Artykuł metodologiczny

Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

DOI:

10.3791/53087

⸱

25 listopada 2015

 ,  , 
1Department of Electrical Engineering, University of Washington, 2Department of Computer Science & Engineering, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę wyprowadzania bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów i testowania ich za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki można modułowo komponować w systemy wieloskładnikowe w celu przybliżenia zachowania formalnych sieci reakcji chemicznych (CRN), demonstrując nowe zastosowanie CRN jako molekularnego języka programowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanotechnologia DNA wymaga dużych ilości wysoce czystego DNA jako materiału inżynieryjnego. Plazmidowe DNA może zaspokoić tę potrzebę, ponieważ jest replikowane z wysoką wiernością, jest łatwo amplifikowane przez hodowlę bakteryjną i może być przechowywane w nieskończoność w postaci bakteryjnych zapasów glicerolu. Jednak dwuniciowy charakter plazmidowego DNA do tej pory utrudniał jego efektywne wykorzystanie do budowy nanostruktur DNA lub urządzeń, które zazwyczaj zawierają domeny jednoniciowe lub rozgałęzione. W ostatnich pracach stwierdzono, że bramki przemieszczenia nici dwuniciowego DNA (ndsDNA) mogą pochodzić z plazmidowego DNA. Poniżej znajduje się protokół, który szczegółowo opisuje, w jaki sposób te bramki ndsDNA mogą być skutecznie kodowane w plazmidach i mogą być uzyskiwane z plazmidów poprzez niewielką liczbę etapów przetwarzania enzymatycznego. Podano również protokół testowania bramek ndsDNA za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki NdsDNA mogą być wykorzystywane do implementacji dowolnych sieci reakcji chemicznych (CRN), a tym samym zapewniają drogę do wykorzystania formalizmu CRN jako normatywnego języka programowania molekularnego. Aby zademonstrować tę technologię, skonstruowano wieloetapową kaskadę reakcji z kinetyką katalityczną. Ponadto wykazano, że składniki pochodzące z plazmidu działają lepiej niż identyczne składniki złożone z syntetycznego DNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewidywalność parowania zasad Watsona-Cricka pozwoliła na pojawienie się dynamicznej nanotechnologii DNA jako programowalnego sposobu projektowania urządzeń molekularnych o dynamicznych właściwościach1,2. W szczególności przemieszczenie nici DNA – programowalna, konkurencyjna reakcja hybrydyzacji – okazała się potężnym mechanizmem inżynierii dynamicznych systemów DNA. W reakcji przemieszczenia nici DNA nadchodzący oligonukleotyd wypiera wcześniej związaną nić "wyjściową" z komplementarnego partnera wiążącego. Wiele takich reakcji można łączyć w wieloetapowe kaskady reakcyjne z wysokim stopniem kontroli nad kolejnością i czasem poszczególnych etapów reakcji3. Kaskady przemieszczeń nici DNA zostały wykorzystane do stworzenia cyfrowych i analogowych obwodów molekularnych4-7, przełączalnych nanostruktur8-10, autonomicznych silników molekularnych11-15 oraz niekowalencyjnych wzmacniaczy katalitycznych13,16-21. Co więcej, urządzenia DNA wykorzystujące reakcje przemieszczenia nici mogą być symulowane i projektowane do różnych zastosowań za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo22-24.

Obecnie, chemicznie syntetyzowane DNA służy jako główny materiał dla nanotechnologii DNA. Uważa się jednak, że błędy w procesie syntezy DNA i wynikające z nich niedoskonałe oligonukleotydy ograniczają działanie dynamicznych urządzeń DNA, powodując błędne reakcje uboczne. Na przykład reakcje "wycieku" mogą prowadzić do uwolnienia wyjściowego oligonukleotydu nawet przy braku wyzwalacza reakcji. Takie efekty są najbardziej widoczne w kaskadach reakcji autokatalitycznych, gdzie nawet minimalna ilość początkowego wycieku ostatecznie doprowadzi do pełnej aktywacji kaskady19,20. I odwrotnie, reakcje często nie osiągają oczekiwanego poziomu aktywacji, ponieważ niektóre składniki nie wyzwalają się nawet w obecności zamierzonego wejścia7,25. Aby wydajność nanourządzeń opartych na DNA była porównywalna z ich odpowiednikami opartymi na białkach biologicznych, takie tryby błędów muszą zostać radykalnie zredukowane.

Plazmidy bakteryjne lub inne biologiczne DNA mogą służyć jako stosunkowo tanie źródło wysoce czystego DNA do zastosowań nanotechnologicznych. Duże ilości DNA mogą być generowane przez replikację w bakteriach, a wewnętrzne zdolności korekty żywych systemów zapewniają czystość powstałego DNA. W rzeczywistości kilka ostatnich prac uznało potencjalną użyteczność biologicznego DNA w zastosowaniach nanotechnologii21,26-28. Jednak w pełni dwuniciowy charakter plazmidowego DNA do tej pory uniemożliwiał jego stosowanie jako materiału do tworzenia dynamicznych urządzeń DNA, które zazwyczaj składają się z wielu oligonukleotydów i zawierają zarówno domeny dwuniciowe, jak i jednoniciowe. W niedawnym artykule29 poruszono tę kwestię i przedstawiono nową architekturę bramek DNA, która składa się głównie z naciętego dwuniciowego DNA (ndsDNA).

Co ważne, systemy bramek ndsDNA mogą być zaprojektowane tak, aby realizowały dynamikę określoną przez dowolną formalną sieć reakcji chemicznych (CRN)29. Bramki ndsDNA mogą być zatem w zasadzie używane do tworzenia dynamicznych systemów, które wykazują oscylacje i chaos, bistabilność i pamięć, logikę Boole'a lub zachowania algorytmiczne30-38. Na przykład, Ref. 29 zademonstrował trzyreakcyjny CRN, który zapewnił molekularną implementację protokołu "konsensusu", rodzaju rozproszonego algorytmu obliczeniowego29,39,40. Praca ta po raz pierwszy zademonstrowała nowatorskie zastosowanie formalizmu CRN jako "języka programowania" do szybkiej syntezy funkcjonalnych układów molekularnych (Rysunek 1A).

Tutaj znajduje się szczegółowy protokół wyprowadzania bramek ndsDNA z plazmidowego DNA. Pierwszym z nich jest przegląd procesu projektowania sekwencji. Następnie następuje wyjaśnienie, w jaki sposób syntetyczne oligonukleotydy zawierające sekwencje bramek są klonowane do plazmidów, a sekwencja jest weryfikowana i amplifikowana za pomocą hodowli bakteryjnej. Następnie pokazano, w jaki sposób bramki ndsDNA mogą być uzyskane z plazmidów poprzez przetwarzanie enzymatyczne (patrz ryc. 2). Na koniec przedstawiono metodę testowania zachowania bramki za pomocą testów kinetyki fluorescencji.

Mechanizm reakcji
Na przykład protokół koncentruje się na katalitycznej reakcji chemicznej A+B->B+C. Gatunki A, B i C ("sygnały", ryc. 1B) odpowiadają innej jednoniciowej cząsteczce DNA. Sekwencje tych cząsteczek są całkowicie niezależne, a nici nie reagują ze sobą bezpośrednio. Sekwencje wszystkich sygnałów mają dwie różne domeny funkcjonalne, tj. podsekwencje, które działają razem w reakcjach przemieszczenia nici: 1) domena krótkiego palca u nogi (etykiety ta, tb, tc), która jest używana do inicjacji reakcji przemieszczenia nici, oraz 2) domena długa (etykiety a, b, c), która określa tożsamość sygnału.

