Method Article

Odtwarzalna komputerowa metoda ilościowego oznaczania gęstości naczyń włosowatych za pomocą kapilaroskopii fałdów paznokciowych

DOI:

10.3791/53088

⸱

October 27th, 2015

 ,  , 
1Department of Family and Community Medicine, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Thomas Jefferson University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapilaroskopia to nieinwazyjna, wydajna, stosunkowo niedroga i łatwa do nauczenia metoda bezpośredniej wizualizacji naczyń włosowatych w mikrokrążeniu. Jednak do tej pory tylko jedna publikacja opisuje niezawodność złożonego oprogramowania dostępnego do ilościowego oznaczania danych kapilaroskopowych. Tutaj przedstawiamy prosty, niezawodny protokół ilościowego oznaczania naczyń włosowatych przy użyciu ustandaryzowanego algorytmu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapilaroskopia to nieinwazyjna, efektywna, stosunkowo tania i łatwa do nauczenia metoda bezpośredniej wizualizacji mikrokrążenia. Technika kapilaroskopowa może zapewnić wgląd w stan zdrowia mikronaczyniowego pacjenta, prowadząc do wielu potencjalnie cennych zastosowań klinicznych w dermatologii, okulistyce, reumatologii i układzie sercowo-naczyniowym. Ponadto wzrost guza może być zależny od angiogenezy, którą można określić ilościowo, mierząc gęstość mikronaczyń w guzie. Jednak obecnie standaryzacja technik jest niewielka lub żadna, a tylko jedna publikacja do tej pory donosi o niezawodności obecnie dostępnych, złożonych algorytmów komputerowych do ilościowego określania danych kapilaroskopowych. 1 W tym artykule opisano nowy, prostszy, niezawodny i ustandaryzowany algorytm zliczania naczyń włosowatych do ilościowego określania danych kapilaroskopii fałdów paznokciowych. Prosty, powtarzalny skomputeryzowany algorytm kapilaroskopii, taki jak ten, ułatwiłby szersze zastosowanie tej techniki wśród badaczy i klinicystów. Wielu badaczy analizuje obecnie obrazy kapilaroskopowe ręcznie, co sprzyja zmęczeniu użytkownika i subiektywności wyników. W artykule opisano nowatorski, łatwy w użyciu algorytm automatycznego przetwarzania obrazu, a także powtarzalny, półautomatyczny algorytm zliczania. Algorytm ten umożliwia analizę obrazów w ciągu kilku minut przy jednoczesnym zmniejszeniu subiektywności; Do nauczenia się techniki potrzebna jest tylko minimalna ilość czasu na trening (z naszego doświadczenia wynika, że mniej niż 1 godzina).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie mikronaczyniowe to szybko rozwijająca się dziedzina z wieloma potencjalnymi zastosowaniami klinicznymi. 2 Na przykład onkolodzy wykorzystują obrazowanie mikronaczyń do określenia zakresu angiogenezy guza, dostarczając cennych informacji na temat stanu guza i wglądu w możliwe opcje leczenia. 34 Jednak kapilaroskopia fałdów paznokciowych jest prawdopodobnie najbardziej opłacalną i szeroko stosowaną formą obrazowania mikronaczyniowego. Naukowcy wykorzystują wideokapilaroskopię fałdu paznokciowego do badania szybkości przepływu krwi i badania morfologii naczyń włosowatych. 5 6 Zarówno kapilaroskopia fałdu paznokciowego na wideo, jak i na zdjęciach jest wspomagająca diagnostykę i leczenie zjawiska Raynauda oraz różnych chorób tkanki łącznej, takich jak twardzina układowa. cyfra arabska

