Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.
Artykuł metodologiczny
Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tkanka błony śluzowej jelita grubego stanowi istotną barierę dla antygenów świetlnych. Bariera ta składa się z monowarstwy prostych komórek nabłonka walcowatego. Nabłonek jelita grubego jest dynamicznie przewracany, a komórki nabłonkowe są generowane w komórce macierzystej zawierającej krypty Lieberkühna. Komórki progenitorowe wytwarzane w podstawach krypt migrują w kierunku powierzchni światła, przechodząc proces różnicowania komórkowego przed zrzuceniem do światła jelita. Aby zbadać te procesy na poziomie molekularnym, opracowaliśmy prostą metodę mikrodysekcji dwóch przestrzennie odrębnych regionów błony śluzowej okrężnicy; proliferacyjna strefa krypty i zróżnicowane powierzchniowe komórki nabłonkowe. Naszym celem jest wyizolowanie specyficznych populacji komórek nabłonka krypty i powierzchni z błony śluzowej okrężnicy myszy w celu wyizolowania RNA i białka.
Wprowadzenie
Wyściółka nabłonka okrężnicy jest wysoce regenerującą tkanką, z rezydującymi komórkami macierzystymi uzupełniającymi tkankę co kilka dni1. Ten proces regeneracji wymaga utrzymania kompartmentu proliferacyjnych komórek macierzystych. Z biegiem czasu nowo wytworzone komórki potomne tracą swój potencjał proliferacyjny i migrują w kierunku powierzchni światła jelita. Równolegle z migracją komórki progenitorowe różnicują się w dojrzałe enterocyty tworzące barierę lub komórki kubkowe wytwarzające śluz. Uważa się, że niepowodzenie tego programu różnicowania przyczynia się do naruszenia bariery nabłonkowej, co obserwuje się w nieswoistych zapaleniach jelit i raku jelita grubego2,3.
Szczegółowe badanie powyższych procesów będzie wymagało metodologii izolowania populacji komórek bazowych i powierzchniowych. Istnieje wiele metod, z których każda ma unikalne zalety i wady. Obecne metody izolacji komórek nabłonka jelitowego obejmują czynniki chelatujące i dysocjację mechaniczną, w wyniku czego dochodzi do izolacji całych krypt, arkuszy nabłonka lub pojedynczych komórek, w zależności od warunków doświadczalnych4,5. Są to metody o wysokiej wydajności, jednak w tych warunkach odnotowano zmiany w sygnalizacji międzykomórkowej, które mogą nie reprezentować rodzimego środowiska6,7. Mikrodysekcja wychwytu laserowego pozwala na zbieranie przestrzennego odrębnego materiału, ale osiąga niską wydajność cząsteczkową8,9. W tkance jelita grubego człowieka opracowano metody szeregowej kriosekcji poziomej10. Jednak mysie tkanki błony śluzowej są zbyt małe, aby można je było bezpośrednio przywłaszczyć sobie tą techniką. U ludzi długość krypty jelitowej (odległość między podstawą krypty a komórkami powierzchniowymi) w okrężnicy waha się między ~100–1,000 μm 11. U myszy długości krypt wynoszą od ~50 do 300 μm (patrz rysunek 1A). Niewielki rozmiar mysich krypt stanowi wyzwanie dla izolacji tych dwóch populacji komórek przy użyciu istniejących protokołów.
Teraz opisujemy tanią, wysokowydajną metodę izolacji populacji komórek nabłonka podstawy krypty i powierzchni w tkance okrężnicy myszy. Tkanka pobrana w ten sposób może być następnie analizowana za pomocą wielu standardowych zastosowań końcowych, w tym barwienia immunofluorescencyjnego, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) lub western blotting.
Protokół
W eksperymentach wykorzystano myszy C57BL/6 w wieku od 10 do 12 tygodni. Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Emory University Institutional Animal Care and Use Committee i zostały przeprowadzone zgodnie z kryteriami National Institutes of Health.
1. Konfiguracja eksperymentalna
- Konfiguracja kriostatu
- Wyrównać temperaturę kriostatu do -20 °C, łącznie z ostrzem mikrotomu i uchwytami (należy zachować szczególną ostrożność wokół ostrza!).
- Napełnij pustą kriomoldę związkiem OCT (Optimal Temperature Temperature) i zrównoważ do -20 °C (~30 min). Wyjmij zamrożony OCT z formy i przymocuj go do uchwytu za pomocą płynnego OCT. Umieść blok/uchwyt w ramieniu mikrotomu i pozwól OCT zastygnąć przez 10 minut.
