Artykuł metodologiczny

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

19.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53131

⸱

26 listopada 2015

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Sciences, Medical University of South Carolina, 3Intuitive Surgical, Inc

W tym artykule

Podsumowanie

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Streszczenie

Badacze wykorzystali szeroki wachlarz modeli zwierzęcych i technik badawczych do badania układu słuchowego ssaków. Wiele badań podstawowych dotyczących ślimaka i związanych z nim ścieżek neuronowych wiąże się z narażeniem ślimaków modelowych na różne czynniki ototoksyczne. Dzięki temu badacze mogą badać skutki celowego uszkodzenia struktur ślimaka, a w niektórych przypadkach samonaprawy lub regeneracji tych struktur. Istnieją różne techniki dostarczania środków ototoksycznych do ślimaka. Wybierając konkretną technikę, badacze muszą wziąć pod uwagę szereg czynników, w tym indukcję niezamierzonej toksyczności ogólnoustrojowej, stopień uszkodzenia ślimaka spowodowanego samym zabiegiem chirurgicznym, rodzaj pożądanej zmiany, przeżywalność zwierząt oraz odtwarzalność/wiarygodność wyników. Obecnie stosowane techniki obejmują wstrzyknięcie pozajelitowe, wstrzyknięcie dootrzewnowe, wstrzyknięcie przezbębenkowe, wstrzyknięcie do worka endolimfatycznego oraz ślimak z perfuzją perlimfatyczną. Każda z tych metod została z powodzeniem wykorzystana i jest dobrze opisana w literaturze; Jednak każdy z nich ma różne wady. W tym miejscu przedstawiamy technikę miejscowego stosowania środków ototoksycznych bezpośrednio do okrągłej wnęki okiennej. Technika ta jest nieinwazyjna dla struktur ucha wewnętrznego, powoduje szybki początek niezawodnie ukierunkowanych zmian chorobowych, pozwala uniknąć toksyczności ogólnoustrojowej i pozwala na kontrolę wewnątrzzwierzęcą (ucho przeciwstawne). Wyniki uzyskane dzięki temu podejściu pomogły lepiej zrozumieć patofizjologię słuchu, zwyrodnienie komórek ślimakowych i zdolności regeneracyjne w odpowiedzi na ostry uraz. W przyszłych badaniach można wykorzystać tę metodę do przeprowadzenia badań interwencyjnych obejmujących terapię genową i przeszczep komórek macierzystych w celu zwalczania ubytku słuchu.

Wprowadzenie

Badacze wykorzystali szeroki wachlarz modeli zwierzęcych do zbadania normalnego funkcjonowania układu słuchowego, jak również patofizjologii ubytku słuchu. Modele te są również bardzo przydatne do prowadzenia badań interwencyjnych przeciwko różnym procesom patologicznym i służą jako podstawa do zastosowań translacyjnych u ludzi. W przypadku większości badań dotyczących ślimaka i związanych z nim ścieżek słuchowych konieczne jest wprowadzenie do systemu pewnego stopnia uszkodzenia lub zakłócenia. Często uszkodzenie jest celowo ukierunkowane na stworzenie określonej zmiany, co pozwala badaczom na zbadanie wpływu tej zmiany na normalne funkcjonowanie, a także zdolność ślimaka do powrotu do zdrowia. Przy wyborze konkretnego modelu zwierzęcego i/lub techniki (technik) wprowadzania uszkodzeń, należy wziąć pod uwagę szereg czynników, aby osiągnąć jak najlepsze wyniki. Różne modele zwierzęce mogą różnie reagować na interwencje, podczas gdy bezpośrednie i pośrednie skutki techniki mogą być całkowicie szkodliwe dla pożądanego wyniku. W większości przypadków idealny protokół uszkodzenia ucha wewnętrznego pozwoliłby uniknąć toksyczności ogólnoustrojowej, szybko i niezawodnie spowodowałby uszkodzenie, stworzyłby precyzyjną i spójną zmianę chorobową oraz byłby możliwy do przeżycia, aby umożliwić dalsze badania zmian funkcjonalnych, komórkowych i molekularnych. Idealnie byłoby, gdyby metody te w jak największym stopniu zachowały delikatną mikroarchitekturę i gradienty elektrochemiczne ślimaka.

Do tej pory badaczom udało się ustalić szereg technik wywoływania uszkodzeń ucha wewnętrznego. Większość z nich wiąże się z narażeniem ślimaka na działanie czynnika ototoksycznego ogólnoustrojowo lub chirurgicznie. Techniki obejmują wstrzyknięcie pozajelitowe, wstrzyknięcie dootrzewnowe, wstrzyknięcie przezbębenkowe, wstrzyknięcie do worka endolimfatycznego i ślimakotomię z perfuzją perlimfatyczną. Techniki te zostały wykorzystane do wprowadzenia różnych środków ototoksycznych, takich jak furosemid, gentamycyna, ouabaina i heptanol. 1-5 Chociaż powyższe techniki są skuteczne w tworzeniu określonych zmian w ślimaku, mają również swoje ograniczenia. Zastrzyki ogólnoustrojowe mogą być wysoce toksyczne dla zwierzęcia i mogą wiązać się z niezamierzonymi urazami ślimaka i niespójnymi wynikami. Ta ostatnia wada jest również związana z iniekcjami przezbębenkowymi. Techniki takie jak ślimakotomia i perfuzja perylimfatyczna, choć są w stanie wywołać szybkie i wysoce wiarygodne zmiany, są bezpośrednio inwazyjne dla struktury i funkcji ucha wewnętrznego. Wiele podejść chirurgicznych wiąże się również z wysokim stopniem trudności technicznych i może wymagać pozostawienia ciał obcych w zwierzęciu, takich jak zaparzacz z mikropompą. 2-4,6-8 Żadna pojedyncza technika nie jest wolna od wad, a badacze muszą starannie dobierać metody, aby dopasować je do swoich potrzeb eksperymentalnych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy technikę aplikacji niszy z okrągłym oknem (RWN) do miejscowego podawania środków ototoksycznych dorosłym myszom.

Po raz pierwszy opisana przez Husmanna i innych w 1998 roku podczas badania wpływu gentamycyny na zwyrodnienie czuciowych komórek rzęsatych w modelu ptasim, technika ta okazała się być w stanie wytworzyć znacznie bardziej wiarygodne zmiany niż ogólnoustrojowe stosowanie gentamycyny, unikając jednocześnie związanych z tym toksyczności. 9 Od tamtej pory wielu innych badaczy, w tym nasze laboratorium, stosowało tę technikę z wielkim powodzeniem. W 2004 roku Heydt i wsp. dostosowali go do modelu mysiego i opisali zwiększoną zdolność do kontrolowania wielkości zmiany poprzez wypełnienie RWN wchłanialną gąbką żelatynową nasączoną różnymi stężeniami gentamycyny. 10 Palmgren i wsp. w 2010 r. badali ototoksyczne działanie beta-bungarotoksyny, silnego pierwiastka w jadzie tajwańskiej klatki pręgowanej, poprzez zastosowanie jej wodnej formy do RWN dorosłych szczurów. 11 Ponadto w wielu wcześniejszych badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium wykorzystano podejście okrągłego okna do zbadania ototoksycznego działania furosemidu, ouabainy i heptanolu. 5,6,12-15 Wyniki tych badań wykazały znaczenie homeostazy płynu ślimakowego i jonów dla prawidłowego słuchu, odkryły zdolność proliferacyjną komórek w zwoju spiralnym i bocznej ścianie ślimaka oraz pogłębiły naszą wiedzę na temat ubytku słuchu związanego z wiekiem.