Kapilaroskopia fałdu paznokciowego ma również różne potencjalne zastosowania sercowo-naczyniowe. Obecne badania z wykorzystaniem kapilaroskopii fałdów paznokciowych sugerują, że pacjenci z cukrzycą typu 1 i typu 2 wykazują wysoką częstość występowania nieprawidłowej morfologii naczyń włosowatych, ale mają niezmienioną gęstość naczyń włosowatych w porównaniu z osobami bez cukrzycy. 7-8 Kapilaroskopia była również badana eksperymentalnie w nadciśnieniu tętniczym. Strukturalne rozrzedzenie naczyń włosowatych prowadzące do zmniejszenia gęstości naczyń włosowatych wykazano u osób z nadciśnieniem tętniczym w porównaniu z osobami bez nadciśnienia. 9-10 W przeciwieństwie do starszych pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (średnia wieku 40 lat i więcej), którzy wykazują strukturalne rozrzedzenie, nowsze badania wykazały, że młodsi pacjenci z nadciśnieniem tętniczym (średni wiek poniżej 40 lat) mają funkcjonalne rozrzedzenie bez strukturalnego rozrzedzenia. 11 Sugeruje to, że rozrzedzenie funkcjonalne zachodzi przed rozrzedzeniem strukturalnym i może z czasem przejść do rozrzedzenia strukturalnego.

Ciekawe, pacjenci z nadciśnieniem leczeni specyficznymi lekami przeciwnadciśnieniowymi, takimi jak peryndopryl/indamid, wykazywali normalną gęstość naczyń włosowatych i funkcję śródbłonka po leczeniu, podczas gdy ci leczeni inhibitorami ACE (konwertazy angiotensyny) lub diuretykami utrzymywali niską gęstość naczyń włosowatych pomimo porównywalnej kontroli ciśnienia krwi. 12 Sugeruje to, że niektóre leki przeciwnadciśnieniowe mogą normalizować gęstość naczyń włosowatych poprzez odwrócenie rozrzedzenia naczyń włosowatych spowodowanego nadciśnieniem. Ponadto inni badacze wykazali, że zmniejszenie spożycia soli prowadzi do odwrócenia zarówno funkcjonalnego, jak i strukturalnego rozrzedzenia naczyń włosowatych u osób z nadciśnieniem. 13

Pomimo różnych potencjalnych zastosowań klinicznych tej technologii, istnieje niewielka standaryzacja techniki ilościowego oznaczania gęstości naczyń włosowatych. 2 Do tej pory naukowcy odkryli, że wyniki gęstości naczyń włosowatych są powtarzalne zarówno z perspektywy wewnątrzobserwatorskiej, jak i międzyobserwacyjnej tylko wtedy, gdy za każdym razem liczony jest dokładnie ten sam obszar. 1,14 15 Warto zauważyć, że poprzedni badacze w dużej mierze wykonywali liczenie naczyń włosowatych ręcznie gołym okiem, 9 16 17 18, co jest procesem powolnym i subiektywnym.

Ustandaryzowane, komputerowe algorytmy do ilościowego oznaczania obrazów naczyń włosowatych teoretycznie zapewniają bardziej efektywną i powtarzalną analizę danych przy mniejszym subiektywnym charakterze, ułatwiając kliniczne zastosowania kapilaroskopii. Niektórzy badacze rzeczywiście używali programów komputerowych do ilościowego oznaczania danych z obrazów kapilaroskopowych fałdów paznokciowych. 1,6 19 20 Jednak do tej pory tylko jedna publikacja opisuje niezawodność złożonego oprogramowania dostępnego do ilościowego oznaczania danych kapilaroskopowych,1 a program ten, jak wcześniej wspomniano powyżej, jest skomplikowany ze względu na wymóg zliczania dokładnie tego samego pola widzenia. W tym miejscu przedstawiamy prostszy, niezawodny protokół ilościowego oznaczania naczyń włosowatych przy użyciu ustandaryzowanego algorytmu, który pozwala na wykorzystanie wielu pól widzenia. Zastosowanie wielu pól widzenia nie tylko upraszcza procedurę, ale także pozwala na ocenę normalnej zmienności biologicznej liczby naczyń włosowatych.

Celem tego badania jest opisanie powtarzalnego i wydajnego algorytmu komputerowego, który standaryzuje proces kwantyfikacji kapilarnej. Chociaż metody te nie są w pełni zautomatyzowane, wymagają bardzo niewielkiego wkładu użytkownika i zapewniają szybką i wiarygodną ocenę ilościową zdjęć.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Proces akwizycji obrazów kapilarnych został wcześniej opublikowany i odbywa się za pomocą aparatu cyfrowego z odpowiednim programem komputerowym do akwizycji i analizy obrazu. 1121 To laboratorium wykorzystuje do analizy nieruchome obrazy, a nie filmy, co upraszcza pozyskiwanie obrazów do analizy. Poniżej opisano nową technikę ilościowego oznaczania naczyń włosowatych na podstawie obrazów.

