Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Streszczenie

Dorosłe wyższe kręgowce mają ograniczony potencjał do powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego. Niedawno pojawiły się dowody na to, że połączenia propriordzeniowe są obiecującym celem interwencji w celu poprawy regeneracji funkcjonalnej. Do tej pory nie istnieje model in vitro, który dawałby możliwość zbadania funkcjonalnej odbudowy włókien propriordzeniowych. W związku z tym opracowano reprezentatywny model, który opiera się na dwóch organotypowych odcinkach rdzenia kręgowego zarodka szczura, hodowanych obok siebie na matrycach wieloelektrodowych (MEA). Plastry te rosną i w ciągu kilku dni in vitro łączą się wzdłuż boków zwróconych do siebie. Konstrukcja zastosowanych MEA pozwala na wykonanie zmian chorobowych za pomocą ostrza skalpela przez to miejsce fuzji bez powodowania uszkodzeń MEA. Wycinki pokazują spontaniczną aktywność, zwykle zorganizowaną w wybuchy aktywności sieciowej, a parametry aktywności przestrzennej i czasowej, takie jak lokalizacja początków impulsów, prędkość i kierunek ich propagacji oraz opóźnienia między impulsami, mogą być scharakteryzowane. Korzystając z tych cech, możliwa jest również ocena funkcjonalnego połączenia warstw poprzez obliczenie ilości zsynchronizowanych serii między dwiema stronami. Ponadto wycinki mogą być analizowane morfologicznie, wykonując barwienia immunohistochemiczne po nagraniach.

W tym modelu łączy się kilka zalet zastosowanych technik: wycinki w dużej mierze zachowują oryginalną architekturę tkanki z nienaruszonymi lokalnymi obwodami synaptycznymi, tkanka jest łatwo i wielokrotnie dostępna, a aktywność neuronalna może być wykrywana jednocześnie i nieinwazyjnie w dużej liczbie miejsc w wysokiej rozdzielczości czasowej. Cechy te pozwalają w wyrafinowany i skuteczny sposób badać funkcjonalną regenerację połączeń wewnątrzrdzeniowych w izolacji in vitro.

Wprowadzenie

Organotypowe kultury warstwowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) były szeroko wykorzystywane do badania różnych zjawisk fizjologicznych i patologicznych, począwszy od rozwoju neuronów, a skończywszy na neurodegeneracji. W porównaniu z zdysocjowanymi kulturami komórkowymi, plastry organotypowe mają tę zaletę, że są bardziej złożone z nienaruszoną cytoarchitekturą i lokalnymi obwodami synaptycznymi. Jednocześnie tkanka może być analizowana w sposób wyizolowany, bez konieczności implikowania zawiłości całości w kontekście in vivo. Ponadto gwarantowany jest łatwy i wielokrotny dostęp do wybranych komórek, środowisko zewnątrzkomórkowe może być precyzyjnie kontrolowane, a modele in vitro są zazwyczaj tańsze niż ich odpowiedniki in vivo. W ostatnich latach różne badania wykazały uderzające podobieństwa między profilami rozwojowymi kultur długoterminowych w porównaniu z odpowiadającymi im żywymi zwierzętami ^1,2. Wykazano, że obwody neuronalne różnych regionów OUN wyrażają spontaniczną aktywność sieci podczas rozwoju, a warstwy organotypowe częściowo podtrzymują to zjawisko ^3–7. Izolowane preparaty rdzenia kręgowego są szczególnie wykorzystywane do badania generowania ^rytmu6 i tworzenia obwodów neuronalnych ¹.

Sposobem na zarejestrowanie spontanicznej aktywności wycinków organotypowych jest hodowla ich na matrycach wieloelektrodowych (MEA). Urządzenia te zawierają wiele elektrod, które mogą monitorować potencjały zewnątrzkomórkowe generowane przez potencjały czynnościowe z wielu komórek jednocześnie (zapis wielojednostkowy). Wysoka rozdzielczość czasowa zapisów MEA może być wykorzystana do rekonstrukcji precyzyjnej dynamiki aktywności w danym obwodzie neuronalnym. Dodatkowo, w przeciwieństwie do zaciskania plastrów, technika ta jest nieinwazyjna, co pozwala na długoterminowe pomiary i skutkuje tym, że neurony nie są zaburzone w swoim zachowaniu.

