Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

19.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53086

⸱

20 sierpnia 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Streszczenie

Badania nad wchłanianiem tłuszczu w diecie są zazwyczaj prowadzone przy użyciu modelu zwierzęcego wyposażonego w kaniulę limfatyczną. Chociaż ten model zwierzęcy jest powszechnie akceptowany jako model wchłaniania tłuszczu w diecie in vivo, stosowane techniki chirurgiczne są trudne i kosztowne. Manipulacja genetyczna modelu zwierzęcego jest również kosztowna i czasochłonna. Alternatywny model in vitro jest prawdopodobnie bardziej przystępny cenowo, oszczędza czas i jest mniej wymagający. Co ważne, model in vitro pozwala badaczom badać enterocyty jako wyizolowany system, zmniejszając złożoność nieodłącznie związaną z modelem całego organizmu. W artykule opisano, w jaki sposób ludzkie komórki raka jelita grubego (Caco-2) mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków i witamin. Wyjaśnia prawidłowe utrzymanie komórek Caco-2 i przygotowanie ich mieszaniny lipidowej; Dalej omówiono cenną opcję zastosowania systemu membran przepuszczalnych. Ponieważ zróżnicowane komórki Caco-2 są spolaryzowane, główną zaletą stosowania przepuszczalnego systemu błonowego jest to, że oddziela on przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego. W związku z tym mieszaninę lipidów można dodać do przedziału wierzchołkowego, podczas gdy lipoproteiny można pobrać z przedziału podstawno-bocznego. Ponadto omówiono skuteczność systemu ekspresji lentiwirusa w zwiększaniu ekspresji genów w komórkach Caco-2. Wreszcie, w artykule opisano, w jaki sposób potwierdzić pomyślną izolację lipoprotein jelitowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Wprowadzenie

Badania wchłaniania jelitowego tłuszczu w diecie oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków i witamin mogą być prowadzone in vivo przy użyciu modelu przetoki limfatycznej 1–4. Jednak stosowane techniki chirurgiczne są nie tylko trudne, ale także kosztowne. Chociaż można stosować podejścia in vivo oparte na analizie kału, stosuje się je głównie do określenia procentowego wychwytu przez przewód pokarmowy 2,5. Model in vitro opisany w tym artykule jest bardziej opłacalny, a stosowane techniki są prawdopodobnie mniej wymagające. Badania nad modyfikacją genetyczną są również bardziej ekonomiczne i mniej czasochłonne, gdy są prowadzone przy użyciu tego modelu in vitro.

Ponieważ rozpuszczalne w tłuszczach materiały pobierane przez enterocyty są pakowane w lipoproteiny 6,7, skuteczność tego modelu in vitro do produkcji lipoprotein jest kluczowa. Dwie główne lipoproteiny jelitowe to chylomikrony i lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL). Chylomikrony, zdefiniowane jako lipoproteiny o średnicy 80 nm lub większej, są wytwarzane wyłącznie przez jelito cienkie, gdy lipidy są obficie obecne w świetle przewodu pokarmowego. Ponieważ są to największe lipoproteiny, chylomikrony są prawdopodobnie najbardziej wydajnymi transporterami lipidów. Ten model in vitro, który jest zdolny do wytwarzania chylomikronów 8, może być wykorzystany do badania wchłaniania tłuszczu w diecie, wchłaniania witamin rozpuszczalnych w tłuszczach przez jelita oraz biodostępności doustnych leków lipofilowych. Obecność cząsteczek rozpuszczalnych w tłuszczach, witamin lub leków we frakcji lipoprotein jest wskaźnikiem ich wchłaniania przez jelito cienkie. Jak omówiono wcześniej, model ten może być wykorzystany do poprawy biodostępności doustnych leków lipofilowych 6.

