Artykuł metodologiczny

Przygotowanie frakcji wzbogaconych w mitochondria do analizy metabolicznej u Drosophila

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53149

⸱

30 września 2015

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w regulacji metabolizmu i homeostazy. Subtelne zmiany w metabolizmie mitochondrialnym, które wpływają na fizjologię organizmu, mogą być trudne do wykrycia w badaniach metabolomicznych całego organizmu. Tutaj opisujemy metodę izolacji, która zwiększa wykrywanie subtelnych zmian metabolicznych u Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Ponieważ mitochondria odgrywają rolę w metabolizmie aminokwasów, metabolizmie węglowodanów i utlenianiu kwasów tłuszczowych, defekty w funkcjonowaniu mitochondriów często zagrażają życiu osób cierpiących na te złożone choroby. Wykrywanie mitochondrialnych zmian metabolicznych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zaburzeń mitochondrialnych i odpowiedzi mitochondriów na czynniki farmakologiczne. Chociaż metabolizm mitochondrialny jest podstawą regulacji metabolicznej, wykrycie subtelnych zmian w metabolizmie mitochondrialnym może być utrudnione przez nadreprezentację innych metabolitów cytozolowych uzyskanych przy użyciu ekstrakcji całego organizmu lub całych tkanek.

Tutaj opisujemy metodę izolacji, która wykryła wyraźne zmiany metaboliczne w mitochondriach u Drosophila, które były różne między preparatami wzbogaconymi w całe muchy i mitochondria. Aby zilustrować czułość tej metody, użyliśmy zestawu Drosophila zawierających genetycznie zróżnicowane mitochondrialne DNA (mtDNA) i wystawiliśmy je na działanie leku rapamycyny. Za pomocą tej metody wykazaliśmy, że rapamycyna modyfikuje metabolizm mitochondrialny w sposób zależny od genotypu mitochondrialnego. Jednak zmiany te są znacznie wyraźniejsze w badaniach metabolomicznych, gdy metabolity zostały wyekstrahowane z frakcji wzbogaconych w mitochondria. W przeciwieństwie do tego, ekstrakty z całych tkanek wykryły tylko zmiany metaboliczne, w których pośredniczy lek rapamycyna, niezależnie od mtDNA.

Wprowadzenie

Celem tej procedury jest opracowanie wzbogaconych frakcji mitochondrialnych, które dostarczają wystarczającą ilość metabolitów mitochondrialnych do badań metabolomicznych z użyciem Drosophila melanogaster. Z naszego doświadczenia wynika, że analiza metabolomiczna przy użyciu metod ekstrakcji całych komórek nie jest w stanie wykryć subtelnych zmian metabolitów mitochondrialnych u Drosophila. Jednak frakcjonowanie mitochondriów przed analizą metabolomiczną zwiększa czułość identyfikacji zmian metabolitów mitochondrialnych.

Mitochondria to organelle komórkowe odpowiedzialne za dostarczanie 90% energii potrzebnej komórkom do normalnego funkcjonowania1. W ostatnich latach uznano, że mitochondria odgrywają znacznie bardziej dynamiczną rolę w funkcjonowaniu komórek i organizmu niż tylko produkcja trifosforanu adenozyny (ATP) i są obecnie uznawane za ośrodki regulacji homeostazy metabolicznej2,3. Mitochondria są wynikiem endosymbiotycznego procesu, w którym odrębne linie drobnoustrojów połączyły się ~1,5 miliarda lat temu4. Gdy mitochondria przekształciły się w prawdziwe organelle, geny endosymbionta zostały włączone do powstającego genomu jądrowego. U dzisiejszych zwierząt około 1500 białek mitochondrialnych jest kodowanych jądrowo, podczas gdy 37 genów pozostaje w mtDNA, z których 13 koduje białka mitochondrialne, które są podjednostkami kompleksów enzymatycznych fosforylacji oksydacyjnej5. Koordynacja między mitochondriami a przedziałami jądrowymi jest potrzebna do utrzymania prawidłowej funkcji mitochondriów.