Następujące podejście polega na chirurgicznym dostępie do ucha środkowego poprzez nacięcie pouszne i częściowe odsłonięcie kostnego pęcherza bębenkowego. Pozwala to na doskonałą ekspozycję RWN i błony, na którą można bezpośrednio nałożyć wybrany środek ototoksyczny. Płynny środek następnie gromadzi się w przypominającym miseczkę zagłębieniu RWN (lub powoli spływa z nasyconego wchłanialnego nośnika gąbki żelatynowej upakowanego w RWN) i dyfunduje przez okrągłą błonę okienną do przestrzeni perylimfatycznej przedsionka ślimaka. W tym podejściu nie wykonuje się bezpośredniej cochleostomii. Do zalet tej techniki należą: zachowanie mikroarchitektury ucha wewnętrznego, unikanie toksyczności ogólnoustrojowej, dopuszczanie ucha kontrolnego wewnątrz zwierzęcia, szybki początek działania, selektywne zwyrodnienie niektórych typów komórek ślimakowych (np. spiralnych neuronów zwojowych typu I z ekspozycją na ouabainę i fibrocytów ślimaka typu II indukowanych przez leczenie heptanolem) oraz powtarzalne/wiarygodne wyniki. Ta technika może być stosowana z niewielkimi zmianami między innymi gatunkami gryzoni, w tym szczurami, świnkami morskimi i myszoskoczkami. Wady obejmują stromą krzywą uczenia się technicznego i względne ograniczenie ototoksycznych zniewag, które są ograniczone do jednego punktu w czasie.

Protokół

Wszystkie aspekty badań na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi odpowiedniego Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne na kręgowcach zostały zatwierdzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny (MUSC).

1. Wybór modelu

  1. Utrzymuj model zwierzęcy w wiwarium o niskim poziomie hałasu z rutynową opieką zgodnie z protokołami instytucjonalnymi, aż będzie gotowy do użycia. W ośrodkach badawczych na zwierzętach (ARF) utrzymuj stabilność drgań, tłumienie hałasu, oświetlenie dobowe, przestrzeń przygotowawczą, wykończenia powierzchni, uszczelnianie i uszczelnianie oraz wentylację, które spełniają normy NIH.
    Uwaga: Wytyczne National Institutes of Health (NIH) dotyczące ARF i utrzymania wiwarium o niskim poziomie hałasu można przejrzeć pod adresem: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
  2. We wszystkich eksperymentach używaj prawego ucha jako ucha eksperymentalnego. Lewe ucho służy jako kontrola wewnątrzzwierzęca i nie jest zmieniane chirurgicznie.
  3. Przed operacją należy sprawdzić model zwierzęcia pod kątem oznak infekcji ucha środkowego lub zewnętrznego. Potencjalne objawy mogą obejmować odpływ płynu lub ropy z ucha, stan zapalny tkanki małżowiny usznej i/lub letarg zwierzęcia. Jest to niezwykłe, ale jeśli zostanie to zauważone, unikaj dalszej operacji i odpowiednio traktuj zwierzę.

2. Procedury przedoperacyjne

  1. Znieczulenie zwierzęcia należy przeprowadzić na 30 minut przed zabiegiem i wszelkimi zabiegami okołooperacyjnymi poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg IP) i ksylazyny (20 mg/kg IP). W razie potrzeby uzupełnij znieczulenie, oceniane na podstawie dodatniego odruchu szczypania palców u stóp, niższą dawką ketaminy (25 mg/kg IP) i ksylazyny (5 mg/kg IP). Określ dawkowanie zgodnie z instytucjonalnie dozwolonymi protokołami dla myszy z dostosowaniem dawki odpowiednim do wieku.
  2. Sprawdź, czy model jest w pełni uspokojony. Sprawdź, czy w całym opisanym protokole znajduje się płaszczyzna znieczulenia etapu 3, charakteryzująca się regularnym częstym oddechem, brakiem odruchu prostowania (u myszy) oraz brakiem odruchów pedałowania i powieki (szczypanie palców u stóp). Utrzymuj zwierzę na tym poziomie znieczulenia. Ma to zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania bólu i ruchów śródoperacyjnych, krwawienia i wycieku płynów śródmiąższowych podczas operacji.
  3. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5 °C za pomocą poduszki grzewczej w zamkniętej pętli.
  4. Analgezję należy podawać poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny. Podawać buprenorfinę (0,1 mg/kg mc. raz na 30 minut przed zabiegiem) jako środek przeciwbólowy, aby zminimalizować dyskomfort chirurgiczny. Podstawowe dawkowanie i alternatywy odpowiednie dla wybranego modelu na zatwierdzonych instytucjonalnie protokołach. Stosowanie antybiotyków nie jest konieczne, jeśli praktykowana jest dobra technika aseptyczna. Zwierzęta otrzymują analgezję pooperacyjną, jeśli występują oznaki bólu i niepokoju.
  5. Wykonaj badania fizjologiczne przed operacją. Przeprowadzenie badań słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) i/lub badania emisji optoakustycznych produktu zniekształcenia (DPOAE) zarówno przed operacją, jak i tuż przed uśmierceniem zwierzęcia służy jako obiektywny pomiar wpływu wybranego czynnika ototoksycznego na słuch myszy.

