Ocena mikrozawałów kory mózgowej na obrazach MR o wysokiej rozdzielczości

Podsumowanie

Przedstawiono protokół obrazowania MR 7T o wysokiej rozdzielczości, w celu przeprowadzenia histopatologicznej walidacji mikrokrążenia w pośmiertnej tkance mózgowej ludzkiej pod kontrolą MR. Ponadto przedstawiono wytyczne dotyczące oceny mikrozawałów kory mózgowej na obrazach MR in vivo 7T i 3T.

Streszczenie

Mikrozawały mózgu są częstym zjawiskiem w pośmiertnym ludzkim mózgu i są związane ze spadkiem funkcji poznawczych i demencją. Ze względu na ich niewielkie rozmiary trudno jest je badać na klinicznych skanach MRI. Niedawno wykazano, że mikrozawały kory mózgowej można zobrazować za pomocą skanerów MRI przy użyciu pola magnetycznego o wysokim natężeniu (7T). Na podstawie tego doświadczenia można stwierdzić, że część tych zmian jest również widoczna w rezonansie magnetycznym 3T o niższej rozdzielczości. Wyniki te zostały potwierdzone obrazowaniem ex vivo pośmiertnej tkanki mózgowej człowieka, któremu towarzyszyła histopatologiczna weryfikacja ewentualnych mikrozawałów korowych.

Tutaj przedstawiono protokół obrazowania ex vivo, w celu walidacji zaobserwowanej przez MR patologii mikrokrążenia mózgu z oceną histologiczną. Ponadto przedstawiono wytyczne dotyczące oceny mikrozawałów kory mózgowej zarówno na obrazach MR in vivo 7T, jak i 3T. Wytyczne te dostarczają naukowcom narzędzia do oceny mikrozawałów kory mózgowej na obrazach in vivo większych próbek pacjentów, aby jeszcze bardziej odkryć ich znaczenie kliniczne w pogorszeniu funkcji poznawczych i demencji oraz ustalić te zmiany jako nowy biomarker choroby małych naczyń mózgowych.

Wprowadzenie

Zastosowanie ultra-wysokiego pola 7 Tesla (T) MRI w badaniach z udziałem pacjentów szybko postępuje¹. W artykule przedstawiono reprezentatywne zastosowanie rezonansu magnetycznego 7T w kontekście chorób naczyń mózgowych w starzejącym się mózgu człowieka. Choroba naczyń mózgowych jest główną przyczyną pogorszenia funkcji poznawczych i demencji. Ten naczyniowy wkład w demencję często obejmuje małe naczynia mózgu, takie jak tętniczki, małe żyły i naczynia włosowate. W związku z tym określa się ją mianem choroby małych naczyń mózgowych (SVD)². Ponieważ małe naczynia mózgowe są zbyt małe, aby można je było uchwycić za pomocą konwencjonalnego rezonansu magnetycznego, można uwidocznić tylko konsekwencje SVD - tj. wynikające z tego uszkodzenie tkanki. Obejmuje to nadmierne natężenie istoty białej, mikrokrwawienia mózgowe i zawały lakunarne³.

Inne ważne objawy SVD to mikrozawały mózgu (CMI)⁴. Badania autopsyjne wskazują na wysoką częstość występowania CMI w otępieniu naczyniowym i chorobie Alzheimera⁵. Jednak ze względu na swoje niewielkie rozmiary (od 50 μm do kilku mm) unikają wykrycia w konwencjonalnym rezonansie magnetycznym^4,5. Rezonans magnetyczny 7T zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości z lepszym stosunkiem sygnału do szumu i kontrastem, co umożliwia wykrycie niektórych struktur i zmian chorobowych poza granicą wykrywalności konwencjonalnego rezonansu magnetycznego. Technika ta została zatem zastosowana do wykrywania CMI. Aby zidentyfikować możliwe CMI, wiele skanów MRI in vivo 7T zostało wcześniej przebadanych pod kątem zmian o rozmiarach <5 mm i charakterystyce obrazowania zgodnej z właściwościami niedokrwiennymi. Takie zmiany można było wiarygodnie zidentyfikować w korze mózgowej. Te ogniskowe wydłużone zmiany były hiperintensywne na 7T FLAIR (woksele izotropowe 0,8 mm), ograniczone do kory i wydawały się rozciągać od powierzchni kory, hiperintensywne na T2 (woksele izotropowe 0,7 mm) i hipointensywne na T1 (woksele izotropowe 1,0 mm). Potwierdzono, że zmiany te były korowymi CMI przy użyciu podejścia histopatologicznego pod kontrolą MR w pośmiertnej tkance mózgowej człowieka^6,7.