Na potrzeby tego badania, kombinacja organotypowych kokultur rdzenia kręgowego i wielomiejscowych zapisów została wykorzystana do zbadania funkcjonalnej regeneracji w obrębie rdzenia kręgowego. Ponieważ dorosłe kręgowce mają ograniczony potencjał powrotu do zdrowia po uszkodzeniu rdzenia kręgowego, badano różne strategie wspierania regeneracji po urazie rdzenia kręgowego. Do tej pory układ korowo-rdzeniowy był zwykle układem modelowym z wyboru dla takich badań. Eksperymenty te są zazwyczaj czasochłonne, kosztowne i wymagają dużych kohort zwierząt ze względu na dużą zmienność w obrębie pojedynczych grup. Co więcej, dowody sugerują, że połączenia propriordzeniowe (neurony, które są całkowicie zamknięte w rdzeniu kręgowym) mogą odgrywać kluczową rolę w procesie powrotu do zdrowia po uszkodzeniach rdzenia kręgowego ⁸. Włókna te są trudne do zbadania in vivo bez ingerencji wstępujących i opadających odcinków włókien. Bonnici i Kapfhammer ⁹ wykorzystali podłużne hodowle warstw rdzenia kręgowego myszy po urodzeniu jako alternatywne podejście. Po wykonaniu zmian mechanicznych przeanalizowali półilościowo regenerację morfologiczną aksonów między segmentami rdzenia kręgowego. Zaobserwowali mniej, ale nie żadną liczbę aksonów przecinających miejsce zmiany w kulturach wyciętych w dojrzałym wieku. Natomiast posiewy, które zostały uszkodzone w młodszym stadium, wykazywały wysoki stopień regeneracji aksonów 5-7 dni po uszkodzeniu. Nie przedstawiono jednak dowodu na funkcjonalne powiązania.

Dlatego opracowanie reprezentatywnego modelu in vitro włókien propriordzeniowych, który pozwala na badanie funkcjonalnej regeneracji, może być cennym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy na temat procesów regeneracyjnych w rdzeniu kręgowym.

Protokół

Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi zatwierdzonymi przez szwajcarskie władze lokalne (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, zatwierdzenie nr 52/11 i 35/14). Niniejsze wytyczne są zgodne z Dyrektywą Wspólnoty Europejskiej 2010/63/UE.

Uwaga: Pracuj w okapie z przepływem laminarnym ze sterylnymi narzędziami i roztworami dla wszystkich kroków 1 - 5, w tym podkroków.

1. Przygotowanie MEA

Uwaga: MEA składają się ze szklanego podłoża, mikro-prefabrykowanych metalowych elektrod i warstwy izolacyjnej z polimeru SU-8 (zobacz także Tscherter et al. ³). Na potrzeby tego badania zamówiono dostępne na rynku MEA z niestandardowym układem matrycy elektrod (Rysunek 1 A&B). 68 elektrod jest ułożonych w prostokątną siatkę, która jest podzielona na dwie strefy za pomocą rowka o szerokości 300 μm, wolnego od elektrod, przewodów elektrycznych i izolacji. Każda elektroda ma wymiary 40 x 40 μm i są one oddalone od siebie o 200 μm od środka do środka. Cztery duże elektrody uziemiające są umieszczone wokół miejsca rejestracji. Różnią się one od innych dostępnych na rynku standardowych MEA rozmiarem (21 mm x 21 mm) i nie posiadają stałej komory zapisu.

1. W celu dezynfekcji płukać MEA w 100% etanolu (2x), 70% etanolu (1x) i wodzie destylowanej (2x) przez co najmniej 30 sekund każdy. Pozostaw do wyschnięcia. Umieść 10 - 12 MEA na czystej szklanej szalce Petriego (150 mm x 25 mm) i zamknij pokrywkę.
2. Autoklaw MEA przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Przechowywać w temperaturze RT.
3. Przygotować roztwór powlekający (patrz wykaz materiałów) dla MEA i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
4. Umieść każdy MEA na indywidualnej sterylnej szalce Petriego (35 mm x 10 mm).
5. Za pomocą schłodzonej pipety nałożyć 150 μl schłodzonego roztworu powlekającego na elektrody i zamknąć pokrywę szalki Petriego. Po około 10 minutach sprawdź, czy na elektrodach nie ma pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby delikatnie usuń je gumową szpatułką. Odstaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Odessać pozostałości roztworu powlekającego, przemyć 1x pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych oraz 2x destylowaną, sterylną wodą. Jeśli MEA nie zostaną użyte do następnego dnia, należy je przechowywać w destylowanej, sterylnej wodzie o temperaturze 37 °C w inkubatorze O/N. W przeciwnym razie pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

2. Składniki niezbędne do przygotowania i wzrostu kultur organotypowych

1. Przygotować bezwapniowy roztwór myjący (patrz lista materiałów).
2. Rozpuść osocze kurczaka w roztworze do przemywania (1:1, delikatnie wstrząsnąć, unikać tworzenia się pęcherzyków), odwirować przy 3 000 x g przez około 20 minut i zdekantować klarowną zawartość do sterylnej probówki. Podać 200 μl do krioprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Rozpuść odpowiednio trombinę z osocza bydlęcego (200 j./ml) i sterylnego filtra (filtr porowy 0,2 μm). Podwielokrotność 200 μl do krioprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Na 30 kultur przygotuj 100 ml pożywki (patrz lista materiałów).