3. Przygotowanie i pozycjonowanie chirurgiczne

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed operacją zgodnie ze standardami instytucjonalnymi. Przygotuj narzędzia chirurgiczne i pole w spójny, sterylny i zorganizowany sposób, aby uniknąć niepotrzebnego wysiłku i ruchu podczas zabiegu. Typowe wymagane narzędzia to ostre nożyczki preparacyjne, kilka par metalowych kleszczy z końcówkami jubilerskimi, otologiczny kilof, otologiczna łyżeczka i bipolarna jednostka elektrokoagulacji (ryc. 1).
  2. Przygotuj i wysterylizuj wcześniej papierowe wykonane z chusteczek laboratoryjnych, wycinając mały trójkątny kawałek chusteczki (~ 0.7 cala x 1.25 cala x 1.75 cala) i mocno przekręcając go między kciukiem a palcem wskazującym jednej ręki (~ 1.25 cala). Stworzenie mocno skręconego, niezwykle cienkiego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu. Przygotuj w sumie 15-20 przed zabiegiem (ryc. 2).
  3. Użyj wiertła dentystycznego, aby szybko przebić kość pęcherza bębenkowego w kontrolowany sposób. Preferowane jest użycie ręcznej wiertarki dentystycznej z napędem pasowym ze stożkową końcówką 1 lub 2 mm. Do wypełnienia protokołu niezbędny jest mikroskop operacyjny. (patrz krok 4.7)
  4. Pobrać 0,2 ml roztworu wodnego zawierającego wybrany czynnik ototoksyczny do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml za pomocą igły 28 G, 1/2'. Zazwyczaj wystarczy 1 kropla (~10 μl) środka, aby całkowicie wypełnić mysz RWN. Metalowa igła strzykawkowa z końcówką ułatwia podawanie środka, jednocześnie zapobiegając uszkodzeniom struktur znajdujących się pod spodem przez ostrą końcówkę skośną. Usunąć powietrze ze strzykawki, ponieważ pęcherzyki mogą przypadkowo wypełnić RWN i/lub uniemożliwić prawidłowe nałożenie środka na samo okrągłe okienko.
  5. Usuń sierść ze skóry usznej za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia do pielęgnacji. Usuń sierść w strefie rozciągającej się od fałdy uszno-głowowej rostrale do obręczy barkowej doogonowo. Przedłuż depilację od grzbietowej, strzałkowej linii środkowej do kąta żuchwy bocznie. Prawidłowe usuwanie sierści ma kluczowe znaczenie dla utrzymania czystego i przejrzystego pola operacyjnego. Delikatnie zetrzyj ścinki z zamierzonego miejsca operacji.
  6. Sterylizuj skórę przygotowanego obszaru zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Stosować betadynę (powidon/jod) na przemian z etanolem miejscowo okrężną przez 2 minuty. Inni agenci mogą być zastępowani zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  7. Umieść zwierzę na płaskiej powierzchni, aby utrzymać stałą pozycję ciała podczas zabiegu. Użyj małej poduszki grzewczej umieszczonej pod ciałem na platformie, aby kontrolować temperaturę ciała podczas zabiegu, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 36-38 °C. Nie należy przegrzewać zwierzęcia, ponieważ może to prowadzić do łagodnego lub ciężkiego uszkodzenia skóry i/lub wczesnej eutanazji.
    1. Zabezpiecz głowę zwierzęcia za pomocą bloku zgryzowego/uchwytu na głowę. Użyj bloku zgryzowego o wymiarach 0,5 cm na 2 cm wykonanego z mosiądzu z otworami o średnicy 2-4 mm wywierconymi w nim w odstępach 5 mm wzdłuż długiej osi. Otwórz pysk zwierzęcia wokół tego uchwytu i dopasuj górne środkowe siekacze do jednego z otworów, w zależności od wielkości zwierzęcia. Delikatnie dokręć mały zacisk na grzbiecie pyska zwierzęcia, aby utrzymać go na miejscu (ryc. 3).
    2. Upewnij się, że blok zgryzu/uchwyt głowy jest sztywno połączony ze środkiem ramienia przegubowego w kształcie litery U (Rysunek 3). Przymocuj pręt o szerokości 1 cm do lewego ramienia "U" i użyj pręta jako zagłówka po lewej stronie (prawa strona jest zawsze stroną operacyjną).
    3. Po mocnym zamocowaniu w uchwycie na głowę obróć mysz do lewej bocznej pozycji odleżynowa. Ostrożnie ułóż ciało na płaskiej powierzchni operacyjnej, aby upewnić się, że będzie stabilne przez cały zabieg i uniknąć nadmiernego obciążenia skrętnego kręgów szyjnych.
  8. Ustaw mikroskop operacyjny z 4-, 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniem nad polem operacyjnym. Upewnij się, że mikroskop może utrzymać swoją pozycję w sposób bezdotykowy, ponieważ jest to idealne rozwiązanie dla omówionego poniżej protokołu chirurgicznego oburęcznego.
  9. Umieść dwubiegunową jednostkę do kauteryzacji z rękojeścią jubilera z cienką końcówką w pozycji, która jest natychmiast dostępna, aby uzyskać pomoc w kauteryzacji małych naczyń i rozwarstwianiu tkanek. Może to być również konieczne w przypadku wystąpienia obfitszego krwawienia.

4. Podejście chirurgiczne

  1. W mikroskopijnym powiększeniu użyj ostrych nożyczek lub ostrza skalpela, aby wykonać 1-1,5 cm nacięcie postuszne, około 6-8 mm ogonowe do zgięcia uszno-głowowego. U dorosłej myszy wystarczające jest nacięcie od grzbietowej linii środkowej bocznie do punktu w pobliżu kąta żuchwy. Ostrożnie unikaj głębokiego cięcia, aby zachować leżące pod spodem struktury naczyniowe.
  2. Przeprowadź staranną sekcję przez podskórną warstwę tłuszczu, która może mieć różną grubość. Tłuszcz można bezpiecznie usunąć, jeśli jest to konieczne, aby poprawić ekspozycję. Należy zachować ostrożność podczas preparacji w kierunku brzuszno-przyśrodkowym, ponieważ żyła szyjna zewnętrzna przechodzi przez ten obszar, a uszkodzenie tej struktury może spowodować dużą utratę krwi i zalanie pola operacyjnego. Kontrolować nadmierne krwawienie za pomocą wchłanialnych gąbek żelatynowych i/lub bawełnianych granulek. Stosuj kauteryzację dwubiegunową w przypadku cięższego krwawienia.
  3. Po prawidłowym podziale warstwy tłuszczu należy odsłonić mięśnie szyjki macicy. Zwróć uwagę na ważne struktury, w tym duży korpus mięśniowy obojczyka sutkowego centralnie w odsłoniętym polu operacyjnym, żyłę szyjną zewnętrzną brzusznie i tkankę ślinianki przyusznej przylegającą do kąta żuchwy. Ważnym punktem orientacyjnym jest mała gałąź nerwowa (nerwu czaszkowego XI), która owija się wokół tylnej/grzbietowej krawędzi obojczyka spultoidowego, aby rozciągać się rostrale w kierunku małżowiny usznej (ryc. 4).
  4. Delikatnie cofnij ciało mięśnia obojczykowo-sutkowego w kierunku tylnym/grzbietowym (ryc. 4, 5). Delikatnie podziel przezroczystą powięź otaczającą mięśnie ciała. W podobny sposób delikatnie cofnij śliniankę przyuszną i żyłę szyjną zewnętrzną w przeciwnym kierunku (przednio/brzusznym) (ryc. 5).
  5. Przy dobrym cofnięciu mięśnia obojczykowo-sutkowego pojawi się błyszcząca kopuła okostnej pęcherza bębenkowego (ryc. 6). W ogonowym aspekcie pęcherza pojawi się przyczep głębszego mięśnia szyjnego, mostkowo-sutkowego (ryc. 6). Zachowaj nerw twarzowy, który staje się widoczny w grzbietowej i rostralnej części kopuły bulla. Umieść samozabezpieczający się zwijacz (sterylny tytanowy trzonek - osadzony w jednorazowej paście silikonowej) przed wierceniem.
  6. Techniką oburęczną delikatnie podziel okostną pęcherza za pomocą diapolarnej diatermii, aby odsłonić leżącą pod spodem kość. Za pomocą kleszczy lub kirety otologicznej delikatnie podnieś i popchnij okostną w kierunku obwodowym, aby szeroko odsłonić kopułę bulla.
    Uwaga: Krok 4.6 ma kluczowe znaczenie, aby zmaksymalizować chirurgiczny widok przestrzeni ucha środkowego. Stosuj skrupulatne i delikatne obchodzenie się z tkankami miękkimi, aby uniknąć krwawienia i/lub wycieku płynu śródmiąższowego do jamy pęcherza po wierceniu.
  7. Na prawidłowo odsłoniętej kopule bulla wywierć 2 mm otwór pilotowy przez kość bulla za pomocą wiertła chirurgicznego między ogonowym brzegiem kopuły a widocznie nieprzezroczystą linią (reprezentującą błonę bębenkową) rozciągającą się w poprzek rostralnego aspektu pęcherza (ryc. 7). Należy uważać, aby wiercić tylko przez kość, aby zachować leżące poniżej struktury, takie jak tętnica strzemiączkowa. Wywierć drugi otwór pilotowy w pobliżu, aby ułatwić odczepienie kości pęcherza (ryc. 7).
  8. Za pomocą kleszczy jubilerskich odczep kość pęcherza w kierunku grzbietowym i ogonowym (ryc. 8). Usuń kość w sposób fragmentaryczny pod dużym powiększeniem. Nie należy nakłuwać tętnicy strzemiączkowej, która leży bezpośrednio pod czapeczką pęcherza, ponieważ krwawienie z tej tętnicy może zagrozić zabiegowi. Zminimalizuj ilość usuwanej kości, aby zapobiec nadmiernemu przedostawaniu się płynu do ucha środkowego, jednocześnie umożliwiając doskonałą wizualizację i dostęp do niszy okrągłego okienka (ryc. 8).

