Tutaj prezentujemy protokół do trwałego zamknięcia dystalnej tętnicy środkowej mózgu u starszych samic szczurów z jednoczesnym zamknięciem tętnic szyjnych w celu wygenerowania dużych zawałów korowych i utrzymujących się deficytów. Pokazujemy potwierdzenie wielkości zmiany za pomocą strukturalnego rezonansu magnetycznego po 24 godzinach i 8 tygodniach po udarze.
Artykuł metodologiczny
Wykonywanie stałej dystalnej środkowej części mózgu z niedrożnością tętnicy szyjnej wspólnej u starszych szczurów w celu zbadania niedokrwienia kory mózgowej z trwałą niepełnosprawnością
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Udar zazwyczaj występuje u osób starszych z różnymi chorobami współistniejącymi, w tym miażdżycą tętnic szyjnych (lub innych tętnic), wysokim ciśnieniem krwi, otyłością i cukrzycą. W związku z tym, oceniając terapie udaru mózgu u zwierząt, ważne jest, aby wybrać model o doskonałej trafności twarzy. Udar niedokrwienny stanowi 80% wszystkich udarów, a większość z nich występuje na terytorium tętnicy środkowej mózgu (MCA), często wywołując zawały, które wpływają na korę sensomotoryczną, powodując uporczywą plegię lub niedowład po przeciwnej stronie ciała. W tym filmie pokazujemy metodę wywoływania udaru niedokrwiennego u starszych szczurów, który powoduje trwałą niepełnosprawność sensomotoryczną i znaczne zawały kory mózgowej. W szczególności indukujemy trwałą dystalną niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u starszych samic szczurów za pomocą kleszczy do diatermii w celu zamknięcia krótkiego odcinka tej tętnicy. Tętnica szyjna po stronie ipsilateralnej do zmiany została następnie trwale zamknięta, a tętnica szyjna przeciwległa została przejściowo niedrożna na 60 minut. Mierzymy rozmiar zawału za pomocą strukturalnego rezonansu magnetycznego (MRI) zależnego od T2 po 24 godzinach i 8 tygodniach po udarze. W tym badaniu średnia objętość zawału wynosiła 4,5% ± 2,0% (odchylenie standardowe) półkuli ipsilateralnej po 24 godzinach (skorygowana o obrzęk mózgu za pomocą równania Gerrieta, n = 5). Model ten jest wykonalny i klinicznie istotny, ponieważ pozwala na indukcję trwałych deficytów sensomotorycznych, co jest ważne dla wyjaśnienia mechanizmów patofizjologicznych i nowych metod leczenia.
Wprowadzenie
Udar mózgu jest obecnie trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie i główną przyczyną niepełnosprawności1. Udar niedokrwienny, który stanowi 80% wszystkich udarów, często powoduje zawały kory mózgowej powodujące utratę czucia (np. propriocepcji), funkcji motorycznych i uwagi na chorą stronę2-4. Tętnica środkowa mózgu (MCA) jest największym z naczyń, które czerpie energię z koła Willisa i wywodzi się z tętnicy szyjnej wewnętrznej5. MCA jest naczyniem mózgowym najczęściej dotkniętym udarem niedokrwiennym, przy czym udary na tym terytorium stanowią 65% wszystkich udarów niedokrwiennych6,7. MCA zaopatruje zarówno obszary korowe, jak i podkorowe, a nieprawidłowości neurologiczne spowodowane udarem MCA różnią się w zależności od dokładnej lokalizacji okluzji7. Bliższe okluzje MCA wpływają na głębokie terytorium przez tętnice soczewkowo-pęcherzykowe i powodują duże zawały obejmujące zarówno obszary korowe, jak i podkorowe. W przeciwieństwie do tego, bardziej dystalne okluzje, które pozbawiają tylko obszary korowe przepływu krwi, mają tendencję do wytwarzania mniejszych zawałów korowych.
W badaniach na dużych populacjach, zmiany po udarze u ludzi wahają się od 5-14% półkuli ipsilateralnej8,9; złośliwy udar stanowi 10% udarów i powoduje większe zawały, wymagające hemikraniektomii w celu obniżenia ciśnienia śródczaszkowego, a pacjenci z mniejszymi zmianami mają większe szanse na przeżycie10. Pokazujemy powtarzalny model, który powoduje zmiany chorobowe, które zajmują podobną część półkuli, co wiele udarów u ludzi.
Udar mózgu jest chorobą niejednorodną; 75% udarów niedokrwiennych jest wywoływanych przez zawały lakunarne (z powodu niedrożności małych naczyń wewnątrzczaszkowych); udar sercowo-zatorowy; lub miażdżycę tętnic dużych, która odpowiada za 30% udarów. Objawowa miażdżyca tętnic jest najczęściej obserwowana w miejscu, w którym tętnica szyjna wspólna (CCA) rozgałęzia się na tętnice szyjne wewnętrzne i zewnętrzne11.
Przedkliniczne modele udaru mózgu powinny być jak najbardziej zbliżone do stanu ludzkiego, aby symulować jego patofizjologię i powinny uwzględniać czynniki ryzyka udaru. 92% udaru niedokrwiennego występuje u osób powyżej 65 roku życia, a inne czynniki ryzyka obejmują otyłość, wysokie ciśnienie krwi i miażdżycę, jak wcześniej omówiono12. Aby lepiej przedstawić te czynniki ryzyka, zaleca się użycie modelu, który może mieć wspólne cechy patofizjologiczne stanu naturalnego. W tym protokole uwzględniliśmy zaawansowany wiek i utrudniony przepływ krwi przez tętnice szyjne.
