Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Podsumowanie

W tym badaniu opisano metodę syntezy ultra-małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, a także kilka metod in vitro, za pomocą których można ocenić ich interakcje komórkowe.

Streszczenie

Pojazdy dostarczające oparte na nanocząstkach okazały się bardzo obiecujące dla zastosowań wewnątrzkomórkowych, dostarczając mechanizm specyficznej zmiany sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów. W poprzednim badaniu zademonstrowano syntezę ultramałych stałych nanocząstek lipidowych (SLN) do miejscowego dostarczania leków i wykrywania biomarkerów. SLN są dobrze zbadanym przykładem systemu dostarczania nanocząstek, który okazał się obiecującym sposobem dostarczania leków. W tym badaniu SLN załadowano barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystano jako model do badania interakcji cząstka-komórka. Metodę temperatury inwersji faz (PIT) wykorzystano do syntezy ultramałych populacji biokompatybilnych nanocząstek. Zastosowano test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylofenylotetrazolowego (MTT) w celu ustalenia odpowiednich poziomów dawkowania przed badaniami interakcji nanocząstka-komórka. Ponadto pierwotne ludzkie fibroblasty skórne i mysie komórki dendrytyczne były z czasem wystawione na działanie SLN obciążonego barwnikiem, a interakcje w odniesieniu do toksyczności i wychwytu cząstek scharakteryzowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Badanie to wykazało, że ultramałe SLN, jako system dostarczania nanocząstek, nadają się do wewnątrzkomórkowego celowania w różne typy komórek.

Wprowadzenie

Nośniki oparte na nanocząsteczkach wykazują duży potencjał w zastosowaniach dotyczących targetowania wewnątrzkomórkowego, zapewniając mechanizm specyficznej modyfikacji sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów. Nośniki te mogą być obciążone lekami, białkami i kwasami nukleinowymi zaprojektowanymi w celu wpłynięcia na odpowiedzi komórkowe i osiągnięcia pożądanego efektu w tkankach docelowych. W celu uzyskania korzyści terapeutycznych i diagnostycznych zbadano wiele rodzajów nanonośników, w tym lipidy, polimery, krzem oraz materiały magnetyczne. Systemy te są atrakcyjne ze względu na ich potencjał w zakresie lokalnego dostarczania leków, zwiększenia stężenia terapeutycznego w tkankach docelowych oraz redukcji toksyczności systemowej.

Stałe nanocząsteczki lipidowe (SLNs) są dobrze przebadanym przykładem systemu dostarczania nanocząsteczek, który w ostatnich latach wyłonił się jako obiecujący nośnik leków. SLNs mogą być łatwo formułowane do wielu zastosowań, w tym do biosensingu ¹, kosmetyki ² oraz dostarczania terapeutyków ^3-7. Ich użyteczność wynika z faktu, że składają się w całości z wchłanialnych, nietoksycznych lipidów, co skutkuje zwiększoną biokompatybilnością. Podczas syntezy do nośników SLN można włączyć leki lipofilowe, co zwiększa rozpuszczalność leku i jego przydatność do podawania drogą parenteralną. Nośniki SLN pomagają również stabilizować enkapsulowane terapeutyki, ograniczając ich degradację i usuwanie z organizmu oraz maksymalizując działanie terapeutyczne. Nośniki te są szczególnie odpowiednie do preparatów długo działających o kontrolowanym uwalnianiu ze względu na ich stabilność w temperaturze ciała ^3,4,8,9. Co istotne, enkapsulacja leków w nanocząsteczkach lipidowych zmienia wewnętrzne profile farmakokinetyczne cząsteczek leku. Stanowi to potencjalną zaletę, umożliwiając kontrolowane uwalnianie leków o wąskim indeksie terapeutycznym. Szybkość uwalniania terapeutyków włączonych do SLN może być dostrojona w zależności od szybkości degradacji lipidów lub szybkości dyfuzji leku w matrycy lipidowej.