3. Wycięcie tkanki rdzenia kręgowego

Uwaga: Procedura daje, w zależności od liczby zarodków, plastry rdzenia kręgowego dla około 25 - 35 kokultur i jest przygotowywana w kapturze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

1. Nałożyć śmiertelną dawkę pentobarbitalu (0,4 ml) na matkę zwierzęcia we wstrzyknięciu domięśniowym. Potwierdź głębokie znieczulenie, sprawdzając odruch wycofania pedału. Dostarczyć zarodki szczurów E14 przez cesarskie cięcie i złożyć w ofierze przez ścięcie.
2. Przenieś ciała zarodków na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia.
3. Wykonaj jedno pełne cięcie poprzeczne skalpelem nad kończynami tylnymi, a drugie nad kończynami przednimi i usuń kończyny z ciała. Następnie wykonaj nacięcie w płaszczyźnie czołowej, aby oddzielić wnętrzności od tylnej części zawierającej rdzeń kręgowy.
4. W celu pokrojenia należy przenieść tylne części zawierające rdzeń kręgowy pojedynczo na dysk montażowy i przyciąć na grubość 225 - 250 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek. Nałóż kroplę roztworu myjącego na posiekaną tkankę i przenieś plastry szpatułką na szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm wypełnione sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia.
5. Dla każdego plastra osobno wypreparuj rdzeń kręgowy z pozostałej tkanki. Pozostaw przyczepione zwoje korzenia grzbietowego.
6. Odstaw plastry na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.

4. Montaż wycinków tkanki rdzenia kręgowego na MEA

1. Podgrzać sterylną pożywkę w inkubatorze (37 °C, lekko odkręcona pokrywka do natlenienia).
2. Umieść MEA za pomocą sterylnej pęsety z gumowymi końcówkami w punkcie RT na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym z ustawioną ostrością na matrycy elektrod. Wyśrodkuj kroplę 6 μl osocza kurzego na czystym, wolnym od kurzu i sterylnym układzie elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń dwa odcinki rdzenia kręgowego z brzusznymi bokami skierowanymi do siebie do kropli osocza. Nie dotykaj elektrod szpatułką.
3. Dodać 8 μl trombiny wokół kropelki osocza kurczaka. Używając końcówki pipety trombinowej, ostrożnie wymieszaj i rozprowadź mieszaninę osocza kurczaka/trombiny wokół dwóch plasterków. Również w tym przypadku nie należy dotykać bezpośrednio kruchego układu elektrod. Tuż przed krzepnięciem odessać nadmiar osocza kurczaka/trombiny.
4. Zakryj szalkę Petriego, aby utrzymać wysoką wilgotność, podczas gdy zespół MEA/kultura siedzi przez około 1 godzinę w wilgotnej komorze wewnątrz inkubatora w temperaturze 37 °C.
5. Ostrożnie dodać 10 μl pożywki do komory hodowlanej, zakryć szalkę Petriego i włożyć z powrotem do inkubatora na około 30 minut.
6. Umieść każdy zestaw MEA/hodowli ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami w rurce rolkowej, dodaj 3 ml pożywki i szczelnie zamknij pokrywkę. Umieścić rurkę rolkową w bębnie rolkowym obracającym się z prędkością 1-2 obr./min w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
7. Zmienić połowę pożywki po 7 dniach in vitro (DIV), a następnie 1-2 razy w tygodniu.

5. Uszkodzenia mechaniczne

1. Wyjmij zestaw MEA/kultura ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami z rurki rolkowej i umieść na szalce Petriego bez pożywki pod mikroskopem stereoskopowym z tkanką w ostrości. Sprawdź wzrokowo, czy dwa plasterki są połączone.
2. Trzymaj zespół MEA/kultura stabilnie, umieszczając pęsetę z gumowymi końcówkami na MEA.
3. Umieść ostrze skalpela w rowku MEA w pobliżu plastrów tkanki. Trzymaj skalpel raczej poziomo.
4. Podnieś rękojeść skalpela do góry, ale pozwól ostrzu skalpela pozostać w rowku MEA w taki sposób, aby ostrze "toczyło się" od podstawy do czubka, a tym samym przecinało tkankę pokrywającą rowek.
5. W razie potrzeby należy utwardzić wszelkie resztki połączeń tkankowych za pomocą końcówki igły 25 G. Pracuj tylko w obszarze w rowku i nie dotykaj delikatnych krawędzi.
6. Włóż zestaw MEA/kulturę z powrotem do rury rolkowej. Dostarczyć 3 ml świeżej pożywki do kultur i umieścić je z powrotem w bębnie rolkowym w inkubatorze.