Klasyczny model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) to wewnątrzświetlny model wewnątrzświetlny okluzji proksymalnego MCA, który zmniejsza przepływ krwi w tętnicach przednich i środkowych mózgu. Krótkie czasy okluzji przy użyciu tego modelu skupiają zmianę na obszarze podkorowym, podczas gdy dłuższe czasy okluzji mogą powodować duże zmiany rekrutujące obszary zarówno obszaru korowego, jak i podkorowego, co skutkuje wyższą śmiertelnością u starszych szczurów. Dla porównania, model stosowany przez naszą grupę polega na wykonaniu kraniotomii i otwarcia opony twardej, a następnie krzepnięciu krwi i zniszczeniu niewielkiej części MCA za pomocą bipolarnych kleszczy kauteryzujących. Ten model diatermii został zaadaptowany z artykułu Tamury i wsp. z 1981 roku.23 Zastosowanie kraniektomii może ograniczyć podwyższone ciśnienie śródczaszkowe, które jest cechą zamkniętej czaszki i skutkuje wyższą odtwarzalnością i niższą śmiertelnością w naszej kohorcie chirurgicznej w porównaniu z niektórymi innymi modelami13. Aby wygenerować powtarzalne zawały i trwałą niepełnosprawność, trwale zamykamy proksymalne CCA i przejściowo zamykamy dystalne CCA, zgodnie z Chen i wsp.14 Używamy nieinwazyjnego rezonansu magnetycznego (MRI) zależnego od T2 do oceny zakresu i lokalizacji zawału mózgu oraz stopnia obrzęku mózgu w korze czuciowo-ruchowej.
Protokół
Protokół ten został zatwierdzony zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi King’s College London i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (UK Home Office) oraz ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku. Wytyczne mogą różnić się w zależności od instytucji; przed przystąpieniem do tej procedury należy upewnić się, że są one przestrzegane. Aby zachować technikę aseptyczną podczas dotykania sprzętu, należy wysterylizować w autoklawie duży arkusz folii aluminiowej i owinąć nią uchwyty urządzeń, takich jak mikroskop i aparat do znieczulania. Można również użyć sterylnej folii spożywczej.
1. Przygotowanie
- Przynajmniej 48 h przed operacją udaru zapoznaj szczury z żelowymi saszetkami (weterynaryjny żel regeneracyjny) oraz miękką karmą. Ponieważ zwierzęta często mają trudności z jedzeniem i piciem po zabiegu, wprowadź te elementy przed operacją, aby zminimalizować neofobię. Przechowuj starsze szczury z drewnianymi gryzakami, aby zmniejszyć częstotliwość przerastania zębów (zob. Sekcja 6).
- Przed rozpoczęciem procedur chirurgicznych wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie (minimum 121 °C, 15 PSI przez 15 min). Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie robocze, używając 1% chlorheksydyny w 70% etanolu, stosuj obrusy chirurgiczne i zachowaj technikę aseptyczną przez cały czas trwania procedury.
- Wywołaj zmiany w półkuli przeciwległej do preferowanej łapy. Przypisz zmiany do lewej lub prawej półkuli w zależności od preferowanej przedniej łapy każdego szczura, ustalonej na podstawie wyników bazowych przed operacją w teście schodkowym Montoya15 (zob. Rycina 4). Dla uproszczenia, opisując tę procedurę w niniejszym manuskrypcie, przyjęto, że lewa łapa jest łapą preferowaną, a operacje wykonuje się na prawej półkuli. Do tych testów behawioralnych używaj szczurów rasy Lister Hooded lub Long Evans, ponieważ szybko się uczą.
Uwaga: Test schodkowy został zaprojektowany w celu pomiaru zmian zarówno w precyzyjnych, jak i ogólnych ruchach umiejętnościowych po uszkodzeniu układu ruchowego. Schody składają się z siedmiu stopni po każdej stronie centralnej platformy. Jeśli sprzęt do testu schodkowego jest niedostępny, test cylindra stanowi odpowiednią alternatywę do badania lateralizacji, należy jednak pamiętać, że w tym modelu udaru w tym teście występuje jedynie przejściowy deficyt, w związku z czym będzie on nieprzydatny do pomiaru długoterminowej rekonwalescencji po leczeniu.- Umieść trzy granulki cukru w zagłębieniu każdego stopnia (21 granulek na stronę). Umieść szczury w aparacie schodkowym na 10 min i zapisz liczbę pobranych granulek oraz liczbę granulek przemieszczonych po każdej stronie.
Uwaga: Aby zostać włączonym do zadania po operacji, szczury muszą pobrać minimum 75% granulek w pomiarze bazowym.
- Umieść trzy granulki cukru w zagłębieniu każdego stopnia (21 granulek na stronę). Umieść szczury w aparacie schodkowym na 10 min i zapisz liczbę pobranych granulek oraz liczbę granulek przemieszczonych po każdej stronie.
2. Operacja
- Użyj samic starszych szczurów rasy Lister-Hooded w wieku 16-18 miesięcy (250 do 400 g) i przeprowadź indukcję znieczulenia przy użyciu 5% izofluranu w przepływie 1,5 L/min O2. Po indukcji znieczulenia zmniejsz stężenie izofluranu i utrzymuj je na odpowiednim, ale zminimalizowanym poziomie głębokości znieczulenia niezbędnym do operacji (np. 1,5-2%). Podawaj środek znieczulający zwierzęciu przez maskę twarzową i stosuj system odprowadzania gazów, aby ograniczyć ekspozycję chirurga na izofluran.
- W przypadku zwierząt w grupie pozorowanej (sham) wykonaj wszystkie procedury z wyjątkiem kraniotomii, ponieważ zabieg ten może wywołać deficyty behawioralne16. Projektując eksperymenty MCAO, weź pod uwagę cele badawcze i zdecyduj, czy należy uwzględnić grupę pozorowaną w celu kontroli wpływu kraniotomii.
