Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Podsumowanie

W tym badaniu opisano metodę syntezy ultra-małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, a także kilka metod in vitro, za pomocą których można ocenić ich interakcje komórkowe.

Streszczenie

Pojazdy dostarczające oparte na nanocząstkach okazały się bardzo obiecujące dla zastosowań wewnątrzkomórkowych, dostarczając mechanizm specyficznej zmiany sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów. W poprzednim badaniu zademonstrowano syntezę ultramałych stałych nanocząstek lipidowych (SLN) do miejscowego dostarczania leków i wykrywania biomarkerów. SLN są dobrze zbadanym przykładem systemu dostarczania nanocząstek, który okazał się obiecującym sposobem dostarczania leków. W tym badaniu SLN załadowano barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystano jako model do badania interakcji cząstka-komórka. Metodę temperatury inwersji faz (PIT) wykorzystano do syntezy ultramałych populacji biokompatybilnych nanocząstek. Zastosowano test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylofenylotetrazolowego (MTT) w celu ustalenia odpowiednich poziomów dawkowania przed badaniami interakcji nanocząstka-komórka. Ponadto pierwotne ludzkie fibroblasty skórne i mysie komórki dendrytyczne były z czasem wystawione na działanie SLN obciążonego barwnikiem, a interakcje w odniesieniu do toksyczności i wychwytu cząstek scharakteryzowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Badanie to wykazało, że ultramałe SLN, jako system dostarczania nanocząstek, nadają się do wewnątrzkomórkowego celowania w różne typy komórek.

Wprowadzenie

Pojazdy dostarczające oparte na nanocząstkach okazały się bardzo obiecujące dla zastosowań wewnątrzkomórkowych, dostarczając mechanizm specyficznej zmiany sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów. Nośniki te mogą być załadowane lekami, białkami i kwasami nukleinowymi, które mają wpływać na odpowiedzi komórkowe i osiągać pożądany efekt w tkankach docelowych. Zbadano wiele rodzajów nanonośników pod kątem korzyści terapeutycznych i diagnostycznych, w tym lipidów, polimerów, krzemu i materiałów magnetycznych. Systemy te są atrakcyjne ze względu na ich potencjał do miejscowego dostarczania leków, zwiększone stężenie terapeutyczne w tkankach docelowych i zmniejszenie toksyczności ogólnoustrojowej.

Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) są dobrze zbadanym przykładem systemu dostarczania nanocząstek, który w ostatnich latach okazał się obiecującym środkiem dostarczania leków. SLN można łatwo opracować do wielu zastosowań, w tym do wykrywania biologicznego ¹, kosmetyków ² i dostarczania terapeutycznego ^3-7. Ich użyteczność wynika z faktu, że składają się w całości z wchłanialnych, nietoksycznych lipidów, co skutkuje zwiększoną biokompatybilnością. Podczas syntezy leki lipofilowe mogą być włączane do nośników SLN, zwiększając w ten sposób rozpuszczalność leku i przydatność do podawania pozajelitowego. Nośniki SLN pomagają również stabilizować kapsułkowane środki terapeutyczne, zmniejszając ich degradację i klirens oraz maksymalizując działanie terapeutyczne. Nośniki te szczególnie dobrze nadają się do preparatów o długim działaniu o kontrolowanym uwalnianiu ze względu na ich stabilność w temperaturze ciała ^3,4,8,9. Co ważne, enkapsulacja leków w nanocząstkach lipidowych zmienia wewnętrzne profile farmakokinetyczne cząsteczek leku. Daje to potencjalną przewagę, umożliwiając kontrolowane uwalnianie leków o wąskim indeksie terapeutycznym. Szybkość uwalniania środków terapeutycznych zawierających SLN można dostosować w oparciu o szybkość degradacji lipidów lub szybkość dyfuzji leku w matrycy lipidowej.

SLN są często zaprojektowane tak, aby gromadziły się w określonych tkankach docelowych. Na przykład ich rozmiar (zwykle większy niż 10 nm) nasila zatrzymywanie w krążeniu, gdzie nieszczelne unaczynienie tkanki nowotworowej ułatwia odkładanie się. Ponadto wykazano, że droga podawania cząstek zmienia biodystrybucję, z potencjałem do celowania w określone struktury fizjologiczne, takie jak węzły chłonne ^10,11. Po osadzaniu się w tkankach docelowych osiągnięcie odpowiednich interakcji komórkowych i ostateczna internalizacja nanocząstek jest wyzwaniem ze względu na zdolność błon komórkowych do selektywnego kontrolowania przepływu jonów i cząsteczek do i z komórki ¹². Aby ułatwić wychwyt komórkowy, możliwe jest modyfikowanie nanonośników za pomocą specyficznych ligandów, w tym peptydów, małych cząsteczek i przeciwciał monoklonalnych^13,14. Wcześniej opisano kilka mechanizmów, w tym zarówno pasywną penetrację, jak i aktywny transport nanocząstek przez błonę komórkową ^3,12,15. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że na interakcje komórka-nanocząstka mają wpływ właściwości fizykochemiczne nanocząstek, w tym rozmiar, kształt, ładunek powierzchniowy i chemia powierzchni, a także parametry specyficzne dla komórki, takie jak typ komórki lub faza ¹². cyklu komórkowego.

