Artykuł metodologiczny

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

21.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53085

⸱

7 października 2015

 ,  ,  , 
1Orthopaedic Surgery Department, Stanford University, 2Mechanical Engineering Department, Stanford University, 3Bioengineering Department, Stanford University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Streszczenie

Ludzka chrząstka stawowa jest bardzo podatna na uszkodzenia i ma ograniczony potencjał do samonaprawy i regeneracji. Oparte na komórkach strategie inżynierii tkanki chrzęstnej stanowią obiecujące rozwiązanie w zakresie naprawy chrząstki stawowej. Aby wybrać optymalne źródło komórek do naprawy tkanek, ważne jest opracowanie odpowiedniej platformy hodowlanej w celu systematycznego badania biologicznych i biomechanicznych różnic w chrząstce inżynierii tkankowej przez różne źródła komórek. W tym przypadku zastosowaliśmy trójwymiarową (3D) platformę do hodowli biomimetycznego hydrożelu w celu systematycznego badania potencjału regeneracji chrząstki chondrocytów młodocianych, dorosłych i z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA). Biomimetyczny hydrożel 3D składał się z syntetycznego składnika poli(glikolu etylenowego) i bioaktywnego składnika siarczanu chondroityny, który zapewnia fizjologicznie istotne mikrośrodowisko dla hodowli chondrocytów in vitro. Ponadto rusztowanie może być potencjalnie wykorzystywane do dostarczania komórek w celu naprawy chrząstki in vivo. Tkanka chrzęstna zmodyfikowana w rusztowaniu może być oceniana za pomocą ilościowej ekspresji genów, barwienia immunofluorescencyjnego, testów biochemicznych i testów mechanicznych. Wykorzystując te wyniki, byliśmy w stanie scharakteryzować zróżnicowany potencjał regeneracyjny chondrocytów w różnym wieku, zarówno na poziomie ekspresji genów, jak i właściwości biochemicznych i biomechanicznych zmodyfikowanej tkanki chrzęstnej. Model hodowli 3D może zostać zastosowany do zbadania różnic molekularnych i funkcjonalnych między chondrocytami i komórkami progenitorowymi z różnych etapów normalnego lub nieprawidłowego rozwoju.

Wprowadzenie

Ze swoim ograniczonym potencjałem do samonaprawy, ludzka chrząstka stawowa ulega częstym nieodwracalnym uszkodzeniom. Obecnie prowadzone są szeroko zakrojone prace nad opracowaniem skutecznych metod leczenia urazów chrząstki stawowej opartych na komórkach. Powodzenie tych terapii komórkowych w dużym stopniu zależy od wyboru optymalnego źródła komórek i utrzymania ich potencjału regeneracyjnego. Chondrocyty są powszechnym źródłem komórek do naprawy chrząstki, ale ich podaż jest ograniczona i mogą ulegać różnicowaniu podczas ekspansji in vitro w hodowli jednowarstwowej 2D, ograniczając w ten sposób wytwarzanie chrząstki szklistej 1.