- Podaj leki przeciwbólowe przed operacją lub w trakcie jej przebiegu (Carprieve, 0,25 mg/kg, s. cut).
- Dodaj 1 ml preparatu do 19 ml sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór zapasowy, a następnie wstrzyknij 0,6 ml na 300 g masy ciała szczura. Stosowanie preparatu Carprieve jest preferowane nad karprofenem, ponieważ pierwszy z nich jest stabilny w temperaturze pokojowej.
- Ogól futro w brzusznej części szyi oraz w obszarze skroniowej półkuli prawej, aby odsłonić skórę. Zdezynfekuj miejsca operacyjne za pomocą wacików nasączonych etanolem. Pamiętaj o przestrzeganiu lokalnych wytycznych IACUC dotyczących usuwania owłosienia.
- Wykonaj ten krok poza obszarem operacyjnym, aby zminimalizować ilość futra w miejscu nacięcia.
- Umieść szczura w pozycji na plecach na macie grzewczej, na tablicy korkowej przykrytej sterylną obłożką. Na ogolone obszary głowy i szyi nałóż krem z lidokainą. Wprowadź sondę rektalną, aby monitorować i utrzymywać temperaturę zwierzęcia w zakresie 36,5-37,5 °C za pomocą systemu homeotermicznego.
- Nałóż maść lacrilube na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu. Wstrzyknij szczurowi roztwór siarczanu atropiny (0,05 ml roztworu o stężeniu 600 µg/ml, podskórnie), aby zmniejszyć wydzielinę w tchawicy.
Uwaga: Badacze powinni rozważyć pomiar zmiennych fizjologicznych, takich jak gazy krwi i ciśnienie.
- Nałóż maść lacrilube na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu. Wstrzyknij szczurowi roztwór siarczanu atropiny (0,05 ml roztworu o stężeniu 600 µg/ml, podskórnie), aby zmniejszyć wydzielinę w tchawicy.
- Przed rozpoczęciem operacji sprawdź odruch cofania tylnej łapy po ściśnięciu oraz odruch mrugania, aby potwierdzić pełne znieczulenie.
- Pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj skalpelem nacięcie środkowe o długości 2 cm w odsłoniętej części szyi. Delikatnie odsuń ślinianki bocznie od tchawicy po obu stronach.
- Zaciśnij niewchłanialną nić jedwabną wokół skóry pokrywającej tętnicę szyjną wspólną po jednej stronie. Delikatnie odciągnij skórę z tego miejsca za pomocą nici jedwabnej i przymocuj ją do tablicy korkowej taśmą chirurgiczną, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną. Ostrożnie przeprowadź tępą dyssekcję, uwalniając tętnice z otaczającej powięzi i nerwów błędnych przy użyciu delikatnych pęset.
- Uważaj, aby podczas tego kroku nie uszkodzić mięśni ani nerwów błędnych, ponieważ utrudni to karmienie, połykanie i oddychanie.
- Po odsłonięciu tętnicy szyjnej wspólnej użyj niewchłanialnej nici jedwabnej (5/0), aby wyizolować tętnicę; najpierw oddziel tętnicę od nerwu błędnego poprzez dyssekcję wsteczną delikatną pęsetą, uważając, aby nie dotknąć nerwu. Po owinięciu naczynia nicią (bez wiązania) złącz końce nici taśmą chirurgiczną, aby zapobiec rozluźnieniu tego etapu. Usuń szwy odciągające skórę naskórną.
- Powtórz procedurę po drugiej stronie (Sekcje 2.7-2.8).
- Wprowadź do rany gazę nasączoną sterylną solą fizjologiczną, aby utrzymać tkanki w wilgotnym stanie podczas dalszego przebiegu operacji. Luźno zaszyj skórę i połóż dodatkową gazę nasączoną solą fizjologiczną nad tym obszarem, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu.
- Umieść szczury w pozycji bocznej i wykonaj nacięcie skóry w połowie odległości między prawą orbitą a zewnętrznym kanałem słuchowym. Odciągnij skórę, używając do pięciu elastycznych retraktorów hakowatych o szerokości 3 mm przymocowanych do tablicy korkowej, a następnie wykonaj tępą dyssekcję mięśnia skroniowego, aby odsłonić czaszkę.
- Umieść nad otwartym miejscem grawitacyjny system kroplowy z solą fizjologiczną regulowany pokrętłem (przepływ około 2 ml/min) i przygotuj system aspiracyjny do usuwania odłamków kostnych oraz oczyszczania niewielkich krwawień z odsłoniętego miejsca w tej fazie operacji (Sekcje 2.13-2.16).
- Umieść dyszę podawczą soli fizjologicznej w najwyższym punkcie czaszki w pobliżu ucha, a dyszę aspiratora w najniższym punkcie. W przypadku krwawień reguluj pokrętło, aby podać więcej soli fizjologicznej w ten obszar, co pozwoli lepiej zwizualizować źródło krwawienia w celu koagulacji naczynia, skracając tym samym czas przebywania zwierząt pod znieczuleniem.