5. Okrągłe okno aplikacji środka ototoksycznego

  1. Dokonaj subtelnych regulacji obrotowych uchwytu głowicy, aby RWN był prosto widoczny. RWN jest zwykle zlokalizowany w grzbietowej i ogonowej części przestrzeni ucha środkowego i pojawia się jako przypominające miseczkę wgłębienie kości torebki usznej. W większości przypadków tętnica strzemiączkowa biegnie do tego 1-2 mm brzuszno-rostralnie. RWN może być czasami schowany obwodowo pod ostrym kątowaniem kopuły bulla. W takich przypadkach najważniejsze jest staranne ułożenie głowy zwierzęcia.
    1. Korzystając z papierowych przygotowanych przed operacją, usuń cały widoczny płyn z ucha środkowego i RWN, aż do uwidocznienia suchej kości.
      Uwaga: Jest to najbardziej krytyczny krok całego protokołu, ponieważ ~10 μl (1 kropla) środka ototoksycznego nałożonego na RWN może być łatwo rozcieńczony przez ten płyn.
  2. W maksymalnym powiększeniu użyj igły cienkiego kalibru na strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml, aby nanieść jedną kroplę (~10 μl) środka ototoksycznego bezpośrednio na RWN, wypełniając go całkowicie. Uważaj, aby nie zakłócić tętnicy strzemiączkowej i uważnie obserwuj, czy małe odbicie światła u podstawy suchej niszy nie zostało zastąpione matową i zamgloną płynną łąkotką jako wskaźnikiem, że nisza wypełnia się prawidłowo.
    1. Pozostawić czynnik do spoczynku w RWN przez około 10 minut czasu ekspozycji. Następnie całkowicie usuń środek i zastąp go nową aplikacją tego samego środka. Określ powtórzenia aplikacji zgodnie ze specyfikacją środka. Całkowity czas ekspozycji w tej procedurze zwykle waha się od 30 do 60 minut.
    2. Pod koniec zabiegu należy całkowicie usunąć środek po raz ostatni i nałożyć świeży środek na RWN. Pozostaw pęcherz niezamknięty i użyj kleszczy, aby zamknąć tkankę miękką nad polem operacyjnym.
  3. Uszczelnić miejsce operowane na poziomie skóry niewchłanialnym szwem monofilamentowym 4-0. Umieść zwierzę w klatce/stacji ratunkowej. Regularnie monitoruj stan kliniczny zwierzęcia po operacji. Utrzymuj zwierzę w odpowiednich warunkach środowiskowych, w tym w pomieszczeniach z miękką ściółką i suplementacją miękkim pokarmem, aby zminimalizować stres. Określ przyszłe procedury i warunki pooperacyjne zgodnie z instytucjonalnymi protokołami IACUC.
  4. Korzystaj z instytucjonalnych protokołów IACUC, aby sterylizować narzędzia przed użyciem u następnego zwierzęcia. Poczekaj na odpowiedni czas chłodzenia między użyciem instrumentu.

6. Zabiegi pooperacyjne i pobieranie tkanek ślimakowych

  1. Jak opisano w kroku 2.5, należy wykonać fizjologiczne badanie słuchu po operacji w pożądanych punktach i przed uśmierceniem. Wykonaj zabiegi pooperacyjne zgodnie z celami eksperymentalnymi. Poświęć zwierzę w dowolnym dniu po operacji.
  2. Po pełnym znieczuleniu za pomocą wstrzyknięcia IP, zgodnie z wymogami instytucjonalnych protokołów IACUC, należy złożyć zwierzę w ofierze. Za pomocą ostrych nożyczek odetnij zwierzę tuż ogonowo do potylicy. Ostro otwórz sklepienie czaszki nożyczkami wzdłuż grzbietowej i brzusznej linii środkowej i szeroko rozciągnij. Delikatnie zgarnij tkankę mózgową, aby odsłonić kości skroniowe.
    Uwaga: Od tego momentu można rozgałęzić szereg procedur badania zmian w ślimaku po ekspozycji, które zostaną wymienione w części poświęconej dyskusji. Określ metodę badawczą najbardziej odpowiednią dla celów eksperymentu. Jeśli po przecięciu ślimaka planowana jest mikroskopia elektronowa, należy zastosować cewnikowanie serca w celu wstępnego unieruchomienia tkanki. Wykracza to poza zakres tej dyskusji i zostało szczegółowo omówione w innym miejscu. 13
  3. Wytnij nożyczkami kości skroniowe z podstawy czaszki i natychmiast umieść je w roztworze utrwalającym. Zanurz kości bezpośrednio w 4% paraformaldehydzie na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Monitoruj czas utrwalania, ponieważ dłuższy czas trwania może ograniczyć wynik analizy histologicznej na późniejszych etapach. Odwapniać wypreparowane kości przez zmienny okres czasu poprzez zanurzenie w 1 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).