Poprzednie badanie wykazało syntezę SLN poniżej 10 nm do miejscowych ^{zastosowań 16} i wykrywania biomarkerów ¹ przy użyciu metody temperatury inwersji faz (PIT) ¹⁷. Jest to delikatna metoda syntezy, w której ² kompozycja pozostaje stała, podczas gdy temperatura jest stopniowo zmieniana. Ciągłe mieszanie podgrzanego roztworu, gdy stygnie on do temperatury pokojowej, daje w wyniku nanoemulsję. W wyniku tego procesu dochodzi do syntezy SLN o mniejszym rozmiarze cząstek¹ niż wcześniej zgłaszany przy użyciu różnych metod syntezy nanocząstek lipidowych^17-22. Uzyskana w ten sposób skala rozmiarów, mniejsza niż 20 nm, zapewnia przewagę w zastosowaniach celowania wewnątrzkomórkowego ze względu na zwiększoną powierzchnię i potencjał wzmocnionych interakcji komórkowych.

Schemat SLN, zaprojektowanych do dostarczania barwnika fluorescencyjnego lub terapeutycznego, jest pokazany na rysunku 1. SLN składają się z wnętrza lipidowego (np. liniowego alkanu) umożliwiającego włączenie związków lipofilowych (np. barwników lub środków terapeutycznych) oraz zewnętrznego środka powierzchniowo czynnego (np. liniowego niejonowego środka powierzchniowo czynnego) otoczonego wodą. W tym badaniu SLN załadowano barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystano jako model do badania interakcji cząstka-komórka. Pierwotne ludzkie fibroblasty skórne i mysie komórki dendrytyczne wystawiono z czasem na działanie SLN obciążonego barwnikiem w celu scharakteryzowania interakcji w odniesieniu do toksyczności i wychwytu cząstek. Zastosowano test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylofenylotetrazolium (MTT) w celu ustalenia odpowiednich poziomów dawkowania. Mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa to dwie metody stosowane do badania wychwytu cząstek in vitro.

Rysunek 1. Schemat SLN przedstawiający główne składniki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przetwarzanie SLN-ów

1. Synteza SLNs
   Uwaga: Metodę PIT ^1,17,20 należy przygotować SLN poniżej 20 nm ¹.
   1. Stosować technikę aseptyczną, bioodczynniki lub odczynniki do hodowli komórkowych oraz materiały sterylne (np. pipety, szpatułki, fiolki itp.).
   2. Do syntezy SLN należy użyć komory bezpieczeństwa biologicznego (ryc. 2).
   3. Połączyć 0,6 mg barwnika fluorescencyjnego (czerwień nilowa (NiR), stężenie NiR wynosi około 0,3 mg/ml) i 0,10 g heneikozanu (lipid, stężenie lipidów 5 mt/wt%) w fiolce (15 ml), rozpuść w temperaturze 90 °C i wymieszać.
   4. Dodać 0,11 g polioksyetylenowego (10) eteru oleylowego (środek powierzchniowo czynny, stężenie surfaktantu 5,5 % wag.). Powstałą mieszaninę należy rozpuścić w temperaturze 90 °C i wymieszać.
   5. Do mieszaniny dodać 1,79 g sterylnej wody, podgrzać do 90 °C i mieszać do uzyskania przezroczystej nanoemulsji.
      Uwaga: Przy ciągłym mieszaniu i kontrolowanym chłodzeniu tworzone są SLN. Warunki te powodują odwrócenie emulsji typu woda w oleju do emulsji typu olej w wodzie. Cząsteczki lipofilowe, takie jak podział NiR na kropelki lipidów.
   6. Przygotować nanoemulsję równolegle bez dodawania barwnika fluorescencyjnego, aby posłużyła jako próbka kontrolna. Połączyć 0,10 g heneikozanu i 0,11 g polioksyetylenowego (10) eteru oleylowego w fiolce (15 ml) w temperaturze 90 °C i wymieszać.
      1. Do mieszaniny dodać 1,79 g sterylnej wody, podgrzać do 90 °C i mieszać, aż powstanie przezroczysta nanoemulsja.
   7. Następnie wysterylizuj każdą nanoemulsję za pomocą sterylnego filtra 0,2 μm.
   