Rysunek 1. Konfiguracja chirurgiczna modelu trwałego zatoru dystalnego odcinka tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono sprzęt używany podczas kraniotomii u szczura dla prawej półkuli, a na wstawce rozmieszczenie aspiratora i kroplówki z solą fizjologiczną wokół miejsca kraniektomii. Pokazano również kluczowe elementy układu naczyniowego; zaznaczono tętnicę środkową mózgu (kolor czerwony) oraz dolną żyłę mózgową (kolor niebieski), a zacieniowany obszar wskazuje miejsce koagulacji tętnicy. Potwierdzenie zatoru wykonuje się poprzez przecięcie MCA poniżej dolnej żyły mózgowej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
- Wykonaj kraniotomię w odsłoniętym obszarze (około 5 mm x 5 mm) za pomocą wiertarki stomatologicznej z grubym, diamentowym wiertłem 1,6 mm przy prędkości około 8 000 rpm, pamiętając o przykładaniu nacisku kolistego i bocznego, a nie nacisku w dół podczas wiercenia w odsłoniętym obszarze. Gdy kość stanie się na tyle cienka, że będzie wyglądać na całkowicie przezroczystą, usuń ją za pomocą pęsety.
- Użyj własnoręcznie wykonanego haczyka do opony twardej, stworzonego poprzez zgięcie jednego ramienia cienkiej pęsety o około 180° w celu utworzenia łuku, aby ostrożnie otworzyć oponę twardą, unikając przy tym dużych naczyń krwionośnych powierzchniowych, ponieważ są one delikatne i łatwe do przerwania.
Uwaga: W odsłoniętym obszarze mózgu widoczna będzie środkowa tętnica mózgowa (MCA); pożądany odcinek ma długość około 2 mm (patrz Rycina 1, wstawka). - Koaguluj MCA od miejsca, w którym przecina ją dolna żyła mózgowa, do punktu bifurkacji tętnicy, a następnie wzdłuż gałęzi ogonowych MCA, używając pęsety do diatermii, aż do całkowitego zamknięcia naczynia17. Użyj kątowej pęsety diatermicznej jubilerskiej z ostrzami o średnicy 0,25 mm.
- Podczas zamykania tętnicy dostosuj przepływ soli fizjologicznej tak, aby utrzymać ten obszar w chłodzie, co zapobiegnie przywieraniu pęsety koagulacyjnej do naczynia krwionośnego. Po zamknięciu naczynie krwionośne przybiera kolor czarny i nie powinno być widać żadnych oznak przepływu krwi; przepływ krwi jest widoczny w naczyniach częściowo zamkniętych.
- Przetnij MCA w tym miejscu, aby potwierdzić całkowite zamknięcie. Używając nożyczek mikronaczyniowych, przetnij tętnicę poniżej miejsca, w którym dolna żyła mózgowa przecina MCA.
- Przed przejściem do następnego kroku przykryj odsłonięty obszar gazikiem nasączonym solą fizjologiczną.
- Ułóż szczura ponownie w pozycji grzbietowej i rozwiąż luźny szew na szyi, aby ponownie odsłonić tętnice szyjne. Trwale podwiąż tętnicę szyjną po tej samej stronie, po której zamknięto MCA (prawa), wiążąc węzeł z nici jedwabnej wokół tętnicy, podczas gdy lewą tętnicę szyjną zamknij przejściowo za pomocą 13 mm stalowego zacisku tętniczego z naciskiem 125 g przez 60 min. W tym czasie luźno zaszyj nacięcie na szyi i połóż na wierzchu sterylny gazik nasączony solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu.
- Należy pamiętać, że ze względu na ułożenie zwierzęcia w pozycji leżącej na plecach, jego prawa strona będzie znajdować się po lewej stronie chirurga.
- W przypadku zwierząt z grupy pozorowanej (sham) należy naciąć brzuszna część szyi oraz obszary skroniowe i rozsunąć mięśnie, aby zlokalizować tętnice szyjne wspólne, lecz nie należy ich zamykać. Zwierzęta z grupy pozorowanej powinny zostać poddane wszystkim procedurom z wyjątkiem kraniotomii, ponieważ zabieg ten może wywołać deficyty behawioralne.16Aby zachować zaślepienie pozostałych członków zespołu (np., podczas późniejszych testów behawioralnych), wykonaj nacięcia i zaszyj rany.
Rycina 2. Tandemowe zamknięcie tętnic szyjnych po zamknięciu środkowej tętnicy mózgowej. Prawo wspólna tętnica szyjna (CCA) zostaje trwale zamknięta poprzez zawiązanie nici jedwabnej (5/0) wokół naczynia krwionośnego (po lewej stronie obrazu). Lewa CCA (po prawej stronie) jest zamknięta przez 1 hr za pomocą zacisku mikronaczyniowego. Operacje te przeprowadzono z zachowaniem ostrożności, aby nie naruszyć nerwu błędnego po każdej stronie (biały). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Zaszyj nacięcie w obszarze skroniowym podczas 1 h zamknięcia lewej tętnicy szyjnej wspólnej.
- Podaj szczurom 20 ml soli fizjologicznej podskórnie (5 ml w dwa miejsca na każdym boku), aby utrzymać nawodnienie (patrz 6.2).
- Po upływie 60 min usuń klips. Nałóż sól fizjologiczną miejscowo na otaczające mięśnie i zamknij nacięcie na szyi, stosując podskórny szew ciągły z użyciem nici wchłanialnych (4/0).
3. Opieka pooperacyjna
- Umieść szczura w inkubatorze o temperaturze 31 °C, aby mógł dojść do siebie po znieczuleniu przez maksymalnie 4 hr.
Uwaga: Badacze mogą preferować inne temperatury i czasy trwania, zgodnie z lokalną praktyką. - Powtórz podanie leku Carprieve (0,25 mg/kg) w celu uśmierzenia bólu po 24 hr. Ponieważ wszystkie zwierzęta otrzymują tę samą dawkę leku Carprieve, czynnik ten jest kontrolowany systematycznie. Jakikolwiek efekt neuroprotekcyjny leku Carprieve jest prawdopodobnie pomijalny.