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowej platformy hydrożelowej do porównawczego badania in vitro ludzkich chondrocytów w różnym wieku i stanie chorobowym. W przeciwieństwie do konwencjonalnej hodowli dwuwymiarowej (2D), trójwymiarowe (3D) hydrożele pozwalają chondrocytom zachować ich morfologię i fenotyp oraz zapewniają fizjologicznie istotne środowisko umożliwiające chondrocytom wytwarzanie tkanki chrzęstnej 2,3. Oprócz zapewnienia 3D struktury fizycznej dla hodowli chondrocytów, hydrożele naśladują funkcję natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki (ECM). W szczególności włączenie metakrylanu siarczanu chondroityny stanowi potencjalny rezerwuar dla wydzielanych czynników parakrynnych 4 i umożliwia degradację za pośrednictwem komórek i obrót matrycy 5. Chociaż wiele systemów hodowli hydrożeli 3D było szeroko stosowanych w różnych badaniach, w tym żele agarozowe i alginianowe, użyliśmy biomimetycznego systemu hodowli 3D, który ma pewne wyraźne zalety dla hodowli chondrocytów. Siarczan chondroityny (CS) jest obfitym składnikiem chrząstki stawowej, a wykazano, że hydrożele PEG-CS utrzymują, a nawet wzmacniają fenotyp chondrogenny i ułatwiają degradację i obrót macierzy za pośrednictwem komórek 2,5. Ponadto właściwości mechaniczne rusztowania hydrożelowego mogą być łatwo modulowane przez zmianę stężenia PEG, a tym samym mogą być wykorzystane do dalszego zwiększenia potencjału regeneracyjnego chondrocytów lub pokrewnego typu komórki 6,7. PEG/CSMA jest również biokompatybilny, a zatem może być stosowany bezpośrednio klinicznie, na przykład w przypadku wad chrząstki. Ograniczeniem tego systemu jest jego złożoność i zastosowanie fotopolimeryzacji, która może potencjalnie wpływać na żywotność komórek w porównaniu z prostszymi systemami, takimi jak agaroza, jednak korzyści dla hodowli chondrocytów przeważają nad potencjalnymi ograniczeniami.

Hodowla hydrożelu 3D jest kompatybilna z konwencjonalnym testem do oceny fenotypu komórki (ekspresja genów, barwienie immunologiczne białek) i wyniku funkcjonalnego (kwantyfikacja produkcji matrycy chrząstki, testy mechaniczne). To korzystne środowisko 3D zostało przetestowane w celu porównania potencjału regeneracji tkanek ludzkich chondrocytów z trzech różnych populacji w wieku w długoterminowych hodowlach 3D.

Wyniki zostały ocenione zarówno za pomocą testów fenotypowych, jak i funkcjonalnych. Condrocyty młodociane, dorosłe i zwyrodnieniowe stawów wykazywały zróżnicowane odpowiedzi w hodowli biomimetycznego hydrożelu 3D. Po 3 i 6 tygodniach ekspresja genów chondrogennych była regulowana w górę w chondrocytach młodocianych i dorosłych, ale była obniżona w chondrocytach OA. Odkładanie się składników tkanki chrzęstnej, w tym agrekanu, kolagenu typu II i glikozaminoglikanu (GAG), było wysokie w przypadku chondrocytów młodocianych i dorosłych, ale nie w przypadku chondrocytów w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Moduły ściskające powstałych konstruktów chrząstki również wykazywały podobne tendencje. Podsumowując, zarówno młode, jak i dorosłe chondrocyty wykazywały dyspozycję chondrogenną i macierz chrzęstnej do 6 tygodni hodowli 3D w hydrożelach. W przeciwieństwie do tego, chondrocyty z chorobą zwyrodnieniową stawów wykazały utratę fenotypu chrząstki i minimalną zdolność do generowania mocnej chrząstki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Stanforda dla osób badanych na ludziach i zatwierdzonym protokołem Institutional Review Board.

1. Izolacja chondrocytów stawowych

  1. Uzyskać chrząstkę z tkanki odrzuconej podczas całkowitej endoprotezoplastyki stawu kolanowego i przeprowadzić sekcję zgodnie z wcześniejszym opisem 8.
  2. Wizualnie wybierz przyśrodkowe lub boczne kłykcie kości udowej próbek chrząstki dla gładkich powierzchni i wykonaj nacięcie na powierzchni chrząstki za pomocą skalpela, aby usunąć biopsje chrząstki 4-5 mm bez wpływu na kość podchrzęstną.
  3. Wyizolować chondrocyty z macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez enzymatyczną dysocjację tkanki z traktowaniem O/N oczyszczoną kolagenazą. Stosować kolagenazę II (125 U/ml) i kolagenazę IV (160 U/ml) w proporcji 1:1 w pożywkach do wzrostu chondrocytów w temperaturze 37 °C.
  4. Następnego dnia przefiltruj strawioną tkankę zawierającą zdysocjowane komórki przez nylonową siatkę o porach 70 mm. Przemyć dwa razy 20 ml DMEM/F12 i odwirować przy 600 x g przez 5 minut.
  5. Pokryj wyizolowane chondrocyty na płytce o gęstości 1 x 106 komórek/60 mm szalka hodowlana po ponownym zawieszeniu w DMEM/F12 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 25 μg/ml askorbinianu, 2 mM L-glutaminą, środkami przeciwdrobnoustrojowymi (100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml fungizone). Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C i utrzymywać pierwotne kultury chondrocytów jako monowarstwę o dużej gęstości przed enkapsulacją w hydrożelach biomimetycznych.