1. Proces ulepszania obrazu

  1. Uzyskuj obrazy cyfrowe za pomocą monochromatycznego aparatu cyfrowego. Skalibruj obrazy do obiektu o znanym rozmiarze, robiąc zdjęcie obiektu o znanej długości, takiego jak linijka, za pomocą aparatu. Proces ten pozwala programowi komputerowemu na dokładny pomiar i zliczenie naczyń włosowatych po przetworzeniu. Idealnie, aby uzyskać najwyższą precyzję, należy użyć siatki (naukowo wyprodukowanego kawałka szkła z wytrawioną w nim linijką). Zmierz liczbę pikseli w kwadratowym pudełku o średnicy 1 mm za pomocą programu komputerowego.
    Uwaga: Kluczem do odtwarzalności i standaryzacji tego protokołu jest w dużej mierze prawidłowe umieszczenie liczonego pudełka o średnicy 1 mm2.
  2. Użyj narzędzi do poprawy kontrastu, aby przyciemnić naczynia włosowate i rozjaśnić tło, co zmaksymalizuje wizualizację naczyń włosowatych. Początkowe odróżnienie naczyń włosowatych od tła jest ważne dla prawidłowego kadrowania obrazu w późniejszych krokach. W tym celu należy dostosować obraz za pomocą "histogramu najlepszego dopasowania". Aby to zrobić, kliknij: przechwytywanie, intensywność, histogram obrazu, najlepsze dopasowanie.
  3. Przytnij obszar zainteresowania (ROI) do zliczania kapilar jako nowy obraz (wybierz obszary zainteresowania). Użyj pola 1 mm2, które zostało określone przez kalibrację obrazów przy 530 pikselach równych 1 mm. Sprawdź, czy przycięty obraz umieszcza wierzchołek pętli kapilarnych na samej górze obrazu.
  4. Spłaszcz obraz, aby wszystkie przyszłe dopasowania obrazu zostały równomiernie zastosowane do obrazu. Aby to zrobić, kliknij na: zakładkę proces, filtry 2D, spłaszczenie, intensywność BG "jasne", szerokość obiektu na "75", zastosuj.
  5. Zwiększ kontrast obrazu, aby maksymalnie uwidocznić naczynia włosowate. Aby to zrobić, kliknij: dostosuj zakładkę, wyświetl, zwiększ kontrast do 75.
  6. Usuń plamki na obrazie, aby wygładzić krawędzie naczyń włosowatych, klikając zakładkę procesu, filtry 2D, usuń plamki, rozmiar jądra 7 x 7, zastosuj.
  7. Sfinalizuj kontrast obrazu, tak aby naczynia włosowate były czarne, a tło białe. Wykonaj ten krok, dostosowując histogram do modelu "najlepiej dopasowanego".
    Uwaga: Zapoznaj się z rysunkiem 2 w Reprezentatywnych wynikach, aby zapoznać się z przykładem tego, jak powinien wyglądać przetworzony obraz po wykonaniu tych kroków.

