Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Streszczenie

Modelowy organizm wielokomórkowy Caenorhabditis elegans to mały nicień o wielkości około 1 mm w wieku dorosłym, który jest genetycznie i eksperymentalnie podatny na manipulacje. Jest ekonomiczny i łatwy do hodowli i dozowania w płynnym podłożu, dzięki czemu dobrze nadaje się do badań przesiewowych o średniej przepustowości. Wcześniej przeprowadziliśmy walidację zastosowania transgenicznych szczepów C. elegans wykazujących ekspresję lucyferazy, aby zapewnić szybką ocenę in vivo poziomów ATP nicieni. ^1-3 W tym miejscu przedstawiamy wymagane materiały i procedurę do przeprowadzenia testów biologicznych na bioluminescencyjnych szczepach C. elegans PE254 lub PE255 (lub dowolnym z ich pochodnych szczepów). Protokół pozwala na wykrywanie in vivo subletalnych skutków leków, które mogą identyfikować toksyczność mitochondrialną, a także na wykrywanie in vivo potencjalnych korzystnych skutków leków. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla substancji chemicznych parakwatu, rotenonu, szczawiooctanu i czterech związków hamujących lucyferazy świetlika. Metodologia ta może być rozbudowywana, aby zapewnić platformę do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków zdolnych do modulowania funkcji mitochondriów. Przedkliniczna ocena toksyczności leków jest często przeprowadzana na unieśmiertelnionych liniach komórek nowotworowych człowieka, które pochodzą z ATP głównie z glikolizy i często tolerują toksyczne substancje mitochondrialne. ^4,5 W przeciwieństwie do tego, C. elegans zależy od fosforylacji oksydacyjnej, aby podtrzymać rozwój do dorosłości, rysując paralelę z ludźmi i zapewniając wyjątkową okazję do oceny związku w kontekście fizjologicznym całego żywego organizmu wielokomórkowego.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie ilościowe określenie stanu energetycznego C. elegans in vivo z zamiarem wykorzystania go jako punktu końcowego w badaniach przesiewowych związków. Uzasadnienie opiera się na transgenicznej ekspresji lucyferazy świetlika w nicieniu C. elegans^1-3 za pośrednictwem plazmidu pSLGCV (¹https://www.addgene.org/49862). Enzym lucyferazy jest połączony z zielonym białkiem fluorescencyjnym GFP i ulega konstytutywnej i wszechobecnej ekspresji w cytoplazmie (usunięto sygnał celowania w peroksysomy lucyferazy). Prowadzi to do emisji światła, gdy substrat lucyferyna jest dostarczany egzogennie. Ponieważ robak jest przezroczysty, światło może być mierzone w luminometrze jako względne jednostki światła (RLU). Komórkowe ATP napędza reakcję bioluminescencji, a jego dostępność determinuje poziom wytwarzanego światła. W związku z tym luminometria oferuje wygodny sposób oceny względnych poziomów ATP, a co za tym idzie, funkcji mitochondriów, ponieważ produkcja ATP zachodzi głównie w mitochondriach. Związek między funkcją mitochondriów a poziomem bioluminescencji wykazano już wcześniej poprzez wyciszenie mitochondrialnych genów łańcucha transportu elektronów i jednoczesne zmniejszenie emisji światła. ¹

Wygenerowane szczepy bioluminescencji zostały oznaczone jako PE254(feIs4) i PE255(feIs5)¹ (zobacz listę materiałów) i mogą być używane zamiennie. ³ W wielu badaniach wykorzystano te szczepy czujników do raportowania komórkowych poziomów ATP in vivo po narażeniu na różne ksenobiotyczne chemikalia, takie jak azydek sodu¹, kadm², ekstrakt z osadów ściekowych³, 5'-fluoro-2-deoksyurydyna6 i nitrozoamina^specyficzna dla tytoniu 7. Szczepy te okazały się również przydatne do monitorowania skutków ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe^{C 8} oraz skutków zakłócenia funkcji mitochondrialnego łańcucha oddechowego. ^1,9 Wczesna wersja czujnika luminescencji wyrażającego gen lucyferazy bez fuzji GFP (PE39) została również wykorzystana w badaniu wpływu metali ciężkich i rozprzęgania układu oddechowego. Wykazano, że ¹⁰ szczepów PE254 i PE255 przenoszą lucyferazę: fuzję GFP i fluorescencję GFP zwiększają się proporcjonalnie do masy nicieni, oferując wygodny sposób normalizacji wartości luminescencji. ^6,9 Wpływ zróżnicowanej liczby robaków na studzienkę można również uwzględnić poprzez włączenie do testu wielu powtórzeń technicznych (co najmniej 5 studzienek na warunek). ³

Protokół oferuje możliwość monitorowania poziomów energii in vivo (w przeciwieństwie do bardziej pracochłonnych technicznie oznaczeń ATP in vitro), umożliwiając badanie przesiewowe związków i repozycjonowanie w kontekście fizjologicznym całego organizmu wielokomórkowego. Procedura może być rozszerzona na różne tła genetyczne poprzez skrzyżowanie chromosomalnie zintegrowanego transgenu z dostępnymi zmutowanymi szczepami i/lub poprzez wyciszenie genów przez interferencję RNA; w ten sposób w pełni wykorzystując C. elegans jako organizm modelowy. Metoda ta powinna przyczynić się do zmniejszenia niepowodzeń w późnej fazie leczenia potencjalnych leków z powodu toksyczności mitochondrialnej i przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach (komora z przepływem laminarnym) i przy użyciu wstępnie wysterylizowanych materiałów (autoklawując w 126 °C, 11 min). Wymagana jest płytka LB z prążkowanymi E. coli OP50 przechowywana w temperaturze 4 °C, rozsypana na świeże płytki LB i ponownie paskowana co miesiąc.