Wyniki

W niedawnym badaniu przeprowadzonym przez Stevensa i współpracowników z wykorzystaniem powyższego protokołu, dorosłe myszy CBA/CaJ obu płci zostały poddane działaniu heptanolu poprzez dyfuzję przez okno owalne.15 Heptanol jest odsprzęgacz połączeń szczelinowych, o którym wiadomo, że powoduje celowe, odwracalne uszkodzenie komórek bocznej ściany ślimaka. Celem badania było opracowanie wiarygodnego modelu ukierunkowanego uszkodzenia ślimaka, umożliwiającego badanie pooperacyjnej regeneracji uszkodzonych elementów. Przedoperacyjne i pooperacyjne progi słyszalności służyły jako punkt końcowy funkcjonalny. Do badania zmian morfologicznych wykorzystano mikroskopię oraz techniki barwienia immunohistochemicznego. U myszy traktowanych heptanolem zaobserwowano znaczące wzrosty progów ABR (Rycina 9). Zwierzęta kontrolne, u których przeprowadzono operację pozorowaną z podaniem soli fizjologicznej zamiast heptanolu, nie wykazały istotnych przesunięć progów przy żadnej z badanych częstotliwości.

Immunobarwienie przeciwko wewnątrzsterownemu potasowemu kanałowi prostującemu (Kir) 4.1 służyło jako pośrednia metoda wizualizacji uszkodzeń/regeneracji struktur ślimaka. Wykazało ono wysoce powtarzalne różnice między uszami traktowanymi a kontrolnymi. Całkowita intensywność barwienia była wyraźnie zmniejszona w obrębie stria vascularis (StV) oraz wśród fibrocytów więzadła spiralnego (SLF) od 1 do 3 dni po ekspozycji na heptanol, co wskazywało na znaczny stopień ukierunkowanych uszkodzeń w tych obszarach. Odnotowano szczególny spadek intensywności barwienia Kir 4.1 w obszarach SLF typu II i IV (Ryc. 10) oraz w StV (Ryc. 11). W tych obszarach ślimaka, na podstawie przeciwbarwienia jąder komórkowych, zaobserwowano również dowody na utratę integralności jądra oraz kondensację chromosomów/powstawanie pęcherzyków typowych dla apoptozy komórkowej (Ryc. 10). Opróżnione strefy barwienia Kir 4.1 uległy wyraźnemu cofnięciu w 7. dniu i całkowicie zanikły w 14. dniu. Po ilościowym określeniu intensywności barwienia Kir 4.1 w obszarach StV, w uszach traktowanych zaobserwowano początkowy spadek, a następnie istotne przesunięcie (p < 0,05) z powrotem w stronę intensywności grupy kontrolnej 7 dni po ekspozycji na heptanol (Ryc. 12).