SLN są często projektowane tak, aby gromadzić się w określonych tkankach docelowych. Na przykład ich rozmiar (zazwyczaj powyżej 10 nm) zwiększa retencję w krwiobiegu, w którym nieszczelne naczynia krwionośne tkanki nowotworowej ułatwiają ich osadzanie. Dodatkowo wykazano, że droga podania cząsteczek zmienia biodystrybucję, co stwarza możliwość celowania w konkretne struktury fizjologiczne, takie jak węzły chłonne ^10,11. Po osadzeniu się w tkankach docelowych, osiągnięcie odpowiednich interakcji komórkowych i ostateczna internalizacja nanocząsteczek są trudne ze względu na zdolność błon komórkowych do selektywnej kontroli przepływu jonów i cząsteczek do wnętrza komórki i na zewnątrz ¹². Aby ułatwić pobieranie komórkowe, możliwe jest modyfikowanie nanonośników specyficznymi ligandami, w tym peptydami, małymi cząsteczkami i przeciwciałami monoklonalnymi^13,14. Wcześniej opisano kilka mechanizmów, obejmujących zarówno penetrację pasywną, jak i transport aktywny nanocząsteczek przez błonę komórkową ^3,12,15. Ogólnie wykazano, że interakcje między komórką a nanocząsteczką są zależne od właściwości fizykochemicznych nanocząsteczek, w tym ich rozmiaru, kształtu, ładunku powierzchniowego i chemii powierzchni, a także od parametrów specyficznych dla komórki, takich jak typ komórki lub faza cyklu komórkowego ¹².

Wcześniejsze badanie wykazało możliwość syntezy SLN o rozmiarach poniżej 10 nm do zastosowań w terapii miejscowej ¹⁶ oraz detekcji biomarkerów ¹ z wykorzystaniem metody temperatury inwersji fazowej (PIT) ¹⁷. Jest to łagodna metoda syntezy, w której ² skład pozostaje stały, podczas gdy temperatura jest stopniowo zmieniana. Ciągłe mieszanie podgrzanego roztworu podczas jego chłodzenia do RT prowadzi do powstania nanoemulsji. Proces ten skutkuje syntezą SLN o mniejszym rozmiarze cząstek¹ niż raportowano wcześniej przy użyciu różnych metod syntezy nanocząsteczek lipidowych^17-22. Uzyskana skala rozmiarów, mniejsza niż 20 nm, stanowi zaletę w zastosowaniach związanych z celowaniem wewnątrzkomórkowym ze względu na zwiększoną powierzchnię właściwą i potencjał do wzmocnienia oddziaływań komórkowych.

Schemat SLN, zaprojektowanych do dostarczania barwnika fluorescencyjnego lub leku, przedstawiono na Rysunku 1. SLN składają się z lipidowego wnętrza (np. liniowego alkanu), co umożliwia inkorporację związków lipofilowych (np. barwników lub leków), oraz zewnętrznej warstwy surfaktanta (np. liniowego surfaktanta niejonowego) otoczonej wodą. W niniejszym badaniu SLN załadowano barwnikiem fluorescencyjnym i wykorzystano jako model do badania oddziaływań między cząstkami a komórkami. Pierwotne ludzkie fibroblasty skóry oraz dendrytyczne komórki mysie eksponowano na SLN załadowane barwnikiem w określonym czasie, aby scharakteryzować oddziaływania pod kątem toksyczności i poboru cząstek. W celu ustalenia odpowiednich poziomów dawek wykorzystano test 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylofenylotetrazolium bromku (MTT). Do zbadania poboru cząstek in vitro zastosowano dwie metody: mikroskopię fluorescencyjną oraz cytometrię przepływową.