2. Wytwarzanie hydrożelu biomimetycznego

UWAGA: Ta metoda pozwala na syntezę biomimetycznego hydrożelu zawierającego poli(diakrylan glikolu etylenowego) (PEGDA, MW 5,000 g/mol), siarczan chondroityny-metakrylan (CS-MA) w DPBS. Dodanie fotoinicjatora umożliwia fotoaktywowane sieciowanie. Ostateczna kompozycja hydrożelu zawiera 7% wagowo-objętościowo (w/v) PEGDA, 3% w/v CS-MA i 0,05% w/v fotoinicjatora.

  1. Synteza CS-MA poprzez funkcjonalizację polimeru CS grupami metakrylanowymi.
    1. Przygotować buforowy roztwór 50 mM kwasu 2-morfolinoetanosulfonowego (MES) i 0,5 M chlorku sodu (NaCl), rozpuszczając 1,952 g MES i 5,84 g NaCl w 200 ml wody dejonizowanej (DiH2O). Rozpuścić 5 g soli sodowej siarczanu chondroityny w roztworze buforowym.
    2. Do roztworu dodać 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroksysukcynimidu (NHS) i 1,771 g (9,24 mmol) chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodimidu (EDC) (stosunek molowy NHS:EDC = 1:2) i mieszać przez 5 minut.
    3. Dodać 0,765 g (4,62 mmol) metakrylanu 2-aminoetylu (AEMA) (stosunek molowy NHS:EDC:AEMA = 1:2:1) do roztworu i utrzymywać reakcję w temperaturze RT przez 24 godziny.
    4. Oczyszczać mieszaninę przez dializę z wodą dejonizowaną (diH2O) przez 4 dni za pomocą rurki do dializy (12-14 kDa MWCO).
    5. Przefiltrować oczyszczony roztwór przez filtr 0,22 μm i umieścić otwarte probówki zawierające roztwór w eksykatorze i odkurzyć O/N. Upewnij się, że wszystkie probówki są chronione przed światłem. Rozpuszczony polimer należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem i wilgocią.