Tutaj prezentowany jest protokół MRI ex vivo, który był używany w poprzednich badaniach do histopatologicznej walidacji korowych CMI. Po drugie, przedstawiono wytyczne dotyczące oceny korowych CMI w MRI 7T in vivo. Wreszcie, ocena korowych CMI na 7T została przełożona na szerzej dostępny 3T MRI i podano wytyczne dotyczące identyfikacji korowych CMI na 3T MRI.

Protokół

Wykorzystanie próbek z sekcji zwłok oraz obrazów MR in vivo w niniejszym protokole odbyło się zgodnie z lokalnymi przepisami i zostało zatwierdzone przez lokalną komisję bioetyczną University Medical Center Utrecht (UMCU).

1. Histopatologiczna walidacja mikrozawałów korowych z obrazowaniem MR

1. Ex vivo MRI
   1. Podczas pracy z tkanką mózgu należy zawsze nosić rękawice i odpowiednią odzież ochronną.
   2. W zależności od pytania badawczego należy wybrać odpowiednie, najlepiej 10-mm grube, utrwalone w formalinie plastry mózgu. Plastry mózgu wykorzystane w niniejszej pracy pochodziły z oddziału neuropatologii UMCU oraz VU University Medical Centre (VUMC), na podstawie znanej patologii choroby Alzheimera.
      1. Przed pocięciem należy utrwalić całe mózgi w formalinie przez co najmniej 3-4 tygodnie poprzez zanurzenie w 10% formalinie. Mózgi należy pociąć na plastry czołowe obejmujące obie półkule.
      2. Do obrazowania pośmiertnego należy wybrać na przykład trzy plastry mózgu z każdego mózgu, pobrane z regionów czołowego, skroniowo-ciemieniowego i potylicznego. Niniejszy protokół jest zoptymalizowany pod kątem zastosowania trzech czołowych plastrów mózgu, zawierających obie półkule, w jednej sesji skanowania.
   3. Należy wykonać zdjęcia plastrów mózgu z obu stron (grzbietowej i ogonowej) oraz sporządzić dokładne notatki (lub szkice) dotyczące orientacji plastrów w pojemniku i w skanerze, w celu późniejszej ko-lokalizacji histologii z MRI.
   4. Należy wypełnić specjalnie zaprojektowany pojemnik (Rysunek 1) – w tym przypadku taki, który mieści się w cewce głowowej MR – 10% świeżą formaliną w temperaturze pokojowej. Jeśli sygnał MRI z cieczy jest niepożądany, zamiast formaliny należy użyć środka smarnego na bazie perfluoropolieteru (PFPE) o odpowiedniej gęstości (takiego jak Fomblin lub Galden PFPE). Podczas pracy z formaliną należy bezwzględnie korzystać z dygestorium.
   5. Podczas umieszczania plastrów mózgu w pojemniku należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Większość pęcherzyków powietrza należy usunąć poprzez delikatne potrząsanie tkanką, ręcznie, za pomocą wytrząsarki lub kąpieli ultradźwiękowej.
   6. Należy upewnić się, że plastry nie mogą przemieszczać się wewnątrz pojemnika i ograniczyć ilości potrzebnej cieczy, stosując mniejszy pojemnik do utrzymania plastrów na miejscu (Rysunek 1).
   7. Pojemnik należy przykryć folią plastikową lub parafilmem, aby zapobiec parowaniu i chronić cewkę MR (głowową) przed potencjalnym zanieczyszczeniem (Rysunek 2).
   8. Należy użyć skanera MRI 7T do całego ciała z odpowiednią cewką. W tym protokole zastosowano cewkę głowową z podwójnym nadawaniem i 32-kanałowym odbiorem.
   9. Pojemnik należy umieścić w cewce głowowej, owijając go ręcznikiem lub podkładem chirurgicznym, aby zapobiec ewentualnemu rozlaniu cieczy. Należy upewnić się, że pojemnik jest nieruchomy, a plastry pozostają w pozycji poziomej (Rysunek 2).
   10. Należy wykonać skan orientacyjny (survey scan), który posłuży do zaplanowania skanów o wysokiej rozdzielczości, skorygować niejednorodność B0 za pomocą odpowiedniego narzędzia do shimowania i skalibrować moc RF w celu uzyskania prawidłowych kątów odchylenia (flip angles) zgodnie z protokołem producenta (kilka plastrów wymaga mniejszej mocy w porównaniu do obrazowania in vivo całej głowy).
   11. Na podstawie skanu orientacyjnego należy zaplanować akwizycje o wysokiej rozdzielczości, aby upewnić się, że plastry mózgu są w całości zawarte w polu widzenia. Plastry mózgu należy skanować przez noc z zastosowaniem akwizycji o wysokiej rozdzielczości przedstawionych w Tabeli 1, które są zoptymalizowane do obrazowania ex vivo. Przedstawiony tutaj protokół akwizycji obejmuje obrazy 3D FLAIR, T2 i T1 o rozdzielczości izotropowej 0,4 mm oraz obraz T2* o rozdzielczości izotropowej 0,18 mm.
   12. Należy zidentyfikować automatyczne procesy oprogramowania, które mogą przerwać skanowanie, takie jak automatyczne aktualizacje uruchamiane w nocy lub ostrzeżenia o stymulacji nerwów obwodowych, i upewnić się, że procedury skanera nie zostaną przez nie przerwane.
   13. Należy monitorować skaner w nocy pod kątem możliwych wyskakujących okien potwierdzenia, które mogą przerwać skanowanie, korzystając na przykład z połączenia VPN.
   14. Należy wrócić następnego ranka (po całkowitym czasie skanowania wynoszącym około 12 h w obecnym protokole). Plastry mózgu należy przechowywać w formalinie i uporządkować stanowisko.
   15. Obrazy należy zapisać na zewnętrznym dysku twardym.