6. Elektrofizjologiczne zapisy spontanicznej aktywności

1. Aby zbadać funkcjonalną regenerację między dwoma wycinkami rdzenia kręgowego po wybranej liczbie DIV, zamontuj zespół MEA/hodowla w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i nałóż około 500 μl roztworu zewnątrzkomórkowego (patrz lista materiałów).
2. Odczekaj 10 minut przed pierwszym nagraniem, aby system się ustabilizował.
3. Rejestruj podstawową spontaniczną aktywność 2x przez około 10 minut z każdej elektrody wykrywającej aktywność MEA w RT.
4. Aby zapewnić stabilne warunki zewnątrzkomórkowe, wymieniaj się roztworem zewnątrzkomórkowym po każdej sesji nagraniowej.
5. Aby odhamować sieć, należy zastosować roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający strychninę (1 μM) i gabazynę (10 μM). Odczekaj co najmniej 2 minuty przed rozpoczęciem nagrywania.

7. Analiza danych

Uwaga: Do wykrywania pozakomórkowych zarejestrowanych potencjałów czynnościowych użyj dla każdej elektrody detektora opartego na odchyleniach standardowych i późniejszym dyskryminatorze. Procedura ta została szczegółowo opisana w Tscherter i wsp. ^{Rozdział 3}.

1. Wyświetlanie wykrytej aktywności neuronalnej każdej elektrody na wykresie rastrowym zgodnie ze standardowymi procedurami ³ (rysunek 1F).
2. Określ i wyświetl całkowitą aktywność sieciową dla każdego wycinka, sumując liczbę zdarzeń w odpowiednich kanałach w przesuwanym oknie o 10 ms, przesuniętym o krok co 1 ms (rysunek 1G i patrz Tscherter i in. ³).
3. Wykryj w każdym wycinku pojedyncze impulsy (skupiska aktywności, które pojawiają się na kilku elektrodach). W związku z tym należy ustawić minimalny próg szczytowej aktywności w odpowiedniej całkowitej aktywności sieci i zdefiniować każdy początek i koniec serii. Na przykład, odpowiednim progiem jest 25% średniej amplitudy impulsu, a początek serii może być zdefiniowany jako pierwsze zdarzenie w oknie czasowym wynoszącym co najmniej 5 ms, a koniec serii jako ostatnie zdarzenie w oknie czasowym wynoszącym co najmniej 25 ms (patrz Heidemann i wsp. ^{Rozdział 10}).
4. Aby określić ilościowo regenerację funkcjonalną, oblicz procent zsynchronizowanych serii między dwoma wycinkami. Aby to zrobić, oblicz opóźnienie między serią w jednym wycinku a następną serią w drugim wycinku.
   Uwaga: Para serii jest określana jako "zsynchronizowana", gdy opóźnienie jest mniejsze niż średnia długość serii. Szczególnie w kokulturach o dużej aktywności istnieje możliwość, że obie strony przypadkowo zainicjują impuls w wybranym oknie opóźnienia. Fakt ten musi być brany pod uwagę przy określaniu procentu zsynchronizowanych impulsów. Szczegółowy opis obliczeń znajduje się w Heidemann et al. ^{Rozdział 10}.

8. Utrwalenie kultur i immunohistochemia

1. W przypadku wszystkich etapów, które obejmują mycie lub inkubację, należy umieścić kultury na uchylnym stole, aby zapewnić prawidłową dyfuzję roztworu przez tkankę.
2. Bezpośrednio po zakończeniu sesji nagraniowej wyjmij zestaw MEA/kultura z zestawu, umieść go na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) i dodaj około 2 ml roztworu zewnątrzkomórkowego.
3. Aby oddzielić plastry od otaczających warstw komórek, które utworzyły się podczas in vitro, weź końcówkę pipety o pojemności 10 μl i zakreśl plasterki. Uważaj, aby nie uszkodzić kultur. Możliwe jest pominięcie tego kroku, ale późniejsze osadzanie jest łatwiejsze, gdy jest wykonywane.
4. Użyj cienkiej niemetalowej igły strzykawkowej (patrz lista materiałów) w połączeniu ze strzykawką o pojemności 1 ml wypełnioną roztworem zewnątrzkomórkowym, aby delikatnie zdmuchnąć kulturę z MEA.
5. Zdejmij końcówkę pipety Pasteura i umieść gumową gruszkę na odciętym końcu. Użyj tylnego końca, aby przenieść kulturę do utrwalacza (4% paraformaldehydu z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 0,1 M)). Nie należy używać standardowej końcówki pipety Pasteura do przenoszenia, ponieważ jest ona zbyt mała, a kultury zostałyby złożone i prawdopodobnie uszkodzone. Utrwalaj przez 1 - 2 godziny w temperaturze 4 °C. Spłucz MEA wodą destylowaną i usuń pozostałości tkanek opuszkami palców, ale nie drap paznokciem. Przechowywać MEA w wodzie destylowanej o temperaturze 4°C.
6. Myj kultury 3x w PBS przez co najmniej 10 minut każda. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C lub bezpośrednio rozpocząć procedurę barwienia.
7. Inkubować kultury przez co najmniej 90 minut w roztworze blokującym (5% surowicy koziej, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,3% detergentu w PBS).
8. Dodać pierwsze przeciwciało rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować przez 3 noce w temperaturze 4 °C.
9. Prać 3x w PBS przez co najmniej 30 min każdy.
10. Dodać drugie przeciwciało rozcieńczone w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
11. Prać 3x w PBS przez co najmniej 30 min każdy.
12. Przenieś plastry pipetą Pasteura z usuniętą końcówką na szkiełko podstawowe. Usuń nadmiar PBS i osadź go za pomocą nośnika montażowego.