   Rysunek 2. Schemat syntezy SLN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
2. Wielkość cząstek i polidyspersyjność
   1. Użyj dynamicznego rozpraszania światła (DLS) do pomiaru wielkości cząstek i polidyspersyjności SLNs ¹ za pomocą szklanej kuwety i przyrządu zaprojektowanego do pomiaru wielkości cząstek.
   2. Przed przystąpieniem do pomiarów próbek należy zmierzyć wielkości cząstek dwóch znanych wzorców, postępując zgodnie z protokołem producenta dotyczącym przygotowania i pomiaru wzorców.
   3. Napełnić szklaną kuwetę 1,5 ml roztworu wzorcowego i zmierzyć roztwór wzorcowy, stosując te same warunki pomiaru, co próbki.
      Uwaga: Poprzedni krok został powtórzony dla każdej normy.
   4. Zmierzyć próbki w takiej postaci, w jakiej są przygotowane. Dla każdego z nich należy zastosować następujące parametry doświadczalne: czas pracy 100 sekund, współczynnik załamania światła wody (1,33), lepkość wody w temperaturze 20 °C (1,002 mPa·s).
      Uwaga: Ta technika wykorzystuje światło o przesuniętej częstotliwości do pomiaru wielkości nanocząstek.
   5. Należy podać średnią średnicę cząstek i polidyspersyjność rozkładu wielkości cząstek.
3. Temperatura topnienia i utajone ciepło topnienia
   1. Użyj różnicowego kalorymetru skaningowego (DSC) wyposażonego w automatyczny próbnik i źródło chłodzenia ciekłym azotem, aby zbadać zachowanie termiczne SLN ¹.
   2. Odpipetować tak przygotowane SLN do aluminiowej szalki o pojemności 40 μl o masie około 25 mg i hermetycznie zamknąć szalkę za pomocą uniwersalnej prasy zaciskowej, aby zminimalizować utratę wilgoci podczas skanowania DSC.
   3. Odmierz każdą nanoemulsję w temperaturze od 5 do 80 °C.
   4. Należy podać temperaturę topnienia i utajone ciepło topnienia z wykresu DSC, gdzie dolina reprezentuje temperaturę topnienia, a całka obszaru pod krzywą na wykresie DSC podzielona przez ilość materiału odpowiada utajonemu ciepłu topnienia.

2. Interakcja SLN z fibroblastami i komórkami dendrytycznymi

1. Kultura pierwotnych ludzkich fibroblastów
   1. Hodowla pierwotnych ludzkich fibroblastów zgodnie z instrukcjami producenta w płynnej pożywce do hodowli ludzkich fibroblastów skórnych (pożywka 106), uzupełniona zestawem suplementu o niskim wzroście surowicy (LSGS). Utrzymuj komórki w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i subkulturze po osiągnięciu 80% konfluencji.
   2. Zarówno w przypadku MTT, jak i analizy obrazowej, komórki nasienne w 96-dołkowej płytce, o gęstości 2 x 10⁴ komórki na dołek i pozostawić do zrównoważenia w temperaturze 37 °C O/N przed ekspozycją na SLN.
   3. W czasie zerowym rozcieńczyć SLN w kompletnym podłożu, jak wskazano (rysunek 4), w odniesieniu do stężenia lipidów, i dodać 10 μl na studzienkę do każdej studzienki kontrpróbnej na płytce 96-dołkowej.
   4. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w okresie inkubacji.
2. Test toksyczności MTT
   1. Po 24 godzinach inkubacji z SLN określ żywotność komórek za pomocą testu MTT, zgodnie z protokołem producenta.
   2. Umyj komórki raz i dodaj świeżą pożywkę do każdej studzienki (100 μl/studzienkę). Zabić studzienki kontrolne przez inkubację w 70% roztworze metanolu przez 10 minut przed zastąpieniem świeżą pożywką.
   3. Dodać odczynnik MTT (10 μl na studzienkę) do każdego dołka mikropłytki i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
   4. Po inkubacji O/N rozpuścić wewnątrzkomórkowe kryształy formazyny w dostarczonym roztworze detergentu (100 μl na studzienkę) zgodnie z protokołem producenta.
   5. Po 3 godzinach inkubacji w temperaturze suchej at, uzyskać wartości absorbancji przy długości fali pomiarowej 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
      Uwaga: Stosowany odczynnik MTT powinien zawierać mniej niż 1% (w/v) bromku 3-(4,5-dimetylotiazolylo-2)-2,5-difenylo-tetrazolu.
3. Mikroskopia fluorescencyjna
   1. W określonych punktach czasowych po podaniu fibroblastom SLN, należy dwukrotnie przemyć fibroblasty sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i utrwalić na 10 minut zimnym 70% metanolem.
   2. Po 10 minutach zastąp metanol PBS i uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu odwróconego, używając zestawu filtrów pasmowoprzepustowych (BP) 690/50 nm.
4. Hodowla komórek dendrytycznych szpiku kostnego myszy
   1. Indukuj komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego myszy (BMDC), jak opisano wcześniej ^23,24. Krótko mówiąc, zawiesiny jednokomórkowe szpiku kostnego C57BL / 10 na 100 mm szalkach Petriego w odległości 2 x 10⁶ / płytka z rekombinowanym mysim czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF, 300 U/ml) i rekombinowanym mysim IL-4 (czynnik stymulujący limfocyty B, 200 U/ml). Zmieniaj nośniki co 3 dni.
   2. W dniu 7 dodaj do szalek SLN obciążone NiR w końcowym stężeniu 0,5 i 5,0 μg/ml lipidów i utrzymuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez pożądany czas ekspozycji.
   3. Zebrać komórki z szalek, zasysając wszystkie podłoża z płytki, zbierając je do probówki o pojemności 50 ml, a następnie dokładnie umyć płytkę (w celu usunięcia luźno przylegających komórek) 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 4 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Otrzymaną zawiesinę komórkową należy zebrać do tej samej probówki o pojemności 50 ml.
5. Ocena włączenia SLN za pomocą cytometrii przepływowej
   1. Oznaczyć stężenie zawiesiny komórek otrzymanej w ppkt 2.4.3 i rozprowadzić 3x10⁵ komórek w probówce FACS o okrągłym dnie 12 mm x 75 mm.
   2. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS, a następnie odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 400 x g, w temperaturze 4 °C.
   3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl PBS/2 mM EDTA/0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor barwiący) zawierającej przeciwciało monoklonalne anty-CD11c-FITC (0,25 μg/ml final). Inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności.
   4. Przemyć komórki 1 ml PBS, a następnie odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 400 x g.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę za pomocą 400 μl buforu barwiącego. Komórki są teraz gotowe do pobrania próbek za pomocą cytometru przepływowego (ewentualnie wyposażonego w niebieski i czerwony laser).
   6. Korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, oceń poziom włączenia SLN przez prąd stały, bramkując na populacji komórek CD11c+ (dodatni FITC) i porównując intensywność fluorescencji związanej z SLN (mierzoną w kanałach PerCP-Cy5.5 lub APC).

