysiego mięśnia brodawkowatego in vitro , która może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kilka pytań naukowych związanych z fizjologią i patologią serca u myszy, a także do wsparcia analizy linii transgenicznych i odkrycia nowych podejść farmaceutycznych do leczenia dysfunkcji serca. Przedstawiono zastosowanie tej metody do oceny fizjologicznych, patologicznych i farmakologicznych właściwości kurczliwości mięśnia sercowego (patrz ryc. 3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen", FR 1638/1-2) oraz przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych, część Niemieckich Centrów Badań nad Zdrowiem, które jest inicjatywą BMBF (niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań)).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| Monoksym 2,3-butanodionu | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-izobutylo-1-metyloksantyna | Sigma-Aldrich | I5879 | Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia H 302, rozpuścić w DMSO |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Chlorowodorek izoprenaliny | Sigma-Aldrich | I5627 | Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia H 315-H319-H335 |
| Heparyna sodowa 250 000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Dichlorowodorek histaminy | Sigma-Aldrich | H7250 | Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia H 315-H 317-H319- H334-H335 |
Bibliografia
- Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
- Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
- Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
- Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
- Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
- Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
- Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
- Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
- Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
- Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
- Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
- Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
- Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
- Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
- Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
- Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
- Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
- Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
- Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
- Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
- Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
