Artykuł metodologiczny

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53157

⸱

30 października 2015

 ,  , 
1Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Streszczenie

Limfocyty T są niezwykle specyficzne i skuteczne w rozpoznawaniu antygenów w postaci peptydów osadzonych w cząsteczkach MHC (pMHC) na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Dzieje się tak pomimo tego, że receptory antygenu komórek T (TCR) wywierają zwykle umiarkowane powinowactwo (zakres μM) do antygenu, gdy wiązanie mierzy się in vitro1. Ze względu na parametry molekularne i komórkowe przyczyniające się do wrażliwości antygenu komórek T, opracowano metodologię opartą na mikroskopii jako sposób monitorowania wiązania TCR-pMHC in situ, ponieważ zachodzi ono w synapsie żywej komórki T oraz sztucznej i funkcjonalizowanej dwuwarstwowej płaskiej warstwy lipidowej (SLB) na podłożu szklanym, która naśladuje błonę komórkową komórki prezentującej antygen (APC) 2. Pomiary opierają się na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między przesuniętym do niebieskiego i czerwonego barwnikiem fluorescencyjnym dołączonym do TCR a pMHC. Ponieważ wydajność FRET jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między barwnikami, można wykorzystać sygnały FRET do wizualizacji synaptycznego wiązania TCR-pMHC. Czułość podejścia mikroskopowego wspomaga wykrywanie zdarzeń FRET w postaci pojedynczej cząsteczki. Pozwala to określić powinowactwo i niewspółczynniki interakcji synaptycznych TCR-pMHC, a co za tym idzie, interpolować szybkość wiązania. Analogiczne testy można zastosować do pomiaru innych interakcji receptor-ligand w ich naturalnym środowisku.

Wprowadzenie

Głębsze zrozumienie mechanizmów rozpoznawania antygenów przez limfocyty T wymaga analizy odpowiedniego obszaru, a mianowicie synapsy immunologicznej tworzącej się między limfocytem T a APC. W tym miejscu kinetyka wiązania molekularnego nie jest określana wyłącznie przez immanentne właściwości biochemiczne zaangażowanych partnerów oddziaływania, lecz w dużym stopniu zależy od parametrów komórkowych, do których należą siły komórkowe, architektura błony i oddziaływania lateralne między białkami błonowymi, a także specyficzne dla synapsy ograniczenia geometryczne 3. Podejścia biochemiczne mają ograniczoną rozdzielczość, ponieważ wymagają one naruszenia co najmniej jednej z zaangażowanych błon synaptycznych. Z tego powodu opracowano metodologię obrazowania opartą na FRET, aby monitorować wiązanie TCR z antygenowymi pMHC 2. W tej metodzie limfocyty T są znakowane rekombinowanym i specyficznie w danym miejscu znakowanym fragmentem przeciwciała jednowątkowego (scFV) reaktywnego z TCRβ i konfrontowane z płaskimi, wspartymi na szkle dwuwarstwami lipidowymi (SLB), które zawierają cząsteczki MHC klasy II obciążone fluorescencyjnie znakowanym peptydem antygenowym, cząsteczki kostymulujące oraz białka adhezyjne. Wiązanie synaptyczne między znakowanym barwnikiem TCR a znakowanym barwnikiem pMHC skutkuje wystąpieniem FRET, co można monitorować w skali zbiorczej oraz pojedynczych cząsteczek za pomocą mikroskopii TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence).

W niniejszym artykule szczegółowo wyjaśniono, jak wykorzystać SLB do badania synaps limfocytów T, weryfikować ich integralność za pomocą funkcjonalnego testu napływu jonów wapnia w limfocytach T, przeprowadzać pomiary FRET w skali masowej oraz z czułością na poziomie pojedynczych cząsteczek, a także analizować pozyskane dane. Przedstawiono zalecenia dotyczące otrzymywania białek o prawidłowej konformacji, niezbędnych do funkcjonalizacji dwuwarstwy. Po bardziej szczegółowe informacje dotyczące formowania dwuwarstwy oraz konfiguracji odpowiedniego mikroskopu TIRF należy odnieść się do dodatkowej publikacji JoVE z otwartym dostępem, wydanej równolegle 4.