- Wykonywaj codzienne iniekcje soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu, przez co najmniej pierwsze trzy dni. Zakładając, że szczur wymaga 65 mL płynów na kg masy ciała (na każde 24 hr), należy zapewnić, aby każdy szczur o masie 300 g otrzymywał ~22 ml płynów na dobę.
4. Potwierdzenie zawału
- Do pomiaru objętości zawału należy wykorzystać strukturalne MRI.
Uwaga: Alternatywną metodą może być barwienie histologiczne, np. chlorkiem tetrazoliu (TTC), co zostało wcześniej skorelowane z danymi strukturalnego MRI18. Metoda ta może być jednak zastosowana jedynie w punkcie końcowym badania, a nie w badaniu podłużnym.- Dwadzieścia cztery godziny po indukcji MCAO znieczulić szczury izofluranem (5% do indukcji, 1-1,5% do podtrzymania) w przepływie 0,9 L/min powietrza medycznego i 1 L/min O2, unieruchomić w kwadratowej cewce rezonansu magnetycznego typu birdcage (średnica 43 mm) i umieścić w skanerze z poziomym otworem o natężeniu pola 7 Tesla.
- Wykonać skany ważone T2 przy użyciu sekwencji fast-spin echo: czas echa (TE) 60 msec, czas repetycji (TR) 4 000 msec, pole widzenia (FOV) 40 x 40 mm, macierz akwizycji 128 x 128, pozyskując 40 przekrojów o grubości 0,5 mm w około 8 min. Następnie przekształcić 40 przekrojów w 20 przekrojów o grubości 1 mm, korzystając z funkcji resamplingu w oprogramowaniu do obrazowania medycznego.
- Wyznaczyć objętość zmian w programie do wyświetlania obrazów medycznych poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego zawału w 20 wolumenach. Objętość całkowitą obliczyć, mnożąc sumę tych pól przez grubość (1 mm). Obliczyć średnią objętość dla grupy oraz odchylenie standardowe. W celu obliczenia procentowej objętości zmian należy również wyznaczyć objętości półkuli ipsilesionalnej i kontralesionalnej.
- Aby skorygować obrzęk mózgu spowodowany edemą, należy dostosować te wartości zgodnie z formułami Gerrietsa18. Aby uniknąć nadmiernej korekty, która może prowadzić do uzyskania ujemnych objętości zmian, należy uwzględnić tylko te przekroje, które zawierają korę i nie zawierają móżdżku ani opolich cebulek, zgodnie ze standardowym atlasem szczura19.
- Ponownie wykonać obrazy ważone T2 po 8 tygodniach od zabiegu udarowego.
5. Obliczanie wielkości próby dla przyszłych badań oceniających neuroprotekcję i powrót funkcji behawioralnych
- Przeprowadź obliczenia wielkości próby, aby oszacować minimalną liczbę próbek wymaganą w przyszłych hipotetycznych eksperymentach neuroprotekcyjnych z wykorzystaniem dwóch grup (kontrolnej vs. badawczej), w celu zidentyfikowania efektów terapeutycznych o trzech różnych amplitudach (redukcja o 25%, redukcja o 50%, redukcja o 75%), stosując algorytmy a priori zaimplementowane w oprogramowaniu do analizy mocy20.
Uwaga: Aby umożliwić czytelnikom wykonanie podobnych obliczeń na własnych danych, zamieszczono zrzuty ekranu z bezpłatnie dostępnego oprogramowania do analizy mocy (patrz Representative Results). Użyj następujących parametrów: dopuszczalny poziom błędów fałszywie dodatnich (t.j., próg błędu typu I; α) ≤0.05 oraz moc (równa 1-β) ≥0.80 (t.j., moc większa niż 80%). Wyjaśnienia i dyskusja znajdują się poniżej21.
6. Dobrostan starszych zwierząt po operacji udaru
- Zapewnij dodatkową miękką karmę i żelowe pakiety nawadniające, do których szczury były przyzwyczajone przed operacją, a także butelki z wodą z przedłużonymi końcówkami dla łatwiejszego dostępu. Ponadto w klatkach w ciągu pierwszych 24 hr należy zastosować wchłaniające podkłady pooperacyjne zamiast luźnej ściółki (np. unikaj trocin) oraz zapewnić dodatkową ściółkę do budowy gniazda. Nie stosuj pokarmów papkowatych (np. jedzenia dla niemowląt), ponieważ szczury z dysfagią mogą się nimi zadławić.
- Waż zwierzęta codziennie przez 7 dni w celu monitorowania rekonwalescencji. Utrata masy ciała jest głównym wskaźnikiem odwodnienia i stresu. Spadek wagi w pierwszych kilku dniach po operacji odzwierciedla przede wszystkim odwodnienie (a nie utratę masy ciała z powodu ograniczonego żywienia).
- W przypadku gdy u starzejącego się szczura wystąpi utrata masy ciała niezwiązana z operacją, uzupełnij ubytek masy ciała równoważną ilością płynów i sprawdź górne oraz dolne zęby. W przypadku przerostu zębów, znieczul szczura izofluranem (zgodnie z sekcją 2.1) i ułóż go w pozycji na plecach
- Umieść tulejkę strzykawki o pojemności 1 ml za zębami, aby chronić tkanki miękkie. Przetnij zęby za pomocą ręcznej piły tarczowej (np. o średnicy około 3 cm) przy wysokiej prędkości obrotowej, ale powolnymi i pewnymi ruchami ręki (np. cięcia trwające 3 s). Pozostaw zęby szczura do schłodzenia pomiędzy cięciami. Upewnij się, że piła tarczowa jest zamontowana na trzpieniu w taki sposób, aby zęby piły były skierowane w stronę obrotu. Warto mieć przygotowane indywidualnie zapakowane, sterylizowane piły tarczowe na takie ewentualności.