Wyniki

Aby zbadać potencjał do regeneracji funkcjonalnej kokultur pochodzących z rdzenia kręgowego embrionów szczura w stadium E14, wykonano uszkodzenia w przedziale czasowym od 8 do 28 DIV. Po 2 do 3 tygodniach zarejestrowano spontaniczną aktywność neuronalną za pomocą MEA (Rycina 1 C&D). Potencjały czynnościowe rejestrowane z przestrzeni zewnątrzkomórkowej zidentyfikowano w analizie offline dla każdej pojedynczej elektrody (Rycina 1E). Na podstawie tych danych wygenerowano wykresy rasterowe (Rycina 1F), a następnie wykresy aktywności sieci, aby zwizualizować całkowitą aktywność oddzielnie dla każdej strony (Rycina 1G). W każdym przekroju aktywność spontaniczna jest zazwyczaj zorganizowana w postaci serii impulsów (burstów). Jeśli przekroje są połączone funkcjonalnie, serie te mogą propagować z jednego przekroju do drugiego. Dlatego obliczono liczbę zsynchronizowanych serii impulsów między dwoma przekrojami, aby ilościowo zmierzyć regenerację funkcjonalną. Szczegółowy opis sposobu przekształcania danych w poszczególne wykresy oraz sposób wyprowadzenia wzoru do obliczania procentu aktywności zsynchronizowanej znajduje się w pracy Heidemann et al. ¹⁰.

We wszystkich eksperymentach aktywność rejestrowano najpierw w warunkach standardowych. W drugim kroku hamowanie synaptyczne blokowano poprzez dodanie strychniny (1 µM) i gabazyny (10 µM) do pozakomórkowego roztworu kąpieli. Taka dysinhibicja prowadzi zazwyczaj do bardziej regularnego wzorca aktywności z wydłużonymi serie impulsów oraz odstępami między nimi, co ułatwia definiowanie serii, a tym samym określenie synchronizacji serii impulsów pomiędzy plastrami.

Kultury uszkodzone w młodym wieku (7 - 9 DIV) wykazywały wysoką ilość zsynchronizowanej aktywności 2-3 tygodnie po uszkodzeniu, podczas gdy kultury uszkodzone w późniejszych etapach (>19 DIV) wykazywały wyraźny spadek zdolności do regeneracji (Rysunek 2 A - F). Wyniki te wskazują, że zdolność do regeneracji funkcjonalnych połączeń w kulturach warstwowych rdzenia kręgowego spada z poziomu wysokiego, reprezentującego stan embrionalny in vivo, do poziomu niskiego, reprezentującego bardziej rozwinięty stan in vivo, w ciągu trzech tygodni hodowli.

Jakie rodzaje połączeń są w rzeczywistości zaangażowane w synchronizację wybuchową między dwiema warstwami? Poza połączeniami propriospinalnymi, włókna mogą pochodzić również z motoneuronów lub neuronów zwojów korzeni tylnych. Wykazano wcześniej, że neurony zwojów korzeni tylnych nie są istotne dla łączności funkcjonalnej między warstwami rdzenia kręgowego ¹⁰. Jednak zaangażowanie motoneuronów pozostawało możliwością. Ponieważ wiadomo, że motoneurony tworzą połączenia cholinergiczne z neuronami rdzenia kręgowego poprzez receptory nikotynowe ¹³, aktywność kokultur rdzenia kręgowego zarejestrowano w 8 DIV, w czasie, gdy kultury wykazują wysoce zsynchronizowaną aktywność ¹⁰, i dodano do zewnątrzkomórkowego roztworu kąpielowego antagonistę nikotynowy mekamylaminę (MEC, 100 µM). Udział motoneuronów w połączeniu między dwiema warstwami skutkowałby zmniejszeniem odsetka zsynchronizowanej aktywności. Jednak tak nie było (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; kontrola: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p >0,05, test Wilcoxona dla par zależnych). Wyniki te sugerują, że synapsy cholinergiczne nie przyczyniają się do funkcjonalnego połączenia między warstwami. Jednak ponieważ wykazano również, że motoneurony uwalniają glutaminian w synapsach w obrębie OUN ^{11, 15}, doświadczenia te nie wykluczają całkowicie ich udziału.

