Method Article

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

DOI:

10.3791/53152

⸱

August 29th, 2015

 , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Sunnybrook Research Institute, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy platformę przesiewową do identyfikacji dedykowanych ludzkich kinaz białkowych dla fosforylowanych substratów, które mogą być wykorzystane do wyjaśnienia nowych szlaków transdukcji sygnału. Nasze podejście polega na wykorzystaniu biblioteki oczyszczonych ludzkich kinaz białkowych znakowanych GST oraz rekombinowanego substratu białkowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Wykorzystaliśmy tę technologię do identyfikacji kinazy 2 regulującej powinowactwo MAP / mikrotubul (MARK2) jako kinazy dla miejsca regulowanego glukozą na regulowanym przez CREB koaktywatorze transkrypcji 2 (CRTC2), białku wymaganym do proliferacji komórek beta, a także rodziny kinaz tyrozynowych Axl jako regulatorów przerzutów komórkowych poprzez fosforylację białka adaptorowego ELMO. Opisujemy tę technologię i omawiamy, w jaki sposób może ona pomóc w ustaleniu kompleksowej mapy tego, jak komórki reagują na bodźce środowiskowe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne białek (PTM) są niezbędne do komunikacji wewnątrzkomórkowej. Być może najlepiej zbadaną ze wszystkich PTM jest fosforylacja, katalizowana przez kinazy białkowe, które regulują niezliczone funkcje białek, w tym ich aktywność biochemiczną, lokalizację subkomórkową, konformację i stabilność. Identyfikacja miejsc fosforylacji na białkach docelowych może być dokonana przez mapowanie fosfopeptydów tryptycznych lub za pomocą obecnie standardowych technik proteomicznych przy użyciu próbek wzbogaconych o fosforylowane peptydy 1,2. Podczas gdy oczekuje się, że trzy czwarte eksprymowanego proteomu będzie fosforylowane 3 i zidentyfikowanych 200 000 miejsc fosforylacji 5, z szacunkami do 1 miliona 6, wiele z nich nie ma przypisanej biologii, szlaku sygnałowego ani kinazy białkowej.

Podczas gdy identyfikacja fosforylowanych miejsc jest stosunkowo prosta, stosunkowo większym wyzwaniem jest zidentyfikowanie pokrewnych kinaz, które celują w te miejsca, proces, który nazywamy mapowaniem par kinaza:substrat. Opisano kilka podejść do identyfikacji par kinaza:substrat, zaczynając od kinazy będącej przedmiotem zainteresowania i szukając jej substratów lub zaczynając od interesującego substratu i próbując znaleźć modyfikującą kinazę eksperymentalnie 7-11 lub obliczeniowo 12. Aby zidentyfikować kinazy dla znanego fosforylowanego substratu, bioinformatyka może być wykorzystana do identyfikacji białek, które zawierają krótką konserwatywną sekwencję aminokwasów flankujących fosforylowaną resztę (miejsce konsensusu), a także do identyfikacji kinaz, które tworzą wytrącający się kompleks z substratem. Podejścia te są jednak czasochłonne i często nie spotykają się z sukcesem.

Opracowaliśmy systematyczne podejście funkcjonalne do szybkiej identyfikacji kinaz, które mogą fosforylować dany substrat 13. Test przesiewowy daje doskonałą swoistość, z bardzo wyraźną selekcją potencjalnych kinaz pokrewnych. Biorąc pod uwagę centralne znaczenie fosforylacji dla sygnalizacji biologicznej, badanie przesiewowe jest przydatne do odkrywania praktycznie wszystkich szlaków sygnalizacji komórkowej 14-16. Badanie przesiewowe polega na wykonaniu testu kinazy na dużą skalę z biblioteką ludzkich kinaz białkowych. Kinazy zostały oznaczone białkiem S-transferazy glutationowej (GST) i są oczyszczane z ekstraktów z komórek ssaków, co oznacza, że rekombinowane enzymy - w przeciwieństwie do tych przygotowanych z bakterii - są wytwarzane w obecności kinaz białkowych w górę, często wymaganych do aktywności rekombinowanych enzymów in vitro. Rzeczywiście, podczas gdy aktywność kinazy seryny, treoniny i tyrozyny wymagana do dalszej aktywacji kinazy jest obecna w drożdżach 10, genom drożdży koduje 122 kinazy białkowe, co wskazuje, że kinom ssaków, z ponad 500 genami 17, stał się znacznie bardziej złożony w celu regulacji procesów unikalnych dla organizmów wyższego rzędu. Co więcej, wpływ różnych bodźców istotnych dla biologii komórki i chorób człowieka (takich jak małe cząsteczki, czynniki wzrostu, hormony itp.) może być wykorzystany do 14,15modulowania aktywności kinazy w odpowiednim kontekście.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników, płytek i komórek