Korzystając z opisanych tutaj metod, byliśmy w stanie wykryć zmiany metaboliczne w mitochondriach u Drosophila, które wynikają z manipulacji koordynacją między genomami mitochondrialnymi i jądrowymi. Użyliśmy szczepu Drosophila, w którym mtDNA z jego siostrzanego gatunku D. simulans umieszczono na pojedynczym tle jądrowym D. melanogaster 6. Ten "zakłócony" genotyp mitojądrowy porównano z "rodzimym" lub współwyewoluowanym genotypem mitojądrowym D. melanogaster posiadającym ten sam genom jądrowy z jego rodzimym mtDNA D. melanogaster. MtDNA D. melanogaster i D. simulans różnią się ~100 aminokwasami i >500 synonimicznymi podstawieniami, które wpływają na komunikację mitojądrową7,8. Wygenerowaliśmy ekstrakty z całych much i ekstrakty wzbogacone w mitochondria, aby zbadać zmiany metabolitów w odpowiedzi na stres farmakologiczny. Tutaj pokazujemy, że przy użyciu frakcji wzbogaconych w mitochondria wykrywamy wyraźne zmiany w metabolitach mitochondrialnych między natywnym, współwyewoluowanym genotypem przenoszącym mtDNA D. melanogaster a zakłóconym genotypem przenoszącym mtDNA D. simulans. W przeciwieństwie do tego, zmiany metabolitów między tymi dwoma genotypami są subtelne przy użyciu normalnych metod, które wykorzystują ekstrakt z całej muchy. W związku z tym metoda ta umożliwiła zrozumienie, w jaki sposób mtDNA pośredniczą w zmianach mitochondrialnych w odpowiedzi na różne leki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Odczynniki i roztwory

  1. Przygotowanie pokarmu dla much i pożywki
    1. Podgrzej składniki muchy 11% cukru, 2% drożdży autolizowanych, 5,2% mąki kukurydzianej, agaru 0,79% w/v w wodzie na płycie grzejnej ustawionej na 90 °C. Mieszaj regularnie, aż do uzyskania jednorodnej, lekko gęstej mieszanki. Przygotować końcową objętość 550 ml pokarmu na muchy, co daje w sumie 100 fiolek z 5 ml pokarmu na muchy w każdej.
    2. Zdjąć ze źródła ciepła, mieszać od czasu do czasu, aż żywność ostygnie do 80 °C i dodać 0,2% tegoseptu 4-hydroksybenzoesanu metylu rozpuszczonego w 95% etanolu.
    3. Podziel jedzenie na dwie równe objętości. Dodać 1,1 ml 50 mM rapamycyny rozpuszczonej w etanolu do jednej objętości i 1,1 ml etanolu do drugiej objętości. Wymieszaj rapamycynę i roztwory etanolu z żywnością. Upewnij się, że temperatura spadnie do 50 °C przed dodaniem leków.
  2. Bufor izolacyjny
    1. Przygotować 500 ml buforu izolacyjnego [225 mM mannitolu, 75 mM sacharozy, 10 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 2,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA)] w wodzie.
    2. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą wodorotlenku sodu. Początkowe pH będzie kwaśne.
    3. Do sterylizacji roztworu należy używać sterylnych butelek do przechowywania z filtrem o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  3. Bufor do płukania
    1. Przygotować 500 ml buforu do przemywania [225 mM Mannitolu, 75 mM Sacharozy, 10 mM KCl, 10 mM Tris HCl i 5 mM KH2PO4] w wodzie.
    2. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą wodorotlenku sodu. Początkowe pH będzie kwaśne.
    3. Do sterylizacji roztworu należy używać sterylnych butelek do przechowywania z filtrem o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze 4 °C.

2. Hodowla szczepów Drosophila

  1. Aby kontrolować zagęszczenie larw podczas rozwoju, umieść 25 par rodziców w butelce hodowlanej i pozwól im składać jaja przez 48 godzin.
  2. Usuń rodziców po 48 godzinach, aby regulować gęstość jaj.
  3. Powtórz kroki 2.1 i 2.2 na przykładzie pojawiającego się potomstwa F1, aby uzyskać dwie generacje tej kontroli gęstości.
  4. Aby zebrać dorosłe osobniki, znieczulij muchy za pomocą dwutlenku węgla (CO2) i oddziel według płci.
    1. Użyj reduktora jednostopniowego, aby dostarczyć czysty CO2 ze zbiornika pod wysokim ciśnieniem przy ciągłym przepływie 5 psi. Aby uniknąć elektryczności statycznej, użyj plastikowej rurki do katalizowania CO2 do kolby filtrującej o pojemności 500 ml z wodą.
    2. Użyć gumowego korka z jednym otworem, aby uszczelnić kolbę. Użyj plastikowej rurki, aby połączyć boczny otwór kolby z wkładką CO2 .
    3. Umieść muchy w podkładce na nie dłużej niż 10-15 minut. Pozostaw do odzyskania po znieczuleniu na 24 godziny przed umieszczeniem ich w warunkach eksperymentalnych.
  5. Aby wygenerować wystarczającą ilość metabolitów dla frakcji wzbogaconych w mitochondria, należy użyć 300 much na próbkę. Tutaj użyj kobiet, ale płeć może się różnić w innych eksperymentach. Przenieś 150 much do domowej roboty klatki demograficznej o pojemności 1 litra. Zapewnić dostęp do 5 ml pokarmu dla much w fiolce.
  6. Przenieś pozostałe 150 much do innej klatki o pojemności 1 l. Nie zaludniaj klatek więcej niż 150 muchami.
  7. Użyć sześciu powtórzonych próbek na warunki doświadczalne. Ponieważ ekstrakty z całych zwierząt dają więcej metabolitów, aby wygenerować 1 próbkę izolatów całych zwierząt, przenieś 50 samic much do jednej klatki. Jeśli chodzi o izolaty mitochondrialne, należy użyć sześciu powtórzonych próbek na warunki eksperymentalne.
  8. Umieścić klatki w temperaturze 25 °C w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności.
  9. Podawaj świeżą żywność co 2 lub 3 dni w fiolce z 5 ml karmy, aby utrzymać jakość żywności.
  10. Utrzymuj muchy na jedzeniu przez 10 dni. Ten etap jest niezbędny do leczenia rapamycyną7. Inne metody leczenia lub schorzenia będą się różnić.