Interakcje między niciami sygnałowymi są pośredniczone przez kompleksy bramek z dwuniciowym DNA (ndsDNA) (zwane JoinAB i ForkBC) oraz pomocnicze gatunki jednoniciowe (, , i ). Formalna reakcja A + B->B + C jest przeprowadzana przez szereg etapów reakcji przemieszczenia nici, gdzie każdy krok reakcji odsłania punkt zaczepienia dla kolejnej reakcji (rysunek 1B). W tym przykładzie sygnały A i B są początkowo wolne w roztworze, podczas gdy sygnał C jest powiązany z bramką widełkową. Pod koniec reakcji B i C znajdują się w roztworze. Mówiąc bardziej ogólnie, sygnały związane z bramką są nieaktywne, podczas gdy sygnały, które są wolne w roztworze, są aktywne, to znaczy mogą uczestniczyć w reakcji przemieszczenia nici jako dane wejściowe. Przebieg reakcji w czasie jest śledzony za pomocą strategii fluorescencyjnego reportera (ryc. 1C). W poprzednich pracach29 wykazano, że ten mechanizm reakcji nie tylko realizuje prawidłową stechiometrię, ale także kinetykę docelowej reakcji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie sekwencji

Uwaga: Przegląd projektowania sekwencji: W tej sekcji opisana jest strategia projektowania bramek DNA pochodzących z plazmidu. Miejsca enzymatyczne umieszczone na obu końcach bramek, aby umożliwić uwolnienie w pełni dwuniciowych bramek po trawieniu. Miejsca nacinania są następnie umieszczane w taki sposób, że enzymy tworzą nacięcia na górnej nici, aby utworzyć końcowe bramki ndsDNA. Na koniec pozostałe sekwencje są wybierane w taki sposób, aby niezależne domeny były do siebie ortogonalne i nie wykazywały struktury drugorzędowej.

  1. Umieść miejsce nacinania Nt.BstNBI w odległości czterech nukleotydów od końca 3' każdej długiej domeny (a, b, c, r i i). Umieść stronę z nickingiem Nb.BsrDI na końcu 5' każdej długiej domeny (a, b, c i r. Zauważ, że domena i nie ma żadnej witryny do nickowania Nb.BsrDI). Rysunek 2C przedstawia szczegółowy widok sekwencji bramek JoinAB i ForkBC.
  2. Umieść miejsce restrykcyjne PvuII na obu końcach bramek ndsDNA, tak aby trawienie PvuII mogło uwolnić bramki z plazmidów (patrz rysunek 2C).
  3. Zaprojektuj inne nieograniczone sekwencje, postępując zgodnie z dwiema zasadami: (a) nici nie powinny wykazywać struktur drugorzędowych (struktury DNA można przewidzieć za pomocą Nupack41) oraz (b) wszystkie domeny powinny być ortogonalne, aby zminimalizować przesłuchy.
  4. Umieść sekwencje ndsDNA w środku szablonu bramki. Umieść 30-40 pz losowych sekwencji dystansowych na obu końcach szablonu bramki, każda przekładka służy jako unikalne miejsce wiązania dla następującej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

2. Klonowanie bramek NdsDNA do plazmidów

Uwaga: Ta sekcja opisuje metodę klonowania Gibsona polegającą na wstawieniu 4 kopii bramki do szkieletu plazmidu.

  1. Zamów matryce bramek ndsDNA jako dwuniciowe bloki genomowe od producenta DNA (sekwencje matryc bramek pokazano w tabeli 1; nici występujące w bramkach ndsDNA pokazano w tabeli 2; sekwencje na poziomie domeny pokazano w tabeli 3).
  2. Po otrzymaniu zamówionego DNA należy obracać probówki zawierające bloki genomowe o masie 10 000-14 000 x g przez 1 minutę, aby upewnić się, że całe wysuszone DNA znajduje się na dnie probówki.
  3. Ponownie zawiesić wysuszone bloki genomu w wodzie wolnej od DNaz, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 ng/μl.
    Uwaga: Alternatywnie, DNA można ponownie zawiesić przy użyciu 1x buforu kwasu Tris etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor TE: 10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 8,0). Jednak EDTA jest czynnikiem chelatującym kationy dwuwartościowe i może hamować PCR.
  4. Wygeneruj 4 fragmenty bramki z różnymi nakładającymi się regionami za pomocą standardowego PCR z polimerazą DNA o wysokiej wierności (patrz rysunek 3A). Sekwencje starterów są wyszczególnione w tabeli 4 (temperatura topnienia tych starterów wynosi 62 °C).
  5. Uruchomić 2% żel agarozowy pod napięciem 140 V przez 30 minut w temperaturze pokojowej (szczegółowy protokół elektroforezy w żelu agarozowym znajduje się w 42) i wyciąć z żelu pasma odpowiadające każdemu fragmentowi amplifikowanemu PCR. Następnie oczyść plastry żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Materiały) zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Trawić szkielet plazmidowy o wysokiej liczbie kopii (patrz materiały) za pomocą PvuII-HF i PstI-HF w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (patrz Tabela 5) zgodnie z protokołem producenta. PvuII-HF i PstI-HF to enzymy restrykcyjne o wysokiej wierności, które radykalnie redukują niespecyficzne cięcia.
  7. Uruchom 1,5% żel agarozowy i odetnij zlinearyzowany szkielet (zwykle uruchamiaj żel pod napięciem 140 V przez 30-40 minut przy RT). Następnie wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Wykonaj montaż Gibsona43 z linearyzowanym wektorem i oczyszczonymi fragmentami PCR (patrz Tabela 6 i Rysunek 3B) w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
  9. Przekształć produkt montażowy Gibsona z kroku 2.8 w Escherichia coli (E. coli) i umieścić na płytce agarowej Lysogeny Bulth (LB) zawierającej antybiotyki ampicylinowe (w stężeniu 100 μg/ml). Przeprowadzić przemianę poprzez elektroporację lub metodę szoku cieplnego 44,45 i użyć odpowiedniego szczepu E. coli. Na przykład użyj szczepu E. coli JM109 do transformacji szoku cieplnego i użyj elektrokompetentnych ogniw E. coli DH5α do elektroporacji.
    Uwaga: Zastosowany szkielet plazmidowy zawiera kasetę oporności na ampicylinę. W przypadku stosowania innego markera selekcyjnego należy zastosować odpowiednie antybiotyki zamiast ampicyliny.

3. Amplifikacja kultur bakteryjnych i kontrola jakości

Uwaga: Ta sekcja opisuje masową produkcję i izolację plazmidów zawierających bramki DNA po kontroli jakości.

  1. Pobrać pojedynczą kolonię z płytki selektywnej Ampicillin z kroku 2.9 i inkubować kulturę składającą się z 3 ml wzbogaconej pożywki zawierającej antybiotyki Ampicillin (w stężeniu 100 μg/ml). Oznacz kolonię w taki sposób, aby można ją było ponownie wykorzystać w kolejnych etapach eksperymentalnych. Uprawiać kulturę w temperaturze 37 °C O/N z energicznym potrząsaniem (200-300 obr./min). Zazwyczaj inkubować przez 16-24 godziny.
  2. Wyodrębnij plazmidowe DNA z kultury bakteryjnej za pomocą zestawu Mini-prep zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Zmierz oczyszczone plazmidowe DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta. Typowy plon waha się od 50-1 000 ng/μl.
  4. Zsekwencjonuj wyekstrahowane plazmidowe DNA, wysyłając próbkę do firmy zajmującej się sekwencjonowaniem DNA. Startery sekwencjonujące powinny znajdować się około 100 nukleotydów przed i za regionem, który ma być sekwencjonowany; starter sekwencjonowania plazmidu (patrz materiały dla plazmidu) ma następującą sekwencję: ATTACCGCCTTTGAGTGAGC.
    Uwaga: Jeśli we wstawionych bramkach ndsDNA występuje błąd sekwencji lub rekombinacja, wybierz inną kolonię z płytki z kroku 2.9. Wykonaj kroki 3.1-3.4, aby sprawdzić, czy sekwencje wstawionych bramek są poprawne.
  5. Po sprawdzeniu, czy sekwencje są prawidłowe, należy pobrać odpowiednią kolonię z płytki selektywnej Ampicillin (z kroku 2.9) i inkubować kulturę 800 ml Terrific Bulth (TB) zawierającą antybiotyki Ampicillin (w stężeniu 100 μg/ml). Hoduj kulturę w temperaturze 37 °C przez 16-24 godziny, energicznie wstrząsając (200-300 obr./min). Gruźlica szczególnie dobrze nadaje się do wysokowydajnej produkcji plazmidów.
    Uwaga: Alternatywnie, LB może być również używany do hodowli bakterii, chociaż wydajność plazmidu może stanowić problem.
  6. Oczyść DNA za pomocą zestawu Maxi-prep zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Wykonaj kroki 3.3-3.4, aby sprawdzić, czy sekwencje są poprawne. Jeśli nastąpiła jakakolwiek rekombinacja, patrz następująca uwaga. W przeciwnym razie przejdź do kroku 4.
    Uwaga: Jednym z możliwych problemów jest to, że wiele kopii wstawionych bramek w plazmidzie może się rekombinować z powodu naprawy DNA. Aby rozwiązać ten problem, należy użyć szczepu E. coli pozbawionego białka recA (białka związanego z naprawą DNA), takiego jak JM109 lub DH5α, do transformacji wcześniej zweryfikowanego plazmidu (tj. bez żadnych błędów sekwencji i rekombinacji). Następnie wybierz jedną kolonię z tej płytki i zweryfikuj sekwencję plazmidu, wysyłając próbkę do firmy zajmującej się sekwencjonowaniem DNA.