W celu identyfikacji motoneuronów wykonano barwienia immunohistochemiczne przeciwko nieufosforylowanemu neurofilamentowi H z użyciem przeciwciała SMI-32. Wykazały one obecność kilku oznakowanych dużych ciał komórkowych typowych dla motoneuronów, rozproszonych w obrębie skrawków (Rycyna 3A). Zgłaszano, że przeciwciało SMI-32 znakuje ciała komórkowe motoneuronów ¹², co potwierdziło się również w zastosowanych kulturach ¹³. Ponadto barwienia ciał komórkowych neuronów w ogóle, np. przeciwko β-III-tubulinie lub NeuN, a także ciał komórkowych gleju, np. astrocytów przeciwciałem GFAP, są zgodne z innymi doniesieniami i odpowiadają opisom morfologicznym tych typów komórek (Rycina 3 B - D). Niemniej jednak, znakowanie aksonów przeciwciałem SMI-32 budzi wątpliwości (Rycina 3E). Wbrew oczekiwaniom, po zastosowaniu tego przeciwciała pojawia się rozbudowana sieć włókien, która wygląda podobnie do barwienia SMI-31 znakującego ufosforylowany neurofilament H (Rycina 3F). Jedna z interpretacji tego wyniku sugeruje, że regulacja rozwojowa fosforylacji/defosforylacji neurofilamentów w użytych kulturach nie jest tak ścisła jak w warunkach in vivo. Współwystępowanie neurofilamentów ufosforylowanych i nieufosforylowanych w tym samym aksonie mogłoby wyjaśnić ten wynik. Inną możliwością jest to, że aksony znakowane przez SMI-32 pochodzą z neuronów projekcyjnych. Tsang i współpracownicy ¹⁶ wykazali, że oprócz motoneuronów, SMI-32 barwi np. neurony kolumny Clarka oraz neuronów bocznej kolumny pośredniej. Wyraźna proliferacja neurytów takich neuronów mogłaby również wyjaśnić obfitość włókien pozytywnych pod kątem SMI-32.