3. Hermetyzacja komórek

  1. Przeklęknij w autoklawie folię PCR i cylindryczne pręty (do wykrawania hydrożeli 3D obciążonych komórkami) i wysterylizuj wykonaną na zamówienie cylindryczną formę żelową przez zanurzenie w 0,2 μm przefiltrowanym 70% etanolu w kapturze do hodowli tkankowych w świetle UV.
  2. Uszczelnij spód formy żelowej autoklawowaną folią PCR bez pęcherzyków powietrza i szczelin, aby zapobiec wyciekom. Przechowuj go na sterylnej płytce o średnicy 150 mm.
  3. Dzień przed enkapsulacją komórek w biomimetycznym hydrożelu zdysocjuj monowarstwę chondrocytów o dużej gęstości z traktowaniem O/N w roztworze kolagenazy II i kolagenazy IV. Stosować 125 j./ml dla kolagenazy II i 160 j./ml dla kolagenazy VI w pożywce do wzrostu chondrocytów w temperaturze 37 °C.
  4. Weź probówkę o pojemności 50 ml i dodaj 5% wagowo-objętościowo (w/v) poli(dikrylanu glikolu etylenowego) (PEGDA, MW = 5,000 g/mol), 3% w/v siarczanu chondroityny-metakrylanu (CS-MA) i 0,05% w/v fotoinicjatora w DPBS. Obracaj probówkę, aby wymieszać roztwór i odłóż ją na bok. Chroń rurkę przed światłem.
  5. Zebrać zdysocjowane komórki do 50 ml probówki Falcon, policzyć i odwirować przy 460 x g przez 5 minut. Odessać wszystkie podłoża z probówki z komórkami i dodać powyższy zmieszany materiał żelowy, aby ponownie zawiesić komórki o gęstości 15×106 komórek/ml. Dokładnie wymieszać 30 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  6. Odpipetować 72 μl zawiesiny komórkowo-hydrożelowej lub samego hydrożelu do specjalnie wykonanej cylindrycznej formy żelowej i wywołać żelowanie poprzez wystawienie na działanie światła UV (długość fali 365 nm) o mocy 3 mW/m2 przez 5 minut. Przygotować roztwór hydrożelu bez zawartości komórek. Wykorzystaj te konstrukty jako kontrole ujemne dla przyszłych testów biochemicznych i mechanicznych. Zmierz intensywność światła UV za pomocą miernika natężenia UV. Aby wyregulować intensywność, zmień odległość między źródłem światła UV a rusztowaniem hydrożelowym podczas żelowania.
    UWAGA: Ponieważ hydrożel zawiera CS, wkład bezkomórkowy jest odejmowany od biochemicznej zawartości GAG w hydrożelach obciążonych komórkami, aby reprezentować tylko komórkowy GAG.
  7. Użyj skalpela, aby odciąć folię, aby łatwo ją odkleić i ostrożnie ją usunąć. Za pomocą cylindrycznych prętów wypchnij żel do 6-dołkowej płytki z 5 ml sterylnego DPBS, aby zmyć niespolimeryzowany żel i luźne komórki.
  8. Hodować hydrożele obciążone komórkami na 24 płytkach dołkowych zawierających 1,5 ml pożywki do wzrostu chondrocytów w każdym dołku. Użyj jednorazowej szpatułki, aby przenieść umyte hydrożele do studzienki.
  9. Oceń żywotność komórek przez barwienie żywymi martwymi 24 godziny po enkapsulacji przy użyciu zestawu żywotności/cytotoksykacji. Hoduj hydrożele obciążone komórkami i puste hydrożele przez 3-6 tygodni, zmieniając je na świeże pożywki do wzrostu chondrocytów co 2 dni przed zbiorem w celu analiz.

4. Ekstrakcja RNA i analizy ekspresji genów

  1. Ostrożnie odessać pożywkę i umieścić sterylny PBS 1X na wypełnionych komórkami i pustych hydrożelach kontrolnych.
  2. Za pomocą sterylnej szpatułki przenieś każdy hydrożel do czystej probówki eppendorfa o pojemności 1,5 ml i dodaj 250 μl Tri-odczynnika do każdej probówki. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyizolować RNA.
  3. Po izolacji i kwantyfikacji RNA należy użyć 1 μg z każdej próbki i przeprowadzić odwróconą transkrypcję do cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności.
  4. Do ilościowego PCR użyj TaqMan Gene Expression Arrays do zbadania ekspresji genów, które Cię interesują. Znormalizuj poziomy ekspresji genów wewnętrznie do GAPDH.
  5. W przypadku warunków PCR należy przeprowadzić 2-minutową inkubację w temperaturze 50 °C w celu inaktywacji poprzednich amplikonów glikozylazą uracylo-DNA, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze 95 °C w celu aktywacji polimerazy Taq. Następnie wykonaj czterdzieści cykli PCR, składających się z 15 sekund w temperaturze 95 °C i 1 minuty w temperaturze 60 °C.