4. Przetwarzanie enzymatyczne

Uwaga: Ta sekcja opisuje proces trawienia plazmidów w taki sposób, że są one cięte i nacinane we właściwych miejscach i gotowe do użycia w eksperymentach kinetycznych.

  1. Trawić oczyszczone plazmidowe DNA z kroku 3.7 enzymem restrykcyjnym PvuII-HF przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (patrz Tabela 7). Zazwyczaj trawi plazmid za pomocą 4 jednostek PvuII-HF na 1 mg plazmidu. Enzymy restrykcyjne o wysokiej wierności są zalecane do stosowania, ponieważ znacznie zmniejszają niespecyficzne cięcia.
  2. Przeprowadzić wytrącanie etanolu na próbce.
    1. Dodać do próbki 2 równoważne objętości lodowatego absolutnego etanolu.
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę (mieszanina ta może również znajdować się w temperaturze -80 °C dla O/N).
    3. Wirować w temperaturze 10 000-14 000 x g w temperaturze 0 °C przez 30 min.
    4. Usunąć supernatant.
    5. Dodać 1 000 μl RT 95% etanolu do próbki i odwrócić 10-15 razy.
    6. Wirować w temperaturze 10 000-14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
    7. Usunąć supernatant i suszyć na powietrzu na stole przez 10-20 minut.
    8. Zawiesić granulki DNA w odpowiedniej objętości H2O wolnej od nukleaz (zwykle 100-200 μl). Dodanie więcej niż 200 μl na ogół powoduje, że próbka jest zbyt rozcieńczona, aby można ją było wykorzystać w eksperymentach kinetycznych.
  3. Zmierzyć zawieszone DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Trawić bramki z enzymem nacinającym Nb.BsrDI w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę przy użyciu 4 jednostek enzymu na 1 μg plazmidu (patrz Tabela 8); bramki widełek trawiennych z enzymem nacinającym Nt.BstNBI w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę przy użyciu 8 jednostek enzymu na 1 μg plazmidu (patrz Tabela 9).
    Uwaga: Krok 4.2 usuwa bufor trawienia enzymatycznego i pomaga skoncentrować bramki do eksperymentów kinetycznych. Krok 4.2 można pominąć w przypadku bramek łączenia, ponieważ zarówno enzym restrykcyjny PvuII-HF, jak i enzym nacinający Nb.BsrDI mają ten sam bufor trawienny. W kroku 4.2.8 zamiast TE stosuje się H2O wolne od nukleaz, ponieważ EDTA jest czynnikiem chelatującym kationy dwuwartościowe i może hamować enzymy restrykcyjne, które potrzebują tych jonów do działania.
    Uwaga: Dodanie nadmiernych ilości enzymów może prowadzić do dużej ilości początkowego wycieku obwodu (rysunek 4), co najprawdopodobniej jest spowodowane nadmiernym trawieniem46. Problem ten można rozwiązać, optymalizując ilości enzymów (patrz rysunek 4). Typowy zakres enzymów wynosi od 1 do 10 jednostek/1 μg plazmidu.

5. Przygotowanie jednoniciowych oligonukleotydów

Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół ponownego zawieszania i ilościowego oznaczania chemicznie syntetyzowanego jednoniciowego DNA (ssDNA), które będzie używane dla nici sygnałowych i nici pomocniczych. Sekwencje nici znajdują się w tabeli 10. Należy pamiętać, że poniższy protokół jest przykładem przygotowania 10 μM ssDNA. Inne stężenia ssDNA można przygotować w podobny sposób.

  1. Po otrzymaniu oligonukleotydów od producenta DNA, należy obracać probówki zawierające DNA o masie 10 000-14 000 x g przez 1 minutę, aby upewnić się, że całe wysuszone DNA znajduje się na dnie probówki.
  2. Ponownie zawiesić DNA za pomocą 1x buforu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) Tris (bufor TE: 10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 8,0), aby osiągnąć końcowe stężenie 100 μM. Na przykład ponownie zawiesić 8 nmol DNA w 80 μl buforu TE.
  3. Zmieszać 10 μl DNA w temperaturze 100 μM z 90 μl wody cząsteczkowej w probówce mikrowirówkowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μM.
  4. Zmierz dokładne stężenie próbki DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcjami producenta. Poniższy protokół podaje przykład, w jaki sposób można zmierzyć stężenie DNA.
    1. Opróżnić spektrofotometr 2 μl wody cząsteczkowej.
    2. Zmierzyć absorbancję próbki DNA przy długości fali 260 nm (A260). Użyj poniższego równania, aby obliczyć stężenie zapasów.
      Uwaga: Stężenie próbki wynosi M = A260/współczynnik ekstynkcji. Współczynnik ekstynkcji można znaleźć w karcie katalogowej specyfikacji producenta DNA.

6. Przygotowanie reporterów fluorescencyjnych

Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół przygotowania ReporteraC, inne reportery fluorescencyjne mogą być montowane podobnie.

  1. Zamów oligonukleotydy oczyszczone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) ROX- (górna nić ReporterC) i -RQ (dolna nić ReporterC) u producenta DNA (sekwencje znajdują się w tabeli 10).
  2. Po otrzymaniu zsyntetyzowanych oligonukleotydów ponownie zawiesić i określić ilościowo próbki, jak wyjaśniono w kroku 5.
  3. Wymieszaj górną i dolną nić reporterową (tj. ROX- i -RQ) w 1x Tris-Acetate-EDTA (TAE) z 12,5 mM Mg2+ (patrz Tabela 11, aby uzyskać szczegółową recepturę). Należy pamiętać, że tutaj dodaje się 30% nadmiaru nici znakowanej wygaszaczem -RQ w celu złożenia reportera, co zapewnia, że wszystkie nici znakowane fluoroforem są wygaszane nawet przy niedoskonałej stechiometrii.
  4. Wyżarzanie kompleksu ReporterC za pomocą termocyklera, chłodzenie z 95 °C do 20 °C z prędkością 1 °C/min. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C.

7. Pomiary fluorescencji

Uwaga: Sekcja opisuje ogólny protokół pomiarów kinetyki fluorescencji (zobacz Rysunek 5 dla procedury eksperymentalnej), a protokół ten będzie używany w krokach 8, 9 i 10. Należy również pamiętać, że ten protokół dotyczy korzystania ze spektrofluorymetru. Alternatywnie, eksperymenty te można również przeprowadzić w czytniku płytek, chociaż czułość, wahania między studniami i brak kontroli temperatury w eksperymentach długoterminowych mogą stanowić problem.