1. Pokarm bakteryjny (Escherichia coli OP50) Przygotowanie

1. Dzień 1. Zaszczepić 2 x 5 ml LB w dwóch uniwersalnych butelkach pojedynczą kolonią E. coli OP50 i umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C (220 obr./min) na 8 godzin.
2. Po 8 godzinach inkubacji użyć 2 ml kultury E. coli OP50 LB do zaszczepienia każdej z 3 x 200 ml LB. Umieścić kolby w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) O/N (17 godz.) w temperaturze 37 °C.
3. Zważyć 20 probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zapisać wagę na probówce.
4. Dzień 2. Za pomocą pipety serologicznej podsycić 30 ml kultury O/N E. coli OP50 do wstępnie zważonych probówek wirówkowych. Wirować przy 7 741 x g, 10 °C, 8 min.
5. Ostrożnie zdekantować supernatant, trzymać probówkę odwróconą pokrywką i odstawić na kilka minut. Za pomocą pipety usunąć nadmiar supernatantu, który mógł zebrać się w pokrywce. Zważ rurkę i oblicz wagę granulki.
6. Obliczyć objętość potrzebną do uzyskania zawiesiny 30 g/l i zaznaczyć tę objętość na probówce. Opatrzyć datą, oznaczyć i umieścić probówki w temperaturze -20 °C do użytku w ciągu 1-3 miesięcy lub w temperaturze -80 °C w przypadku przechowywania dłuższego niż 3 miesiące.
7. Przygotować zawiesinę bakteryjną do hodowli nicieni; pozostawić osad bakteryjny do rozmrożenia i dodać wymaganą objętość kompletnego podłoża S^11,12 do każdej probówki, delikatnie zwirować, aby ponownie zawiesić osad, zebrać zawartość różnych probówek, aby uzyskać wymaganą objętość. Praca w sterylnych warunkach.

2. Przygotowanie wzorców leków w formacie płytki 96-dołkowej

UWAGA: Jeśli korzystasz z biblioteki leków, tabliczki z lekami są dostarczane przy pojedynczym stężeniu związku w DMSO. Podstawowe badania przesiewowe będą testować związki w pojedynczym stężeniu. Poniżej znajdują się instrukcje dotyczące przygotowania płytki leku do potwierdzającego badania związku w zakresie stężeń w zakresie 0-160 μM, wybranych po istotności statystycznej przy 10 μM. Poniższe kroki można dostosować do testowania innych stężeń.

UWAGA! Przestrzegaj niezbędnych środków ostrożności podczas obchodzenia się z narkotykami (zazwyczaj wymagana jest maska na twarz, okulary ochronne, rękawice).

1. Przygotować tabliczkę z roztworem mechanicznym do potwierdzającego badania przesiewowego: zważyć wymaganą ilość związku do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i przygotować 16 mM związku w DMSO (tj. 100 razy skoncentrowany w stosunku do pożądanego stężenia górnego do ekspozycji).
2. Seryjnie rozcieńczać 16 mM zapasu 1:2 w DMSO, aby uzyskać wzorce 8, 4, 2, 1, 0,5 i 0,25 mM (warunki sterylne). Są one 100-krotnie skoncentrowane i zostaną rozcieńczone do końcowych stężeń 0 (tylko nośnik), 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 μM (w 1% DMSO) podczas ekspozycji na lek
.
3. W komorze z przepływem laminarnym umieścić 20-50 μl na studzienkę wzorców związków w kolumnie 96-dołkowej płytki, na przykład pozycja płytki A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM leku i H1: DMSO. Używaj różnych kolumn do rozcieńczania serii różnych leków.
4. Podwielokrotność nośnika do studzienek w kolumnie 12 na tabliczce leku.
   UWAGA: Ułatwi to badanie kolumn sterowniczych pojazdu w dół oprócz badania wzdłuż rzędu H, zapewniając, że pojazd jest badany w pozycjach reprezentatywnych dla całej tablicy.
   UWAGA: Każda tabliczka leku do potwierdzających badań przesiewowych zawiera serię rozcieńczeń dla maksymalnie 11 różnych leków, które mają być badane, plus kontrola pojazdu.
5. Oznaczyć etykietą i uszczelnić płytkę, przykryć folią i umieścić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.

3. Eksperymenty z nicieniami

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach, aseptycznie i przy użyciu wstępnie wysterylizowanych materiałów i odczynników. Rutynowo utrzymuj szczepy C. elegans na płytkach NGM z E. coli OP50. ¹² Sugerowane terminy poszczególnych etapów protokołu przedstawiono w tabeli 1.