Wyniki

Metoda PIT została użyta do syntezy SLN, a temperatura inwersji faz została określona za pomocą kąpieli wodnej. Próbki były powoli podgrzewane i delikatnie mieszane, aż roztwór stał się klarowny. Temperatura inwersji faz dla SLN wykonanych przy użyciu lipidu heneikozanowego wynosi 45 °C. Tabela 1 podsumowuje wielkość cząstek, polidyspersyjność, temperaturę topnienia i utajone ciepło topnienia dla SLN. SLN zsyntetyzowane przy użyciu warunków przetwarzania opisanych powyżej dały kontrolne SLN i SLN obciążo...

Dyskusja

W tym badaniu zbadano syntezę SLN i ich zastosowanie w zastosowaniach celowania wewnątrzkomórkowego. Te biokompatybilne nanocząstki okazały się obiecujące jako nośniki do wielu zastosowań, w tym dostarczania leków, wyciszania genów i technologii szczepionek ^25-30. Ultramałe SLN zsyntetyzowano w łatwym procesie, a następnie zbadano ich interakcje z pierwotnymi komórkami skóry i pierwotnymi komórkami odpornościowymi. SLN zostały zaprojektowane tak, aby zawierały enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (NiR), któ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Czerwień Nilowa (NiR)	Sigma	19123	Bioodczynnik, odpowiedni do fluorescencji, ≥ 98,0%
Heneikozan	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polioksyetylenowy (10) eter oleylowy
Woda	Sigma	W3500	Sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m Membrana Supor o niskim poziomie wiązania białek Nauki	przyrodnicze	PN4612	Niepirogenny
Nanotrac Ultra	Numer seryjny	Microtrac	Przyrząd
do różnicowego kalorymetru skaningowego	Mettlet-Toledo		Instrument
Pierwotne ludzkie fibroblasty	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Sterylna, płynna pożywka do hodowli ludzkich fibroblastów skórnych.
Zestaw suplementów do wzrostu w surowicy (zestaw LSGS)	Life Technologies	S-003-K	Wszystkie elementy kompletnego
zestawu do oznaczania proliferacji komórek LSGS MTT	Trevigen	4890-025-K	Czuły zestaw do pomiaru proliferacji komórek w oparciu o redukcję soli tetrazolowej, bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolu (MTT)
Czytnik mikropłytek Safire2	Tecan	----	Przyrząd
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	P5493	Dla biologii molekularnej
Rekombinowana mysia GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, firmy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych i uwidoczniony przez srebrną plamę.
Rekombinowana mysia IL-4	Peprotech	214-14	>97%, firmy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych i uwidoczniony przez srebrną plamę.