  1. Ustaw regulator temperatury na 25 °C i poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje. Korzystanie z regulatora temperatury może zmniejszyć zmienność sygnału, która może wynikać ze zmian temperatury.
  2. Ustaw odpowiednie parametry dla pomiarów kinetyki w oprogramowaniu do akwizycji danych spektrofluorymetru. Szczegółowe przykładowe ustawienia są następujące:
    1. Ustaw szerokość szczeliny na 2,73 nm zarówno dla monochromatorów wzbudzenia, jak i emisji.
    2. Ustaw czas integracji na 10 sekund dla każdego 60-sekundowego punktu czasowego. Ustaw całkowity czas pomiaru na 24 godziny.
    3. Ustaw długości fal wzbudzenia/emisji tak, aby odpowiadały fluoroforom użytym w eksperymencie. Przykładowe długości fal to: ROX (588 nm / 608 nm) i TAMRA (559 nm / 583 nm).
  3. Dodaj wolny od nukleazH2Oi 10x bufor tris-octano-EDTA zawierający 125 mM Mg2+ (10x TAE/Mg2+) do syntetycznego ogniwa kwarcowego. W tabelach 12, 13 i 14 przedstawiono przykładowe woluminy, których należy użyć.
  4. Dodaj nici polyT, aby osiągnąć końcowe stężenie ~ 1 μM (patrz Tabela 12, 13 i 14 dla objętości), a następnie wiruj syntetyczne komórki kwarcowe przez 10-15 sekund. Ogólnie rzecz biorąc, końcówki do pipet niespecyficznie wiążą DNA. Dodanie wysokich stężeń nici polyT może zmniejszyć ten niespecyficzny błąd wiązania.
  5. Dodaj reporterów i pasma pomocnicze. Zobacz tabele 12, 13 i 14, aby zapoznać się z przykładowymi woluminami do użycia. Należy pamiętać, że do kalibracji reportera nie są potrzebne nici pomocnicze.
  6. Dodaj 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS), aby uzyskać końcowe stężenie 0,15% SDS. Uwaga: SDS służy do dysocjacji enzymów od bramek pochodzących z plazmidu, ponieważ enzymy mogą zakłócać reakcję przemieszczenia nici (patrz rysunek 6). SDS jest tutaj zalecany zamiast denaturacji termicznej enzymów, aby uniknąć dysocjacji i nieprawidłowej rekombinacji nici bramek, co może niekorzystnie wpływać na funkcję obwodu.
  7. [Pomiń ten krok, aby skalibrować reportera.]
    1. Dodaj bramki łączące i widełkowe (patrz tabela 13 i 14 dla objętości) do ogniwa z syntetycznego kwarcu i wymieszaj roztwór, pipetując go w górę iw dół przez co najmniej 20 razy (nie należy wirować kuwety, ponieważ wirowanie roztworów z SDS może spowodować powstawanie pęcherzyków, które wpłyną na pomiary kinetyki fluorescencji).
    2. Należy również jak najszybciej przejść do kolejnych etapów pomiaru, ponieważ reakcja wycieku rozpoczyna się natychmiast po dodaniu bramek złączających i widełkowych do ogniwa z syntetycznego kwarcu.
  8. Umieść syntetyczne ogniwa kwarcowe w komorze spektrofluorymetru.
  9. Rozpocznij pomiar kinetyki.
  10. Po 5 minutach pomiaru dodać pasma wejściowe (patrz tabela 12, 13 i 14 dla objętości) do ogniwa z syntetycznego kwarcu i wymieszać reakcję, pipetując ją w górę iw dół co najmniej 20 razy. Należy pamiętać, że próbkę należy delikatnie wymieszać, aby uniknąć pęcherzyków. Wykonaj ten krok, gdy program do akwizycji danych jest wstrzymany, aby uniknąć sygnałów pomiarowych wyzwalanych przez światło zewnętrzne.
  11. Rejestruj kinetykę reakcji aż do osiągnięcia stanu ustalonego. Kinetyka reakcji jest wyświetlana na komputerze.

8. Kalibracja reporterów fluorescencyjnych

Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół wykonywania krzywych kalibracyjnych reporterów fluorescencyjnych. Krzywe kalibracyjne zostaną wykorzystane do przeliczenia dowolnych jednostek fluorescencji na stężenie sygnału molowego.

  1. Skalibruj reportery fluorescencyjne zgodnie z protokołem opisanym w kroku 7. Objętości reagentów i należy wykorzystać zgodnie z podsumowaniem w tabeli 12. Standardowe stężenie dla tego przykładu wynosi 50 nM (1x); Reporterzy są na 3x; Wejście wynosi 1x. W przypadkach, gdy wejściowe są na poziomie 0,25x, 0,5x, 0,75x, należy odpowiednio dostosować objętość H2O wolnej od nukleaz, aby utrzymać końcową objętość każdej reakcji na poziomie 600 μl. Przykładowe dane przedstawiono na rysunku 7A.
  2. Wykonać krzywą kalibracyjną ReporterC poprzez liniowe dopasowanie końcowych wartości fluorescencji do początkowego stężenia sygnału C (przykładowa krzywa kalibracyjna jest pokazana na rysunku 7B). Ta krzywa kalibracyjna może być używana do przekształcania dowolnych jednostek fluorescencji na odpowiadające im stężenie sygnału.

9. Ilościowe określenie stężenia bramek ndsDNA pochodzących z plazmidu

Uwaga: Każda niezależnie przetworzona partia bramek ndsDNA pochodzących z plazmidu daje inną wydajność funkcjonalnych bramek, a ta sekcja opisuje protokół ilościowego określania stężenia bramek ndsDNA pochodzących z plazmidu.

  1. Określ ilościowo stężenie bramek ndsDNA pochodzących z plazmidu zgodnie z protokołem opisanym w kroku 7. Należy użyć objętości odczynników zgodnie z podsumowaniem w Tabeli 13. Uwaga: W tabeli 13 opisano przykładowy przepis na oznaczanie ilościowe widelcaBC. ŁączenieAB i innych bramek może być wykonywane podobnie, ale przy użyciu różnych pasm wejściowych, pasm pomocniczych i reporterów.
  2. Przelicz końcową wartość fluorescencji zmierzoną w tym doświadczeniu na stężenie sygnału C, korzystając z krzywej kalibracyjnej z kroku 8.2. Następnie oblicz wstecznie stężenie bramki ndsDNA. Na przykład końcowa wartość fluorescencji dla eksperymentu kwantyfikacji bramki odpowiada sygnałowi C 25 nM (0,5x) w oparciu o krzywą kalibracyjną na rysunku 7B. Ponieważ zapas ForkBC jest rozcieńczany 40 razy w tej reakcji, stężenie zapasu w bramie ForkBC wynosi 1 μM.

10. Pomiary kinetyki reakcji >A+B->B+C

Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół testowania realizacji DNA formalnej reakcji chemicznej za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji.

  1. Wykonaj pomiar kinetyczny, postępując zgodnie z protokołem opisanym w kroku 7. Należy stosować objętości odczynników i zgodnie z podsumowaniem w Tabeli 14.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na potrzeby testu funkcjonalnego stworzono implementację DNA dwucząsteczkowej reakcji katalitycznej (>tj. A+B->B+C). Wydajność bramek pochodzących z plazmidu porównano z bramkami złożonymi z syntetycznego DNA. Reakcje katalityczne są dobrym testem czystości bramki, ponieważ wadliwa bramka może nieodwracalnie uwięzić katalizator, powodując nieproporcjonalny wpływ na ilość wytwarzanego produktu18,19. W tym samym czasie niewielka reakcja wycieku skutkująca niewyzwolonym uwolnieniem sygnału katalitycznego zostanie liniowo wzmocniona, co doprowadzi do nieproporcjonalnego sygnału błędu. Dane eksperymentalne dla bramek pochodzących z plazmidu i zsyntetyzowanych przedstawiono odpowiednio na rysunku 8B i 8C. W eksperymentach stężenie nici sygnałowej A jest stałe, podczas gdy ilość sygnału katalitycznego B jest zmienna. Sygnał C służy do odczytu przebiegu reakcji bez przerywania cyklu katalitycznego. W danych można zaobserwować katalizę, ponieważ reakcje zbliżają się do zakończenia nawet przy ilościach katalizatora B znacznie mniejszych niż ilość A. Ponieważ SDS nie został dodany do eksperymentów przeprowadzonych z syntetyzowanym systemem, szybkość reakcji (na którą może mieć wpływ dodanie SDS) nie jest porównywana, a zamiast tego nacisk analityczny skupia się na obrocie katalitycznym (szczegółowo opisanym poniżej).