2. Wykonywanie zliczania naczyń włosowatych / Ilościowe określanie gęstości naczyń włosowatych

  1. Na każdym obrazie ręcznie wybierz jedną część dobrze zdefiniowanej kapilary za pomocą funkcji "obiekt docelowy", który ma zostać rozpoznany jako obiekty do zliczenia przez program. Następnie wybierz niewielką część tła, korzystając z funkcji "tło", jako odniesienie do obszarów, które muszą zostać zignorowane przez algorytm zliczający.
    Uwaga: Połączenie tych świateł powoduje, że wszystkie naczynia włosowate są podświetlone, ignorując szum tła. Protokół kwantyfikacji (zliczania) wykorzystuje funkcje komputerowe do różnicowania części obrazu na podstawie koloru i morfologii.
  2. Użyj funkcji zliczania, aby natychmiast policzyć wszystkie naczynia włosowate na obrazie za pomocą sprzętu do obrazowania. Ustaw minimalną średnicę zliczanych obiektów na 5 pikseli, aby uniknąć zliczania szumu tła jako kapilarek.
  3. Dla każdej osoby policz średnią z 3 - 4 obrazów, aby uzyskać bardziej wiarygodną ocenę.
    Uwaga: Proszę zapoznać się z rysunkiem 3 w Reprezentatywnych wynikach, aby zapoznać się z przykładowym wyglądem obrazu podczas procedury liczenia.

3. Tworzenie i używanie makr do automatyzacji przetwarzania obrazów

Uwaga: Aby zaoszczędzić czas, można tworzyć makra w celu automatycznego wykonywania określonej sekwencji procesów na jednym lub wielu obrazach. Sekwencje te można dostosować, aby przyspieszyć modyfikacje obrazu. Zasadniczo te makra zapamiętują sposób przetwarzania obrazów i wykonują wszystkie kroki szybko i bez udziału użytkownika. Wykonywanie obliczeń na 12 obrazach kapilarnych zajmuje temu laboratorium od 20 do 30 minut z makrami (od 2 do 3 minut na zdjęcie), w przeciwieństwie do około 8 minut na zdjęcie bez makr. Dlatego korzystanie z makr jest od 3 do 5 razy bardziej wydajne niż ręczne przetwarzanie każdego pojedynczego obrazu.