5. Analizy biochemiczne

  1. Dla każdej komórki-hydrożelu konstrukty określ ilościowo produkcję DNA i siarczanowanych glikozaminoglikanu (sGAG) w następujący sposób.
  2. Ostrożnie odessać pożywkę i umieścić sterylny PBS 1X na wypełnionych komórkami i pustych hydrożelach kontrolnych. Zważyć pustą probówkę i włożyć hydrożel do środka po osuszeniu go na bibułce i zapisać wagę lub mokrą masę hydrożeli.
  3. Zamrozić każdy hydrożel w temperaturze -20 °C w oddzielnej probówce eppendorfa o pojemności 1,5 ml do mineralizacji enzymatycznej, a następnie użyć podwielokrotności strawionego produktu do przeprowadzenia testu Picogreen (dla DNA) i testu błękitu dimetylo-metylenowego (dla GAG).
  4. Przygotować roztwór papainazy do enzymatycznego trawienia hydrożeli.
    1. Najpierw przygotuj bufor PBE, odważając 7,1 g dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4) i 1,6 g soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA-Na2). Rozpuścić w 500 mldH2O, doprowadzić pH do 6,5 i przefiltrować oczyszczony roztwór przez filtr 0,22 mm.
    2. Rozpuścić 0,035 g L-cysteiny w 20 ml buforu PBE. Przefiltrować roztwór i 100 μl sterylnego enzymu papainy.
  5. Gdy są gotowe do wykonania testów, należy pobrać probówki o temperaturze od -20 °C i dodać 300 μl gotowego roztworu papainy do zamrożonych hydrożeli. Zmiażdż żel moździerzem i tłuczkiem i dobrze wymieszaj z tłuczkiem silnikowym.
  6. Doprowadzić objętość do 500 μl za pomocą dodatkowego roztworu papainy. Wykonaj tę samą procedurę dla żeli kontrolnych. Inkubować w temperaturze 60 °C przez 16 godzin 3,9. Roztwór zawierający strawiony hydrożel można zatem wykorzystać do ilościowego oznaczania DNA i GAG. Zmierz zawartość DNA za pomocą testu Picogreen z DNA faga Lambda jako standardem zgodnie z protokołem producenta.
  7. Określić ilościowo zawartość siarczanowego GAG za pomocą testu wiązania barwnika 1,9-dimetylometylenowego błękitu (DMMB) z siarczanem chondroityny rekina jako wzorcem 10. Określić zawartość GAG, dzieląc ilość GAG na odpowiednią mokrą masę.

6. Testy mechaniczne

  1. Wykonaj testy nieograniczonego ściskania przy użyciu systemu testowego Instron 5944 wyposażonego w czujnik wagowy 10 N.
    1. Po pożądanych dniach hodowli in vitro należy przeprowadzić próbę kompresji na rusztowaniu komórkowo-hydrożelowym i hydrożelach do kontroli bezkomórkowej.
    2. Zanurz próbki w kąpieli PBS w temperaturze pokojowej i ściskaj z szybkością 1% odkształcenia/sekundę do maksymalnego naprężenia 15% 11,12, ponieważ fizjologiczne obciążenie odczuwane przez tkankę chrzęstną w warunkach obciążenia wynosi 10-20% 13,14.
  2. Tworzenie krzywych naprężeń i odkształceń oraz dopasowanie krzywej za pomocą równania wielomianowego trzeciego rzędu. Określ moduł stycznej ściskania na podstawie równania dopasowania krzywej przy wartościach odkształcenia 15%.