Ten artykuł opisuje, jak komórki Caco-2 powinny być utrzymywane w przepuszczalnej błonie lub zwykłych naczyniach do hodowli tkankowych, jak powinna być przygotowana mieszanina lipidów do stymulowania produkcji lipoprotein, jak można wykorzystać system ekspresji lentiwirusa do osiągnięcia efektywnej nadekspresji i jak powinny być analizowane izolowane lipoproteiny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konserwacja komórek Caco-2

  1. Korzystanie ze zwykłych naczyń do hodowli tkankowych
    1. Rozmrozić komórki Caco-2 z zamrożonej fiolki, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i natychmiast dodać je do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowych zawierającego 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco).
      1. Gdy komórki Caco-2 osiągną 50-70% konfluencji, podziel je 1:6, inkubując komórki z 3 ml 0,05% trypsyny / 0,53 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C, aż do odłączenia (15 min). Aby uniknąć zlepiania się komórek, należy je kilkakrotnie wymieszać, delikatnie pipetując. Dodać 0,5 ml trypsynizowanych komórek do 10 cm naczynia do hodowli tkankowych zawierającego 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej.
    2. Delikatnie potrząśnij naczyniami kilka razy w kierunku do przodu i do tyłu, a następnie w lewo i w prawo. Unikaj wirowania naczyń, ponieważ może to spowodować nierównomierne rozproszenie komórek.
    3. Umieść naczynia na płaskiej powierzchni w inkubatorze o temperaturze 37 °C zasilanym 5% CO2 . Pochyłe powierzchnie mogą również powodować nierównomierne rozproszenie komórek.
    4. Zmień pożywkę wzrostową dzień po rozpoczęciu inkubacji.
    5. Monitoruj komórki i rejestruj dzień, w którym osiągną zbieg. Komórki osiągną zbieg komórek w ciągu około 1 tygodnia od dnia ich podziału.
    6. Zmieniaj pożywkę wzrostową dwa razy w tygodniu, zanim komórki osiągną zbieg. Gdy komórki osiągną zbieg, zmieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień. Po tym, jak komórki są 7 dni po zlaniu, codziennie zmieniaj pożywkę wzrostową.
      Uwaga: Komórki są gotowe do eksperymentów, gdy są 13 dni po zlewaniu się (ryc. 1). Ponieważ komórki w końcu staną się mniej efektywne w wytwarzaniu lipoprotein, używaj komórek, które są od 13 do 17 dni po zlaniu 8. Przejdź do kroku 3, aby dowiedzieć się, jak przeprowadzić eksperyment.
  2. Zastosowanie systemu membran przepuszczalnych
    1. Zasiać komórki Caco-2 w przepuszczalnym wkładzie membranowym, jak opisano w kroku 1.1.1.1. powyżej. Należy unikać używania komórek z zamrożonej fiolki, ponieważ ich wzrost komórek jest zwykle wolniejszy (okres rekonwalescencji). Na krótko dodać 0,5 ml trypsynizowanych komórek do komory wierzchołkowej (górna komora), która zawiera 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej. Dodać również 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej do komory podstawno-bocznej (dolna komora).
      Uwaga: Aby uzyskać najlepszą praktykę, najpierw dodaj pożywkę wzrostową do komory wierzchołkowej, a następnie do komory podstawno-bocznej. Podczas usuwania starego podłoża należy usunąć podłoże podstawno-boczne przed podłożem wierzchołkowym. Unikaj szturchania membrany poliwęglanowej, ponieważ może to spowodować pęknięcie membrany.
    2. Ze względu na słabą widoczność komórek przez membranę poliwęglanową, umieść komórki Caco-2 w zwykłym naczyniu do hodowli tkankowej o podobnej gęstości i użyj tego naczynia do oceny zbiegu komórek.
    3. Wykonaj kroki 1.1.2-1.1.6 powyżej.