Rysunek 1. Przygotowanie utrwalonych w formalinie plastrów mózgu do skanowania pośmiertnego w MRI 7T. Specjalnie zaprojektowany pojemnik z pleksiglasu wypełnia się 10% formaliną lub smarem perfluoropolieterowym (PFPE), jeśli sygnał MRI z cieczy jest niepożądany. W pojemniku umieszcza się trzy utrwalone w formalinie plastry mózgu w przekroju wieńcowym o grubości 10 mm. Mniejszy pojemnik służy do stabilizacji plastrów w jednej pozycji. Drugi pojemnik należy przykleić taśmą do pierwszego, aby zapobiec jego przemieszczaniu się.

Rycina 2. Umieszczenie specjalnie wykonanego pojemnika w cewce głowowej 7T. Przykryć pojemnik folią plastikową lub parafilmem, aby zapobiec odparowywaniu formaliny. Umieścić pojemnik, owinięty w ręcznik lub podkład chirurgiczny, w cewce głowowej skanera MR 7T. Upewnić się, że pojemnik jest unieruchomiony, a preparaty pozostają w pozycji poziomej.

2. Histopatologia
   1. Zidentyfikuj możliwe CMI kory — lub inne interesujące zmiany — na uzyskanych obrazach. Zmiany te stanowią cele analizy histologicznej. Zwróć uwagę na artefakty, takie jak pośmiertne uszkodzenia tkanki (które czasami pojawiają się na powierzchni plastrów mózgu w wyniku cięcia) lub artefakty wynikające z długotrwałego przechowywania w formalinie (np. grube hipointensywności w MRI reprezentujące zmiany neuropilu⁸).
      Uwaga: Różne podtypy histopatologiczne CMI kory mają różne charakterystyki w MR. Po więcej szczegółów na temat podtypów CMI odsyła się czytelnika do niedawnego badania ex vivo⁷.
   2. Po zidentyfikowaniu możliwych CMI kory na obrazach MR, pobierz próbkę z obszaru zainteresowania w celu walidacji histopatologicznej. Należy pamiętać o wycięciu obszaru zawierającego punkty orientacyjne anatomiczne, aby umożliwić późniejsze dopasowanie obrazów MRI do histopatologii. Wykonaj standardową procedurę histopatologiczną zgodnie z poniższym opisem (choć mogą mieć zastosowanie również inne podejścia).
   3. Wycięć obszar o wymiarach około 30 x 20 x 5 mm³ zawierający możliwy CMI kory.
   4. Aby uzyskać precyzyjny pobór próbki, oszacuj lokalizację zmiany na podstawie grubości warstw obrazów MR oraz architektury tkanki. Odetnij tkankę ręcznie nieco powyżej szacowanej lokalizacji zmiany, aby ograniczyć liczbę seryjnych cięć (po zatopieniu w parafinie) niezbędnych do dotarcia do zmiany.
   5. Upewnij się, że pobrana tkanka mieści się w kasecie do tkanek. Umieść powierzchnię przeznaczoną do cięcia stroną skierowaną w dół w kasecie.
   6. Przechowuj wszystkie kasety z tkankami w 10% formalinie do czasu przetworzenia tkanki.
   7. Przygotuj tkankę do zatopienia w parafinie. Zazwyczaj obejmuje to zautomatyzowaną procedurę odwadniania tkanki poprzez serię kąpieli w alkoholach o różnym stężeniu (np. 70%, 95% i 100%) oraz klarowanie tkanki w ksylenie.
   8. Zatop tkankę w blokach z wosku parafinowego. Upewnij się, że po zatopieniu powierzchnia przeznaczona do cięcia jest skierowana do góry.