Zestaw narzędzi chirurgicznych na sterylnej tacy; nożyczki, pęsety i sonda do procedur medycznych.
Rycina 1. Przygotowanie instrumentarium. Przedstawienie przygotowania instrumentarium przed operacją. Cały sprzęt powinien być łatwo dostępny w obrębie sterylnego pola operacyjnego. Typowy zestaw instrumentów obejmuje 2 ostre nożyczki do dyssekcji, 2-3 pęsety jubilerskie z końcówkami prostymi i/lub zakrzywionymi z kuretami do ucha, zakrzywione zgłębniki otologiczne (później zastąpione zgłębnikami Rosena – niewidoczne na rysunku) oraz urządzenie do elektrokoagulacji z końcówką w postaci cienkiej zakrzywionej pęsety jubilerskiej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Szalki Petri z papierem filtrowanym i bawełną przygotowane do eksperymentu absorpcyjnego w badaniu laboratoryjnym.
Rysunek 2. Materiały chirurgiczne. Dodatkowe materiały do utrzymania środowiska RWN. Sterylne wycinki chusteczek laboratoryjnych do tworzenia papierowych knotów (lewo), ściśle zwinięte papierowe knoty wykonane ze sterylnych chusteczek laboratoryjnych (środek) oraz 4 mm pellety bawełniane (prawo) są używane do usuwania nadmiaru płynu i krwi zalewającej niszę okna owalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Układ chirurgiczny z przecinarką do tkanek, technika precyzyjnego nacięcia, aparatura eksperymentalna do badań.
Rysunek 3. Uchwyt do głowy zwierzęcia. Zdjęcie przedstawiające uchwyt do głowy i blok do gryzienia. Otwory w bloku dopasowują się i stabilizują górne siekacze centralne. Zacisk jest delikatnie dociągany nad grzbietową częścią pyska, aby unieruchomić zwierzę. Stosowanie uchwytu do głowy jest kluczowe dla pomyślnego wyniku chirurgicznego. Idealnie, urządzenie to powinno umożliwiać obrót wokół osi rostralno-kaudalnej zwierzęcia, aby zoptymalizować widoczność bębenka podczas zabiegu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat anatomiczny mięśni szyi gryzonia z oznaczeniem mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
Rycina 4. Mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy. Schemat przedstawiający podstawową anatomię mięśni szyi gryzonia oraz ich powiązanie z żyłą szyjną zewnętrzną. Mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy jest najłatwiej identyfikowalnym mięśniem podczas dostępu chirurgicznego. Uwolnienie otaczającej powięzi, a następnie retrakcja ciała mięśnia w kierunku tylnym/grzbietowym, skieruje dyssekcję chirurgiczną w stronę pęcherzyka bębenkowego (czarne koło). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Struktura anatomiczna oznaczona jako A, B, C; obraz mikroskopowy do edukacyjnej analizy morfologii tkanki.
Rycina 5. Obszar odsłonięcia chirurgicznego. Przedstawia pole operacyjne po przecięciu warstw skóry i tkanki tłuszczowej podskórnej. Istotne punkty orientacyjne obejmują gałąź nerwu czaszkowego XI przebiegającą nad mięśniem mostkowo-obojczykowym (A), żyłę szyjną zewnętrzną (B) oraz odsłoniętą tkankę ślinianki przyusznej (C). Gałąź nerwu czaszkowego XI jest często powiązana z małym naczyniem i musi zostać przecięta przed kontynuacją procedury. Kierunek z prawej do lewej na obrazie odpowiada osi rostralno-kaudalnej zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy próbki tkanki z oznaczonymi obszarami A, B, C przedstawiający analizę struktury anatomicznej.
Rycina 6. Odsłonięcie pęcherzyka bębenkowego. Odsłonięcie pęcherzyka bębenkowego po odsunięciu mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i struktur otaczających. Kluczowe punkty orientacyjne obejmują brzusiec mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego (A) odsunięty tylno-grzbietowo, nerw twarzowy (B) oraz lśniącą kopułę okostnej pęcherzyka bębenkowego (C). Zwróć również uwagę na przyczep mięśnia mostkowo-sutkowego w lewej części ogonowej pęcherzyka bębenkowego (gwiazdka). Obecność nerwu twarzowego w części grzbietowej i rostralnej pęcherzyka jest krytycznym punktem orientacyjnym dla prawidłowej identyfikacji pęcherzyka. Kierunek od prawej do lewej na obrazie odpowiada osi rostralno-caudalnej zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zakażenie miejsca operacyjnego w tkance, obraz mikroskopowy, diagnoza zakażenia, ilustracja badania medycznego.
Rycina 7. Eksponowanie niszy okna owalnego I. Obraz przedstawiający w pełni odsłoniętą tchółkę słuchową po wycięciu nadkładającego ją okostnego. Otwór prowadzący najlepiej umieścić w połowie odległości między krawędzią ogonową kopuły tchółki a subtelną, nieprzezroczystą linią widoczną w części głowowej tchółki (reprezentującą błonę bębenkową). Drugi, sąsiedni otwór prowadzący może ułatwić usunięcie dachu kości tchółki. Należy unikać głębokiego wiercenia, aby nie uszkodzić leżącej poniżej tętnicy strzemiączkowej. Ciemny, metalowy obiekt na dole obrazu to tytanowy retraktor do tkanek miękkich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces implantacji stomatologicznej, odsłonięte gniazdo kostne, fotografia procedury klinicznej, szczegół chirurgiczny.
Rycina 8. Odsłanianie niszy okna owalnego II. Otwarta pęcherzykowo-bębenkowa część czaszki z odsłoniętą niszą okna owalnego (strzałka) oraz tętnicą strzemiączkową (struktura czerwona 1-2 mm bocznie od niszy) w powiększeniu 20x. Nisza często znajduje się pod ostrym kątem utworzonym przez kopułę pęcherzyka z torebką błędnika w jej tylnej części. Niezbędne jest pełne uwidocznienie niszy przed podaniem środka ototoksycznego lub zastosowaniem knotka. Należy również unikać nadmiernego usuwania kości podczas otwierania pęcherzyka, ponieważ płyn śródmiąższowy/krew miały tendencję do zalewania jamy w przypadku powstania dużych otworów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat progów ABR; porównanie funkcji słuchu przy różnych częstotliwościach w czasie (POD1, POD7, POD14).
Rysunek 9. Reprezentatywne wyniki– Utrata słuchu i regeneracja wywołana heptanolem. Średnie progi odpowiedzi pnia mózgu (ABR) (dB SPL) przedstawione jako funkcja częstotliwości impulsu tonowego. Pomiary pogrupowano według stanu przed ekspozycją (czarny – kontrola) oraz dni pooperacyjnych (POD) 1, 7 i 14 (czerwony). Słupki błędów reprezentują SEM. Rysunek został przerysowany na podstawie pracy Stevens et al. 2014.15 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia tkanki naczyniowej z zaznaczonymi na czerwono i zielono strukturami komórkowymi, porównanie badań.
Rycina 10. Reprezentatywne wyniki – Celowane uszkodzenie ślimaka po ekspozycji na heptanol, część I. Zmiany w barwieniu kanałów potasowych wewnątrzprostownych (Kir) 4.1 w obrębie stria vascularis (StV) uszu traktowanych heptanolem oraz uszu kontrolnych. (A) Prawidłowe barwienie Kir 4.1 typowe dla uszu kontrolnych z silnym powinowactwem komórek stria vascularis do Kir 4.1 (zielony). (B) Ucho traktowane w 1. dobie po operacji (POD1). W obrębie StV widoczne są duże zwakuolizowane strefy zmniejszonego powinowactwa do Kir 4.1 (groty strzałek) wraz z ogólnym spadkiem intensywności barwienia Kir 4.1 w StV. Jądra komórkowe przeciwbarwiono jodkiem propidyny (czerwony) (B). Pasek skali = 15 µm. Rycina została opracowana na podstawie Stevens et al, 2014.15 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie mikroskopowe fluorescencyjne tkanki neuronowej; kontrolna vs. 1. dzień po operacji; zielone i czerwone markery komórkowe.
Rysunek 11. Reprezentatywne wyniki – Celowane uszkodzenie ślimaka po ekspozycji na heptanol, część II. Zmiany w więzadle spiralnym (SL) ucha traktowanego heptanolem w porównaniu do ucha kontrolnego. (A) Normalne barwienie Kir 4.1 (zielone) w obrębie SL typowe dla ucha kontrolnego z prawidłowo wyglądającymi fibrocytami typu II więzadła spiralnego (II). (B) Ucho traktowane heptanolem z wyraźnym spadkiem intensywności barwienia Kir 4.1 w obszarze fibrocytów typu II więzadła spiralnego, zaburzeniami jądrowymi oraz kondensacją chromosomów/pęcherzykami charakterystycznymi dla apoptozy (strzałki). Jądra są przeciwbarwione jodkiem propidyny (czerwone). Pasek skali = 15 µm. Rysunek opracowano na podstawie Stevens et al, 2014.15 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres przedstawiający względną ekspresję luminescencji prążkowanej w funkcji dni po ekspozycji; analiza danych.
Rycina 12. Reprezentatywne wyniki – Powrót intensywności barwienia ślimaka po ekspozycji na heptanol. Średnia względna luminancja barwienia Kir 4.1 przedstawiona jako funkcja dnia po ekspozycji. Względną luminancję obliczono jako intensywność odblaskową Kir 4.1 w mikroskopii konfokalnej w uszach traktowanych heptanolem, wyrażoną jako procent wartości w uszach kontrolnych. Należy zauważyć, że dane z POD14-28 zostały zgrupowane jako jeden punkt na krzywej. Pełne koła reprezentują wartości średnie, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. Wykazano istotny powrót względnej luminancji między POD 7 a późniejszymi datami (test t Studenta p < 0.05, gwiazdka). Rycina została przerysowana z pracy Stevens et al., 2014.15 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół i reprezentatywne wyniki opisane powyżej uzyskano w mysim modelu CBA/CaJ obejmującym obie płcie. Ten wsobny szczep jest dobrze ugruntowany jako standard "dobrego słuchu" i model "normalnego starzenia się" w badaniach nad słuchem. 16-23 Opis zastosowania tego protokołu w innych modelach ssaków wykracza poza zakres tego tekstu. Czytelnik powinien jednak zauważyć, że technika aplikacji RWN oferuje kilka zalet w badaniu ucha wewnętrznego ssaków. Spośród nich najbardziej godne uwagi jest to, że pozwala uniknąć bezpośredniego zakłócenia delikatnej struktury anatomicznej i gradientów biochemicznych, które istnieją w ścianach torebki usznej. Zabiegi takie jak ślimakomia i wszczepienie pomp infuzyjnych mają skłonność do bezpośredniego naruszania struktur ucha wewnętrznego, co prowadzi do trwałych przesunięć progowych; Jest to fakt, który należy wziąć pod uwagę podczas analizy wyników. Niszczenie struktur ścian bocznych ślimaka metodami inwazyjnymi może również ograniczać stosowanie środków ototoksycznych, takich jak furosemid lub heptanol, których specyficzna strefa działania jest ograniczona do tej lokalizacji. 15,24 Alternatywne nieinwazyjne podejścia, takie jak iniekcja przezbębenkowa i wstrzyknięcie pozajelitowe, były nękane niewiarygodnymi wynikami i/lub toksycznością ogólnoustrojową dla modelu zwierzęcego. Udowodniono, że ta metoda aplikacji pozwala uniknąć obu tych niedociągnięć, osiągając poziom spójności zbliżony do bardziej inwazyjnych metod omówionych powyżej.