2. Nadekspresja genów

  1. Stosowanie metody regularnej transfekcji
    1. Wysiewać komórki Caco-2 na szalce do hodowli tkankowej, jak opisano w 1.1.1.1.-1.1.4 powyżej.
      Uwaga: Gdy komórki są w około 40-50% zlewne, są gotowe do transfekcji.
    2. Dodać 67 μl odczynnika do transfekcji do 472 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce do mikrowirówki. Unikać kontaktu nierozcieńczonego odczynnika do transfekcji ze ścianką probówki.
    3. Dodać 23 μg wzmocnionego białka zielonej fluorescencji pLL3,7 (eGFP) 9 do mieszaniny odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.
    4. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Zastąp pożywkę wzrostową komórek Caco-2 8 ml 10% FBS w DMEM.
    6. Dodawać kroplami do naczynia mieszaninę DNA/odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.
    7. Delikatnie potrząśnij naczyniami kilka razy w kierunku do przodu i do tyłu, a następnie w lewo i w prawo.
    8. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    9. Zastąp pożywkę w naczyniu 10 ml pożywki wzrostowej dziennie po rozpoczęciu inkubacji.
    10. Monitoruj ekspresję genów.
      1. Monitoruj ekspresję genu bez barwienia 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego określ procent komórek, które są zielone. Wartość procentowa reprezentuje wydajność transfekcji.
      2. Monitoruj ekspresję genów za pomocą barwienia DAPI.
        1. Umyj komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
        2. Utrwalić komórki, dodając 10 ml 4% formaldehydu do PBS (10 min inkubacji w temperaturze pokojowej).
        3. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
        4. Inkubować komórki w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 8 ml PBS zawierającego 1:500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitoniny.
        5. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
        6. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego określ liczbę komórek, które są zielone/niebieskie w stosunku do tych, które są niebieskie (rysunek 2 górny panel). Obliczona wartość procentowa reprezentuje wydajność transfekcji.
  2. Korzystanie z systemu nadekspresji lentiwirusa 10
    1. Wysiewaj ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK)293T w 15 cm naczyniu do hodowli tkankowej (10% FBS w DMEM jako pożywka wzrostowa).
      Uwaga: Gdy komórki są w około 60-70% zlewane, są gotowe do transfekcji.
    2. Dodać 162 μl odczynnika do transfekcji do 1,133 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce do mikrowirówki 11. Unikać kontaktu nierozcieńczonego odczynnika do transfekcji ze ścianką probówki.
    3. Dodać 24 μg pLL3,7 eGFP (lub innego konstruktu), 15,6 μg elementu odpowiedzi Rev (RRE), 6,0 μg REV i 8,4 μg glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSVG) do mieszaniny odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.
    4. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Zastąp pożywkę wzrostową 16 ml 10% FBS w DMEM.
    6. Dodawać kroplami do naczynia mieszaninę DNA/odczynnika do transfekcji/zredukowanej pożywki surowicy.
    7. Delikatnie potrząśnij naczyniami kilka razy w kierunku do przodu i do tyłu, a następnie w lewo i w prawo. To normalne, że w tym momencie niektóre z HEK293T komórek są odłączone.
    8. Umieść naczynie w inkubatorze.
    9. Po 24 godzinach inkubacji zastąp pożywkę w naczyniu 25 ml pożywki wzrostowej.
    10. Następnego dnia należy zebrać pożywkę wzrostową zawierającą lentiwirusa (pierwsza kolekcja).
    11. Powtórz krok 2.2.10, aby zebrać więcej lentiwirusa (druga kolekcja).
    12. Połączyć pierwszą i drugą kolekcję i usunąć resztki komórek przez odwirowanie (2 500 x g przez 5 minut).
    13. Przefiltrować kolekcję za pomocą jednorazowego filtra butelkowego (por 0,45 μm) i zagęścić wirusa, odwirowując kolekcję przy 31 400 x g przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (wirnik JA-20). Zaznacz spód probówki wirówki, w której znajduje się osad. Zdekantować supernatant i pozostawić probówkę odwróconą do góry dnem w temperaturze pokojowej na około 15 minut.
    14. Zawiesić osad zawierający wirusa w 100 μl 1X PBS. Unikaj bąbelków.
    15. Skoncentrowany wirus należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
    16. Określ optymalną ilość wirusa potrzebną do transdukcji komórek Caco-2 przez miareczkowanie. Aby obniżyć koszty, do miareczkowania należy użyć 24-dołkowej płytki (0,3 ml pożywki wzrostowej/dołka) zamiast 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej.
      1. Dodawać coraz większe ilości skoncentrowanego wirusa (0, 1, 2, 5, 10, 25 i 50 μl/studzienkę) uzupełnionego polibrenem (stężenie końcowe = 5 μg/ml) do 40-70% zlewających się komórek Caco-2. Delikatnie wstrząsnąć płytką 24-dołkową zgodnie z opisem w ppkt 1.1.2.
      2. Monitoruj ich ekspresję genów (Krok 2.1.10.) (Rysunek 2, 4 dolne panele).
    17. Ponieważ ekspresja transgenu jest na ogół utrzymywana, należy zachować transdukowane komórki do przyszłych eksperymentów i stale monitorować ich ekspresję genów (Krok 2.1.10.).