   9. Wykonaj seryjne cięcia o grubości 4-6 µm za pomocą mikrotomu, aż do momentu uzyskania docelowej zmiany.
   10. Wypłucz skrawki na powierzchni kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Zamocuj skrawki na szkiełkach przedmiotowych. Umieść szkiełka na bloku grzewczym, aby związać tkankę ze szkłem. Przechowuj szkiełka przez noc (O/N) w temperaturze pokojowej (RT).
   11. Wykonaj odpowiednie barwienie (np. barwienie H&E) na pierwszych skrawkach, zachowując sąsiednie niebarwione skrawki do dalszego wykorzystania (np. immunohistochemii).
   12. Przykryj skrawki barwione H&E szkiełkami cover-slip, używając kropli wybranego medium montażowego. Delikatnie opuść szkiełko, unikając powstania pęcherzyków powietrza.
   13. Zbadaj skrawki za pomocą mikroskopu świetlnego przy odpowiednim powiększeniu. Porównaj skrawki z wcześniej uzyskanymi obrazami MR.

2. Ocena mikrozawałów korowych w obrazowaniu In Vivo MRI 7T

1. Wykonaj badanie MRI 7T w interesującej Cię populacji pacjentów, stosując protokół MRI in vivo (obejmujący co najmniej sekwencję 3D FLAIR), zgodnie z opisem w⁶.
2. Oceń korowe mikrokrwawienia (CMI) na obrazach MR 7T in vivo zgodnie z poniższymi krokami, stosując następujące kryteria oceny CMI dla 7T: korowe CMI są hiperintensywne w sekwencji FLAIR (z hipointensywnym centrum lub bez), hiperintensywne w T2, hipointensywne w T1, wykrywalne w co najmniej dwóch przekrojach mózgu (np. strzałkowym i poprzecznym), ograniczone do kory, odróżnialne od przestrzeni periwaskularnych, o największym wymiarze ≤4 mm^6,7.
3. Użyj interfejsu z trzema przeglądarkami obrazów, aby jednocześnie przeglądać obrazy FLAIR, T1 i T2, np. MeVisLab (Rycina 3). Platforma ta pozwala na zintegrowanie wielu przeglądarek i umieszczanie znaczników w potencjalnych lokalizacjach zmian.
4. W pierwszej kolejności oceń jedną półkulę w sekwencji FLAIR w przekroju strzałkowym. Przeskanuj całą korę w poszukiwaniu zmian hiperintensywnych. Każda zmiana hiperintensywna ≤4 mm jest potencjalnym CMI. Umieść znaczniki, klikając w każde potencjalne CMI.
5. Powtórz czynność dla drugiej półkuli.
6. Zweryfikuj wszystkie zaznaczone lokalizacje w sekwencjach T1 i T2. Odrzuć lokalizację, jeśli nie jest ona hipointensywna w T1 lub hiperintensywna w T2.
7. Oceń przekrój poprzeczny w sekwencjach FLAIR, T1 i T2. Odrzuć lokalizację, jeśli nie jest ona widoczna. W razie wątpliwości sprawdź przekrój czołowy.
8. Zwróć uwagę na artefakty MRI i warianty anatomiczne (szczególnie krawędzie bruzd).
9. Zapisz znaczniki.

Rycina 3. Przykładowa platforma do przeglądania obrazów w celu oceny mikrozawałów korowych. Wykorzystano interfejs zintegrowany z programem MeVisLab. Program ten umożliwia jednoczesne korzystanie z wielu okien podglądu, łatwe przełączanie się między orientacją strzałkową, poprzeczną i czołową oraz umieszczanie i zapisywanie markerów w potencjalnych miejscach występowania zmian. (Dla różnych typów zmian można wybrać różne markery).