- Ustaw kriostat na 10 μm na sekcję i ogol blok OCT, aż będzie płaski. Cofnij ramię mikrotomu od ostrza o kilka centymetrów. W tym momencie nie reguluj ostrza ani uchwytu do końca eksperymentu.
- Przygotuj żyletki: Przygotuj 2 żyletki na próbkę. Za pomocą metalowego pilnika stępić ostrą krawędź ostrzy. Następnie zdejmij aluminiowy kołnierz za pomocą kleszczy.
- Wstępnie schłodzić naczynie z Pyrexu lub inną płaską powierzchnię na suchym lodzie.
- Przygotuj naczynie preparacyjne z 10-15 szpilkami do rozwarstwienia. Wystarczy 10 cm naczynie do hodowli tkankowej wypełnione w 50% silikonem. Dodać 5 ml buforu Hanksa w temperaturze pokojowej.
2. Rozwarstwienie tkanki dystalnej okrężnicy
- Umieść myszy w szczelnej komorze i poddaj je eutanazji przez wdychanie izofluranu i zwichnięcie szyjki macicy, a następnie spryskaj 70% etanolem brzuch i klatkę piersiową12.
- Wykonaj małe nacięcie w skórze brzucha nożyczkami, a następnie wykonaj nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewnej. Podobne procedury można znaleźć opisane tutaj12.
- Przetnij jelito grube na brzegu odbytu i rozsuń krezkę, aż okrężnica będzie wolna.
- Wytnij dystalny odcinek okrężnicy w odległości od 0 do 6 cm od odbytu. Tutaj głębokość krypty wynosi ~150 μm (patrz rysunek 1B). Rozetnij okrężnicę wzdłuż nożyczkami i usuń zawartość kału.
- Przypnij tkankę do naczynia preparacyjnego powierzchnią błony śluzowej skierowaną do góry. Rozciągnij tkankę za pomocą szpilek preparacyjnych na silikonowym naczyniu w buforze Hanksa i odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej (ryc. 1C). To usuwa fałdy z tkanki i pozwala warstwom mięśni się rozluźnić.
3. Zamontuj tkankę na kriostacie w celu przekroju
- Wsuń żyletkę pod żądaną część tkanki, a następnie wylej bufor Hanksa. Dodaj kolejną żyletkę na wierzch, robiąc kanapkę. Wytnij segment tkanki i usuń szpilki. Przenieś żyletkę/kanapkę z chusteczką do suchego lodu. Pozwól tkance zamarznąć (5-10 minut, ryc. 1D).
- Podnieś kanapkę z maszynką do golenia/chusteczką i pozwól jej lekko się rozgrzać, kładąc palec na górnym ostrzu (śluzówką do góry. To ustawia tkankę tak, że warstwy mięśni podstawnych są najpierw cięte.). Oddziel kanapkę i przetnij wokół krawędzi segmentu tkanki. Wytnij segment tkanki w przybliżeniu 0,5 cm x 1 cm. Obszary krawędzi mają tendencję do zwijania się, co powoduje, że odcinki szeregowe zawierają wiele warstw tkanki. Pamiętaj, że nadmierne cięcie jest lepsze niż podcinanie, więc zachowaj ostrożność.
- Pozwól chusteczce się rozgrzać, aż lód na wierzchu tkanki zacznie się topić. W tym momencie szybko i ostrożnie wciśnij tkankę w blok OCT w kriostacie.
- Wyjmij ostrze, kładąc palec na próbce. Wymiana ciepła pozwoli ci wyjąć ostrze bez naruszania tkanki.
- Pokryj tkankę OCT i zrównoważ przez 5 minut. Wytnij skrawki na 10 μm (Rysunek 1E, F). Przyjrzyj się wizualnie sekcjom, aż zobaczysz krypty. Umieść skrawki w probówkach o pojemności 1,5 ml lub na szkiełkach.
- W celu analizy mRNA lub białka umieść próbki w probówkach z 5 sekcjami kryptozasadowymi, 5 przejściowymi i 5 sekcjami powierzchniowymi na probówkę. Do zbierania RNA dodać 1 ml komercyjnego odczynnika izolacyjnego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonaj oczyszczanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 5-10 μg całkowitego RNA do wytworzenia cDNA.