Uwaga: Przerost może wystąpić u starszych szczurów nawet przy stosowaniu twardej diety w formie peletu. Zaleca się regularne sprawdzanie stanu zębów u starszych szczurów.
- Umieść tulejkę strzykawki o pojemności 1 ml za zębami, aby chronić tkanki miękkie. Przetnij zęby za pomocą ręcznej piły tarczowej (np. o średnicy około 3 cm) przy wysokiej prędkości obrotowej, ale powolnymi i pewnymi ruchami ręki (np. cięcia trwające 3 s). Pozostaw zęby szczura do schłodzenia pomiędzy cięciami. Upewnij się, że piła tarczowa jest zamontowana na trzpieniu w taki sposób, aby zęby piły były skierowane w stronę obrotu. Warto mieć przygotowane indywidualnie zapakowane, sterylizowane piły tarczowe na takie ewentualności.
- W przypadku gdy u starszego szczura wystąpi utrata masy ciała oraz piloerekcja niezwiązana z operacją, omów opcje leczenia z lekarzem weterynarii. Rozważ humanitarne uśmiercenie zwierzęcia. Obrazowanie MRI takich zwierząt może wykazać guz przysadki mózgowej (często u starszych samic szczurów), który jest nieoperacyjny i śmiertelny.
Wyniki
Trwałe MCAO indukowano poprzez wykonanie kraniotomii, a następnie koagulację i destrukcję tętnicy środkowej mózgu za pomocą diatermii, w połączeniu z trwałym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej po stronie uszkodzenia oraz 60-minutowym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej po stronie przeciwległej. Schemat rozmieszczenia aparatury i zamkniętej MCA przedstawiono na Rysunku 1, a schemat tętnic szyjnych na Rysunku 2 (powyżej).
Wyniki udaru oceniano 24 godziny i 8 tygodni po udarze, mierząc objętość zawału na 40 przekrojach o grubości 0,5 mm (od końca rostralnego opłaty węchowej do końca rostralnego rdzenia kręgowego) przy użyciu narzędzia Region of Interest w pakiecie do wyświetlania obrazów medycznych. Reprezentatywny strukturalny skan MRI ważony T2 dla tego samego zwierzęcia przedstawiono dla 24 godzin i 8 tygodni (Rycina 3A). Objętość zawału zidentyfikowano na podstawie obszarów mózgu szczura wykazujących sygnał hiperintensywny, ponieważ obrazy ważone T2 przedstawiają wodę lub plazmę jako jasne, białe obszary. Wiadomo, że po udarze następuje zwiększenie obrzęku i pęcznienia mózgu, co można zmierzyć na skanie ważonym T2, który korelowano z histologicznymi pomiarami objętości zawału18. Jednak obrzęk występujący wcześnie po udarze (np. w 24. godzinie) może prowadzić do przeszacowania końcowej objętości uszkodzenia (np. w 8. tygodniu), dlatego przedstawiamy również średnie objętości zawału skorygowane według formuł Gerrietsa. Rycina 3B przedstawia średnie dane dla surowej (nieskorygowanej) objętości uszkodzenia w 24. godzinie jako 62,8 mm3 (± 25,4 mm3 SD, górny wykres); stanowi to 9,8% objętej procesem półkuli (± 4,2% SD, środkowy wykres). Po korekcie o obrzęk mózgu za pomocą formuł Gerrietsa wartość ta zmniejsza się do 4,5% (± 2,0% SD, dolny wykres).
Ciężkość udaru mierzono również za pomocą testu schodów Montoyi15. W skrócie, zwierzęta były trenowane w pobieraniu granulek cukru przez 4 tygodnie przed operacją MCAO, a następnie badano je przez 8 tygodni po udarze (Rysunek 4), aby potwierdzić trwały deficyt. Szczury umieszczano w aparacie ze schodami na 10 min, a liczbę pobranych granulek zapisywano (z 21 granulek) i przedstawiano jako procent (średnie grup ± błędy standardowe). Przeprowadzono analizę regresji w celu dopasowania linii do danych.
Rysunek 5 przedstawia obliczenia wielkości próby z wykorzystaniem danych o objętości zawału (dla potencjalnych efektów terapii eksperymentalnych), przeanalizowane za pomocą algorytmu w oprogramowaniu do analizy mocy dla testu t, stosując opcję „Różnica między dwiema niezależnymi średnimi (dwie grupy)” oraz wykorzystując (niepoprawione) średnie i odchylenia standardowe z Rysunku 3B. Informacje na Rysunku 5 oraz w Tabeli 1 wskazują, że do wykrycia terapii redukującej objętość zawału o 50% w 24. godzinie wymagane byłoby 12 szczurów na grupę, natomiast Rysunek 6 przedstawia „wykres X-Y” osiągniętej mocy przy zastosowaniu różnej liczby zwierząt. Tabela 1 podsumowuje obliczenia wielkości próby dla wszystkich punktów czasowych.