1. Zadanie dnia 1: skonfigurowanie płynnej kultury szczepu biosensora do późniejszej synchronizacji.
   1. Pobrać nicienie z jednej płytki NGM o średnicy 6 cm (z dużą ilością młodych larw, w miejscach, gdzie właśnie skończył się pokarm) w 2 ml S complete i przenieść do kolby z 30 g/l E. coli OP50 w S complete (całkowita objętość 30 ml w stożkowej szklanej kolbie o pojemności 250 ml). Inkubować przez 3 dni w temperaturze 20 °C, 160 obr./min.
2. Zadanie dnia 4 (odczekaj około 30-35 minut): kultura wybielania w celu zebrania jaj i zsynchronizowania populacji robaków. Przeprowadzaj wszystkie etapy wirowania przez 1 min, 600 x g.
   1. Przygotuj roztwór wybielacza tuż przed użyciem: do każdych 16 ml 0,156 M KOH/NaOH dodaj 4 ml wybielacza.
   2. Wlać 2 x 14 ml kultury robaków do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie (3 min). Usuń i wylej płyn powyżej osiadłych nicieni. Dodaj 5 ml roztworu wybielacza do każdej probówki i uruchom minutnik. Połącz objętości w jedną probówkę.
   3. Delikatnie odwróć probówkę przez 2 minuty, sprawdź pod stereoskopem, czy robaki się rozbiły i czy jaja zostały uwolnione do zawiesiny. Gdy większość jaj zostanie uwolniona lub w maksymalnym czasie 2 minut w roztworze wybielacza, odwirować.
   4. Ostrożnie usunąć supernatant. Przemyć granulat 1x 14 ml S complete i odwirować.
   5. Odrzuć supernatant, dodaj 10 ml roztworu wybielacza i uruchom timer (ten drugi etap wybielania zapewnia, że większość tusz robaków rozpada się i nie jest już widoczna w stereoskopie). Po maksymalnym czasie w roztworze wybielacza wynoszącym 2 minuty odwirować.
   6. Po każdym odwirowaniu przemyć granulat 3x in S, delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 14 ml S complete. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić granulki jaj w 14 ml S complete.
   7. Przenieść objętość do stożkowej szklanej kolby. Inkubować 18-24 godziny w temperaturze 20 °C, 160 obr./min.
      UWAGA: Zebrane jaja wykluwają się O/N i zatrzymują rozwój w pierwszym stadium larwalnym (L1) z powodu braku pożywienia, stąd wszystkie będą na tym samym etapie wzrostu.
3. Zadanie dnia 5: skonfiguruj zsynchronizowane kultury robaków do testów leków.
   UWAGA: Robaki zawieszone w pożywce głodowej mają tendencję do przylegania do hydrofobowych powierzchni z tworzywa sztucznego, takich jak końcówki do pipet i rurki. 0,01% tween-20 jest środkiem powierzchniowo czynnym stosowanym tutaj w celu nadania powierzchniom tworzyw sztucznych bardziej hydrofilowego charakteru i umożliwienia większej dokładności liczenia (można również użyć 0,01% trytonu-X100). Kiedy nicienie znajdują się w pożywce z dodatkiem bakterii, nie mają tendencji do przyklejania się do plastiku.
   1. Określić liczbę wyklutych L1 w kolbie, trzymać kolbę na platformie wytrząsającej (160 obr./min).
      1. Pobrać 3 próbki po 100 μl z kolby (za każdym razem używać czystej końcówki) do oddzielnych mikroprobówek o pojemności 1,7 ml z 900 μl płynnego podłoża 0,01% Tween-20,
         UWAGA: Wsuń 100 μl próbki do czystej końcówki tylko raz. Następnie, podczas dozowania, należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół do podłoża uzupełnionego z kwecinami, aby uwolnić wszelkie robaki przylegające do końcówki.
      2. Policz nicienie w 4 kropelkach po 10 μl z każdej probówki do trzykrotnego rozcieńczenia. Obliczyć wartość średnią i oszacować liczbę robaków obecnych w stożkowej szklanej kolbie.
   2. Obliczyć objętość wyklętej zawiesiny nicieni wymaganą do założenia kultury o pojemności 2 x 20 ml z 10 nicieniami na 10 μl. Zwiększyć obliczoną objętość o 10 %, aby uwzględnić pewną późniejszą utratę nicieni podczas etapów wirowania.
   3. Wymagana objętość dekantacji do 2 probówek wirówkowych o pojemności 15 ml (wstępnie zważonych). Zważyć probówki, aby uzyskać rzeczywistą objętość, delikatnie wymieszać i dostosować do objętości docelowej, usuwając nadmiar objętości za pomocą pipety o pojemności 5 ml (tylko sterylna końcówka powinna wejść do probówki).
   4. Uzupełnić objętość do 14 ml świeżym płynem S complete do przemywania nicieni. Wirówka (1 min, 600 g). Usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu nicieni.
   5. Dodać 5 ml S w komplecie z 30 g/l E. coli OP50 do granulowanych nicieni. Przenieść 5 ml z każdej probówki do stożkowej szklanej kolby zawierającej 15 ml S wraz z 30 g/l E. coli OP50. Zanotuj czas, w którym nicienie po raz pierwszy zostały zaopatrzone w pożywienie.
   6. Delikatnie wstrząsnąć kolbą (160 obr./min), pobrać 9 kropelek po 10 μl na szkiełka mikroskopowe (za każdym razem używać świeżych końcówek), aby policzyć nicienie i potwierdzić średnią około 10 (±2) na 10 μl.
   7. Umieścić kolby nicieni w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 20 °C, 160 obr./min przez 42-44 godziny.
4. Zadanie dnia 7: przenieś nicienie do 96 płytek dołkowych i rozpocznij ekspozycję na lek.
   1. Połączyć kultury nicieni w jednej kolbie, delikatnie obracać kolbą i umieścić 3 x 4 ml kultury nicieni w sterylnym korycie o pojemności 60 ml. Umieść koryto na platformie wigrowającej (160 obr./min).
   2. Za pomocą pipety 8-kanałowej należy podać 25 μl zawieszonych nicieni na dołek 96-dołkowych czarnych płytek do mikromiareczkowania z płaskim przezroczystym dnem (do pomiaru zarówno luminescencji, jak i fluorescencji; lub białych płytek tylko do luminescencji). Przykryj pokrywką talerza i odłóż na bok.
      1. Po ustawieniu każdych 2 płytek umieść kolejne 2 x 2,5 ml nicieni w korycie, aby zastąpić utraconą objętość (utrzymuj "martwą objętość" w korycie około 7 ml).
      2. Ustaw 13/14 płytek z nicieniami. Do przetestowania dwóch 96-dołkowych płytek z lekiem potrzebnych będzie 11 płytek z nicieniami. Dwunasta płytka nicienia zostanie załadowana wyłącznie pojazdem jako kontrola. ^Trzynasta płytka zostanie użyta do ustalenia fluorescencji tła w dniu 8 (patrz poniżej). Można przygotować dodatkową płytę do użycia w przypadku wystąpienia błędów podczas konfiguracji.
   3. Porcję 74 μl siarki uzupełnić do każdej studzienki i umieścić na płytce w wilgotnej komorze (patrz wykaz materiałów) w inkubatorze do wytrząsania (20 °C, 160 obr./min) do momentu, gdy będzie gotowa do podwielokrotnienia badanych związków w ustalonym wcześniej czasie rozwoju (np. 45 godzin 30 minut po dostarczeniu pokarmu). [Objętość na studzienkę wynosi teraz 99 μl].
   4. Rozmrozić płytkę (płytki) z lekiem do przetestowania.
   5. Użyj pipety wielokanałowej, aby ustawić płytki nicieni z lekiem, zmieniając końcówki za każdym razem. Odczekać 5 minut na płytkę 96-dołkową do porcjowania leku.
      1. Pobrać 1 μl z 1. kolumny płytki leku i dodać do kolumn 1-5 płytki zawierającej nicienie; powtórzyć od 2. kolumny płytki z lekiem do kolumn 8-12 płytki zawierającej nicienie. Dodać 1 μl nośnika do kolumn 6 i 7 płytki dotyczącej nicieni.
         UWAGA: Całkowita objętość na studzienkę w płytce nicienia wyniesie 100 μl, co spowoduje rozcieńczenie związku/nośnika w stosunku 1:100.
      2. Powtórzyć proces, dodając 1 μl 3/4 kolumny płytki z lekiem do kolumn 1-5/8-12 drugiej płytki z nicieniami; dodać nośnik do kolumn 6 i 7 płytki z nicieniami.
      3. Kontynuuj testowanie pozostałych kolumn z płytką leku. Umieścić co najmniej jedną tabliczkę z nicieniami z nośnikiem we wszystkich studzienkach, pobierając próbki z kolumny 12 tabliczki dotyczącej leku. Umieść płytki z powrotem w wilgotnych komorach w inkubatorze z wytrząsaniem (20 °C, 160 obr./min) na 20-22 godziny (patrz uwaga dla dnia 8).
   6. Częściowo przygotuj bufor luminescencyjny na następny dzień: dodaj DMSO i 10% Triton-X-100 do wymaganej objętości S complete, aby uzyskać 1% DMSO i 0,15% Triton X-100. Odczekać, aby 5 ml na płytkę odczytać pod kątem luminescencji, plus 1 ml na zalewanie wtryskiwacza luminometru.
5. Zadanie dnia 8: Odczyt eksperymentalnych punktów końcowych — fluorescencji i bioluminescencji. (Odczyty fluorescencji GFP są zalecane jako sposób na normalizację danych bioluminescencyjnych).
   UWAGA: Należy dążyć do odczytania punktów końcowych do 66-67 godzin po podaniu nicieniom pokarmu, aby zapobiec znaczącej produkcji potomstwa w opisanych warunkach doświadczalnych.
   1. Skonfiguruj płytę, która będzie używana jako kontrolka tła dla odczytów GFP. Połączyć zawartość studzienki z 13^{. płytki do} probówki o pojemności 15 ml. Pozwól nicieniom się uspokoić (2-3 min). Użyć supernatantu, aby załadować mikropłytkę (czarną z przezroczystym dnem) ze 100 μl zawiesiny bakteryjnej na studzienkę.
      1. Obserwuj płytkę kontrolną tła pod mikroskopem, notując dołki, w których można zobaczyć nicienie. Należy je wykluczyć z szacunków tła wykorzystywanych w późniejszej analizie danych.
   2. Odczytaj fluorescencję każdej płytki 96-dołkowej, w tym kontrolę tła. (Ustawienia: optyka od spodu płyty; filtry 485/20 wzbudzenie; emisja 528/20.)
   3. Przygotuj bufor do odczytów luminescencji: dodaj lucyferynę (20 mM) do częściowo przygotowanego buforu (z poprzedniego dnia), aby otrzymać bufor luminescencyjny z 1% DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) i 0,3 mM lucyferyny (3x). Główny wtryskiwacz luminometru 6x z buforem luminescencyjnym 150 μl.
      1. W poprzednim kroku założono 1% DMSO jako nośnik podczas ekspozycji na lek. Gdy nośnikiem jest woda, dostosuj stężenie DMSO w buforze luminescencyjnym do 3% (tj. 3x).
   4. Pracuj z jedną płytą na raz. Dozować 50 μl buforu luminescencyjnego na dołek. (150 μl objętości końcowej w studzience; 3x rozcieńczenie buforu luminescencyjnego: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 i 0,1 mM końcowe stężenia lucyferyny.) Umieść natychmiast na platformie do wytrząsania i uruchom timer.
      1. Po 3 minutach na platformie wibracyjnej (160 obr./min) odczytaj luminescencję (1 s na pomiar).