  1. Przygotuj 500 ml buforu do lizy: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% TritonX-100, 5 mM beta-glicerofosforanu, 5% glicerolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 mM ditiotreitolu (DTT), 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 1 mM wanadanu sodu. Po tym etapie PMSF nie jest wymagany w żadnym buforze do płukania.
  2. Przygotuj 20 ml 10x buforu kinazy: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glicerofosforanu (FW 216), 2 mM wanadanu sodu. Porcjować w probówkach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać 5 mM DTT.
  3. Przygotować 20 ml 10x buforu M-ATP: 300 μM trifosforanu adenozyny (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl2. Podwielokrotność porcji rozlać do probówek o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować 100 ml 2x dodecylosiarczanu sodu (SDS) buforu do lizy: 1,5 g zasady TRIS, 20 ml glicerolu, 30 mlH2O. Rozpuść i dostosuj pH do 6,8 za pomocą HCl. Dodać 40 ml 10% SDS, dostosuj objętość do 100 ml. Dodać 25 mg błękitu bromofenolowego.
  5. Plamka 4 μl plazmidu ekspresyjnego ssaków o stężeniu 25 ng / μl kodującego kinazę GST 14 na dołek w zestawach 96 płytek dołkowych i odpowiednio płytki znakowane. Uszczelnić i zamrozić płytki w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  6. 1-2 dni przed transfekcją należy przeprowadzić hodowlę komórek HEK293T w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i antybiotykach w inkubatorze o temperaturze 37 °C uzupełnionej CO2 (ostatnie 5%). Przejście z trypsyną i nie pozwól, aby bulion stał się >80% zlewający się podczas ekspansji. Do ekranu wymagane jest co najmniej 6 x 107 komórek (około 3 x 15 cm szalki z HEK293T komórek przy 80% zbieżności).

2. Transfekcja

Uwaga: Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć schemat blokowy całego protokołu.

  1. Jeśli płytki zawierające plazmidy kinazy zostały zamrożone, rozmrozić w temperaturze pokojowej i odwirować przy 1,900 x g przez 3 minuty, aby zebrać wilgoć na dnie studzienek.
  2. Zmieszać 8,6 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. OPTI-MEM) z 312,7 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów. Odstaw na 5 minut.
  3. Dodać 10 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej studzienki za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o małej objętości.
  4. Dodać 10 μl na studzienkę zredukowanej pożywki surowicy/odczynnika do transfekcji z kroku 2.2 za pomocą automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w kasetę o małej objętości. Odstaw na 20 do 45 minut.
  5. Zawiesić komórki 293T przy 7,5 x 105 komórek/ml w 80 ml kompletnego DMEM. Dodać 100 μl zawiesiny komórek (tj. 7,5 x 104 komórek) do dołka za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o standardowej objętości.
  6. Sprawdź studzienki pod mikroskopem pod kątem równomiernego rozmieszczenia komórek i wróć do inkubatora na 24 godziny.