Charakterystyka SLB

Funkcjonalizowalne SLB można łatwo wytworzyć z pęcherzyków jednowarstwowych (SUVs) zawierających dwa lipidy: 1-palmitoylo-2-oleoylo-sn-glicero-3-fosfocholinę (skrót: POPC, 90-99%) oraz 1,2-dioleoylo-sn-glicero-3-{[N(5-amino-1-karboksypentylo) iminodiacetowy kwas] succynylowy} (skrót: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs rozprzestrzeniają się na czystych szkiełkach przedmiotowych, tworząc ciągłą płaską dwuwarstwę 4. DGS-NTA-Ni służy do kotwiczenia białek z tagiem polihistydynowym poprzez tworzenie kompleksów z syntetyczną grupą głowową zawierającą NTA-Ni (Rycina 1A). W celu uzyskania stabilnego powiązania zazwyczaj zastępuje się natywną domenę transbłonową i ogon cytoplazmatyczny białka adhezyjnego ICAM-1 oraz cząsteczki kostymulującej B7-1 tagiem zawierającym dwanaście histydyn (ICAM-1-12H, B7-1-12H) (Rycina 1B). Załadowana peptydem cząsteczka klasy II I-Ek składa się z dwóch osadzonych w błonie (α i β) łańcuchów polipeptydowych. Domeny transbłonowe/cytoplazmatyczne obu łańcuchów muszą zostać zastąpione tagiem zawierającym po sześć histydyn (I-Ekα6H β6H lub I-Ek-2x6H). Alternatywnie, przedłużenie łańcucha α dwunastoma histydynami i pozostawienie domeny zewnątrzkomórkowej łańcucha β bez tagu (co daje I-Ekα12H β0H lub I-Ek-12H) przynosi satysfakcjonujące wyniki (Rycina 1B).

Specyficzne dla miejsca znakowanie pMHC

Ważne jest, aby pMHC znakować stechiometrycznie i specyficznie w odniesieniu do miejsca wiązania, aby móc przeliczyć zmierzone wydajności FRET na istotne stałe wiązania równowagowego. Można to osiągnąć poprzez chemiczne znakowanie syntetycznego peptydu, który jest wprowadzany do szczeliny wiążącej peptyd rekombinowanych cząsteczek MHC klasy II z oznakowaniem histydynowym 2,5. Peptyd zawiera wszystkie reszty epitopu limfocytów T oraz krótki linker C-terminalny (GGS), po którym następuje cysteina (np. w peptydzie cytochromu c ćmy (MCC) ANERADLIAYLKQATK-GGSC linker zaznaczono pogrubieniem). Cysteina ta służy do stechiometrycznego znakowania peptydu przy użyciu pochodnych maleimidu z barwnikiem. Na tym etapie szczególną uwagę należy poświęcić weryfikacji ilościowego sprzężenia barwnika z peptydem zawierającym cysteinę. Zaleca się oczyszczanie adduktu peptyd-barwnik metodą HPLC, po której powinno nastąpić badanie spektrometrią mas z jonizacją elektrospray. Wszelkie zarejestrowane masy odpowiadające substratowi peptydowemu (bez barwnika) świadczą o niepełnym znakowaniu. W takim przypadku oczyszczony metodą HPLC peptyd należy poddać kolejnym rundom znakowania barwnikiem, aż do momentu, gdy znakowanie zostanie uznane za ilościowe. Należy pamiętać, że należy unikać spektrometrii mas MALDI-TOF, ponieważ metoda ta wykorzystuje promieniowanie laserowe do jonizacji próbki. Zabieg ten rozkłada przyłączone wrażliwe fluorofory przed odczytem masy peptydu, co prowadzi do niedoszacowania stopnia koniugacji z barwnikiem.