4. Analiza danych

1. Odejmij średni odczyt tła GFP od wyników fluorescencji. Podziel bioluminescencję przez odpowiedni odczyt GFP.
   1. W przypadku wykrycia wysokiej wartości GFP dla nicieni narażonych na działanie związku, należy zmierzyć fluorescencję samego związku, aby uwzględnić fluorescencję związku. Jeśli jest wyższa niż średnia, użyj tego jako tła.
2. Wyraź bioluminescencję, znormalizowane dane dotyczące bioluminescencji GFP i fluorescencji GFP jako procent średniej wartości kontroli pojazdu na każdej tablicy.
3. Wykreślić wartości średnie i słupki błędów dla każdego stężenia.
4. Przetestuj istotność statystyczną za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z efektami "Koncentracji", "Eksperymentu" i ich interakcji (każdy punkt danych odnosi się do pojedynczego dołka), a następnie użyj testu Dunnetta jako testu post hoc (w porównaniu z kontrolą pojazdu).
   UWAGA: Jeśli warunki "eksperymentu" lub "interakcji" są znaczące, mogą być konieczne dalsze eksperymenty w celu potwierdzenia odpowiedzi. W przypadku gdy brak jest oczywistej zmienności między doświadczeniami na podstawie obserwacji wykresów danych, jednoczynnikową ANOVA można przeprowadzić na zbiorczych danych z niezależnych eksperymentów.
   1. Do celów analizy statystycznej płytki (płytek) tylko z nośnikiem należy wybrać wszystkie studzienki w kolumnach 6 -7 i wszystkie studzienki w wierszu H jako grupę kontrolną (są to pozycje rutynowo przypisywane nośnikowi podczas badania złożonego).

Wyniki

Reprezentatywne wyniki ilustrujące metodę uzyskano dla rotenonu (Rysunek 1), parakwatu (Rysunek 2), szczawiooctanu (Rysunek 3) i 4 związków, które zostały wykryte jako inhibitory lucyferazy świetlików podczas badania przesiewowego biblioteki leków¹³ (Rysunek 4). Ekspozycję na lek rozpoczęto we wszystkich przypadkach na etapie L4, ale eksperymenty z ekspozycją na parakwas rozpoczęto po 41 godzinach od pierwszego podania nicieniom pokarmu, w porównaniu do 45-46 godzin w przypadku innych związków. Protokół pozwala na pewną elastyczność w doborze czasu rozpoczęcia ekspozycji na lek i długości ekspozycji. Jednak do celów przesiewowych należy przestrzegać ustalonych czasów po ich wybraniu, aby zapewnić odtwarzalność między eksperymentami. Punkty końcowe powinny być mierzone na podstawie 66-67 godzin czasu rozwoju, aby zapobiec intensywnemu składaniu jaj i wykluwaniu się potomstwa w studzienkach. Wskazówki dotyczące harmonogramu znajdują się w tabeli 1.

Rotenon, inhibitor kompleksu mitochondrialnego I, zmniejszył bioluminescencję zarówno po stosunkowo krótkiej (2 godziny), jak i dłuższej ekspozycji (24 godziny) na zakres stężeń (Rysunek 1). W tym przypadku nie przeprowadzono pomiarów GFP, ale liczba użytych powtórzeń technicznych (n=6) jest wystarczająca do wyrównania wszelkich różnic w liczbie robaków między odwiertami³. 24-godzinna ekspozycja to okno czasowe, w którym nicienie rosną, a wolniejszy rozwój w wyniku hamowania kompleksu I miał przyczynić się do spadku bioluminescencji. Zostało to potwierdzone obserwacją wizualną w stereoskopie, w której zaobserwowano opóźniony rozwój, szczególnie przy stężeniach 20 μM i większych; ponadto zaobserwowano pewną śmiertelność od 40 μM (obserwacje jakościowe nieokreślone ilościowo). Nie zaobserwowano śmiertelności po 2 godzinach ekspozycji, ale zaobserwowano wpływ na przemieszczanie się robaków. Gwałtowny spadek bioluminescencji w stosunku do grupy kontrolnej wystąpił przy najniższym stężeniu testowanego rotenonu 2,5 μM, dla którego efekty nie były łatwe do wykrycia przez szybką obserwację wzrokową po 2 godzinach ekspozycji. Ten spadek bioluminescencji jest zgodny ze zmniejszonym ATP w komórkach. Maksymalne zahamowanie osiągnięto przy najniższym stężeniu zastosowanego rotenonu (2,5 μM), co wskazuje, że wszelkie kolejne eksperymenty ukierunkowane konkretnie na rotenon powinny być przeprowadzane w zakresie od 0 do 5 μM [zakres stężeń 0-160 μM został wybrany w ramach porównania z innymi lekami, które początkowo zidentyfikowano jako mające znaczące skutki przy 10 μM (do opublikowania w innym miejscu)].