3. Ściąganie kinazy GST

  1. Przygotować świeży: 4 mM roztwór perwanadatu, mieszając 60 μl 0,2 M wanadanu sodu z 540 μlH2O. W drugiej probówce wymieszać 2,7 μl 30% nadtlenku i 1,4 ml PBS. Dodaj oba roztwory razem i odstaw na 15 minut przed użyciem.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej (nie należy używać automatycznego dozownika cieczy, ponieważ powoduje on zbyt duże turbulencje w studzince) dozuje 2 μl 0,25 M CaCl2 do każdej studzienki, a następnie 2,5 μl perwanadatemu przygotowanego w kroku 3.1. Inkubować każdą płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie umieścić na lodzie.
  3. Przygotować 35 ml buforu do lizy, dodając DTT, PMSF i wanadan sodu, jak wskazano w sekcji 1 (Przygotowanie odczynników).
  4. Trzymając talerze na lodzie, usuń pożywkę z każdej studzienki za pomocą aspiratora próżniowego. Natychmiast dodać 50 μl/studzienkę lodowatego buforu do lizy za pomocą automatycznego dozownika cieczy wyposażonego w standardową kasetę. Pozostaw na lodzie na 30 minut do lizy (opcjonalnie: w razie potrzeby można tu zatrzymać, uszczelniając płytkę i przechowując w temperaturze -80 °C. Aby kontynuować, rozmrozić talerze na lodzie).
  5. Obracać płytki przy 1 900 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.
  6. Zeskrob komórki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety i przenieś całą zawartość na odpowiednio oznakowane płytki z 96 dołkami z dnem w kształcie litery V. Obracać płytki przy 1 900 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  7. Podczas wirowania napełnij płytki pokryte glutationem (po jednej na każdą 96-dołkową płytkę) 100 μl/dołek lodowatego buforu do lizy (bez PMSF) jako płukanie. Trzymaj talerze na lodzie.
  8. Wyjmij płytki z dnem w kształcie litery V z wirówki. Pojedynczo odwróć płytki glutationu nad zlewem, aby wytrząsnąć bufor do lizy i osuszyć ręcznikiem papierowym. Przenieść bufor do lizy z płytek z dnem w kształcie litery V na płytki glutationowe, przechylając płytkę i używając pipety wielokanałowej, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie. Przykryj talerze i pozostaw na lodzie na minimum 2 godziny, aby się związały.
  9. Blisko końca 2-godzinnego etapu wiązania należy przygotować stanowisko pracy radioaktywnej, upewniając się, że zastosowano niezbędne środki ostrożności dotyczące pracy radioaktywnej. Ustawić piec do hybrydyzacji na 30 °C.
  10. Przygotować 200 ml buforu do lizy, dodając DTT i wanadan sodu, jak wskazano w sekcji 1. Na tym etapie PMSF nie jest wymagany.
  11. Odwróć płytki glutationu nad zlewem, aby wytrząsnąć bufor do lizy i osuszyć ręcznik papierowy. Przepłukać studzienki 3x 100 μl buforem do lizy (bez PMSF). Nie pozwól, aby studzienki pozostały suche — trzymaj je w płukance, aż będą gotowe do kontynuowania.
  12. Przygotować 55 ml 1x buforu kinazy (KB), rozcieńczając 10x bulion i dodając DTT, jak wskazano w sekcji 1. Przepłukać płytki raz 50 μl 1x KB za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o standardowej objętości. Pozostaw 1x KB w studzienkach, aż roztwór A będzie gotowy:
    1. Przygotuj roztwór A, dodając 500 do 530 μg interesującego Cię substratu, 500 μg zasadowego białka mielinowego (MBP), 2,65 ml 10x KB, 13,25 μl 1 M DTT iH2Odo 15,9 ml.
  13. Pojedynczo odwróć talerze nad zlewem, aby usunąć 1x KB płukania, osusz ręcznikiem papierowym i natychmiast dodaj 30 μl roztworu A za pomocą automatycznego dozownika płynów wyposażonego w kasetę o małej pojemności. Trzymaj talerze na lodzie.
  14. Przygotować roztwór B w obszarze roboczym radioaktywności, dodając 2,5 ml 10x M-ATP, 500 μCi gamma-32P ATP iH2Odo 10 ml.
    1. Dodać 20 μl roztworu B do dołka za pomocą pipety powtarzalnej, która pomaga w mieszaniu dzięki sile wyrzutu. Przykryć i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
  15. Po 30 minutach przenieś talerze z powrotem na lód. Dodaj 50 μl 2x buforu do lizy SDS do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. W tym momencie można przejść do następnego kroku lub uszczelnić płytki folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, aż będzie to wygodne.