Wyniki

Bioaktywne hydrożele zawierające grupy PEG i CS (Rycina 1) stanowią idealną platformę do hodowli i dojrzewania ludzkich chondrocytów stawowych 2,3,5,7. Chondrocyty w różnym wieku i stanach chorobowych mogą być hodowane za pomocą opisaną metody i analizowane pod kątem fenotypu, ekspresji genów oraz właściwości biochemicznych i mechanicznych wytworzonej tkanki chrzęstnej. Trzy próbki chondrocytów – od noworodka (6 miesięcy), osoby dorosłej (34 lata) oraz pacjenta z chorobą zwyrodnieniową (74 lata) – pobrano po 3 tygodniach hodowli w biomimetycznych hydrożelach 3D. Analizy ekspresji genów prawidłowych chondrocytów, zarówno młodzieńczych, jak i dorosłych, wykazały wzrost ekspresji genów chondrocytarnych Col2a1 i Col6a1. W przeciwieństwie do nich, chondrocyty chorobowe wykazały gwałtowny spadek ekspresji Col2a1 przy zachowaniu ekspresji Col6a1 (Rycina 2), co wskazuje na utratę fenotypu chondrogennego mimo hodowli w sprzyjającym środowisku biomimetycznym.

Hydrożele CS-PEG służą również jako dynamiczne środowisko umożliwiające chondrocytom proliferację, trawienie istniejącej macierzy PEG i CS oraz odkładanie macierzy pericelularnej i zewnątrzkomórkowej, będącej głównymi składnikami dojrzałej tkanki chrzestnej. Biorąc pod uwagę te właściwości, ekspansję chondrocytów po 3 tygodniach hodowli in vitro można ocenić poprzez kwantyfikację DNA przy użyciu barwnika Picogreen. Analiza porównawcza trzech grup komórek wykazała, że gęstość komórek w populacjach młodzieńczych i dorosłych nie uległa zmianie, podczas gdy w przypadku chondrocytów z OA odnotowano gwałtowny spadek w porównaniu z 1. dniem hodowli. Utrata zawartości DNA została zaobserwowana w przypadku OA, ale nie w innych chondrocytach, co sugeruje możliwą śmierć komórek podczas długoterminowej hodowli (Rycina 3). Wydzieloną macierz skwantyfikowano jako zawartość siarkowych GAG za pomocą testu wiązania barwnika DMMB w punkcie końcowym po 3 tygodniach hodowli. Zawartość GAG została znormalizowana względem masy mokrej hydrożelu, zmierzonej przed trawieniem enzymatycznym, a następnie odjęto wkład a-komórkowy. Jak pokazano na Rycynie 4, chondrocyty odłożyły podobną, znaczącą ilość GAG w ciągu 3 tygodni hodowli w hydrożelach 3D.

Obecność fizycznego rusztowania umożliwia ocenę właściwości biomechanicznych próbek za pomocą testów ściskania bez ograniczenia bocznego 2,3. Podczas gdy w hydrożelach acelularnych odnotowano spadek modułów sprężności przy ściskaniu, konstrukty z komórkami zachowały te moduły po 3 tygodniach hodowli (Rysunek 4). Opisane tutaj analizy fenotypowe, biochemiczne i biomechaniczne są zatem przydatne do oceny i zrozumienia potencjału różnych populacji chondrocytów w inżynierii chrząstki.