Rycina 1. Schemat SLN przedstawiający główne składniki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

1. Przetwarzanie SLN

1. Synteza SLN
   Uwaga: Do przygotowania SLN o rozmiarze poniżej 20 nm należy zastosować metodę PIT ^{1,17,20 1}.
   1. Należy stosować technikę aseptyczną, bioreagenty lub odczynniki klasy do hodowli komórkowych oraz materiały sterylne (np. pipety, szpachelki, fiolki itp.).
   2. Do syntezy SLN należy użyć komory z laminarnym przepływem powietrza (Rycina 2).
   3. Do fiolki (15 ml) należy wprowadzić 0,6 mg barwnika fluorescencyjnego (Nile Red (NiR), stężenie NiR wynosi około 0,3 mg/ml) oraz 0,10 g heneikosanu (lipid, stężenie lipidów 5% masowych) i poddać wspólnemu topnieniu w temperaturze 90 °C przy mieszaniu.
   4. Należy dodać 0,11 g polioksyetylenowego (10) oleylu eteru (surfaktant, stężenie surfaktanta 5,5% masowych). Powstałą mieszaninę należy poddać wspólnemu topnieniu w temperaturze 90 °C przy mieszaniu.
   5. Do mieszaniny należy dodać 1,79 g sterylnej wody, podgrzać do 90 °C i mieszać do czasu utworzenia przezroczystej nanoemulsji.
      Uwaga: Pod wpływem ciągłego mieszania i kontrolowanego chłodzenia powstają SLN. Warunki te powodują inwersję emulsji woda-w-oleju na emulsję olej-w-wodzie. Cząsteczki lipofilowe, takie jak NiR, przenikają do kropli lipidowych.
   6. Równolegle należy przygotować nanoemulsję bez dodatku barwnika fluorescencyjnego, która będzie służyć jako próbka kontrolna. Do fiolki (15 ml) należy wprowadzić 0,10 g heneikosanu i 0,11 g polioksyetylenowego (10) oleylu eteru, poddać wspólnemu topnieniu w temperaturze 90 °C i mieszać.
      1. Do mieszaniny należy dodać 1,79 g sterylnej wody, podgrzać do 90 °C i mieszać do czasu utworzenia przezroczystej nanoemulsji.
   7. Każdą nanoemulsję należy dodatkowo wysterylizować za pomocą sterylnego filtra 0,2 µm.
   
   Rycina 2. Schemat syntezy SLN. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Rozmiar cząstek i polidyspersyjność
   1. Do pomiaru rozmiaru cząstek i polidyspersyjności SLN ¹ należy użyć dynamicznego rozpraszania światła (DLS), wykorzystując kuwetę szklaną oraz przyrząd przeznaczony do pomiaru rozmiaru cząstek.
   2. Przed pomiarem próbek należy zmierzyć rozmiar cząstek dwóch znanych standardów, postępując zgodnie z protokołem producenta dotyczącym przygotowania i pomiaru standardów.
   3. Kuwetę szklaną należy napełnić 1,5 ml roztworu standardowego i przeprowadzić pomiar roztworu standardowego w tych samych warunkach pomiarowych co w przypadku próbek.
      Uwaga: Powyższy krok powtórzono dla każdego standardu.
   4. Przygotowane próbki należy zmierzyć, stosując następujące parametry eksperymentalne: czas pomiaru 100 s, współczynnik załamania światła wody (1,33), lepkość wody w temperaturze 20 °C (1,002 mPa·sec).
      Uwaga: Technika ta wykorzystuje światło o przesuniętej częstotliwości do pomiaru rozmiaru nanocząstek.
   5. Należy podać średnicę cząstek oraz polidyspersyjność rozkładu rozmiarów cząstek.
3. Temperatura topnienia i utajone ciepło topnienia
   1. Do zbadania właściwości termicznych SLN ¹ należy użyć różnicowego kalorymetru skaningowego (DSC) wyposażonego w autoprobnik i źródło chłodzenia ciekłym azotem.
   2. Przygotowane SLN należy pipetować do aluminiowego tygla o pojemności 40 µl i masie około 25 mg, a następnie szczelnie zamknąć tygiel za pomocą uniwersalnej praski zaciskowej, aby zminimalizować utratę wilgoci podczas skanowania DSC.
   3. Każdą nanoemulsję należy mierzyć w zakresie od 5 do 80 °C.
   4. Na podstawie wykresu DSC należy określić temperaturę topnienia oraz utajone ciepło topnienia, gdzie dolina reprezentuje temperaturę topnienia, a całka z powierzchni pod krzywą na wykresie DSC podzielona przez ilość materiału reprezentuje utajone ciepło topnienia.