Przeprowadzono dalszą analizę obrotu katalitycznego tej reakcji. Obrót definiuje się jako ilość sygnału C wyprodukowanego dla każdego katalizatora B w danym momencie. W szczególności obrót obliczono na podstawie naszych danych eksperymentalnych, dzieląc sygnał C odjęty od wycieku przez początkową ilość dodanego katalizatora B. W przypadku idealnego układu katalitycznego ta liczba obrotu powinna rosnąć liniowo w czasie i być niezależna od ilości katalizatora, o ile substrat nie jest ograniczony. W rzeczywistym systemie wadliwe bramki mogą wyłączyć katalizatory, a obrót osiągnie maksymalną wartość, nawet jeśli nie cały dostępny substrat zostanie przekształcony w produkt. Maksymalna wartość obrotu wskazuje, ile substratów (sygnał A) katalizator (sygnał B) może przekształcić przed dezaktywacją. W tym miejscu zaobserwowano, że zsyntetyzowany układ odbiega od idealnego liniowego wzrostu obrotu znacznie wcześniej niż robi to układ pochodzący z plazmidu, co wskazuje na sekwestrację katalizatora poprzez niepożądaną reakcję uboczną (ryc. 8D). Porównanie obrotów jest pokazane tylko dla niskich stężeń, ponieważ przy wysokich stężeniach katalizatorów wszystkie bramki zostaną uruchomione i uwolnią sygnał C. Porównano również upływ obwodu i zaobserwowano, że stosunek sygnału wycieku przy użyciu bramek pochodzących z plazmidu jest o około 8% mniejszy niż przy użyciu zsyntetyzowanych bramek po 10 godzinach reakcji (ryc. 8E).

figure-results-1
Rysunek 1. orazNumery CRN służą jako normatywny język programowania. Sieci reakcji DNA można zaprojektować tak, aby przybliżyły dynamikę formalnego CRN. (B) Implementacja DNA przykładowej instrukcji chemicznej: A+B->B+C. Nici DNA są rysowane jako linie ze strzałkami na końcu 3', a * oznacza komplementarność. Wszystkie pasma sygnałowe A (, zielona), B (, pomarańczowa) i C (, czerwona) składają się z jednej domeny toehold (oznaczonej jako ta, tb i tc) i jednej domeny tożsamości (oznaczonej jako a, b i c). Reakcja dwucząsteczkowa A + B->B + C wymaga dwóch wieloniciowych kompleksów JoinAB i ForkBC oraz czterech nici pomocniczych , , i . Reakcja przebiega przez siedem etapów przemieszczenia pasma, z których każdy rozpoczyna się od wiązania palca. (C) Strategia zgłaszania. Reakcję śledzi się za pomocą reportera, w którym dolna nić jest znakowana fluoroforem (czerwona kropka), a górna nić jest dołączana do wygaszacza (kropka). Ze względu na kolokalizację fluoroforu i wygaszacza, fluorescencja reporterowa jest wygaszana w nienaruszonym reporterze. Sygnał C może zastąpić górną nić reportera, prowadząc do wzrostu fluorescencji. (Ten rysunek został zmodyfikowany w stosunku do Ref29.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. orazBramki NdsDNA wykonane z bakteryjnego plazmidowego DNA. Kilka kopii dwuniciowej matrycy bramki ndsDNA jest klonowanych do plazmidu. Sklonowane plazmidy są następnie przekształcane w komórki E. coli, a kolonie na płytce są weryfikowane pod kątem sekwencji. Po potwierdzeniu sekwencji plazmidowe DNA jest amplifikowane i ekstrahowane. Wreszcie, dwuniciowy plazmid jest przetwarzany na pożądane bramki ndsDNA poprzez przetwarzanie enzymatyczne. (B) Enzymatyczne przetwarzanie bramek ndsDNA. Enzym restrykcyjny PvuII służy do uwalniania bramki z plazmidu. Zwolnione bramki są dalej przetwarzane przy użyciu enzymów nacinających: Nb.BsrDI służy do generowania nacięć dla JoinAB (Panel i); Nt.BstNBI służy do generowania nicków dla ForkBC (Panel ii). Miejsca z ograniczeniami i linkami są oznaczone kolorowymi polami. (C) Widok sekwencji szablonu bramki JoinAB (Panel i) i ForkBC (Panel ii). Miejsce restrykcyjne PvuII (zaznaczone w fioletowym polu) znajduje się na obu końcach bramek ndsDNA. Strony nickowania Nb.BsrDI i Nt.BstNBI są wyróżnione odpowiednio czerwonymi i czarnymi polami. Miejsca cięcia są oznaczone grotami strzałek. Sekwencja N to dowolny nukleotyd. (Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ref29.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. orazPCR matrycy bramki DNA. Matryca bramki DNA zawiera sekwencje bramek ndsDNA w środku (niebieski region) i sekwencje dystansowe na obu końcach (czarne regiony; te dwie sekwencje końcowe są ortogonalne). Startery mogą wiązać się z sekwencjami dystansowymi matrycy bramki i generować cztery nakładające się fragmenty DNA za pomocą PCR (nakładające się sekwencje są oznaczone kolorami na rysunku). (B) Montaż Gibsona. Cztery amplifikowane fragmenty DNA są następnie składane w zlinearyzowany szkielet plazmidowy za pomocą metody składania Gibsona43. (Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ref29.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Wydajność obwodu z różnymi ilościami enzymów.(A) Uproszczona reprezentacja nici bramki, reportera, nici pomocniczych i nici sygnałowych używanych w odpowiednich eksperymentach. (B) Eksperymenty kinetyczne z JoinAB pochodzącym z plazmidu przetworzonym z różnymi ilościami enzymów. i. 10 jednostek PvuII-HF i 45 jednostek Nb.BsrDI na 1 μg plazmidu; ii. 10 jednostek PvuII-HF i 4 jednostki Nb.BsrDI na 1 μg plazmidu; iii. 4 jednostki PvuII-HF i 4 jednostki Nb.BsrDI na 1 μg plazmidu. Wszystkie nici pomocnicze były pod kątem 2x (1x = 10nM). Kompleks bramek wynosił 1,5x, a eksperymenty przeprowadzono w temperaturze 35 °C w 1x TAE/Mg2+. (Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ref29.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Schemat blokowy eksperymentów kinetycznych. Niebieski: Materiały do dodania do kuwety (0,875 ml syntetycznego ogniwa kwarcowego). Tabela referencyjna 14 dla określonych objętości, które należy dodać do eksperymentu kinetycznego A+B -> B+C. Zielony: Instrukcje spektrofluorymetru (oznaczonego jako SPEX). Czerwony: Instrukcja mieszania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Dysocjacja enzymów i zachowanie obwodów.(A) Uproszczona reprezentacja nici bramki, reportera, nici pomocniczych i nici sygnałowych używanych w odpowiednich eksperymentach. (B) Eksperymenty kinetyczne Join AB pochodzącego z plazmidu przy użyciu inaktywacji cieplnej w temperaturze 80 °C (zielone ślady), 0,15% dodecylosiarczanu sodu (SDS) (czerwony) i kontroli bez inaktywacji cieplnej lub dodatku SDS (niebieski). Standardowe stężenie wynosiło 1x = 10 nM, a wszystkie nici pomocnicze i wejście B były na poziomie 2x. Kompleks bramek wynosił 1,5x, a eksperymenty przeprowadzono w temperaturze 35 °C w 1x buforze tris-octanu-EDTA zawierającym 12,5 mM Mg2+ (1x TAE/Mg2+). (Ten rysunek został zmodyfikowany w stosunku do Ref29.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Kalibracja reportera.(A) Kinetyka reportera C. Stężenie reporterowe było na poziomie 3x (1x = 50 nM), a początkowe stężenie sygnału C przedstawiono na rysunku. (B) Poziomy fluorescencji sygnału C w punkcie końcowym pomiaru (40 min) wykazują liniową zależność od początkowego stężenia sygnału C. W przykładzie kwantyfikacji bramki ForkBC (zielona linia przerywana) wartość fluorescencji ForkBC została zmierzona jako 3 x 106 (j.a.), co odpowiada 25 nM (0,5x) w oparciu o krzywą kalibracyjną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8. Dwucząsteczkowa kinetyka reakcji katalitycznej (A+B->B+C).(A) Uproszczona reprezentacja nici bramki, reportera, nici pomocniczych i nici sygnałowych używanych w odpowiednich eksperymentach. Eksperymenty przeprowadzono w 1x buforze tris-octanu-EDTA zawierającym 12,5 mM Mg2+ (1x TAE/Mg2+). Wszystkie kompleksy bramek miały stężenie 75 nM (1,5x), a nici pomocnicze miały stężenie 100 nM (2x). Dane kinetyki dla bramek pochodzących z plazmidu i dane dla zsyntetyzowanych bramek są pokazane odpowiednio w (B) i (C). Sygnał był na poziomie 50 nM (1x). Do systemu wprowadzono różne ilości sygnału (katalizatora), a reakcję testowano w temperaturze 35 °C. (D) Bramki pochodzące z plazmidu wykazywały wyższy obrót niż zsyntetyzowane bramki DNA, gdy dodano niewielkie ilości danych wejściowych. (E) Zakres wycieku. Wykres słupkowy przedstawia stosunek przecieku końcowego do sygnału końcowego (CB0=0/CB0=1) w punktach końcowych (10 godzin). (Ten rysunek został zmodyfikowany w stosunku do Ref29.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szablony bramSekwencjiDługość (nt)
Dołącz do ABTCTAGTTCGATCAGAGCGTTATTACCAGTAGTCGATTGCTCAGCTGCTACATTGCTTCTACGAGTCATCATCCTTCCACCATTGACCTTAGAGTCCGAATCCTACCATTGCTTAACCGAGTCTCACAACCAGCTGTCATTATGGACTTGACACACAGATTACACGGGAAAGTTGC powiedział:Rozdział 173
WIDELECTCTAGTTCGATCAGAGCGTTATTACCAGTAGTCGATTGCTCAGCTGCCATCATAAGAGTCACCATCACATTGCCACATCGAGTCCCTTCCACCATTGCACCATTAGAGTCCGAATCCCATTGCTTAACCGACATTGCTTAACCGAGTCACACAACCAGCTGTCATTATGGACTTGACACACACAGATACGGGAAAGTTGC powiedział:Rozdział 194