Herbicyd parakwat wpływa na funkcję mitochondriów poprzez wzrost reaktywnych form tlenu. Tutaj pokazujemy jego wpływ na bioluminescencję szczepu C. elegans PE254 po ekspozycji na różne stężenia przez 24 godziny (ryc. 2). Ponieważ szczep przenosi fuzję luc::GFP, fluorescencja GFP została również zmierzona jako sposób normalizacji. ^6,9 Parakwat znacznie zmniejszył bioluminescencję, fluorescencję GFP i znormalizował bioluminescencję. Test post-hoc Dunnet wykazał, że stężenia parakwatu z istotnymi różnicami w stosunku do kontroli pojazdu wynosiły 4 i 8 mM dla bioluminescencji i bioluminescencji znormalizowanej, a także 2 mM dla bioluminescencji znormalizowanej. Jedynym stężeniem istotnie zmniejszającym fluorescencję GFP było 8 mM, przy którym obserwowano efekty wzrostu i sporadycznie martwego robaka (obserwacje jakościowe). Spadek bioluminescencji (i znormalizowanej bioluminescencji) był większy niż fluorescencji, co było zgodne ze zmniejszoną funkcją mitochondriów i wpływem na produkcję ATP.

Pośredni szczawiooctan kwasu cytrynowego testowany na C. elegans szczep PE254 przy pojedynczym stężeniu 8 mM, doprowadził do wzrostu bioluminescencji (Rysunek 3). Nie uzyskano pomiarów fluorescencji GFP ani nie przeprowadzono dodatkowych obserwacji wizualnych; Jednakże taka reakcja na pojedyncze stężenie zasługiwałaby na dalsze potwierdzające narażenie na szereg stężeń i bardziej szczegółowe obserwacje skutków. Zwiększenie bioluminescencji przez ten związek nie jest zaskakujące, ponieważ można postulować, że prowadzi ono do większej aktywności cyklu kwasu cytrynowego, a ostatecznie do większej produkcji ATP (niemniej jednak wskazane byłoby kontrolowanie wpływu na poziom lucyferazy poprzez ocenę fluorescencji GFP w kolejnych eksperymentach). Przedstawione zestawy danych szczawiooctanu ujawniają zakres zmienności odpowiedzi obserwowanej w eksperymentach opartych na lucyferazy. Z naszego doświadczenia wynika, że ta zmienność jest cechą systemu testowego, szczególnie w przypadku mniej szkodliwych warunków ekspozycji.

Związki hamujące lucyferazy świetlika, DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 i DDD00023047 zostały przetestowane zarówno in vitro, patrząc na wpływ na oczyszczony enzym, jak i in vivo przy użyciu szczepu eksprymującego C. elegans lucyferazę. Nie znaleziono dowodów na to, że którykolwiek z badanych związków powodował śmierć nicieni w warunkach ekspozycji. Wszystkie 4 związki wpływały na aktywność lucyferazy in vitro w 2 badanych stężeniach 25 i 100 μM (ryc. 4A). DDD00001434 prawie całkowicie zabiło aktywność oczyszczonej lucyferazy, co stanowiło wiarygodne uzasadnienie dla dużego spadku bioluminescencji in vivo (Figura 4B). Chociaż testy in vitro i in vivo nie są bezpośrednio porównywalne, odpowiedź na DDD00023047 była podobna w obu testach. DDD0001477 i DDD00000635 spowodowały większy spadek in vivo niż in vitro. Związki te zostały dostarczone żywym robakom 22 godziny przed substratem lucyferyny, a wyniki mogą odzwierciedlać, że nie były one łatwo wypierane z miejsca aktywnego lucyferazy, gdy lucyferyna stała się dostępna. Alternatywnie, DDD0001477 i DDD00000635 mogą mieć dodatkowy wpływ na poziom ATP w komórkach. Musiałoby to zostać ocenione za pomocą środków, które nie obejmują lucyferazy świetlika. Na uwagę zasługuje silne wzmocnienie sygnału GFP u żywych robaków narażonych na działanie DDD00000635 złożonych. Zostanie to omówione poniżej.

Rysunek 1. Inhibitor mitochondrialnego kompleksu I rotenon obniżył status energetyczny C. elegans, mierzony za pomocą bioluminescencji szczepu PE254. Zsynchronizowane robaki w stadium L4 (45-46 godzin po podaniu pokarmu larwom L1) wystawione na działanie 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 μM rotenonu w 1% DMSO przez 2 godziny (krótka) lub 24 godziny (długa ekspozycja) wcześniejsze odczyty bioluminescencji odpowiednio po 48 i 69 godzinach rozwoju robaków po podaniu pokarmu. Bioluminescencję (jednostka Relative Light Units, RLU) wyrażono jako procent wartości nośnika (1% DMSO). Słupki błędów przedstawiają SEM kontrprób technicznych przy każdym stężeniu rotenonu (n=6). Wszystkie badane stężenia wykazały wysoce istotną statystycznie różnicę w stosunku do kontroli pojazdu (p<0,001).

Rysunek 2. Parakwat stresora oksydacyjnego obniżył stan energetyczny szczepu C. elegans PE254 w sposób zależny od stężenia (mierzony za pomocą bioluminescencji). Zsynchronizowane robaki w stadium L4 (dla wygody w tym przypadku po 41 godzinach od dostarczenia pokarmu larwom L1) wystawiono na działanie parakwatu 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 lub 8 mM przez 24 godziny. Fluorescencja GFP (jednostka względnych jednostek fluorescencji, RFU) została użyta do normalizacji danych bioluminescencyjnych (jednostka RLU), oba punkty końcowe uzyskano po 65 godzinach rozwoju. Dane są wyrażone jako procent kontroli (1% DMSO). Słupki błędów przedstawiają SEM kontrprób technicznych (n=5 dla różnych stężeń; n=18 dla kontroli). Jednokierunkowa ANOVA: *** p<0,001 w odniesieniu do sterowania pojazdem.

Rysunek 3. Pośredni szczawiooctan kwasu cytrynowego (8 mM) wzmocnił bioluminescencję szczepu C. elegans PE254. Zsynchronizowane robaki w stadium L4 (45-46 godzin po podaniu pokarmu larwom L1) wystawiono na działanie świeżo przygotowanego 8 mM szczawiooctanu przez 18 godzin ± 30 minut. Bioluminescencję (jednostka RLU) odczytano w czasie rozwoju wynoszącym 63,5 godziny ± 1 godzinę i wyrażono jako procent kontroli pojazdu (ddH₂O). Różne kolumny reprezentują różne zestawy danych 8 powtórzeń technicznych przydzielonych do różnych 96-dołkowych płytek w ramach tego samego eksperymentu. Słupki błędów przedstawiają SEM replik technicznych (n=8). 2-kierunkowa ANOVA z czynnikami "zestaw" i "stężenie": "Set" p>0,05, "stężenie" p<0,001 i termin interakcji p>0,05.