Rycina 1. Prezentacja i analiza aktywności spontanicznej. (A) Schemat MEA. Elektrody pokryte platyną przedstawiono na czarno, przezroczyste przewody na czerwono, a rowek w środku MEA na żółto. (B) Zbliżenie macierzy elektrod znajdującej się w centrum MEA. Schematy zostały udostępnione przez dr. M. Heuschkela. (C) Obraz w jasnym polu hodowli w 8 DIV. Przekroje urosły i zlały się wzdłuż sąsiadujących ze sobą boków. Żółty pasek reprezentuje wolną od elektrod i izolacji szczelinę MEA. Pasek skali = 400 µm (D) Harmonogram eksperymentów. Dwa przekroje rdzenia kręgowego embrionów szczura w stadium E14 umieszcza się obok siebie na MEA. W ciągu kilku dni przekroje rosną i zlewają się wzdłuż sąsiadujących boków. W przedziale czasowym od 8 do 28 DIV wykonuje się całkowite uszkodzenia w miejscu zrostu. Dwie do trzech tygodni później rejestruje się aktywność spontaniczną, a hodowle utrwala się do barwień immunohistochemicznych. (E) Ślady aktywności spontanicznej z każdej pojedynczej elektrody w hodowli w 23 DIV. Dla lepszej wizualizacji przedstawiono co drugi ślad. Pomarańczowe ślady obrazują aktywność zarejestrowaną z przekroju po prawej stronie, niebieskie z lewej strony. Większość serii impulsów (bursts) jest zsynchronizowana między obiema stronami. Strzałka wskazuje serię impulsów występującą w lewym przekroju, która jedynie częściowo rozprzestrzeniła się na przekrój prawy. Aktywność w prawym przekroju nie osiągnęła jednak wybranego progu wynoszącego co najmniej 25% uśrednionej maksymalnej aktywności szczytowej dla danej strony, w związku z czym nie została wykryta jako seria impulsów. Powiększenia po prawej stronie przedstawiają ostatnią zsynchronizowaną parę serii impulsów. (F) Wykres rastrowy aktywności pokazanej na (E). (G) Wykres aktywności sieci z zdefiniowanymi seriami impulsów (słupki poniżej linii bazowej) dla aktywności pokazanej na (E). Adaptacja z Heidemann et al. ¹⁰. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Aktywność synchroniczna w porównaniu z niesynchroniczną. (A, B) Wykresy rastrowe kultur poddanych uszkodzeniu w młodym wieku (w 7 - 9 DIV), wykazujące aktywność synchroniczną w warunkach standardowych (A) oraz w warunkach odhamowania (B). (C, D) Wykresy rastrowe kultur poddanych uszkodzeniu w późnym wieku (w >19 DIV), wykazujące aktywność niesynchroniczną w warunkach standardowych (C) oraz w warunkach odhamowania (D). (E, F) Średni procent aktywności synchronicznej wykreślony dla każdego pojedynczego dnia uszkodzenia, zarejestrowany w warunkach standardowych (E) oraz w warunkach odhamowania (F). Pomiary wykonano 2 - 3 tygodnie po dniu uszkodzenia. Adaptacja z Heidemann et al. ¹⁰. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Charakterystyka immunohistochemiczna. (A) Barwienie ciał komórek motoneuronów za pomocą SMI-32. (B) Markowanie ciał dojrzałych neuronów i ich wypustek za pomocą β-III tubuliny. (C) Identyfikacja astrocytów za pomocą GFAP. (D) Markowanie ciała dojrzałego neuronu za pomocą NeuN. (E) Barwienie niefosforylowanego neurofilamentu H za pomocą SMI-32. (F) Fosforylowany neurofilament H zidentyfikowany za pomocą SMI-31. Adaptacja z Heidemann et al. ¹⁰. Należy zauważyć, że zarówno w przypadku SMI-31, jak i SMI-32, w kulturach widoczna jest rozległa sieć włókien. Paski A-D = 20 µm, H&F = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kilka elementów przedstawionej procedury ma zasadnicze znaczenie dla przeprowadzenia dokładnych i powtarzalnych eksperymentów. Wszystkie etapy przygotowania MEA, roztworów i produkcji kultur plastrów są wykonywane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Antybiotyki nie są stosowane do pożywki, ponieważ mogą wpływać na spontaniczną aktywność ¹⁴. Podczas powlekania MEA najważniejszą częścią jest upewnienie się, że roztwór żelu macierzy zewnątrzkomórkowej pozostaje zimny przez cały czas. Rozmrozić go w lodówce i przechowywać na lodzie przez całą procedurę, aby zapewnić maksymalną temperaturę bliską 0 °C. Podczas przygotowania plastrów szybkie izolowanie i krojenie, a także zwracanie uwagi na niską temperaturę poprzez stosowanie lodowatych preparacyjnych zwiększa odsetek zdrowych kultur. Co więcej, krzepnięcie osocza/trombiny jest jednym z najbardziej krytycznych etapów. Najpierw upewnij się, że osocze jest odpowiednio wymieszane z trombiną. Po drugie, należy zwrócić szczególną uwagę na usunięcie jak największej ilości pozostałości, aby zapewnić prawidłowe przyleganie plastrów do MEA. Ten krok jest niezwykle wrażliwy na czas; Jeśli ramy czasowe są zbyt krótkie, usuwa się zbyt dużo mieszaniny osocza i trombiny. Jeśli ramy czasowe są zbyt długie, koagulacja już nastąpiła, co zwiększa ryzyko usunięcia plastrów wraz z resztkowym osoczem/trombiną.

Jeśli planowane są zmiany mechaniczne, ważne jest, aby stosować MEA o dokładnym projekcie. Obszar, w którym ma być zmieniona skóra, musi być wolny od elektrod, przewodów i izolacji. W przeciwnym razie elektryka MEA zostanie uszkodzona i w związku z tym nie będzie można już wykonywać żadnych nagrań.

Kolejnym kluczowym krokiem jest wielkość zmiany. Wykazano wcześniej, że ponowne połączenie dwóch młodych plastrów po zmianie zajmuje około dwóch dni ¹⁰. We wszystkich eksperymentach stosowano zasadę, że przestrzeń między plastrami po zmianie nie powinna być większa niż szerokość rowka MEA (300 μm). Większy rozmiar zmiany może skutkować dłuższym czasem na ponowne połączenie lub, jeśli zmiana jest zbyt duża, brakiem ponownego połączenia. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że początkowe umieszczenie dwóch plasterków w odległości większej niż 1 mm skutkuje bardzo niską szybkością połączenia.

Przed rozpoczęciem zapisów zaleca się co najmniej 10 minut dostosowań do temperatury względnej (RT) zamiast 37 °C w inkubatorze i do roztworu zewnątrzkomórkowego zamiast pożywki. Ścisła obserwacja wzorca aktywności w tych początkowych minutach zapewnia, że zmierzone dane odpowiednio reprezentują wzór pękania kultury po rozpoczęciu rejestrowania.

Do wykrywania aktywności, pozyskiwania danych i dalszego przetwarzania używany jest sprzęt domowej roboty (komora nagrywająca, połączenia ze wzmacniaczami i wzmacniaczami), programy w LabVIEW, C⁺⁺ i IgorPro. Komercyjne konfiguracje MEA i inne pakiety oprogramowania są również odpowiednie do tych operacji. W tym przypadku sygnały widziane przez elektrody są wzmacniane 1001 razy, a następnie digitalizowane z częstotliwością 6 kHz.