Tabela 1. Sekwencje matryc bramek ndsDNA.

bramaplażaDługość dolnego pasma (nt)
Dołącz do ABJoinAB-Bottom, , , Rozdział 87
Widelec BCWidelecBC-Bottom, , , ,
Rozdział 108

Tabela 2. Pasma składające się z JoinAB i ForkBC. (Ta tabela została zmodyfikowana w stosunku do Ref29.)

) ) powiedział: powiedział:
domenakolejnośćDługość (nt)
dziękujęAparatura CTGCTA (CTGCTA)6
TbTTCCAC (Biblioteka TTCCAC6
TcTACCCA (Międzynarodowa Organizacja Turystyczna6
TrTCCTAC (Blok Blokowy6
tq powiedział:AACCAG6
ZACATTGCTTCTACGAGTCATCC21
bCATTGCACCTTAGAGTCCGAA (CATTGCACCTTAGAGTCCGAA)21
cCATTGCCACATCGAGTCCCTT powiedział:21
rCATTGCTTAACCGAGTCTCAC21
jaCTGCCATCATAAGAGTCACCA powiedział:21

Tabela 3. Sekwencje na poziomie domeny do realizacji reakcji chemicznej A+B -> B+C. (Ta tabela została zmodyfikowana w stosunku do Ref29.)

Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział
Pasmo podkładuSekwencjiDługość (nt)
Starter do przodu-1AAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTAACAG CGTTATTACCAGTAGTCGATTGC60
Podkład odwrotny-1ACTACTATTTACTAATCCCATTGCGTGTTCTTATT TAATCTGTGTGTCAAGTCCATAATG60
Podkład do przodu-2AATAAGAACACGCAATGGGATTAGTAAATAGT CGTTATTACCAGTAGTCGATTGCRozdział 58
Podkład odwrotny-2GCGAAACTAGCTTGTGGTGTGATATTGTCTCGTGTGTGT TAATCTGTGTGTCAAGTCCATAATG60
Podkład do przodu-3ACACACGAGACAATATCACCACAAGCTAGTTTCGC CGTTATTACCAGTAGTCGATTGC POWIEDZIAŁ:Rozdział 58
Podkład odwrotny-3ACATTGTACGCCTAAATCATCAAGAATAATTGTTG TAATCTGTGTGTCAAGTCCATAATG60
Podkład do przodu-4CAACAATTATTCTTGATGATTTAGGCGTACAATGT CGTTATTACCAGTAGTCGATTGCRozdział 58
Podkład odwrotny-4GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGGAAGCCTGCAG TAATCTGTGTGTCAAGTCCATAATG60

Tabela 4. Sekwencje starterów do PCR matryc bramek ndsDNA.

OdczynnikObjętość na 1x reakcja (μl)
Szkielet plazmidowy o wysokiej kopii (~300 ng/μl)10
PvuII-HF (20 000 jednostek/ml)cyfra arabska
PstI-HF (20 000 jednostek/ml)cyfra arabska
10x Cut inteligentny buforcyfra arabska
H2O4
Całkowita objętość20

Tabela 5. Protokół trawienia szkieletu plazmidu.

OdczynnikObjętość na 1x reakcja (μl)
Wektor DNA (~50 ng/μl)1
PCR amplifikowany fragment-1 (~50 ng/μl)1
PCR amplifikowany fragment-2 (~50 ng/μl)1
PCR amplifikowany fragment-3 (~50 ng/μl)1
PCR amplifikowany fragment-4 (~50 ng/μl)1
2x Gibson Assembly master Mix5
Całkowita objętość10

Tabela 6. Protokół do montażu Gibsona.

szt. szt. pkt.
OdczynnikObjętość na 1x reakcja (μl)
Plazmidowe DNA (stężenie ~1 μg/μl)1 000
PvuII-HF (20 000 jednostek/ml)200
10x Cut inteligentny bufor133,3
Całkowita objętość1333.3

Tabela 7. Protokół dla bramek ndsDNA z wprowadzonym trawieniem plazmidu za pomocą enzymu restrykcyjnego PvuII-HF.

szt. szt. Rozdział szt.
OdczynnikObjętość (μl)
Dołącz do bramek (stężenie ~5 μg/μl)150
Nb.BsrDI (10 000 jednostek/ml)300
10x Cut inteligentny bufor50
Całkowita objętość500

Tabela 8. Protokół trawienia bramek łączących z enzymem nacinania Nb.BsrDI.

szt. szt. pkt.
OdczynnikObjętość (μl)
Bramki widłowe (stężenie ~5 μg/μl)150
Nt.BstNBI (10 000 jednostek/ml)600
10 razy większy bufor NEB 3.183,3
Całkowita objętość833.3