- W celu oczyszczenia białek dodać 0,5 ml zimnego buforu do lizy RIPA (plus inhibitory proteazy) na 5 sekcji. Sonikować 3 razy w cyklu 70%, na lodzie.
- Dodać próbki do bufora ładującego SDS PAGE (bufor Laemmli) i inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Poddać próbki SDS PAGE i przenieść, a następnie zablokować w 5% mleka/PBS przez 2 godziny. Przeprowadzić analizę western blot, a następnie inkubować z przeciwciałami KLF4 (1:500) O/N w temperaturze 4 °C.
Wyniki
Przekroje tkanki jelita grubego poddano obróbce w celu oceny histologicznej i barwienia H&E13. Tradycyjny widok przekroju poprzecznego błony śluzowej przedstawiono na Rysunku 2A. Obszary podstawowe zawierają warstwę mięśniową zewnętrzną, składającą się głównie z warstwy mięśni okrężnych. Przesuwając się w stronę światła jelita, widoczna jest warstwa mięśniowa błony śluzowej sąsiadująca z komórkami nabłonkowymi podstawy krypt, komórki przejściowe znajdują się w środkowej części tkanki, a na końcu populacje komórek powierzchniowych przylegają do światła jelita. Opisana tutaj metoda seryjnego cięcia zachowuje orientację w taki sposób, że najpierw napotyka się warstwę mięśniową podłużną i okrężną (Rysunek 2B), a następnie warstwę mięśniową błony śluzowej (Rysunek 2C). Należy zwrócić uwagę na obecność nie mięśniowych komórek śródmiąższowych w lewym górnym rogu obrazu. W przypadku dalszej analizy opisanej poniżej, przekroje mięśniowe są odrzucane. Kolejne przekroje zawierają komórki nabłonkowe i tkankę śródmiąższową (blaszka własna), zaczynając od komórek podstawy krypt (Rysunek 2D). Należy zauważyć brak centralnego światła w większości krypt, które wydają się ciemniejsze ze względu na gęsto upakowane jądra. Warstwy te zawierają przedział proliferacyjny. Komórki przejściowe występują w postaci gęsto upakowanych gruczołów z wyraźnymi światłami centralnymi (Rysunek 2E). Na koniec, populacje komórek powierzchniowych mają nieregularną strukturę, z obszarami jednowarstwowego nabłonka widocznymi en face (Rysunek 2F).
Przekroje seryjne opisane powyżej mogą być również przetwarzane w celu znakowania immunofluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej (opisanej tutaj14). Rysunek 2G przedstawia wyizolowane krypty utrwalone i permeabilizowane w 100% metanolu, a następnie barwione na jądra komórkowe (niebieski) oraz białko połączeń międzykomórkowych Zonula Occludens 1 (ZO-1, zielony). W tradycyjnej orientacji przekroju można jednocześnie obserwować kryptę i komórkę powierzchniową (Rysunek 2G). Należy zauważyć, że barwienie połączeń ZO-1 wyściela światło krypty jelita grubego. To wyścielenie światła przez ZO-1 jest widoczne również w próbkach z przekrojów seryjnych populacji komórek przejściowych, w centrum kolistych gruczołów (Rysunek 2G). Wzmocnione barwienie ZO-1 obserwuje się w populacjach komórek powierzchniowych (Rysunek 2I oraz J).