  1. Aby utworzyć makro, wybierz opcję "nagraj makro" i na jednym obrazie wykonaj żądane kroki i procesy, zgodnie z opisem w krokach 1 i 2 powyżej. Nazwij makro, na podstawie którego zostały wykonane kroki przetwarzania obrazu, aby móc się z niego odwołać w przyszłości. Używając makra na przyszłych zdjęciach, po prostu kliknij "uruchom makro", a program automatycznie zastosuje nagrane ulepszenia do żądanych obrazów.
    Uwaga: W tym module użyto makra do wykonania wszystkich kroków opisanych w sekcji 1 metod w ciągu kilku sekund, z wyjątkiem jednego. Jedynym krokiem, który wymaga wprowadzenia przez użytkownika, jest wybór miejsca przycięcia obrazu, krok 1.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej procedury przetwarzania obrazu jest odróżnienie naczyń włosowatych od obrazu tła, aby można było je dokładnie określić ilościowo. Zarówno niepełne przetwarzanie obrazu, jak i nadmierne przetwarzanie obrazu są szkodliwe dla zdolności programu do ilościowego określania naczyń włosowatych. Jak widać na rysunku 3, niepełne przetwarzanie obrazu sprawia, że naczynia włosowate są trudne do odróżnienia od tła. Bardzo ważne jest, aby użytkownik był w stanie łatwo odróżnić granicę kapilary, ponieważ opis...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapilaroskopia fałdów paznokciowych jest obiecującym narzędziem klinicznie użytecznym w przyszłości w różnych zastosowaniach onkologicznych, sercowo-naczyniowych i reumatologicznych. Proces pozyskiwania obrazów jest dość spójny wśród badaczy, jednak obecnie istnieje wiele metod przetwarzania i analizy obrazu. Obecnie stosowane metody obejmują skomputeryzowane i ręczne zliczanie naczyń włosowatych. Ręczne liczenie jest problematyczne, ponieważ jest czasochłonne i podlega subiektywności i zmęczeniu użytkownika. Obecne meto...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez Granty Numerów HL96593 z NIH i D56HP20783 z HRSA/ HHS. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH lub HRSA / HHS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Image-Pro PremierMedia Cybernetics, Inc9.1Oprogramowanie do przetwarzania obrazu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gronenschild, E. H., et al. Semi-automatic assessment of skin capillary density: proof of principle and validation. Microvasc Res. 90, 192-198 (2013).
  2. Allen, J., Howell, K. Microvascular imaging: techniques and opportunities for clinical physiological measurements. Physiol Meas. 35, R91-R141 (2014).
  3. Boettcher, M., Gloe, T., de Wit, C. Semiautomatic quantification of angiogenesis. J Surg Res. 162, 132-139 (2010).
  4. Wild, R., Ramakrishnan, S., Sedgewick, J., Griffioen, A. W. Quantitative assessment of angiogenesis and tumor vessel architecture by computer-assisted digital image analysis: effects of VEGF-toxin conjugate on tumor microvessel density. Microvasc Res. 59, 368-376 (2000).
  5. Tresadern, P. A., et al. Simulating nailfold capillaroscopy sequences to evaluate algorithms for blood flow estimation. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2636-2639 (2013).
  6. Anderson, M. E., et al. Computerized nailfold video capillaroscopy--a new tool for assessment of Raynaud's phenomenon. J Rheumatol. 32, 841-848 (2005).
  7. Neubauer-Geryk, J., et al. Decreased reactivity of skin microcirculation in response to L-arginine in later-onset type 1 diabetes. Diabetes Care. 36, 950-956 (2013).
  8. Pazos-Moura, C. C., Moura, E. G., Bouskela, E., Torres-Filho, I. P., Breitenbach, M. M. Nailfold capillaroscopy in diabetes mellitus: morphological abnormalities and relationship with microangiopathy. Braz J Med Biol Res. 20, 777-780 (1987).
  9. Antonios, T. F., Singer, D. R., Markandu, N. D., Mortimer, P. S., MacGregor, G. A. Structural skin capillary rarefaction in essential hypertension. Hypertension. 33, 998-1001 (1999).
  10. Kaiser, S. E., Sanjuliani, A. F., Estato, V., Gomes, M. B., Tibirica, E. Antihypertensive treatment improves microvascular rarefaction and reactivity in low-risk hypertensive individuals. Microcirculation. 20, 703-716 (2013).
  11. Cheng, C., Diamond, J. J., Falkner, B. Functional capillary rarefaction in mild blood pressure elevation. Clinical and Translational Science. 1, 75-79 (2008).
  12. Debbabi, H., Bonnin, P., Levy, B. I. Effects of blood pressure control with perindopril/indapamide on the microcirculation in hypertensive patients. Am J Hypertens. 23, 1136-1143 (2010).
  13. He, F. J., Marciniak, M., Markandu, N. D., Antonios, T. F., MacGregor, G. A. Effect of modest salt reduction on skin capillary rarefaction in white, black, and Asian individuals with mild hypertension. Hypertension. 56, 253-259 (2010).
  14. Murray, A. K., et al. The influence of measurement location on reliability of quantitative nailfold videocapillaroscopy in patients with SSc. Rheumatology (Oxford). 51, 1323-1330 (2012).
  15. Ingegnoli, F., et al. Feasibility of different capillaroscopic measures for identifying nailfold microvascular alterations. Semin Arthritis Rheum. 38, 289-295 (2009).
  16. Debbabi, H., et al. Increased skin capillary density in treated essential hypertensive patients. Am J Hypertens. 19, 477-483 (2006).
  17. Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
  18. Shore, A. C. Capillaroscopy and the measurement of capillary pressure. Br J Clin Pharmacol. 50, 501-513 (2000).
  19. Rieder, M. J., O'Drobinak, D. M., Greene, A. S. A computerized method for determination of microvascular density. Microvasc Res. 49, 180-189 (1995).
  20. Vermeulen, P. B., et al. Quantification of angiogenesis in solid human tumours: an international consensus on the methodology and criteria of evaluation. Eur J Cancer. 32A, 2474-2484 (1996).
  21. Cheng, C., Daskalakis, C., Falkner, B. Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  22. Antonios, T. F., et al. Maximization of skin capillaries during intravital video-microscopy in essential hypertension: comparison between venous congestion, reactive hyperaemia and core heat load tests. Clin Sci (Lond). 97, 523-528 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary Density QuantitationNailfold CapillaroscopyImage Processing AlgorithmCapillary Counting MethodMicrocirculation AnalysisImage Manipulation TechniqueRegion of Interest PlacementHistogram Adjustment ProtocolAutomated Image AnalysisCapillary Morphology Assessment

Related Articles