Rysunek 3. Strukturalne MRI T2-zależne służy do pomiaru wielkości zawału oraz obrzęku mózgu po udarze. (A) T2-zależny obraz rezonansu magnetycznego tego samego mózgu szczura 24 h i 8 tygodni po wywołaniu udaru. Biały obszar reprezentuje zmianę, ale zawiera również obrzęk naczyniowy, który ustępuje do 8. tygodnia. (B) Objętości zawałów mierzono przy użyciu pakietu wyświetlania obrazów medycznych Region of Interest Toolkit; przedstawiono je na wykresie obrazującym średnią ± SD dla 3 zastosowanych punktów czasowych (n = 6). Przedstawiono tutaj surową objętość zmiany (niepoprawioną o obrzęk mózgu wynikający z obrzęku), procentowy udział zmiany w objętej półkuli (niepoprawiony o obrzęk) oraz procentowy udział zmiany w półkuli po korekcie o obrzęk mózgu z zastosowaniem wzorów Gerrietsa. Zastosowano SD zamiast SEM w celu przeprowadzenia obliczeń wielkości próby (patrz Rysunek 5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4. Test schodkowy wykazuje zaburzenia w chwytaniu i pobieraniu granulek. W tym modelu udaru odnotowano bardzo niewielką spontaniczną regenerację. Udar u starszych szczurów trwale upośledza sprawność manualną, co wykazano w cotygodniowych testach sięgania po granulki za pomocą „testu schodkowego”. Wstawka: Zdjęcie szczura wykonującego test behawioralny. Wykres przedstawia średnią liczbę (± błąd standardowy) pobranych granulek (z 21, wyrażoną jako procent) tygodniowo przez dotkniętą łapę przednią. n = 5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 5. Obliczenia wielkości próby w celu określenia liczby szczurów w grupach niezbędnej do wykrycia pożądanego efektu terapeutycznego. Ten zrzut ekranu z oprogramowania do analizy mocy pokazuje, że wymagane byłoby 12 szczurów na grupę, aby wykryć terapię redukującą objętość zawału o 50% w 24 hr. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6. Moc uzyskana przy zastosowaniu różnych całkowitych liczb zwierząt. „Wykres X-Y dla zakresu wartości” z oprogramowania do analizy mocy przedstawia moc, jaka zostałaby uzyskana w eksperymentach z wykorzystaniem różnych (całkowitych) liczb starszych szczurów, przy parametrach przedstawionych na Rycynie 5. Tabela 1 podsumowuje wszystkie nasze wyniki. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| Czas po udarze: | Liczba szczurów w grupie wymagana do wykrycia redukcji objętości zmiany o: | ||
| 75% | 50% | 25% | |
| 24 h | 6 | 12 | 42 |
| 8 tygodni | 4 | 5 | 17 |
Tabela 1. Obliczenia wielkości próby na grupę dla hipotetycznych przyszłych eksperymentów. Obliczone przy użyciu oprogramowania do analizy mocy (Patrz Rysunki 5 i 6). Tabela przedstawia liczbę szczurów na grupę wymaganą dla eksperymentu dwugrupowego w celu wykrycia redukcji objętości zmiany o 25%, 50% i 75% w każdym z punktów czasowych w niniejszym badaniu.
Dyskusja
MCAO u gryzoni jest techniką często stosowaną do modelowania ludzkiego udaru. Ten model ma kilka szczegółów, na które należy zwrócić uwagę w protokole. Po pierwsze, konieczne jest utrzymanie temperatury ciała zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ wpływa to na wielkość zawału i liczbę zgonów w badaniu. Możliwe jest odstawienie izofluranu podczas przejściowej niedrożności prawego CCA i trzymanie szczurów w ciepłym, cichym środowisku w celu zwiększenia przeżywalności poprzez zmniejszenie ekspozycji na izofluran. Naukowcy powinni rozważyć, czy krótszy okres znieczulenia przeważa nad stresem związanym z dodatkową indukcją. Unaczynienie (np. rozgałęzienie MCA) szczurów różni się w obrębie i między kohortami zwierząt22. Ważne jest, aby mieć to na uwadze rozpoczynając nowe badanie. Można ocenić różne czasy okluzji CCA (np. 30, 45, 60 i 90 min). W tym badaniu zastosowano czas okluzji wynoszący 60 minut. W innych badaniach odkryliśmy, że 45-minutowe okluzje powodują zawał korowy o podobnej wielkości, ale z anegdotycznymi dowodami na poprawę wskaźników przeżycia. W związku z tym niech chirurdzy zaczną od krótkiego czasu okluzji (np. 30 minut), aby sprawdzić, czy uzyskano odpowiednią objętość zmiany (i/lub wymagane deficyty behawioralne), a następnie w razie potrzeby wydłużyć czas zgryzu. Deficyty behawioralne nie utrzymują się u dorosłych szczurów w porównaniu ze starszymi szczurami o identycznym czasie zgryzu.
Rezonans magnetyczny można wykorzystać do oceny, czy (po określonym czasie okluzji) objętości zmian są odpowiednie dla celów badania. Mała zmiana obejmowałaby mniej niż dziesięć 0,5 mm wycinków koronalnych (z 40). Średniej wielkości zmiana obejmowałaby od dziesięciu do dwudziestu wycinków koronalnych. Duża zmiana obejmowałaby od dwudziestu do trzydziestu wycinków koronalnych. Bardzo duża zmiana obejmowałaby ponad trzydzieści z czterdziestu plasterków. Z naszego doświadczenia wynika, że szczury z bardzo dużymi zmianami (ponad trzydzieści plastrów) i/lub dowodami przepukliny w linii środkowej zwykle mają złe rokowanie: można rozważyć krótsze czasy okluzji. MRI jest również przydatny do oceny lokalizacji zawału: niektóre są bardziej zlokalizowane doogonowo, a niektóre są bardziej rostralne.
Zachowaj szczególną ostrożność podczas oddzielania nerwu błędnego od obu wspólnych tętnic szyjnych. Rales (zgrzytanie) może wystąpić po operacji udaru mózgu i może to być spowodowane uszkodzeniem nerwów u niektórych zwierząt, chociaż przyczyna jest obecnie niejasna: z naszego doświadczenia wynika, że rokowanie dla tych zwierząt jest bardzo złe i zwykle zaleca się ich humanitarne zabijanie.