4. Żele do biegania, barwienia i suszenia

Uwaga: Wszystkie prace powinny być wykonywane w obszarze przeznaczonym dla radioaktywności.

  1. Włącz piekarnik do hybrydyzacji i ustaw na 85 °C. Rozmrozić talerze w temperaturze pokojowej. Gdy piec osiągnie temperaturę, przenieś płytki do pieca i inkubuj przez 10 minut w celu denaturacji próbek.
  2. Załaduj 26-dołkowe wstępnie oblane żele po 15 μl każdej reakcji za pomocą pipety wielokanałowej, aby napełnić kilka studzienek jednocześnie. Należy zadbać o to, aby wszystkie końcówki dobrze się zrównały z odpowiednimi otworami przed dodaniem próbek. Uruchom żel pod napięciem 150 V. Nie pozwól, aby barwnik śledzący (niebieska linia) spłynął z dna żelu, ponieważ zawiera on niewłączone ATP.
  3. Zdemontuj żele i odetnij niewłączone ATP (niebieska linia) za pomocą skalpela lub prostej krawędzi, ponieważ spowoduje to prześwietlenie folii. Umieść żele w oznaczonych pojemnikach i przykryj bejcą Coomassie na 15 minut.
  4. Usuń plamę Coomassie, krótko spłucz żele wodą i dodaj roztwór odplamiający. Odbarwić żele, aż białka będą wyraźnie widoczne. Dla każdej próbki powinna być widoczna prążek dla MBP i prążek dla substratu.
  5. Aby wysuszyć żele:
    1. Wytnij duży arkusz bibuły filtracyjnej i umieść go na suszarce.
    2. Zwilż arkusz celofanu w wodzie destylowanej, aż będzie gładki i bez zmarszczek, a następnie połóż go na papierze.
    3. Połóż żele na wierzchu arkusza celofanu, notując kolejność żeli. Zwilż drugi arkusz celofanu i ułóż na wierzchu żeli.
    4. Rozwałkuj wszystkie bąbelki (dobrze sprawdza się do tego wałek uszczelniający płytkę), aby uzyskać ładną, jednolitą powierzchnię. Zamknij klapkę, włącz odkurzacz i susz żele przez 3 godziny w temperaturze 80 °C.
  6. Po wyschnięciu żeli wystaw je na folię XAR za pomocą ekranu, aby wzmocnić sygnał. Owiń kasetę folią saran lub plastikową torbą i zaklej taśmą, aby chronić przed szronem. Kasetę należy przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C.