3. Stymulacja wydzielania lipoprotein

  1. Korzystanie ze zwykłego naczynia do hodowli tkankowej
    1. Przygotuj 100-krotną mieszaninę lipidów, mieszając 50 mg kwasu oleinowego, 40 mg lecytyny i 48 mg taurocholanu sodu. Doprowadzić objętość do 900 μl za pomocą PBS (wystarcza na 8 potraw). Energicznie zmieszaj mieszaninę lipidów.
    2. Dodać 900 μl mieszaniny lipidów 100X do 89,1 ml pożywki wzrostowej. Wymieszać i przefiltrować pożywki zawierające lipidy. Końcowe stężenia (1X) kwasu oleinowego, lecytyny i taurocholanu sodu wynoszą odpowiednio 2,0 mM, 1,36 mM i 1,0 mM.
    3. Dodać do komórek 10 ml pożywki zawierającej lipidy.
    4. Inkubować komórki z pożywką zawierającą lipidy przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    5. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
    6. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej do komórek, aby zebrać wydzielinę lipoprotein.
    7. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    8. Zbierz pożywkę zawierającą lipoproteiny.
  2. Zastosowanie systemu membran przepuszczalnych
    1. Wykonaj kroki 3.1.1-3.1.2, aby przygotować mieszaninę lipidów.
    2. Dodać 10 ml pożywki zawierającej lipidy do komory wierzchołkowej i 10 ml pożywki wzrostowej do komory podstawno-bocznej.
    3. Inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Zbierz pożywkę zawierającą lipoproteiny w komorze podstawno-bocznej.

4. Izolacja lipoprotein (Rysunek 3)

  1. Usunąć resztki komórek z pożywki zawierającej lipoproteiny przez odwirowanie (2 000 x g przez 5 minut).
  2. Przelać pożywkę do probówki o pojemności 50 ml.
  3. Dodać 5,95 g chlorku sodu do pożywki.
  4. Jeśli próbka będzie analizowana przez TEM, dodaj 1 tabletkę koktajlową inhibitora proteazy, aby zachować integralność lipoprotein.
  5. Doprowadzić objętość do 23 ml wodą (1,2 g/ml roztworu o gęstości NaCl).
  6. Całkowicie rozpuść substancje rozpuszczone.
  7. Przelać cały roztwór do probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu.
  8. Delikatnie nałożyć roztwór o gęstości 1,2 g/ml na 0,5 ml wody (o gęstości 1,0 g/ml).
  9. Zrównoważ rurkę wagowo, a nie objętościowo.
  10. Delikatnie załaduj rurki do wirnika T865.
  11. Wirować próbki w ultrawirówce o wymiarach 429,460 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  12. Natychmiast odizolować górną ilość 0,5 ml roztworu, delikatnie pipetując. Trzymaj rurkę tak nieruchomo, jak to możliwe.