Tabela 9. Protokół trawienia bramek widelcowych za pomocą enzymu nacinającego Nt.BstNBI.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
plażadomenakolejnośćDługość (nt)
JoinAB-Dółtq* r * tr * b * tb * a * ta *CTGGTT GTGAGACTCGGTTAAGCAATG GTAGGA TTCGGACTCTAAGGTGCAATG GTGGAA GGATGACTCGTAGAAGCAATG TAGCAGRozdział 87
WIDELEC-Dnotq* r* tr* b* tb* c* tc* i*CTGGTT GTGAGACTCGGTTAAGCAATG GTAGGA TTCGGACTCTAAGGTGCAATG GTGGAA AAGGGACTCGATGTGGCAATG TGGGTA TGGTGACTCTTATGATGGCAGRozdział 108
CTGCTA CATTGCTTCTACGAGTCATCC powiedział:27 Rozdział 27
ta aTTCCAC CATTGCACCTTAGAGTCCGAA27 Rozdział 27
TB BTACCCA CATTGCCACATCGAGTCCCTT27 Rozdział 27
< TB>tc cCATTGCTTCTACGAGTCATCC TTCCAC27 Rozdział 27
A TBCATTGCACCTTAGAGTCCGAA TCCTAC27 Rozdział 27
< r tq>b trCATTGCTTAACCGAGTCTCAC AACCAG27 Rozdział 27
r tqCTGCCATCATAAGAGTCACCA powiedział:21
jaTCCTAC CATTGCTTAACCGAGTCTCAC27 Rozdział 27
tr rCTGCCATCATAAGAGTCACCA TACCCA27 Rozdział 27
i tcCATTGCCACATCGAGTCCCTT TCCTAC27 Rozdział 27
c trCATTGCCACATCGAGTCCCTT TTCCAC27 Rozdział 27
C TBCATTGCACCTTAGAGTCCGAA TCCTAC27 Rozdział 27
b trCTGCCATCATAAGAGTCACCA TTCCAC powiedział:27 Rozdział 27
I TBCATTGCACCTTAGAGTCCGAA TTCCAC powiedział:27 Rozdział 27
B TBCATTGCACCTTAGAGTCCGAA TACCCA27 Rozdział 27
b tcCATTGCCACATCGAGTCCCTT TCCTAC27 Rozdział 27
c trCATTGCACCTTAGAGTCCGAA TCCTAC27 Rozdział 27
ROX-b tr/56-ROXN/ AAGGGACTCGATGTGGCAATG TGGGTA27 Rozdział 27
-RQc* tc*CATTGCCACATCGAGTCCCTT /3IAbRQSp/21
-TAMRAcCTGGTT GTGAGACTCGGTTAAGCAATG /36-TAMTSp/27 Rozdział 27
RQ-TQ* R*/5IAbRQ/ CATTGCTTAACCGAGTCTCAC21
r

Tabela 10. Sekwencje nici do realizacji reakcji chemicznej A+B -> B+C. (Ta tabela została zmodyfikowana w stosunku do Ref29.)

Rozdział szt.
OdczynnikObjętość (μl)Końcowe stężenie
ROX- przy 100 μM1010 μM (1x)
-RQ przy 100 μM1313 μM (1,3x)
10x TAE z 125 mM Mg2+101x TAE z 12,5 mM Mg2+
H2O67--
Całkowita objętość10010 μM (1x)

Tabela 11. Protokół montażu ReporteraC.

TGL Rozdział szt.
OdczynnikObjętość (μl)Końcowe stężenie
H2OOkręg wyborczy 514-
10x TAE z 125 mM Mg2+601x TAE z 12,5 mM Mg2+
PolyT przy 300 μMcyfra arabska1 μM
ReporterC przy 10 μM9150 nM (3x)
10% SDS90,15%
przy 5 μM650 nM (1x)
Całkowita objętość600-

Tabela 12. Protokół kalibracji ReporteraC. Podane tutaj objętości dotyczą całkowitej objętości reakcyjnej 600 μl (co odpowiada użyciu syntetycznej komórki kwarcowej o pojemności 0,875 ml), ale można je dostosować do pracy z komórkami o różnych rozmiarach.

Rozdział szt.
OdczynnikObjętość (μl)Końcowe stężenie
H2OZ numerem 493-
10x TAE z 125 mM Mg2+601x TAE z 12,5 mM Mg2+
polyT przy 300 μMcyfra arabska1 μM
ReporterC przy 10 μM9150 nM (3x)
przy 100 μM310x
przy 100 μM310x
przy 100 μM310x
10% SDS90,15%
WidelecBC przy ~1 μM (stężenie nieznane)15~0,5x
przy 100 μM310x
Całkowita objętość600-

Tabela 13. Protokół kalibracji widelcaBC. Podane tutaj objętości dotyczą całkowitej objętości reakcji wynoszącej 600 μl, ale można je dostosować do pracy z komórkami o różnych rozmiarach.

r. pkt. przy 10 μM szt.
OdczynnikObjętość (μl)Stężenie końcowe
H2O407,2-
10x TAE z 125 mM Mg2+52,812,5 mM Mg2+
polyT przy 300 μMcyfra arabska1 μM
ReporterC przy 10 μM9150 nM (3x)
przy 10 μM6100 nM (2x)
przy 10 μM6100 nM (2x)
przy 10 μM6100 nM (2x)
6100 nM (2x)
10% SDS90,15%
Dołącz doAB na 1 μMRozdział 4575 nM (1,5x)
WidelecBC przy 1 μMRozdział 4575 nM (1,5x)
przy 10 μM350 nM (1x)
przy 10 μM350 nM (1x)
Całkowita objętość600-

Tabela 14. Protokół reakcji chemicznej A+B->B+C. Podane tutaj objętości dotyczą całkowitej objętości reakcji wynoszącej 600 μl, ale można je dostosować do pracy z komórkami o różnych rozmiarach.

Bramki syntetyzowaneBratki pochodzące z plazmidu
opiskosztDołącz do bramBramy widełkowe
PAGE oczyszczone długie pasmo (100 nt; służyło jako dolne pasma bramy)~$75opiskosztopiskoszt
PAGE oczyszczona krótka nić (~30 nt, służyła jako górne pasma bramki)~$185Szablon bramy~$100Szablon bramy~$100
łączny~$260Zestaw do ekstrakcji plazmidu~26 dolarówZestaw do ekstrakcji plazmidu~26 dolarów
Enzym restrykcyjny (PvuII-HF)~$11Enzym restrykcyjny (PvuII-HF)~$11
Enzym nacinający (Nt.BsrDI, Join gates)~$29Enzym nacinający (Nt.BstNBI, Bramki widełkowe)~62 zł
łączny~$166łączny~$199

Tabela 15. Porównanie kosztów między bramkami pochodzącymi z plazmidu a bramkami syntetyzowanymi. (Ta tabela została zmodyfikowana w stosunku do Ref29.)

. . . . .
Zsyntetyzowane bramkiBratki pochodzące z plazmidu
przetwarzanieCzas przetwarzaniaprzetwarzanieCzas przetwarzania
Wyżarzanie1 godzklonowanie5 godz
Oczyszczanie STRONY2 godzEkstrakcja plazmidu2 godz
łączny3 godzDwa etapy trawienia enzymatycznego0,5 godz
Wytrącanie etanolu1 godz
łączny8,5 godz

Tabela 16. Porównanie czasu przetwarzania między bramkami pochodzącymi z plazmidu a bramkami syntetycznymi. (Ta tabela została zmodyfikowana w stosunku do Ref29.)

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metodę wyprowadzania bramek ndsDNA z wysoce czystego plazmidowego DNA. Ponadto przedstawiono protokół charakteryzujący wydajność bramki za pomocą testu kinetyki fluorescencji. Dane eksperymentalne pokazują, że system pochodzący z plazmidu przewyższa swój syntetyczny odpowiednik, nawet jeśli system syntetyczny jest złożony z pasm oczyszczonych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Prawdopodobnie poprawa wydajności bramek pochodzących z plazmidu wynika przede wszystkim z bardzo wysokiej czystości biologicznego DNA. Syntetyczne DNA zawiera wiele błędów, w szczególności delecje, które skutkują oligonukleotydami o długości n-1, a takie produkty uboczne zazwyczaj nie są całkowicie usuwane w procedurach oczyszczania PAGE lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Podobne ulepszenia do tych opisanych tutaj zaobserwowano również w poprzednim badaniu katalizowanego wzmacniacza spinki do włosów, który wykorzystywał DNA pochodzące ze źródeł biologicznych21.