Inne zalety tej techniki to jej szerokie zastosowanie do wielu modeli zwierzęcych oraz możliwość włączenia do istniejącej infrastruktury laboratoryjnej. Jeśli chodzi o te ostatnie, nie są wymagane żadne specjalistyczne odczynniki ani chemikalia poza wybranymi środkami ototoksycznymi, środkami znieczulającymi i przeciwbólowymi. Środki ototoksyczne są zwykle stosowane w ustalonym stężeniu i mieszane z wystarczająco dużą objętością roztworu (5 ml), aby wystarczyły na długi czas, biorąc pod uwagę, że każde zastosowanie zużywa około 10 μl (u myszy). W związku z tym, po początkowym zakupie materiałów eksploatacyjnych i instrumentów, badacze są stosunkowo wolni od czasochłonnego przygotowywania roztworów lub częstej wymiany materiałów. Technika ta zapewnia również skrócenie czasu operacji, co może być znaczące w porównaniu z zabiegami polegającymi na implantacji pomp infuzyjnych perylimfatycznych lub ślimakoztomii. Po osiągnięciu poziomu biegłości technicznej nasz średni czas ukończenia od początkowego nacięcia do zamknięcia wynosił zwykle od 20 minut do 1,5 godziny, w zależności od długości ekspozycji pożądanej dla środka ototoksycznego. Trzy lub cztery operacje można z łatwością wykonać w ciągu jednego dnia, co pozwala na zwiększenie wydajności i zwiększenie potencjału uzyskania pomyślnych wyników. Jak opisano powyżej, technikę tę można również łatwo zastosować do różnych modeli gryzoni, w tym myszy, szczurów, świnek morskich i myszoskoczków.

Ograniczenia tej metody koncentrują się na umiarkowanie stromej krzywej uczenia się potrzebnej do jej opanowania i zmniejszonych oczekiwanych wynikach do momentu osiągnięcia biegłości technicznej. Jak zostanie to omówione bardziej szczegółowo poniżej, drobne błędy podczas dostępu chirurgicznego lub niewystarczająca wizualizacja pola operacyjnego prawie zawsze prowadzą do złego wyniku. Subtelne odkrycia, których nowicjusz może nie rozpoznać, takie jak pęcherzyk powietrza o grubości poniżej milimetra blokujący dostęp środka do okrągłej błony okiennej lub płyn śródmiąższowy rozcieńczający środek, wymagają czasu, aby docenić i rozwinąć umiejętności psychomotoryczne wymagane do ich skorygowania. Jednak przy wielokrotnym wykonywaniu procedury przeszkody te można łatwo pokonać i stanowią one mniej zniechęcające wyzwanie techniczne dla badaczy niż niektóre z wyżej wymienionych metod inwazyjnych. Wreszcie, technika ta wiąże się ze względnym ograniczeniem polegającym na tym, że uraz ślimaka może być wywołany tylko w jednym momencie podczas ekspozycji chirurgicznej. Można to do pewnego stopnia przezwyciężyć, wypełniając RWN wchłanialną gąbką żelatynową nasączoną środkiem, jak opisali Heydt i wsp.10 Wchłanialna gąbka żelatynowa ulega resorpcji z czasem, ale może pozwolić na dłuższy okres ekspozycji niż jest to możliwe do osiągnięcia przy zastosowaniu samego roztworu wodnego.

Aby badacz mógł w pełni zdać sobie sprawę z zalet tej techniki i uniknąć wszelkich pułapek, ważne jest, aby rozpoznać dwa kluczowe elementy tej techniki: 1) konsekwentne utrzymywanie wizualizacji przestrzeni ucha środkowego i RWN; oraz 2) zdolność do utrzymywania pola operacyjnego wolnego od płynu śródmiąższowego i/lub krwi. W osiągnięciu pierwszego z nich nie można przecenić znaczenia odpowiedniego uchwytu na głowę. Bezpieczne mocowanie głowy zwierzęcia zapewnia stabilny widok pod mikroskopem; Znaczenie tego staje się oczywiste, gdy subtelne oprzyrządowanie drastycznie zmienia położenie struktur pod wpływem powiększenia. Dobry uchwyt na głowę, który może obracać się wokół osi rostralno-ogonowej zwierzęcia, ułatwia również ważne dynamiczne zmiany w linii miejsca badacza. Często kilka milimetrów obrotu wokół tej osi może oznaczać różnicę między wizualizacją RWN a wizualizacją samej kości torebki usznej. Zdolność do ciągłej zmiany widoku ma również zasadnicze znaczenie dla zapewnienia, że płyn śródmiąższowy jest prawidłowo usuwany z głębi niszy, a także, że czynnik ototoksyczny jest całkowicie usuwany między aplikacjami, jak omówiono w części 5. Z naszego doświadczenia wynika, że krew, kondensacja lub płyn śródmiąższowy, który dostaje się do przestrzeni ucha środkowego, może zakłócać cały eksperyment. Nie jest to zaskakujące, ponieważ niewielka ilość środka ototoksycznego nałożona na okrągłe okienko (~10 μl) może być łatwo rozcieńczona przez kontakt nawet z niewielkimi objętościami obcego płynu. Z tego powodu skrupulatne rozwarstwienie chirurgiczne, fragmentaryczne odsklepianie pęcherza bębenkowego i staranne zachowanie tętnicy strzemiączkowej są równoznaczne z pomyślnymi wynikami eksperymentalnymi.