Wiadomo, że kilka czynników różnicowania jest eksprymowanych w sposób spatiotemporalny wzdłuż osi krypta–powierzchnia. Należy do nich czynnik transkrypcyjny Kruppel-like factor 4 (KLF4), który wykazuje wzbogacenie w populacjach komórek powierzchniowych. Przy zastosowaniu tradycyjnych metod cięcia preparatów, KLF4 stwierdzono w jądrach populacji komórek powierzchniowych skierowanych w stronę światła (Ryc. 2K). Przypuszczaliśmy zatem, że mRNA KLF4 będzie eksprymowane głównie w populacjach komórek powierzchniowych. Aby to sprawdzić, pobrano seryjne skrawki i podzielono je na próbki z powierzchni, strefy przejściowej oraz podstawy krypt. Następnie RNA wyizolowano przy użyciu standardowej ekstrakcji Trizol, z dodatkowym oczyszczaniem kolumną RNeasy i traktowaniem DNAzą. RNA pobrano z 5 połączonych kolejnych skrawków, co dało od 5-10 µg całkowitego RNA na próbkę. Próbki te poddano następnie półilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla KLF4 oraz genu referencyjnego, białka TATA box binding protein 1 (TBP-1) (Ryc. 2L)14. Jak pokazano na Ryc. 2L, po normalizacji względem TBP-1 stwierdzono, że komórki powierzchniowe wykazują do 8-krotnie wyższą ekspresję mRNA KLF4 niż komórki krypt. Podobnie poziomy białka KLF4 wykazywały regulację przestrzenną wzdłuż osi krypta–powierzchnia. Seryjne skrawki połączono w opisany wyżej sposób, a następnie inkubowano w buforze lizującym przez 20 min w 4 °C. Uzyskano w ten sposób od 200-250 µg białka na próbkę. Próbki poddano następnie analizie metodą SDS-PAGE (Ryc. 2M)15. Jak pokazano na Ryc. 2M, poziomy białka KLF4 są znacznie wyższe w populacjach komórek powierzchniowych. Powyższe wyniki demonstrują zdolność niniejszego protokołu do izolowania dużych ilości komórek nabłonkowych powierzchniowych i krypt z błony śluzowej jelita grubego myszy.
Rycina 1: (A) Schemat przedstawiający błonę śluzową okrężnicy myszy oraz zewnętrzne warstwy mięśniowe. Nasza metoda ma na celu wyizolowanie oddzielnych populacji komórek powierzchniowych i komórek podstawy krypt poprzez seryjne mrożenie i krojenie (każdy przekrój 10 μm). Zewnętrzne warstwy mięśniowe są odrzucane. (B) Wysokość krypt zmienia się wzdłuż okrężnicy (odległość między podstawą krypty a warstwami powierzchniowymi). Punkty danych wskazują pomiary poszczególnych krypt, a symbole oznaczają powtórzenia biologiczne (n = 4). (C) Zebrane segmenty okrężnicy, przekrojone wzdłuż i przypięte do silikonowej szalki do sekcji. (D) Segment tkanki oddalony o około 3 cm od odbytu jest dociskany między dwiema żyletkami i mrożony na suchym lodzie. (E) Tkanka jest następnie montowana na upoziomowanym bloku OCT. (F) Przekroje mrożone są pobierane i poddawane inspekcji wizualnej.
Rysunek 2: Reprezentatywne dane. (A) Tkanka okrężnicy barwiona hematoksyliną i eozyną w przekroju poprzecznym, ukazująca okrągłą warstwę mięśniową (c.m.), błonę mięśniową śluzówki (m.m.), komórki podstawy krypty, komórki przejściowe oraz komórki powierzchniowe. (B-C) warstwy mięśniowe okrężnicy. (D) Komórki podstawy krypty. Zwrócić uwagę na brak centralnego światła. (E) Komórki przejściowe. (F) Komórki powierzchniowe. (G) Barwienie immunofluorescencyjne izolowanych krypt okrężnicy. ZO-1 (zielony) i jądra (niebieskie) obserwowane w przekroju poprzecznym. (H-I) Barwienie ZO-1 i jąder w komórkach przejściowych i powierzchniowych. (J) powiększony widok barwienia ZO-1. (K) KLF4 (zielony) jest wzbogacony w populacjach komórek powierzchniowych. (L) Ocena poziomu mRNA KLF4 w trzech przedziałach za pomocą RT-PCR. (M) Analiza poziomu białka KLF4 w tych populacjach komórek metodą Western blot.
Dyskusja
Mechanizmy molekularne biorące udział w proliferacji i różnicowaniu komórek nabłonka okrężnicy są słabo poznane. Obejmuje to luki w naszej wiedzy na temat środowiska sygnalizacji komórkowej przedziału komórek macierzystych u podstawy krypt nabłonka okrężnicy. Rośnie również zainteresowanie procesami leżącymi u podstaw różnicowania enterocytów. Na przykład pogłębienie wiedzy na temat różnicowania in vivo jest wymagane jako punkt odniesienia dla badań mających na celu wytworzenie pierwotnych układów jelitowych in vitro16.