Jednak nawet zastosowanie bramek pochodzących z plazmidu nie może całkowicie wyeliminować błędów w działaniu bramki, dla których istnieją co najmniej dwa powody: po pierwsze, nadmierne trawienie lub brak precyzji cięcia może prowadzić do bramek ze zbyt dużą liczbą nacięć lub nacięć w niewłaściwych pozycjach. W obu przypadkach bramki są bardziej skłonne do udziału w niepożądanych reakcjach. Problemy te można złagodzić poprzez optymalizację ilości stosowanego enzymu (patrz rysunek 4). Po drugie, w tych eksperymentach większość danych wejściowych i nici pomocniczych była syntetycznym DNA, a zatem zawierała delecje i mutacje. Zasadniczo wszystkie jednoniciowe nici wejściowe i pomocnicze można również uzyskać z DNA fagi poprzez trawienie enzymem nacinającym wstępnie zakodowanego genomu wirusa m1326. Być może wydajność obwodu można jeszcze bardziej poprawić za pomocą ssDNA pochodzącego z genomu bakteryjnego.

Podczas gdy stwierdzono, że zastosowanie bramek pochodzących z plazmidów poprawia wydajność obwodu, analiza kosztów i czasu przetwarzania wykazała, że chociaż produkcja bramek pochodzących z plazmidów jest nieco tańsza (Tabela 15), zajmuje 2-3 razy dłuższy czas przetwarzania w porównaniu do montażu i oczyszczania bramek z komercyjnie zsyntetyzowanych oligonukleukleotydów (Tabela 16). Głównymi kosztami bramek pochodzących z plazmidu są synteza genów i stosowanie enzymów restrykcyjnych. W przypadku 300 pmol bramek (wystarcza na 15 reakcji przy 30 nM) szacowany koszt bramek Join wynosi około 170 USD i 200 USD w przypadku bramek Fork, przy czym różnica w kosztach wynika z zastosowania różnych enzymów nacinania. W przeciwieństwie do tego, synteza chemiczna nici dla tej samej bramki kosztuje około 260 USD, w tym opłatę za oczyszczanie PAGE. Podstawowym kosztem czasu dla bramek pochodzących z plazmidu jest procedura klonowania, która, podobnie jak synteza DNA, może być zlecona firmie zajmującej się syntezą genów. Jednak po złożeniu bramki pochodzące z plazmidów mają tę zaletę, że plazmidy gospodarza mogą być łatwo replikowane i mogą być przechowywane w postaci bakteryjnych zapasów glicerolu. Dzięki temu możliwe jest wielokrotne wykorzystanie bram.

Patrząc w przyszłość, ulepszona wydajność bramek pochodzących z plazmidu może umożliwić znacznie szerszy zakres zachowań dynamicznych niż dotychczas eksperymentalnie wykazane w przypadku DNA CRN. Na przykład niedawne prace teoretyczne47,48 sugerują, że samoorganizujące się wzorce przestrzenne w skali makro mogą być realizowane za pomocą DNA CRN poprzez mechanizm dyfuzji reakcji. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia realną ścieżkę do konstruowania podstawowych składników molekularnych dla takich samokształtnych materiałów DNA. Opracowanie morfologii w skali makro w programowalny sposób, choć jest to wyzwanie, miałoby znaczące implikacje w różnych dziedzinach, od badań nad biomateriałami po medycynę regeneracyjną.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki 1, 2, 3, 4, 6, 8 i tabele 2, 3, 10, 15, 16 są zmodyfikowane z Ref29. Prace te były wspierane przez National Science Foundation (grant NSF-CCF 1117143 i NSF-CCF 1162141 dla G.S.). Y.-J. C. był wspierany przez Taiwanese Government Fellowships. S.D.R był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFNEBM0531S
PvuII-HFNEBR3151L
PstI-HFNEBR3140S
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Wspaniały bulion, zmodyfikowanySIGMA-ALDRICHT0918-250G
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
Zestaw QIAGEN Hispeed Maxi-prepQIAGEN12662
Nb.BsrDINEBR0648L
Nt.BstNBINEBR0607L
NanoDrop 2000cThermo Scientific
Dwuniciowe bloki genomoweIDT
Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 FluorymetrHoriba/Jobin Yvon
 Starna23-5.45-S0G-5
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAGENQIAGEN28706
Szkielet plazmiduBioBrickE0240-pSB1A2Plazmid o wysokiej liczbie kopii z opornością na ampicylinę. Sekwencję można znaleźć pod adresem http://parts.igem.org
Syntetyczne ogniwa kwarcowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).
  2. Krishnan, Y., Simmel, F. C. Nucleic acid based molecular devices. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).
  3. Zhang, D. Y., Winfree, E. Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange. J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).
  4. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475, 368-372 (2011).
  5. Qian, L., Winfree, E. Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades. Science. 332, 1196-1201 (2011).
  6. Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA. Small. 11, 1811-1817 (2015).
  7. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314, 1585-1588 (2006).
  8. Zadegan, R. M., et al. Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami. ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).
  9. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-76 (2009).
  10. Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly. Nat. Commun. 4, (1965).
  11. Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406, 605-608 (2000).
  12. Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices. Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).
  13. Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization. Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).
  14. Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion. Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).
  15. Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs. Science. 324, 67-71 (2009).
  16. Turberfield, A. J., et al. DNA fuel for free-running nanomachines. Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).
  17. Dirks, R. M., Pierce, N. A. Triggered amplification by hybridization chain reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).
  18. Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel. J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).
  19. Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318, 1121-1125 (2007).
  20. Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451, 318-322 (2008).
  21. Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).
  22. Phillips, A., Cardelli, L. A programming language for composable DNA circuits. J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).
  23. Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems. Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).
  24. Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. Abstractions for DNA circuit design. J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).
  25. Zhang, D. Y., Winfree, E. Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction. Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).
  26. Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides. Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).
  27. Lin, C., et al. In vivo cloning of artificial DNA nanostructures. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).
  28. Bhatia, D., et al. Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).
  29. Chen, Y. J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).
  30. Arkin, A., Ross, J. Computational functions in biochemical reaction networks. Biophys. J. 67, 560-578 (1994).
  31. Érdi, P., Tóth, J. Mathematical models of chemical reactions: theory and applications of deterministic and stochastic models. , Manchester University Press. (1989).
  32. Magnasco, M. O. Chemical kinetics is Turing universal. Phys. Rev. Lett. 78, 1190(1997).
  33. Oishi, K., Klavins, E. Biomolecular implementation of linear I/O systems. IET Syst. Biol. 5, 252-260 (2011).
  34. Senum, P., Riedel, M. Rate-independent constructs for chemical computation. PLoS One. 6, (2011).
  35. Soloveichik, D., Cook, M., Winfree, E., Bruck, J. Computation with finite stochastic chemical reaction networks. Natural Computing. 7, 615-633 (2008).
  36. Soloveichik, D., Seelig, G., Winfree, E. DNA as a universal substrate for chemical kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 5393-5398 (2010).
  37. Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell. Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).
  38. Cardelli, L. Two-domain DNA strand displacement. Math. Struct. Comput. Sci. 23, 247-271 (2013).
  39. Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. A simple population protocol for fast robust approximate majority. Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).
  40. Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. The cell cycle switch computes approximate majority. Sci. Rep. 2, 656(2012).
  41. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).
  42. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. , (2012).
  43. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
  44. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. , e253(2007).
  45. Lessard, J. C. Transformation of E. coli via electroporation. Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).
  46. Nasri, M., Thomas, D. Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease. Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).
  47. Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks. DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).
  48. Scalise, D., Schulman, R. Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation. Technology. 2, 55-66 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Plazmidowe DNAnaci te dwuniciowe DNAprzetwarzanie enzymatycznekinetyka fluorescencjitrawienie enzymami restrykcyjnymitraktowanie enzymem nacinaj cymanaliza spektrofotometrycznasyntetyczna kuweta kwarcowa

Powiązane artykuły