A

B

Rysunek 4. Testowanie odpowiedzi na 4 związki z biblioteki 13 związków odkrycia leków w Dundee (C1:DDD00001434, C2:DDD0001477, C3:DDD00000635 i C4:DDD00023047) o znanej aktywności hamującej na luminescencję lucyferazy świetlika. (A) Wpływ związków na aktywność oczyszczonej lucyferazy świetlików (mierzonej jako jednostki lekkie, RLU), wyrażony jako procent kontroli pojazdu. Zestaw CLSII do bioluminescencji ATP (Roche, Manheim, Niemcy) zastosowano zgodnie z instrukcją z taką samą ilością enzymu lucyferazy podaną do studzienek (białe 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe). ATP podawano w końcowym stężeniu 10 μM i dodawano 1 μl związku (wskazane stężenie końcowe) lub DMSO (1%). Sygnał luminescencyjny został zintegrowany na 10 sekund. Słupki błędów przedstawiają SEM replik technicznych (n=4). Analiza: Jednokierunkowa ANOVA; *p<0,05 lub *** p<0,001 w odniesieniu do sterowania pojazdem. Różnice między 25 a 100 μM bardzo istotne dla C1 (DDD00001434; p<0,001) oraz istotne dla C2 i C3 (odpowiednio DDD0001477 i DDD00000635; p<0,05). (B) Pomiary in vivo bioluminescencji, bioluminescencja znormalizowana do fluorescencji GFP i fluorescencji GFP szczepu C. elegans PE254 w czasie rozwoju 67 godzin po ekspozycji na badane związki przez 22 godziny. Słupki błędów przedstawiają SEM replik technicznych (n=8). Analiza statystyczna (One way-ANOVA) przeprowadzona na zbiorczych danych z 3 zbiorów danych (3 x n=8). *p<0,05 lub *** p<0,001 w odniesieniu do odpowiedniego sterowania pojazdem. Różnice między 25 a 100 μM są tylko statystycznie istotne (p<0,05) dla znormalizowanej bioluminescencji po ekspozycji na C4 (DDD00023047).

Pora dnia	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 5	Dzień 6	Dzień 7	Dzień 8
9-10								Krok 5
10-11								Krok 5
11-12							Krok 4	Krok 5
12-13							Krok 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Krok 1				Krok 3
17-18
18-19				Krok 2

Tabela 1. Przegląd etapów protokołu, które należy wykonać w każdym dniu doświadczeń z nicieniami (sekcja 3) oraz sugerowane terminy.

Dyskusja

Organizm modelowy C. elegans stanowi potężny system doświadczalny. Jest łatwy w hodowli i daje obfite, genetycznie identyczne potomstwo o 3,5-dniowym cyklu życiowym od jaja do rozrodu dorosłego (poprzez młode stadia larwalne od L1 do L4). Ze względu na niewielkie rozmiary można ją wygodnie uprawiać na 96-dołkowych płytkach, co ułatwia przesiewanie złożone. Przedstawiamy fenotypowy protokół badań przesiewowych oparty na szczepach C. elegans , które działają jak czujniki poziomu energii in vivo . ¹⁴ Protokół ma zastosowanie do każdego laboratorium, chociaż wymagany jest luminometr na 96-dołkowej płytce i sterylna szafka. Ważne jest, aby zapobiegać zanieczyszczeniu w testach poprzez stosowanie dobrej techniki laboratoryjnej. W przypadku pracy ręcznej maksymalna możliwa do osiągnięcia liczba płytek z nicieniami wynosi 13 na eksperyment, co pozwala na przetestowanie 2 96-dołkowych płytek z lekiem i w tym dwóch płytek z nośnikiem. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla inhibitora mitochondrialnego kompleksu I rotenonu, generatora ponadtlenkowego parakwatu, pośredniego szczawiooctanu cyklu kwasu cytrynowego oraz czterech związków o znanej aktywności hamującej lucyferazy świetlika. Pierwsze dwa związki doprowadziły do spadku bioluminescencji zgodnie z przewidywaniami, podczas gdy szczawiooctan doprowadził do wzmocnienia, co prawdopodobnie wynikało z większego wytwarzania ATP. Zestawy danych szczawiooctanu wykazują również wewnętrzną zmienność w eksperymentach opartych na lucyferazy świetlików jako reporterze. Zaleca się przeprowadzenie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów w celu ustalenia odporności reakcji na nieznane związki.

Hamowanie aktywności lucyferazy świetlików można było zidentyfikować za pomocą testu in vitro przy użyciu komercyjnego zestawu. ³ Jeden ze związków spowodował znaczny wzrost fluorescencji GFP, co jest zgodne z inhibitorem zwiększającym poziomy lucyferazy świetlika znakowanej GFP poprzez wiązanie się z miejscem aktywnym enzymu lucyferazy i czynienie go bardziej stabilnym. ¹⁵ W niektórych przypadkach (nie w tym konkretnym przypadku) może to prowadzić do zwiększonego poziomu bioluminescencji, gdy inhibitor jest wypierany przez nadmiar substratu. ¹⁵ Dlatego ważne jest, aby nie interpretować błędnie wyników dotyczących związków, które wchodzą w interakcje z enzymem świetlika, jako obniżonych lub zwiększonych poziomów ATP/funkcji mitochondriów. Zmiany sygnału luminescencji dość często korelują z dodatkowymi pomiarami zdrowia, takimi jak ruch, rozwój i wzrost. Na przykład związek jest podejrzanym inhibitorem lucyferazy, jeśli wykryty zostanie dramatyczny spadek sygnału bioluminescencji, ale robaki są nie do odróżnienia od kontroli przez obserwację mikroskopową. Wzrost fluorescencji GFP, niewyjaśniony wzrostem lub autofluorescencją złożoną, może również wskazywać na inhibitor. Znanych jest wiele inhibitorów lucyferazy¹⁵, które zostały wprowadzone do PubChem. Dlatego w pierwszej kolejności dobrą praktyką jest zapoznanie się z informacjami na temat inhibitorów lucyferazy będącymi w posiadaniu PubChem; następnie przeprowadza się badanie skutków złożonych w testach in vitro z użyciem oczyszczonego^enzymu3 i/lub potwierdzenie wpływu na funkcję mitochondriów za pomocą dodatkowych środków. ^{Pytania z dnia 16,17} na dzień