2. Interakcja SLN z fibroblastami i komórkami dendrytycznymi

1. Hodowla pierwotnych ludzkich fibroblastów
   1. Hodować pierwotne ludzkie fibroblasty zgodnie z instrukcjami producenta w płynnym medium do hodowli ludzkich fibroblastów skóry (medium 106), uzupełnionym zestawem suplementu wzrostowego z niską zawartością surowicy (LSGS). Komórki utrzymywać w atmosferze wilgotnej w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i pasażować po osiągnięciu 80% konfluencji.
   2. Do analizy MTT oraz obrazowania wysiać komórki na płytkę 96-dołkową w zagęszczeniu 2 x 10⁴ komórek na dołek i pozostawić do równowagi w temperaturze 37 °C przez noc (O/N) przed ekspozycją na SLN.
   3. W punkcie czasowym zero rozcieńczyć SLN w medium kompletnym zgodnie ze wskazaniami (Rysunek 4), z uwzględnieniem stężenia lipidów, i dodać 10 μl na dołek do każdego powtórzenia w płytce 96-dołkowej.
   4. Komórki utrzymywać w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ podczas okresu inkubacji.
2. Test toksyczności MTT
   1. Po 24 h inkubacji z SLN określić żywotność komórek za pomocą testu MTT, zgodnie z protokołem producenta.
   2. Przemyć komórki raz i dodać do każdego dołka świeże medium (100 μl/dołek). Dołki kontrolne z komórkami martwymi przygotować poprzez inkubację w 70% roztworze metanolu przez 10 min, a następnie zastąpić go świeżym medium.
   3. Dodać odczynnik MTT (10 μl na dołek) do każdego dołka mikropłytki i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
   4. Po inkubacji przez noc rozpuścić wewnątrzkomórkowe kryształy formazanu za pomocą dostarczonego roztworu detergentu (100 μl na dołek) zgodnie z protokołem producenta.
   5. Po 3 h inkubacji w temperaturze pokojowej (RT) zmierzyć wartości absorbancji przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
      Uwaga: stosowany odczynnik MTT powinien zawierać mniej niż 1% (w/v) bromku 3-(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2,5-difenylotetrazoliowego.
3. Mikroskopia fluorescencyjna
   1. W określonych punktach czasowych po podaniu SLN fibroblastom, przemyć fibroblasty dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i utrwalić przez 10 min w zimnym 70% metanolu.
   2. Po 10 min zastąpić metanol roztworem PBS i wykonać zdjęcia przy użyciu mikroskopu odwróconego, stosując zestaw filtrów przepustowych (BP) 690/50 nm.
4. Hodowla komórek dendrytycznych szpiku kostnego myszy
   1. Indukować komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego myszy (BMDC) zgodnie z wcześniejszym opisem ^23,24. W skrócie: zawiesiny pojedynczych komórek szpiku kostnego C57BL/10 wysiać na szalki Petriego 100 mm w zagęszczeniu 2 x 10⁶/szalkę z rekombinowanym mysim czynnikiem stymulującym kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF, 300 U/ml) oraz rekombinowaną mysią IL-4 (czynnik stymulujący komórki B, 200 U/ml). Wymieniać medium co 3 dni.
   2. W 7. dniu dodać do szalek SLN obciążone NiR w końcowym stężeniu 0,5 i 5,0 µg/ml lipidów i utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez pożądany czas ekspozycji.
   3. Zebrać komórki z szalek poprzez odessanie całego medium do probówki 50 ml, a następnie dokładnie przemyć szalkę (aby odczepić słabo przylegające komórki) 5 ml buforu fosforanowego (PBS) zawierającego 4 mM kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA). Otrzymaną zawiesinę komórkową zebrać do tej samej probówki 50 ml.
5. Ocena wbudowania SLN za pomocą cytometrii przepływowej
   1. Określić stężenie zawiesiny komórkowej uzyskanej w punkcie 2.4.3 i przenieść 3x10⁵ komórek do probówki FACS o dnie okrągłym 12 mm x 75 mm.
   2. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS, a następnie wirować probówki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
   3. Odlać nadsącz i resuspendować osad w 100 µl PBS/2 mM EDTA/0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor barwiący) zawierającego przeciwciało monoklonalne anty-CD11c-FITC (stężenie końcowe 0,25 μg/ml). Inkubować przez 30 min na lodzie w ciemności.
   4. Przemyć komórki 1 ml PBS, a następnie wirować probówki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C.
   5. Odlać nadsącz i resuspendować każdy osad w 400 µl buforu barwiącego. Komórki są teraz gotowe do analizy próbek za pomocą cytometru przepływowego (ewentualnie wyposażonego w lasery niebieski i czerwony).
   6. Za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej ocenić poziom wbudowania SLN przez komórki DC poprzez bramkowanie populacji komórek CD11c+ (pozytywnych dla FITC) i porównanie intensywności fluorescencji związanej z SLN (mierzonej w kanałach PerCP-Cy5.5 lub APC).