Schemat procesu enkapsulacji komórek w hydrożelu PEGDA/CS-MA oraz wyniki badania żywotności.
Rycina 1. Biomimetyczne hydrożele PEG-CS do 3D kultury chondrocytów. Chondrocyty zostają zawieszone w mieszaninie zawierającej poli(akrylan glikolu etylenowego) (PEGDA) i siarczan chondroityny-metakrylan (CS-MA), a następnie odlane do specjalnie wykonanej cylindrycznej formy do żelu. Po naświetlaniu promieniami UV utwardzone żele są wyjmowane z form, a żywotność komórek jest oceniana za pomocą barwienia żywe/martwe 24 h po enkapsulacji. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza ekspresji genów, Col2a1, Col6a1, wykres słupkowy, krotność zmiany, młodzieńcze, dorosłe, starzenie się, eksperymentalne.
Rysunek 2. Ekspresja genów chondrogennych w ludzkich chondrocytach hodowanych w 3D biomimetycznych hydrożelach. Ilościowa ekspresja genów markerów chrząstki Col2a1 i Col6a1 w chondrocytach młodzieńczych, dorosłych i z OA po 3 tygodniach hodowli w 3D biomimetycznych hydrożelach. Wartości znormalizowano do poziomu ekspresji genów w 1. dniu. Słupki błędów reprezentują średnią± SD. p* <0,05 określone za pomocą dwustronnego testu t Studenta. Zmodyfikowano na podstawie Smeriglio et al. 2 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Względna zawartość DNA u osobników młodszych, dorosłych i z OA; porównanie na wykresie słupkowym w czasie, eksperyment w 3. tygodniu.
Rysunek 3. Zawartość DNA w ludzkich chondrocytach hodowanych w 3D biomimetycznych hydrożelach. Ilościowe oznaczenie DNA metodą Picogreen w chondrocytach osobników młodszych, dorosłych oraz z OA po 3 tygodniach hodowli w 3D biomimetycznych hydrożelach. Wartości zostały znormalizowane do poziomu DNA w 1. dniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Synteza GAG w chondrocytach, eksperyment modułu mechanicznego, wykresy słupkowe, dane dla hydrożelu z dnia 1. i tygodnia 3.
Rysunek 4. Pomiar zawartości GAG oraz test kompresji bez ograniczeń ludzkich chondrocytów w dniu 1. i po 3 tygodniach hodowli w biomimetycznych hydrożelach 3D.(A) Ilościowe oznaczenie GAG za pomocą testu DMMB w chondrocytach w dniu 1. i po 3 tygodniach hodowli w biomimetycznych hydrożelach 3D. Wartości zostały znormalizowane do masy mokrej (w.w.) i wyrażone w µg/g. (B) Moduł sprężystości przy ściskaniu (kPa) hydrożeli acelularnych i z zasiedlonymi komórkami w dniu 1. i po 3 tygodniach hodowli w biomimetycznych hydrożelach 3D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Jak podano w tym protokole, hydrożele 3D są w stanie utrzymać fenotyp chondrocytów w hodowli, unikając procesu dedyferencjacji komórek do komórek chrząstki włóknistej zwykle spotykanej w hodowlach jednowarstwowych 15. Co więcej, długotrwałe hodowle konstruktu chondrocytów i hydrożelu ujawniły korzystne środowisko, które utrzymuje wewnętrzne cechy komórek związane z wiekiem i chorobą.

Zastosowanie hydrożelu biomimetycznego 3D ma kilka zalet. Po pierwsze, włączenie siarczanu chondroityny (CS), głównego składnika znajdującego się w chrząstce stawowej, umożliwia komórkom degradację macierzy hydrożelowej poprzez wydzielanie chondroitynazy i układanie nowo zsyntetyzowanej macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki 5, 16. Ponadto wykazano, że CS ma właściwości przeciwzapalne w stawach artretycznych. Biomimetyczny hydrożel może być również stosowany jako materiał rusztowania do dostarczania komórek w naprawie chrząstki i może być modyfikowany chemicznie w celu ułatwienia lepszej integracji tkankowo-biomateriałowej 17,18.

Zastosowanie hydrożeli PEG-CS pozwala na długotrwałe hodowle chondrocytów oraz ocenę właściwości biochemicznych i mechanicznych. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób platforma ta może być przydatna do analiz porównawczych różnych źródeł zróżnicowanych chondrocytów w celu zdefiniowania optymalnego typu komórek do inżynierii chrzęstnej. Co ciekawe, chondrocyty zamknięte w hydrożelach pozostają żywotne i namnażają się zgodnie ze swoimi wewnętrznymi zdolnościami. Skład hydrożelu wspomaga w rzeczywistości wzrost zdrowych chondrocytów młodocianych i dorosłych, jak pokazano na rycinie 2. Skład i struktura opisywanych hydrożeli sprzyja również tworzeniu tkanki chrzęstnej, na co wskazuje odkładanie się funkcjonalnej macierzy zewnątrzkomórkowej ocenianej za pomocą oznaczania ilościowego glikozaminoglikanu (GAG).