Pośrednie, lecz specyficzne dla miejsca znakowanie receptorów TCR związanych z komórkami przy użyciu monowalentnych fragmentów jednoprzestronowych FV

Specyficzne miejscowo przyłączanie barwników do białek związanych z powierzchnią żywych komórek wciąż stanowi wyzwanie. Aby pokonać tę trudność w przypadku eksponowanych na powierzchni TCR, skonstruowano monowalentną wersję jednopodziałową (scFV) na podstawie genów przeciwciała monoklonalnego H57-197 reaktywnego wobec TCRβ 2. Struktura krystaliczna tego przeciwciała w kompleksie z TCR pozwala na racjonalne zaprojektowanie wersji, w której reszta seryny w bliskim sąsiedztwie C-końca peptydu związanego z MHC (gdzie przyłączony jest odpowiadający mu barwnik partner FRET) zostaje zastąpiona resztą cysteiny. Ta zmutowana cysteina służy następnie jako akceptor do koniugacji z barwnikiem (Rysunek 2).

Metody rejestracji FRET

Wartości FRET w pomiarach zbiorczych najlepiej nadają się do weryfikacji zależności między wybranymi odległościami między barwnikami a wydajnością FRET zmierzoną w tym układzie wiązania TCR-pMHC 2. Ponadto pomiary FRET w skali zbiorczej ujawniają jakościowe i ilościowe różnice w powinowactwach TCR-pMHC w obrębie synapsy (patrz poniżej oraz sekcja 3.2 protokołu). W literaturze opisano różne podejścia do kwantyfikacji wydajności FRET 6. W niniejszym artykule FRET jest rejestrowany za pomocą

(a) powrót fluorescencji donora po wybieleniu akceptora, oraz poprzez

(b) uwrażliwiona emisja akceptora FRET.

Pierwsza metoda (a) wymaga użycia akceptora FRET, który ulega łatwemu fotobleachingowi, oraz donora, który jest stosunkowo fotostabilny. Dodatkowo ważne jest zapewnienie, aby fotowybealony akceptor nie był już zdolny do wygaszania fluorescencji donora. Ponieważ do kwantyfikacji wykorzystuje się ten sam kanał detekcji (donora), nie trzeba brać pod uwagę czynników korekcyjnych ani aberracji chromatycznych, co czyni tę metodologię prostą i niezawodną. Jednakże pomiary ilościowe nie mogą być powtarzane w tym samym punkcie preparatu, a zmiany FRET nie mogą być rejestrowane w czasie. Aby uniknąć efektów spowodowanych dyfuzją molekularną lub ruchliwością komórkową, należy dążyć do szybkiego etapu bleachingu, co zminimalizuje czas upływający między akwizycją pierwszego obrazu donora FRET (przed bleachingiem akceptora) a drugiego obrazu donora FRET (po bleachingu akceptora FRET). Zaleca się zastosowanie mocnego źródła światła laserowego o długości fali wzbudzenia akceptora FRET, aby zminimalizować czas naświetlania i bleachingu.

W przeciwieństwie do tego, w podejściu polegającym na pomiarze emisji uwrażliwionej FRET (b), wzbudzany jest donor FRET, a emisja akceptora FRET jest obserwowana w kanale akceptora FRET. Zmiany sygnału akceptora FRET mogą być rejestrowane w czasie, jednak emisja donora FRET do przesuniętego w stronę czerwieni kanału akceptora (tzw. bleedthrough) oraz wzbudzenie krzyżowe akceptora FRET poprzez wzbudzenie donora muszą zostać dokładnie określone i odjęte od zarejestrowanego sygnału w kanale akceptora FRET. W tym celu odpowiednie obrazy donora FRET i akceptora FRET muszą zostać wyrównane przestrzennie.

Detekcja zdarzeń smFRET (FRET pojedynczych cząsteczek)

Dzięki zastosowaniu laserów jako źródła wzbudzenia, czułej kamery oraz mikroskopii TIRF z tłumieniem szumów, fluorescencję pojedynczych fluoroforów można łatwo śledzić w czasie. Podobne zasady obowiązują w przypadku detekcji międzycząsteczkowych zdarzeń smFRET. Niemniej jednak komplikacje mogą być powodowane przez przesączanie sygnału donora FRET oraz wzbudzenie krzyżowe akceptora FRET, dlatego podczas dostosowywania gęstości fluoroforów w eksperymencie smFRET należy zachować szczególną ostrożność.