Model MCAO trwałej diatermii skutkuje powtarzalnymi zawałami kory mózgowej i akceptowalnymi wskaźnikami przeżycia pooperacyjnego u szczurów w podeszłym wieku. Technika ta wymaga jednak inwazyjnej operacji pod mikroskopem stereoskopowym. Ważne jest, aby zachować technikę aseptyczną, jeśli zwierzęta mają dobrze wrócić do zdrowia po operacji. Należy uważać, aby nie uszkodzić MCA podczas odsłaniania i koagulacji tętnicy, a uszkodzenie powierzchni kory powinno być zminimalizowane, w przeciwnym razie odsłonięty obszar kory może stanowić część obszaru zawału. Zaleca się zdobycie jak największego doświadczenia w celu ustalenia procedury i uzyskania spójnych zawałów oraz określenia czasów okluzji przed przeprowadzeniem badania w celu przetestowania potencjalnych terapii, na przykład. Tam, gdzie to możliwe, eksperymentatorzy powinni randomizować wszelkie zabiegi w ramach sesji chirurgicznych ("randomizacja blokowa"). Warto zauważyć, że model ten nie obejmuje reperfuzji MCA (chyba że zamiast diatermii stosuje się przejściową ligację MCA). Śmiertelność może być wysoka u starszych szczurów z tymi dużymi zawałami kory mózgowej, ale powinno być możliwe zmniejszenie śmiertelności poprzez zastosowanie krótszych czasów okluzji i zminimalizowanie ekspozycji na znieczulenie ogólne tam, gdzie to możliwe (np. podczas okluzji). Stosowanie 70%N2Oi 30%O2 jako nośnika może pozwolić na stosowanie niższych poziomów izofluranu: to zmniejszone narażenie na izofluran może skutkować wyższymi wskaźnikami przeżycia.
Inną kwestią do rozważenia jest to, że miażdżyca jest procesem stopniowym, podczas gdy w tym protokole symulujemy ją z ostrą okluzją CCA. Jednak znaczne zmniejszenie przepływu krwi i utrzymujące się deficyty symulują okluzje tandemowe, które występują u wielu pacjentów po udarze. Stała dystalna MCAO bez tandemowej okluzji CCA u szczurów nie wywołuje udarów w sposób powtarzalny14: ponadto bez jednoczesnej okluzji CCA stwierdziliśmy, że następuje znaczna spontaniczna regeneracja, która wyklucza długoterminową ocenę behawioralną terapii udaru przez 8 tygodni. W przeciwieństwie do tego, pokazujemy, że dystalne MCAO z tandemową okluzją CCA indukuje długotrwałe deficyty u starszych szczurów.
Podsumowując, procedura ta u szczurów powoduje udary, które są podobne pod względem wielkości i lokalizacji do tych obserwowanych u człowieka, z trwałą niepełnosprawnością, którą można wykorzystać, aby umożliwić testowanie nowych metod leczenia i wyjaśnienie mechanizmów naprawczych po udarze niedokrwiennym.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Prof. I Mhairi Macrae i dr Debbie Dewar z Uniwersytetu w Glasgow, którzy uprzejmie gościli CW i DD za szkolenie w tej procedurze. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP/2007-2013) / Umowy o grant ERBN nr 309731 dla LM. Praca ta została również wsparta przez "Serendipity Grant" od The Dunhill Medical Trust dla LM [numer grantu: SA21/0512].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Karprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | dać 0,25 mg/kg |
| Siarczan atropiny | AmTech | RXATRINJ-100 | |
| Waciki nasączone alkoholem | UHS | 20021 | |
| Krem z lidokainą (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Nałóż kroplę wielkości ziarnka grochu na ogoloną szyję i okolice skroniowe |
| Homeotermiczny system | Harvard Instruments | 507222F | |
| Kleszcze | Narzędzia do precyzyjnej nauki | 11019-12 | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Nici jedwabne | Aparat Harvard 723288 | ||
| System kauteryzacji | Eschmann | ||
| 0,25 mm Kleszczyki do kauteryzacji jubilerskiej | Eschmann | 8330349 | |
| drobne kleszcze Dumont | Narzędzia do nauki | 11251-10 | |
| System kroplowy | |||
| System aspiratora Vacusafe | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
| 1,6 mm gruboziarnisty diament powlekany Frezy stalowe | K801 104 016 | ||
| Ręczna wiertarka dentystyczna | NSK | NSKVMAXVRE (rękojeść NSKEX6B) | |
| Vannas Nożyczki sprężynowe | Narzędzia | do nauki15000-03 | |
| Nożyczki mikronaczyniowe | World Precision Instruments | 501790 | |
| 4-0 Nici Vicryl | Ethicon | ||
| Klips naczyniowy i aplikator | |||
| Mikroskop operacyjny | Zeiss | ||
| Kompaktowy system anestezjologiczny Izofluran K/F Pojedynczy gaz | Rozwiązania | ||
| VetTechOstrza skalpela ze stali węglowej nr 10 | Igły Swann-Morton | 201 | |
| 25 g | Terumo | NN-2525R | |
| (1 ml i 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Sól fizjologiczna (chlorek sodu 0,9%) | Patyczki kosmetyczne Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterylizować przed użyciem | |
| gazę | sterylizować przed użyciem | ||
| Pakiet obrazowania medycznego (Jim) | Xinapse | Darmowe oprogramowanie | |
| Oprogramowanie do statystycznego mapowania parametrycznego (SPM8) | UCL | Darmowe oprogramowanie | |
| Oprogramowanie do analizy mocy (G*Power) | Universitä t Dü sseldorf | Darmowe oprogramowanie |
Bibliografia
- Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
- Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331(2010).
- Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
- Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
- Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).
- Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
- Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
- Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
- Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
- Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).
- Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
- Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
- Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
- Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
- Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
- Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
- Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
- Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
- Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
Przedruki i uprawnienia