Pomiary fluorescencji GFP umożliwiają wykrycie poziomów lucyferazy świetlików (i potencjalne wykrycie niektórych inhibitorów enzymów lucyferazy, jak omówiono powyżej), co stanowi silny argument za pomiarem tego punktu końcowego wraz z bioluminescencją, jeśli to możliwe. Normalizacja odczytów bioluminescencji do GFP jest również sposobem na uwzględnienie różnic w liczbie robaków między odwiertami (chociaż można to również osiągnąć poprzez włączenie wielu powtórzeń technicznych). Aby uzyskać większą czułość, ważne jest, aby odjąć fluorescencję tła od odczytów. Protokół ocenia udział zawiesiny bakteryjnej we fluorescencji tła, jednak autofluorescencja nicieni nie jest uwzględniana (ograniczenie obecnego testu, szczególnie krytyczne dla wszelkich badań starzenia, biorąc pod uwagę, że autofluorescencja nicieni wzrasta wraz z wiekiem). Równolegle należy również oceniać autofluorescencję badanych związków. Normalizacja GFP wydaje się niezbędna tam, gdzie naukowcy chcą dostosować protokół do porównywania komórkowych pul ATP w różnych mutantach genetycznych lub po wyciszeniu różnych genów, w celu kontrolowania wszelkich różnic w szczepach na poziomie ekspresji transgenu bioluminescencji.

Krytyczne parametry w protokole obejmują etap rozwojowy, w którym rozpoczyna się ekspozycja, długość ekspozycji oraz uzyskanie podobnej liczby nicieni w różnych studzienkach. Narażenie można rozpocząć na każdym etapie rozwoju nicieni, jednak preferowane jest stadium L3 lub starsze. Od tego etapu nicienie są zależne od fosforylacji oksydacyjnej w celu rozwoju do dorosłości, o czym świadczy bardzo znaczący wzrost zawartości mtDNA, zużycia tlenu i poziomu ATP. ^18,19,20 Niniejszy protokół inicjuje ekspozycję na etapie L4. Powodem podawania nicieni na płytki 96-dołkowe tylko na tym etapie (a nie wtedy, gdy po raz pierwszy dostarczono im pokarmu na etapie L1), jest to, że chociaż płytki są umieszczane w wilgotnych komorach, aby zminimalizować parowanie, w naszym inkubatorze wstrząsowym nadal występuje pewien stopień parowania, widoczny jako bardzo małe kropelki tworzące się na pokrywkach (może to nie stanowić problemu w przypadku innych inkubatorów z wytrząsaniem). Poprzez podawanie nicieni na płytki tuż przed dodaniem wzorców leków, na rzeczywiste stężenie leku nie ma wpływu żadna niewielka zmiana objętości spowodowana parowaniem. Załadowanie płytki z nicieniami samym pojazdem jest przydatne do sprawdzenia, czy nicienie były równomiernie rozmieszczone między studzienkami. Wszelkie znaczące różnice stwierdzone tylko dla tabliczki dla pojazdu wskazywałyby na słabą technikę dozowania nicieni do studzienek.

Długość ekspozycji jest ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę. Jeśli interesujący jest wpływ na stan energetyczny niezależnie od wzrostu, protokół może zostać zmodyfikowany w celu uwzględnienia krótszych ekspozycji (od niemal natychmiastowych reakcji do, na przykład, 2 godzin). Z drugiej strony, wnikanie związków do tkanek C. elegans może zająć trochę czasu. Na przykład 12-24 godziny są potrzebne do osiągnięcia maksymalnych wewnętrznych stężeń resweratrolu i 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FuDR). ²¹ W związku z tym dłuższa ekspozycja (od 18 do 24 godzin) może być uzasadniona w celu maksymalizacji poziomów ekspozycji. Czas ekspozycji powinien być ograniczony do czasów, które nie pozwalają na zaprowadzenie znacznych poziomów reprodukcji w studni. Zalecamy, aby całkowity czas rozwoju nicieni nie przekraczał 66-67 godzin. Chociaż jest to wygodne, nicienie są już wtedy ciężkie i rozpoczęły składanie jaj. Niemniej jednak stwierdziliśmy, że odczyty bioluminescencji z preparatów jajecznych są znikome (nie pokazano). Ekspresja transgenu napędzana przez promotor sur-5 jest po raz pierwszy wykrywana zaledwie dwie do dwóch i pół godziny po zapłodnieniu w stadium²² 100 komórek, a chitynowa skorupka jaja prawdopodobnie ogranicza wnikanie lucyferyny. Inni odkryli, że zarodkowe jaja nie przyczyniały się znacząco do metabolizmu dorosłych osobników. ²³ Należy jednak unikać warunków pozwalających na produkcję znacznego potomstwa. Jeśli jest to preferowane, skala czasowa eksperymentu może zostać cofnięta: wcześniej rozpoczęliśmy ekspozycję na toksynę środowiskową w późnym stadium larwalnym L3 (36 godzin) i przeprowadziliśmy pomiary bioluminescencji i GFP po 55 godzinach.2 Alternatywnie, tła genetyczne, które są warunkowo sterylne, mogą być wykorzystane do zapobiegania produkcji potomstwa, jak na przykład fer-15(b16) II; podwójny mutant fem-1(hc17) IV, który może być utrzymywany w temperaturze 15 °C, ale jest sterylny w temperaturze 25 °^C.24 Nie zaleca się stosowania FuDR w celu wywołania bezpłodności, ponieważ może to samo w sobie wpływać na metabolizm nicieni. ²⁵ Test można również przeprowadzić w szczepach o bardziej przepuszczalnych skórkach, takich jak mutanty bus-8 z częściową utratą funkcji, które są wrażliwe na wiele leków ze względu na zwiększoną przepuszczalność leków. ²⁶ Ułatwi to krótsze narażenie i obniżenie stężeń związków. Warunki dodawania lucyferyny do tych nicieni mogą również wymagać dostosowania, tj. 1% DMSO i 0,05% Triton-X100 w buforze luminescencyjnym mogą nie być wymagane w celu zwiększenia dostępności lucyferyny.

Protokół wykorzystuje 1% DMSO jako nośnik do dostarczania mieszanki. Chociaż nie jest śmiertelne, to stężenie DMSO ma pewne skutki biologiczne, jak omówiliśmy w poprzedniej publikacji. ³ Wiele z dostępnych bibliotek leków jest przygotowywanych w 100% DMSO, w stężeniach, które będą odpowiednie do testów komórkowych po rozcieńczeniu podłoża do 0,1%. Wyższe stężenia związków są wymagane do wywołania odpowiedzi u C. elegans w porównaniu z komórkami ludzkimi, tak że często nie jest możliwe przeprowadzenie testów przy wartości niższej niż 1% DMSO. Ponownie, stosowanie szczepów o bardziej przepuszczalnych skórkach może prowadzić do badań z niższymi stężeniami nośnika. Stężenia DMSO wyższe niż 1% nie są zalecane.