5. Analiza TEM

  1. Przygotować 5 ml 2% kwasu fosfowolframowego (w/v) i dostosować pH do 6,0.
  2. Przefiltrować 2% kwas fosfowolframowy za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów: 0,2 μm).
  3. Upuść 20 μl próbki lipoprotein na sterylne naczynie.
  4. Upuść 20 μl przefiltrowanego 2% kwasu fosfowolframowego obok próbki na tym samym naczyniu.
  5. Delikatnie upuść siatkę EM stroną spoczywającą na próbce.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  7. Delikatnie postukaj w bok siatki EM o bibułę filtracyjną, aby usunąć próbkę z siatki.
  8. Delikatnie upuść siatkę EM stroną spoczywającą na 2% kwasie fosfowolframowym.
  9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  10. Delikatnie postukaj w bok siatki EM w bibułę filtracyjną, aby usunąć kwas fosfowolframowy z siatki.
  11. Za pomocą TEM uchwyć obrazy lipoprotein (ryc. 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia prawidłowe komórki Caco-2 w 13. dniu po osiągnięciu konfluencji. Pojawienie się struktur w kształcie kopuł oraz wewnątrzkomórkowych kropel lipidowych jest charakterystyczne dla zróżnicowanych komórek Caco-2. Jeśli komórki Caco-2 nie zostaną równomiernie rozproszone podczas siewu, będą one tworzyć skupiska i nadmiernie rozrastać się w niektórych obszarach naczynia, podczas gdy w innych obszarach nie będzie żadnych komórek. Należy unikać wirowania oraz kładzenia naczynia na nachylonej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano dwa systemy, które można wykorzystać do utrzymania komórek Caco-2, a mianowicie zwykłe naczynie do hodowli tkankowej i przepuszczalną błonę. Korzyści płynące z zastosowania systemu błon przepuszczalnych obejmują oddzielenie przedziału wierzchołkowego i podstawno-bocznego oraz możliwość jednoczesnej inkubacji mieszaniny lipidów i zbierania wydzieliny lipoprotein. Jednak przepuszczalne wkłady membranowe są drogie, a ich membrana poliwęglanowa nie pozwala na dobrą widoczność komórek. Jedną z zalet tego mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez Seed Grant Award od California Northstate University College of Pharmacy (dla AMN). Autorzy pragną podziękować California Northstate University College of Pharmacy za pokrycie kosztów publikacji tego artykułu oraz George'owi Talbottowi za pomoc w edycji tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMVWR16750-112Przed dodaniem komórek należy wstępnie podgrzać pożywkę wzrostową w indywidualnym naczyniu do hodowli tkankowej
FBSFisher3600511Nie podgrzewamy dezaktywacji naszej surowicy
TrypsynaVWR45000-660Komórki można myć PBS przed leczeniem trypsyną 
System membran przepuszczalnychFisher720017310-centymetrowa płytka, porów 3 mm, membrana poliwęglanowa
10 cm Fisher08-772-ENaczynie do hodowli tkankowych
Naczynie 15 cmFisher08-772-24Naczynie do hodowli tkankowych
Płytka 24-dołkowaFisher12565163Płytka do hodowli tkankowych
Odczynnik do transfekcji na bazie lipidówFisherPRE2691Może być zastąpiony innym odczynnikiem do transfekcji
Zredukowane podłoże surowicyInvitrogen11058021Do transfekcji
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Filtr butelkowyFisher97611200,45 mm por
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
Kwas oleinowySigma01383-5GZapobiegaj cyklowi zamrażania i rozmrażania
Lecytyna FisherIC10214625Lecytyna jajeczna 
Taulocholan soduFisherNC9620276Produkt wycofany z produkcji; Alternatywny numer katalogowy: 50-121-7956
Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy (bez EDTA)Fisher5892791001Stosowany głównie do próbek, które wymagają analizy TEM
Probówka do ultrawirówki z poliwęglanuFisherNC9696153Wielokrotne użycie spowoduje zapadnięcie się rurki
Pokrywka do probówki do ultrawirówkiFisherNC9796914Do wyjęcia rurki/pokrywy z wirnika potrzebne jest narzędzie
Fisher50-949-261Jednorazowy
filtr strzykawkowyFisher09-719CWielkość porów = 0,2 mm; nylon
Kwas fosfowolframowyFisherAC208310250Do przygotowania 2% kwasu fosfowolframowego, pH 6,0
PęsetaFisher50-238-62Bardzo drobne i mocne końcówki
Formvar/siatka węglowaFisher50-260-34Formvar/siatka kwadratowa z folii węglowej 400 Miedź

Bibliografia

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System membran przepuszczalnychultrawirowanie w gradiencie g sto ci chlorku sodutransmisyjna mikroskopia elektronowasekrecja lipoproteinanaliza chylomikron wsystem ekspresji lentiwirusowejizolacja lipoprotein jelitowychprzygotowanie mieszaniny lipid w
Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.