Dodatkową zaletą jest to, że konstrukty chondrocytów-hydrożelu mogą być oceniane pod kątem właściwości mechanicznych nowo powstałej tkanki chrzęstnej. Należy zauważyć, że dla porównania próbę nieograniczonego ściskania należy przeprowadzić na hydrożelu bezkomórkowym. Hydrożele mają w rzeczywistości wewnętrzną sztywność wynikającą ze sztywności ugrupowań CS. Nieograniczone odkształcenie kompresyjne 5-20% (przy szybkości odkształcenia 1%/s) może być stosowane do mechanicznego badania tkanki chrzęstnej 11,12 , ponieważ stwierdzono, że obciążenie fizjologiczne odczuwane przez tkankę chrzęstną w warunkach obciążenia wynosi 10-20% 13,14. Odpowiedź hydrożeli zarówno komórkowych, jak i bezkomórkowych na testy mechaniczne oceniano w punkcie końcowym hodowli. W opisanym powyżej przykładzie zaobserwowaliśmy porównywalną sztywność konstruktów zawierających chondrocyty dorosłe i młodociane w przeciwieństwie do mniejszej sztywności konstruktów zawierających chondrocyty w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Takie właściwości mechaniczne konstruktu komórka-hydrożel pozwalają na ocenę właściwości funkcjonalnych formowanej tkanki, dając dogłębną analizę zdolności komórki do dojrzewania.

Podsumowując, zastosowanie biomimetycznych hydrożeli 3D do badania potencjału różnych populacji chondrocytów do generowania tkanki chrzęstnej może być szeroko stosowane. Oprócz opisanych tutaj badań in vitro , można sobie wyobrazić przeszczepienie in vivo konstruktów obciążonych komórkami w celu zbadania dojrzewania komórek i potencjału regeneracyjnego w kontekście fizjologicznym. Można również przewidzieć dalsze modyfikacje platformy hydrożelowej z dodatkowymi czynnikami biomimetycznymi w celu optymalizacji proliferacji i dojrzewania chondrocytów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Stanford Department of Orthopaedic Surgery i Stanford Coulter Translational Seed Grant za dofinansowanie. J.H.L. chciałby podziękować National Science Foundation Graduate Fellowship i DARE Doctoral Fellowship za wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
młode chondrocyty (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) Dorosłe chondrocytyLonzaCC-2550
(Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)LonzaCC-2550
poli(diakrylan glikolu etylenowego)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-1000-1g
Kwas 2-morfolinoetanosulfonowySigmaM5287
fotoinicjatorIrgacure 2959
Chlorek sodu SigmaS9888
siarczan chondroityny sól sodowa SigmaC9819
N-hydroksysukcynimid Sigma130672
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodimiduSigmaE1769
2-aminoetylometarylanSigma516155
rurki do dializySpectrum Laboratories 132700
Kolagenaza 2Biochemiczna Worthington 
Kolagenaza 4Worthington Biochemiczna 
Media DMEM/F12HyClone, Thermo Scientific SH3002301 
test żywy/martwyLife TechnologiesL3224
Tri odczynnikLife TechnologiesAM9738
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInvitrogenP11496
Fosforan sodu dwuzasadowy SigmaS3264
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego SigmaE5134
L-CysteinaSigmaC1276
1,9-dimetylometylenowy błękit Sigma341088
Instruments
- XX-15LW Lampa stołowa, 365 nmUVP95-0042-07
System testujący Instron 5944 Korporacja InstronE5940
LS004177LS004189Sprzęt do oświetlenia UV

Bibliografia

  1. Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
  2. Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  3. Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553(2013).
  4. Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
  5. Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
  6. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
  7. Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  8. Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
  9. Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
  10. Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
  11. Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
  12. Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
  13. Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
  14. Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
  15. Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
  16. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
  17. Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
  18. Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

metakrylan siarczanu chondroitynydiakrylan glikolu polietylenowegodysocjacja enzymatycznafotopolimeryzacja UVbadania mechaniczneanaliza ekspresji genówbarwienie immunofluorescencyjne
Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.