Jeśli powyższe krytyczne kroki zostaną zaobserwowane, a oczekiwane wyniki nadal nie zostaną osiągnięte, należy rozpocząć rozwiązywanie problemów. Z naszego doświadczenia wynika, że często pomocne jest wykonanie próbnych wariantów dwóch elementów proceduralnych. Pierwszym z nich jest modyfikacja częstotliwości, z jaką środek ototoksyczny jest uzupełniany w okrągłym okienku. W zależności od używanego środka, całkowity czas ekspozycji wynosi od 30 minut do 1 godziny, z całkowitym odprowadzaniem wilgoci i późniejszą wymianą środka co 10 minut. W przypadku krótszego naświetlania, zwiększenie ogólnej ekspozycji może dać środkowi więcej czasu na dyfuzję przez okrągłą membranę okienną. Dodatkowa ekspozycja i uzupełnianie może również pomóc w uniknięciu niepożądanego rozcieńczenia czynnika ototoksycznego przez krew, kondensację lub śródmiąższ, jak omówiono powyżej. Należy jednak zachować ostrożność podczas stosowania tego podejścia, ponieważ ma ono tendencję do zwiększania ryzyka nieumyślnego uszkodzenia tętnicy strzemiążkowej i/lub wprowadzenia płynu śródmiąższowego do RWN.

Technika ta jest znacząca ze względu na to, co oferuje badaniom nad fizjologią i patofizjologią ślimaka. Ta minimalnie inwazyjna technika pozwala na szczegółowe badanie delikatnych procesów biochemicznych i jest równoznaczna z postępem w naszych badaniach mających na celu ocenę potencjału regeneracyjnego ślimaka. 12,24 To chirurgiczne podejście i ekspozycja są również odtwarzane w wielu innych technikach pochodnych, a pomyślne wyniki przy użyciu tej metody zostały zgłoszone w badaniach nad implantacją ślimakowych komórek macierzystych. 14 Wiele pozostaje niewiadomych na temat ślimaka, jednak technika ta, wraz z szerszym arsenałem dostępnym dla badaczy, pomoże w zawężeniu tej luki w wiedzy.

Oświadczenia

Brak sprzecznych interesów finansowych. Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Numer grantu: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). Prace te skorzystały również z nagrody South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i/lub analizie. Autorzy pragną podziękować Lonnie E. Brownowi Jr. za jego wkład artystyczny i graficzny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-Heptanol 98%Sigma-AldrichH2805 PubChem Identyfikator substancji 24895536
Ketaset do wstrzykiwania Patterson Weterynaryjny07-803-6637 Koncentrat 100mg/ml
(Ketamina HCl)10 mlSchemat CIII Substancja
Anased InjectableLloyd LaboratoriesNADA# 139-236Koncentrat 20mg/ml
Buprenex do wstrzykiwań Patterson Weterynaryjny07-850-2280 Koncentrat 0,3 mg/ml
(Buprenorfina HCl)5 ampułek w opakowaniuSchemat CIII substancja kontrolowana
Betadine Skin Prep SolutionMedlineMDS093941  < / a>1 Litrowa butelka z zakrętką
0,9% sterylna sól fizjologicznazmiennado mieszania roztworów i wstrzyknięć
Mikroskop operacyjnyCarl Zeiss32192
Kontrolowana akustyka Środowisko Kabina dźwiękowaFirma zajmująca się akustyką
Chirurgiczny uchwyt na głowęWykonane na zamówienie –  Proszę zobaczyć rysunek 3
Medyczny Karoliny
Południowej Retraktor tkanek miękkich szyi (wziernik druciany, tytan) 1,75 calaWorld Precision Instruments555801LMaksymalny rozpiętość 20 mm
Osadzony w jednorazowej szpachli do dynamicznego mocowania do uchwytu
Wiertarka ręczna 90N napędzana paskiem dentystycznym EmescoVintage Item
Rękojeść skalpela Rozmiar 6Bard-ParkerMEDC-011990
#15c Ostrze skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej Bard-ParkerSKU: 097-721550 ostrzy / pudełko
za pośrednictwem kodu
Kleszcze jubilerskie z prostą końcówką BernellMIL17304
Iris Nożyczki ZakrzywionaMedlineDYND04026 
Irys Nożyczki prosteMedlineDYND04025 
Stevens Nożyczki do tenotomii Prostalinia medycznaMDG3222111 
Rosen Igła do uszu z prostym trzonkiem, lekko zakrzywiona końcówkaMytaMedPozycja# 6.56.00Rysunek 1 przedstawia kątowe kilofy do wału. Zostało to później zastąpione przez wycieraczki Rosen
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Silnie zakrzywiona końcówkaMytaMedPozycja# 6.56.01
Wycieraczki Kimwipes Delicate Task Kimtech ScienceKOD 34155 Biały, rozmiar 4,4x8,4 cala. Pokrój na trójkąty i zwiń w cienkie.
Curette do uszu domowych, trzonek 6", kąt światłaMedlineMDG0396486 
Gelfoam (wchłanialna gąbka żelatynowa) Rozmiar 100MedlineIIS34201  Można dokonać substytucji
Granulki bawełniane #3 4 mmRichmondKod producenta 100108
Jednostka elektrochirurgiczna 100 E M/MLista Elmedanr 52-5770bipolarną i monopolarną
28G, igła o długości 0,5 calaBDNumer produktu: 329410Opcjonalnie do dostarczania środka ototoksycznego
23G, końcówka, 1" długość igłyKendallKod produktu 8881202397Do kontrolowanego dostarczania środka ototoksycznego przy mniejszym ryzyku uszkodzenia tętnicy strzemiączkowej
Maska chirurgicznaU-lineS-10478
Rękawice chirurgiczne nitrylowe klasy egzaminacyjnejU-lineS-12549
Precyzyjne maszynki do strzyżenia włosówWahlWiele modeli można zastąpić
5-0 Nylonowy szew monofilamentowy na PC-1  Igła do koła 13 mm 3/8Ethilon1855GMożliwe są zamienniki.
Woreczek do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniemFisher01-812054
Suchy sterylizatorROBOZGerminator TM 500
kontrolowanaprzemysłową Uniwersytet głowyzaopatrzenia chirurgicznego ACE Strzykawka insulinowa 1cc U-100 z zdolnością

Bibliografia

  1. Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. Selective lesions of the vestibular labyrinth. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).
  2. Dodson, H. C. Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides. Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).
  3. Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin. The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).
  4. Lee, K. S., Kimura, R. S. Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).
  5. Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).
  6. Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).
  7. Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers. Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).
  8. Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).
  9. Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells. Hearing research. 125, 109-119 (1998).
  10. Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse. Hearing research. 162, 65-74 (2004).
  11. Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear. Hearing research. 265, 70-76 (2010).
  12. Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).
  13. Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).
  14. Lang, H., et al. Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).
  15. Stevens, S. M., et al. Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).
  16. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing research. 130, 94-107 (1999).
  17. Hequembourg, S., Liberman, M. C. Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).
  18. Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons. The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).
  19. Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).
  20. Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice. Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).
  21. Tang, X., et al. Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse. Neuroscience. 259, 184-193 (2014).
  22. Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).
  23. Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits. PloS one. 9, e90279(2014).
  24. Lang, H., et al. Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nisza okna owalnegolimak myszyodpowied pnia m zgu na bod ce s uchoweods oni cie p cherzyka b benkowegoprocedura chirurgicznamodel uszkodzenia ucha wewn trznegoselekcyjna indukcja zmianyfunkcjonalna ocena morfologiczna

Powiązane artykuły