Należy przestrzegać ustalonego czasu inkubacji z lucyferyną przed odczytami. Jak wykazano wcześniej, luminescencja osiąga maksymalny poziom w ciągu drugiej minuty po dodaniu lucyferyny, pozostając względnie stabilna przez pierwsze 5 minut, po czym następuje powolny, stopniowy spadek luminescencji w ciągu następnych 30^minut. Reakcje kinetyczne na określoną substancję chemiczną można przeprowadzić w tym początkowym etapie 30 minut po początkowym dozowaniu lucyferyny.

Protokół obejmuje etap głodzenia po zebraniu jaj w celu osiągnięcia synchronizacji populacji nicieni. Zalecamy synchronizację populacji testowych nicieni, ponieważ różne etapy rozwoju różnią się poziomami ATP w komórkach i mogą różnie reagować na badane związki. Przeprowadzając głód w pożywce S complete, w przeciwieństwie do M9, nicienie wylęgające się są zaopatrywane w źródło węgla (etanol), dzięki czemu larwy nie rozwijają się, ale nie są całkowicie głodzone. ^27,28 Wykazano również, że zatrzymane L1 są przygotowane do szybkiej reakcji na pokarm, a normalne tempo wzrostu L1 osiąga się w ciągu 3 godzin po tym, jak pokarm staje się dostępny. ²⁹ Nie można jednak wykluczyć, że etap głodzenia może zmienić metabolizm C. elegans. ³⁰ Z tego powodu długość głodu nie powinna przekraczać 24 godzin (18 godzin jest wystarczające do synchronizacji). Niektóre laboratoria mogą mieć możliwość użycia biosortera Copas do synchronizacji wieku, całkowicie pomijając etap głodówki. Inne laboratoria mogą preferować rozszerzanie populacji nicieni na pożywkach stałych (płytki NGM z OP50) przed bieleniem (krok 3.1) i to również będzie działać. Używamy pożywki S podczas ekspozycji na związki jako standardowej pożywki do hodowli nicieni, jednak można wybrać inne pożywki, na przykład pożywka K lub EPA umiarkowanie twarda woda są często używane do badań ekotoksykologicznych. ^31,32 TGL

Protokół zapewnia środki do badań przesiewowych i identyfikacji kandydatów do dalszych badań pod kątem wpływu na funkcję mitochondriów. Na etapie pierwotnych badań przesiewowych istnieje prawdopodobieństwo, że niektóre związki zostaną pominięte z powodu badania tylko jednego stężenia, dlatego badań przesiewowych leków nie należy uważać za wyczerpujące. Trafienia można zwalidować za pomocą technik oceny różnych aspektów funkcji mitochondriów, na przykład zużycia tlenu, szczepów C. elegans z ekspresją mitochondriów GFP, barwienia potencjału błony mitochondrialnej i/lub pomiary ROS. ^16,33,34 Największym znaczeniem tej metodologii jest dysponowanie środkami do badań przesiewowych dużej liczby związków i/lub warunków na poziomie organizmów wielokomórkowych, a co ważne, możliwość wykorzystania genetycznej zdolności C . elegans do badania mechanizmów działania. Technika ta może pomóc w przyspieszeniu i znalezieniu nowych ścieżek do odkrycia interesujących związków i celów. Przewiduje się, że połączenie czujnika z tłem genetycznym związanym z chorobą człowieka w celu badań przesiewowych bibliotek związków w kontekście istotnym z chorobą będzie miało wiele do zaoferowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Luminometr mikropłytkowy Orion II	Berthold Systemy		z wtryskiwaczem i oprogramowaniem Simplicity 4.2; przesyłanie danych do Excela po zakończeniu pomiaru płytki
Fluorymetr FLx800	Biotek		z oprogramowaniem Gen5; przesyłaj dane do Excela po zakończeniu pomiaru płyty
Podstawowa platforma wytrząsająca Ks 130	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Wytrząsarka z inkubatorem z chłodzeniem
Wirówka Eppendorf 5804R	Eppendorf		z wirnikiem eppendorf A-4-44  (dla 50/15  ml probówki)
Stripette, Costar	Corning	#4489	Pipeta serologiczna
Cellstar 50 ml probówki	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml probówki	Greiner bio-one	#188261
Płytki do hodowli tkankowych Cellstar 60 mm	Greiner bio-one	#628160
Szkiełka mikroskopowe Superfrost	VWR	#631-0909
Sterylna szpatułka	Corning	#3007; #3004	do odważania chemikaliów
0,22 mM Filtry Millex GP	Millipore	#SLGP033RS
Axygen Probówki Eppendorf 1,5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96-dołkowa płytka testowa	VWR	#3603	płytka przezroczyste dno z pokrywką
Płytka testowa studzienna Nunc 96	Fisher Scientific	#236105	Biała płytka z pokrywką
Odczynnik zbiornikowy 60 ml	Thermo Scientific Finnpipeta	#9510027	używana jako koryto dla nicieni w sekcji protokołu 4.4.1
Skrzynka magazynowa/komora wilgotna	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56,6 mm, służy jako wilgotna komora z mokrymi ręcznikami papierowymi; 2x 96-dołkowe płytki z pokrywkami mogą zmieścić się w jednej, dolna część znajduje się na pokrywie mikropłytki
Wybielacz: Roztwór podchlorynu sodu 4-4,99% Zawartość chloru	Sigma Aldrich	#239305	Przechowywać w porcjach pod numerem 4  ° C,  uszczelnić za pomocą Parafilm, aby zapobiec utracie chloru i pokryć folią
D-Lucyferyna, sól potasowa	Biotium Inc	# 10101-2	mogą być również używane jako dostawca; przygotować zapas 20 mM w ddH2O, utrzymywać w temperaturze -20 ° C w porcjach
[nagłówek]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Czystość 99,99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Rozcieńcz do 10% w ddH2O
Nystatin	CalBiochem	#475914
C. elegans szczepy bioluminescencyjne	Własne laboratorium	PE254, PE255	zawierają zintegrowane matryce feIs4 i feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] odpowiednio na chromosomie V i X; co jakiś czas wybieraj do jednorodnej i silnej ekspresji luc::GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (np. wybierz 15 robaków).
E. coli OP50	CGC
Chemikalia ogólne	Sigma Aldrich/Fisher Scientific