Prezentowany model może być pomocnym narzędziem do badania połączeń propriordzeniowych, ponieważ in vivo są one trudne do zbadania bez ingerencji wstępujących i opadających dróg włóknistych. Wspólna hodowla dwóch wycinków rdzenia kręgowego może elegancko obejść ten problem. Kultury zapewniają mikrośrodowisko, które można ściśle kontrolować i łatwo nim manipulować. Z drugiej strony oczywiście brakuje bodźców nadrdzeniowych i sensorycznych. Dodatkowo proces przygotowania kultury reprezentuje sytuację uszkodzenia OUN. Wiadomo, że komórki glejowe, takie jak astrocyty i mikroglej, reagują na zmiany chorobowe zwiększoną proliferacją, a zatem tkanka jest do pewnego stopnia zreorganizowana. W odniesieniu do przedstawionego modelu nie zaobserwowano powstawania blizny glejowej po wykonaniu zmian mechanicznych. Jednym z wyjaśnień może być to, że mechanizmy adaptacyjne astrocytów zostały uruchomione już w trakcie procesu przygotowania, a zmiany w kulturach nie powodowały dalszej odpowiedzi. Nie ma również dowodów na udział inhibitorów związanych z mieliną, np. Nogo-A, w niskim potencjale regeneracyjnym kultur uszkodzonych w starszym wieku. Wykazano jednak, że leczenie inhibitorem fosfodiesterazy 4 Rolipram, rozpoczynające się bezpośrednio po wykonaniu zmian w 23 DIV, zwiększa regenerację funkcjonalną między plastrami ¹⁰. Wyniki te pokazują, że regeneracja funkcjonalna może być zwiększona w starych kulturach. Zauważalnie, że podczas liczenia liczby aksonów przechodzących przez miejsce zmiany nie stwierdzono różnicy między kulturami uszkodzonymi w młodym wieku a kulturami uszkodzonymi w starszym wieku. Wyniki te sugerują, że brak regeneracji aksonów nie jest główną przyczyną utraty regeneracji po późnych zmianach w hodowli, a zatem podkreślają potrzebę stworzenia modelu, który umożliwia funkcjonalną analizę regeneracji. Powstawanie synaps i plastyczność synaptyczna mogą odgrywać ważną rolę w procesie rekonwalescencji ¹⁰. Mechanizmy te zyskały wiele uwagi w ostatnich latach i obecnie powszechnie przyjmuje się, że mają one duży wpływ na wynik po urazie rdzenia kręgowego. Dlatego model, który zapewnia stabilne warunki do badania tych procesów w izolacji i bardzo szczegółowo, może z pewnością pomóc w uzyskaniu wglądu w funkcjonalną regenerację rdzenia kręgowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Planarna matryca wieloelektrodowa	Qwane Biosciences		wykonana na zamówienie według projektu naszego laboratorium
Pożywka			Na 100 ml
Dulbeccos modyfikowana pożywka Eagle's	Gibco	31966-021	80 ml
Serum końskie	Gibco	26050-070	10 ml
destylowana, sterylna woda			10 ml
Czynnik wzrostu nerwów-7S [5 ng/ml]	Sigma-Aldrich	N0513	200 &mikro; l
rozpuszczony w roztworze do płukania z 1% roztworem powlekającym BSA
macierzy
zewnątrzkomórkowej	BD Biosciences	356230	Musi pozostać zimny przez cały czas; rozcieńczyć 1:50 z pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych
pożywka zoptymalizowana dla neuronów prenatalnych i embrionalnych	Gibco	21103-049
Roztwór		do mycia	[mg/L]
MgCl2-6H2O			100
MgSO4-7H2O			100
KCl			400
KH2PO4			60
NaCl			8 000
Na2HPO4 bezwodny			48
D-glukoza (dekstroza)			1,000
Zgodnie z protokołem http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html
Roztwór zewnątrzkomórkowy (pH 7,4)			[mM]
NaCl			145
KCl			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES			5
Na-pirogronian			2
Glukoza			5
Roztwór
Detergent: Triton X-100			0,3%, szkodliwe w przypadku połknięcia
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A9418	1%
Surowica kozia	Gibco	16210-064	5%
Osocze kurczaka	Sigma-Aldrich	P2366	Liofilizowane, rozpuścić w roztworze myjącym
Gabazine	Sigma-Aldrich	SR-95531
Chlorowodorek mekamylaminy	Tocris	2843	działa toksycznie po połknięciu
Micropipette	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
Szkodliwy paraformaldehyd			, 4%
SMI-31	Covance	SMI-31P
SMI-32	Covance	SMI-32R-500
Strychnina	Sigma-Aldrich	S0532	toksyczna
trombina	Merck Millipore	1123740001	drażniące, uczulające, rozpuszcza się w roztworze
myjącymPłaska rurka do hodowli tkankowej 10 (= rura rolkowa)	Techno Plastic Products AG	91243

Żel do blokujący