Wyniki

Do syntezy SLN wykorzystano metodę PIT, a temperaturę inwersji fazowej wyznaczono przy użyciu łaźni wodnej. Próbki powoli podgrzewano i delikatnie mieszano, aż roztwór stał się klarowny. Temperatura inwersji fazowej dla SLN przygotowanych z lipidem heneikozanem wynosi 45 °C. W Tabeli 1 podsumowano wielkość cząstek, polidyspersyjność, temperaturę topnienia oraz utajone ciepło topnienia dla SLN. SLN zsyntetyzowane zgodnie z opisanymi powyżej warunkami procesu pozwoliły na otrzymanie kontrolnych SLN oraz SL...

Dyskusja

W tym badaniu zbadano syntezę SLN i ich zastosowanie w zastosowaniach celowania wewnątrzkomórkowego. Te biokompatybilne nanocząstki okazały się obiecujące jako nośniki do wielu zastosowań, w tym dostarczania leków, wyciszania genów i technologii szczepionek ^25-30. Ultramałe SLN zsyntetyzowano w łatwym procesie, a następnie zbadano ich interakcje z pierwotnymi komórkami skóry i pierwotnymi komórkami odpornościowymi. SLN zostały zaprojektowane tak, aby zawierały enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (NiR), któ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Czerwień Nilowa (NiR)	Sigma	19123	Bioodczynnik, odpowiedni do fluorescencji, ≥ 98,0%
Heneikozan	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polioksyetylenowy (10) eter oleylowy
Woda	Sigma	W3500	Sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m Membrana Supor o niskim poziomie wiązania białek Nauki	przyrodnicze	PN4612	Niepirogenny
Nanotrac Ultra	Numer seryjny	Microtrac	Przyrząd
do różnicowego kalorymetru skaningowego	Mettlet-Toledo		Instrument
Pierwotne ludzkie fibroblasty	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Sterylna, płynna pożywka do hodowli ludzkich fibroblastów skórnych.
Zestaw suplementów do wzrostu w surowicy (zestaw LSGS)	Life Technologies	S-003-K	Wszystkie elementy kompletnego
zestawu do oznaczania proliferacji komórek LSGS MTT	Trevigen	4890-025-K	Czuły zestaw do pomiaru proliferacji komórek w oparciu o redukcję soli tetrazolowej, bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolu (MTT)
Czytnik mikropłytek Safire2	Tecan	----	Przyrząd
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	P5493	Dla biologii molekularnej
Rekombinowana mysia GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, firmy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych i uwidoczniony przez srebrną plamę.
Rekombinowana mysia IL-4	Peprotech	214-14	>97%, firmy SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych i uwidoczniony przez srebrną plamę.

U1985IS