3. Ocena mikrozawałów korowych w badaniu MRI 3T in vivo

1. Pozyskaj obrazy MR 3T z populacji pacjentów, która Cię interesuje. Można również wykorzystać istniejące dane, o ile protokół obrazowania MR zawierał co najmniej sekwencję 3D T1, a także FLAIR i T2.
2. Oceń korowe CMI na obrazach MR 3T in vivo zgodnie ze szczegółami opisanymi w poniższych krokach, stosując następujące kryteria oceny CMI dla 3T: korowe CMI są hipointensywne w T1 (izointensywne z CSF), wykrywalne w co najmniej dwóch rzutach mózgu (np. strzałkowym i poprzecznym), ograniczone do kory, odróżnialne od przestrzeni peryvaskularnych, o największym wymiarze ≤4 mm.
   1. Zbadaj lokalizację hipointensywnej zmiany korowej znalezionej w T1 na obrazach FLAIR i T2. Zakwalifikuj zmianę jako prawdopodobne korowe CMI, jeśli lokalizacja ta jest hiperintensywna lub izointensywna (w stosunku do istoty szarej) w FLAIR i T2. Odrzuć zmianę, jeśli w tym samym miejscu stwierdzono sygnał hipointensywny w T2, co wskazuje, że hipointensywna zmiana w T1 wynika z zmiany krwotocznej, naczynia lub artefaktu. W razie wątpliwości sprawdź lokalizację na obrazie ważonym T2*⁹.
3. Użyj tego samego interfejsu, który opisano powyżej.
4. Najpierw oceń jedną półkulę w T1 w rzucie strzałkowym. Przeskanuj całą korę w poszukiwaniu ogniskowych zmian hipointensywnych. Każda zmiana hipointensywna ≤4 mm jest potencjalnym CMI. Umieść markery, klikając na każde potencjalne CMI.
5. Powtórz czynność dla drugiej półkuli.
6. Oceń T1 w rzucie poprzecznym i jednocześnie zweryfikuj wszystkie zaznaczone lokalizacje na obrazach FLAIR i T2 w rzucie poprzecznym. Uznaj lokalizację za prawdopodobne CMI, jeśli jest ona hiperintensywna lub izointensywna w FLAIR i T2. Odrzuć lokalizację, jeśli wydaje się być artefaktem lub wariantem anatomicznym. Odrzuć lokalizację, jeśli jest ona hipointensywna w T2.
7. Zwróć uwagę na artefakty, które na obrazach ważonych T1 przypominają CMI, zwłaszcza artefakty pierścieniowania na „krawędziach” mózgu, które pojawiają się w kilku sąsiednich zakrętach; uważaj na krawędzie bruzd oraz duże naczynia w płatach skroniowych (przy biegunach). Na koniec zaleca się odrzucenie potencjalnych korowych CMI w tkance znajdującej się w bliskim sąsiedztwie większego zawału kory.
8. Zapisz markery.

Wyniki

Przedstawienie wysokiej rozdzielczości i wysokiej jakości obrazu sekwencji ex vivo uzyskanej przy 7T dostępna jest tutaj (Rysunek 4). Jest to skan ex vivo 3D ważony T2* o izotropowej rozdzielczości 0,18 mm. Tkanka została pobrana od 84-letniej kobiety z otępieniem, u której patologicznie potwierdzono chorobę Alzheimera oraz ciężką amyloidową angiopatię mózgową (CAA). Szczegółowość obrazu pozwala na identyfikację pato...

Dyskusja

W ciągu ostatnich kilku lat CMI cieszą się coraz większym zainteresowaniem. Coraz więcej dowodów pochodzących z badań autopsyjnych zidentyfikowało CMI jako ważne czynniki przyczyniające się do związanego z wiekiem spadku funkcji poznawczych i demencji^4,5. CMI są teraz wykrywalne w rezonansie magnetycznym 7T, a także 3T. Optymalizacja i standaryzacja protokołów oceny tych zmian przyczyni się do szybkiego wdrożenia solidnego i ważnego wykrywania CMI w badaniach kohortowych na całym świecie. Umożliwi to powszechn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fomblin / Galden PFPE	Solvay Solexis, Bollate, Włochy
System 7T MR	Philips Healthcare, Cleveland, OH, USA
32-kanałowa cewka odbiorcza	Nova Medical, Wilmington, MA, USA
MeVisLab MeVis	Medical Solutions AG, Brema, Niemcy