3. Izolacja frakcji mitochondrialnych

  1. Muchy wysypać z jednej klatki (150 much) do homogenizatora szklano-teflonowego wypełnionego 1 ml schłodzonego buforu izolacyjnego.
  2. Homogenizuj, przesuwając tłuczek w górę iw dół przez 15 pociągnięć. Trzymaj moździerz na lodzie, aby mitochondria pozostały nienaruszone.
  3. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Pobrać sklarowany osad i odwirować w temperaturze 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wzbogacenia mitochondriów.
  5. Ponieważ supernatant zawiera frakcję cytozolową, należy go wyrzucić lub użyć do alternatywnych eksperymentów. Zawiesić osad w 300 μl buforu do przemywania ścieków.
  6. Powtórz kroki 3.1 - 3.5 dla drugiej klatki. Połącz zawieszone granulki z obu klatek w kriogenicznej probówce do mikrowirówki.
  7. Wirować przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzucić supernatant i błyskawicznie zamrozić osad w ciekłym azocie.
  9. Frakcje wzbogacone w mitochondria należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub niższej.
    1. Alternatywnie, w celu przygotowania całych zwierząt, umieść dorosłe osobniki w kriogenicznej probówce wirówkowej. Błyskawicznie zamrozić fiolkę w ciekłym azocie i przechowywać dorosłe osobniki w temperaturze -80 °C lub niższej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, przeprowadziliśmy analizę metabolomiczną frakcji wzbogaconych w mitochondria oraz ekstraktów z całych organizmów, aby zbadać wpływ leku rapamycyny na zróżnicowane mtDNA 7. Podaliśmy 200 µM rapamycyny, rozpuszczając lek w pożywce dla much. Muchy były eksponowane na rapamycynę przez 10 dni. Metabolity z ekstraktów z całych much oraz z ekstraktów mitochondrialnych uzyskano za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC/...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi krokami w tym protokole są: 1) hodowla wystarczającej ilości much w dużej przestrzeni. Bardzo ważne jest, aby nie przeludniać klatek demograficznych z więcej niż 150 muchami każda; 2) częsta zmiana pokarmu w klatkach, aby uniknąć konkurencji pokarmowej i stresu żywieniowego; oraz 3) utrzymywanie wszystkich próbek w temperaturze 4 °C w celu zapewnienia integralności podczas izolacji frakcji mitochondrialnej. Zaleca się również schłodzenie bufora izolacyjnego, buforu płuczącego i homogenizatora szkl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant na rozwój wydziału Uniwersytetu Adelphi oraz R15GM113156 grantowe od NIGMS przyznane EVC, R01GM067862 grantowe od NIGMS oraz R01AG027849 grantowe od NIA przyznane DMR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2% tegosept-4-hydroksybenzoesanVWRAAA14289
EtanolSigma-Aldrich792799
MannitolSigma-AldrichM4125
SacharozaSigma-AldrichS9378
Kwas 3-(N-morfolino) propanosulfonowy (MOPS)Sigma-AldrichM1254 
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich38057 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich5470
KClSigma-AldrichP9333
Tris HClSigma-AldrichRES3098T-B7
KH2PO4Sigma-Aldrich1551139
CO2 klocki do znieczulania muchTritech ResearchMINJ-DROS-FP Klatka
1 LSklep restauracyjny999RD32
Pokrywa klatki 1 LSklep restauracyjny999LRD
homogenizator szklano-teflonowy dounce Fisher ScientificNC9661231
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045
rapamycyna Laboratoria LC R-5000
anty-porinMitoSciencesMSA03
anty-alfa tubulinaBadania rozwojowe Hybridoma Bank12G10
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek Thermo Scientific 23225
Podkładka CO2Tritech Research, IncKolba filtrująca MINJ-DROS-FP
ENASCOSB08184M
korek gumowyS08512Menasco

Bibliografia

  1. Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254(2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolomika Drosophilar nicowe wirowanieizolacja mitochondri wtraktowanie rapamycynekstrakt z ca ych muchmitochondrialne DNAwzbogacanie bia ekprofilowanie metabolit w

Powiązane artykuły