5. Wywoływanie filmów XAR

  1. Następnego dnia wyjmij kasetę z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Wywołaj film w ciemni za pomocą procesora filmu zgodnie z instrukcjami producenta.
    Uwaga: Zbadaj filmy pod kątem dowodów na istnienie par kinaza-substrat. Druga, dłuższa ekspozycja może być również przydatna do wykrywania słabszych zdarzeń fosforylacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki z ekranu są pokazane na rysunku 2. 180 kinaz zostało przebadanych przy użyciu substratu peptydowego znakowanego GST odpowiadającego aa 268-283 z CRTC2, jak również klasycznego substratu do badania kinaz białka zasadowego mieliny (MBP). Tylko dwie kinazy, MARK2 i wysoce spokrewniona kinaza MARK3, fosforylowały peptyd CRTC2. MBP jest uwzględniany jako kontrola wewnętrzna we wszystkich testach, ponieważ zawiera wiele pozostałości fosforylujących i przebiega pod ciśnieniem 18 kDa, w ki...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu oryginalnych publikacji opisujących podejście 14,15, oryginalna biblioteka 180 kinaz GST została rozszerzona do 420 członków, czyli ~80% ludzkiego kinomu białkowego. Dzięki rozszerzonej bibliotece opisany protokół zajmuje 4-5 dni, a następnie 1-4 dni na wywołanie filmów (w razie potrzeby), które można skrócić poprzez zastosowanie fosforobrazowania i cyfrowego wzmocnienia sygnału. Istnieje kilka kluczowych kroków, w których należy zachować ostrożność (patrz rysunek 1 , aby zapoznać się...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez 386634 grantowe NSERC. Chcielibyśmy podziękować członkom Screaton Lab za pomocne dyskusje.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bufor do lizyWyprodukowany w domuPatrz Protokół krok 1.1
10x bufor kinazyWyprodukowany w domuZobacz Protokół krok 1.2
10x M-ATPWyprodukowano w domuZobacz krok protokołu 1.3
Plazmidy ludzkiej kinazyOrfeome, Invitrogen, OrigeneOznaczone GST w domu
96-dołkowe płytkiFisher ScientificCS003595
Komórki 293TATCCCRL-11268
DMEMFisher Scientific SH3002201suplement ze 100  U/ml penicyliny, 100  μ g/ml streptomycyny, 10% płodowa surowica cielęca.
Inkubator CO2SanyoMCO-17AIC
15 cm naczynia do hodowli komórkowychFisher Scientific877224
Zredukowana pożywka surowicyInvitrogen22600-050
Odczynnik do transfekcji na bazie lipidówInvitrogen11668-019
Automatyczny dozownik płynówThermo Scientific5840300
Mała nasadka kasetowaThermo Scientific24073295
Standardowa nasadka kasetowaThermo Scientific14072670
4 mM perwanadateMade in housePatrz krok protokołu 3.1
0,25 M CaCl2Made in house
Pipeta wielokanałowa (20-200 μ l)Labnetp4812-200
Pipeta wielokanałowa (1-10 μ l)Thermo Scientific4661040
Płytki 6-dołkowe z dnem w kształcie litery VEvergreen Scientific290-8116-01V
Płytki 96-dołkowe pokryte glutationemFisher ScientificPI-15240
Piec do hybrydyzacjiBiostad350355
Podłoże oznaczone GSTWyprodukowano w domu
Podstawowe białko mielinowe (MBP)Pipeta SigmaM1891
Repeater (1 ml)Eppendorf22266209
32P gamma-ATPPerkin ElmerBLU502Z500UC
2x bufor do lizy SDS (100  ml)Wyprodukowano we własnym zakresieZobacz protokół krok 1.4
26-dołkowe prefabrykowane żele TGX WymaganyBioRad567-1045zależy od masy cząsteczkowej interesującego podłoża
Bejca CoomassieWykonana w domu0,1% Coomassie R250, 10% kwas octowy, 40% metanol
Coomassie destainWykonane we własnym zakresie10% kwas octowy, 20% metanol
Oznaczone pojemniki na żelWyprodukowano we własnym zakresieUżywane plastikowe pokrywki z pustych pudełek na końcówki, wystarczająco duże, aby pomieścić jeden żel
Bibuła filtracyjna WhatmanFisher Scientific57144
Arkusze celofanu (2)BioRad165-0963
Suszarka do żeluLabconco4330150
Podwójna emulsyjna folia autoradiograficznaVWRIB1651454
Kaseta filmowaFisher ScientificFBAC-1417
Ekran intensyfikującyFisher ScientificFBIS-1417
Wałek gumowy uszczelniającypłytę SigmaR1275
procent żelu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).
  2. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
  3. Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
  4. Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
  5. Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
  6. Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
  7. Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
  8. Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
  9. Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
  10. Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
  11. Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
  12. Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247(2013).
  13. Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
  14. Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
  15. Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
  16. Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
  17. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase Substrate IdentificationHigh Throughput ScreeningGST Kinase PulldownProtein Kinase LibrarySubstrate Phosphorylation AnalysisGel ElectrophoresisAutoradiography DetectionKinase Specificity ValidationSignal Transduction MappingCell Based Validation

Related Articles