Powyższa procedura składa się z kilku kroków, które wymagają dodatkowej uwagi. Po pierwsze, wymagane jest usunięcie krawędzi wokół zamrożonego segmentu tkanki (jak omówiono w sekcji 3.2), ponieważ krawędzie tkanki zwijają się podczas sekcji i zamrażania. Niepowodzenie w przesunięciu tych krawędzi powoduje mieszaną populację komórek bazowych powierzchni i krypty. Niezbędne jest również zamontowanie chusteczki na wstępnie schłodzonym, wypoziomowanym bloku OCT. Protokół ten można dostosować do innych obszarów dystalnej części okrężnicy, zmieniając liczbę sekcji w każdej puli. Na przykład, jak pokazano na rysunku 1B, długość krypty błony śluzowej waha się między 150-300 μm. Dlatego badając obszar między 4 cm-6 cm od odbytu, liczbę sekcji należy zwiększyć z 15 do 30. Co ważne, protokół ten nie jest zalecany dla bliższej części jelita grubego (7 cm-9 cm) ze względu na fałdy (plicae obliquae), które rozciągają się do światła, uniemożliwiając oddzielenie komórek powierzchniowych i kryptobazowych przez szeregowe cięcie.
Techniki cięcia seryjnego zostały wykorzystane do badania populacji komórek nabłonka podstawy krypty i powierzchni u ludzi. Jednak nasz protokół dodaje dodatkowe kroki, które są wymagane ze względu na mały rozmiar tkanki mysiej. Proponujemy, aby powyższy protokół pozwolił na badanie populacji komórek nabłonka podstawy krypty i powierzchni w genetycznie podatnych systemach mysich. Rzeczywiście, połączone sekcje dają wysokiej jakości białko i RNA, odpowiednią analizę dalszą. Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie komórkowych szlaków sygnałowych lub immunoprecypitacji chromatyny. Należy jednak zauważyć, że podobnie jak kilka alternatywnych metod opisanych powyżej, powstałe skrawki zawierają mieszaninę komórek nabłonka i śródmiąższowej blaszki właściwej. Podsumowując, opisany tutaj protokół zapewnia szybką, wysokowydajną metodę analizy procesów molekularnych w przestrzennie odrębnych regionach błony śluzowej mysiej okrężnicy.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
Wspierane przez National Institutes of Health (DK55679, oraz DK59888 do A.N.). Zintegrowany rdzeń mikroskopii obrazowania komórkowego Uniwersytetu Emory w ramach kompleksowego grantu centrum onkologicznego Winship Cancer Institute, P30CA138292, oraz nagroda Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development dla CTC i nagroda stypendialna dla A.E.F.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikrotom | Leica Biosystems, Nussloch Niemcy | CM 1510-3 | |
| MyiQ detektor PCR w czasie rzeczywistym | BioRad | ||
| LSM 510 | Mikroskop konfokalny | Carl Zeiss | |
| OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
| cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
| Wysokoprofilowe ostrze mikrotomu | Leica Biosystems, Nussloch niemcy | 818 | |
| GEM ostrza przemysłowe | Amerykańskie maszynki do golenia | 62-0314 | |
| Sylgard silikonowa baza elastomerowa | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
| igła 27 1/2 g | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | szpilki do preparacji |
| TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Rneasy | Qiagen | 74104 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | |
| Przeciwciało ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
| Przeciwciało KLF4 | Sygnalizacja komórkowa | Przeciwciało 4038S | |
| mGAPDH | Sigma | G8795 | |
| Przeciwciało Wtórne koniugat Alexa | Invitrogen | A11034 | 488 przeciwciało anty-królicze |
| Wtórny koniugat HRP | Jackson | 111/115-001-003 | królik / mysz |
| Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| HANKs Zrównoważony bufor soli | Life Technologies | 14025092 | |
| Bufor | RIPA 50mM Tris-HCl pH 7,4 150mM NaCl 1% NP40 0,25% Podkład Na-deoksycholanowy | ||
| TBP | |||
| podkład TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT | |||
| KLF4 | 3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
| podkład KLF4 |
Bibliografia
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).
- Humphries, A., Wright, N. A. Colonic crypt organization and tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).
- Weber, C. R., Turner, J. R. Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall. Gut. 56, 6-8 (2007).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors. Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).
- Lechner, S., et al. Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut. 52, 1148-1153 (2003).
- Reizel, Y., et al. Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction. PLoS Genet. 7, e1002192(2011).
- Kosinski, C., et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).
- Tamura, S., et al. Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm. J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine. Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
- Neumann, P. A., et al. Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon. Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).
- Capaldo, C. T., et al. Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins. Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).
- Wells, J. M., Spence, J. R. How to make an intestine. Development. 141, 752-760 (2014).
Przedruki i uprawnienia