W poniższym protokole (sekcja protokołu 4) jako donor FRET wybrano TCR w dużym stężeniu, a jako akceptor FRET pMHC w niskim stężeniu. Aby wystarczająco zredukować przesłuch (bleedthrough) donora FRET, należy oznakować 10-30% cząsteczek TCR fluorescencyjnym scFV, a 90-70% cząsteczek TCR niefluorescencyjnym scFV. W tym przypadku kanał akceptora FRET wybrano jako kanał pojedynczych cząsteczek, ponieważ jest on konfokalny z kanałem smFRET. Pomaga to powiązać zdarzenia smFRET z pojedynczymi cząsteczkami akceptorów FRET, co stanowi podstawę walidacji smFRET.

Wyznaczanie stałych dysocjacji synaptycznych za pomocą pomiarów smFRET

Podczas wyznaczania okresu półtrwania oddziaływań z przebiegów FRET pojedynczych cząsteczek należy uwzględnić fotoblaknięcie zarówno donora, jak i akceptora FRET. Liczba obserwowalnych sygnałów FRET w momencie pojawienia się pojedynczej pary donor-akceptor N(0) ulega w czasie zmniejszeniu zarówno w wyniku dysocjacji kompleksu receptor-ligand, jak i fotoblaknięcia. Liczbę kompleksów utrzymujących się w danym czasie N(t) można wyrazić matematycznie w następujący sposób:

Wzór na zanik populacji; N(t) = N(0)exp(-t/τ_bleach)exp(-t/τ_off); wyjaśnienie fotowybielania.

W członie fotoblaknięcia exp(-t/τbleach) czas t jest opisany jako iloczyn liczby obserwacji n oraz czasu naświetlania till, ze względu na nieciągły, dyskretny tryb obserwacji (t.j. blaknięcie zachodzi tylko podczas naświetlania). W członie kinetycznym exp-(t/τoff) czas t jest iloczynem liczby obserwacji n oraz czasu tlag dla pojedynczej obserwacji FRET (t.j. kinetyczne rozłączenie zachodzi w sposób ciągły). Równanie 1 można zapisać jako:

Równanie zaniku fluorescencji białka, N(t)=N(0)exp(-ntfit/tbleach)exp(-ntflag/toff).

Termin τbleach/τill opisuje liczbę obserwacji do momentu wystąpienia blaknięcia i jest zdefiniowany jako wartość oczekiwana bleach> jego funkcji wykładniczej. Równanie 2 można uprościć w następujący sposób:

Równanie procesu rozpadu, funkcja wykładnicza, zależność od czasu, formuła symboliczna, analiza naukowa.

Wartość oczekiwana lag)> liczby klatek N(t) z obserwowalnymi zdarzeniami FRET po czasie t jest wyznaczana bezpośrednio z eksperymentu. Zależy ona od ustawionego czasu między obserwacjami (tlag) wybranego w eksperymencie oraz nieznanych wartości τoff (odwrotności stałej szybkości dysocjacji koff) oraz bleach>, czyli wartości oczekiwanej liczby obserwacji przed wystąpieniem fotowyblaknięcia.

Zatem obliczenie wartości oczekiwanej lag)> dla co najmniej dwóch wartości tlag umożliwia eksperymentalne wyznaczenie bleach> oraz τoff.

Wyznaczanie synaptycznych wartości 2D-KD za pomocą pomiarów opartych na FRET

Pomiar stopnia zajętości TCR, t.j. stosunku związanych TCR do całkowitej liczby TCR, jest kluczowy dla wyznaczenia wartości synaptic 2D-KD. Zgodnie z równaniem 4 termin ten jest wprost proporcjonalny do zmierzonej wydajności FRET, pod warunkiem że TCR pełnią rolę donorów FRET, a pMHC rolę akceptorów FRET.

Wzór na wydajność FRET a=FRET yield·c; powiązany z analizą FRET (transferu energii rezonansowej Förstera).

gdzie a = stopień zajęcia TCR, C = współczynnik konwersji

C jest stałą, która zależy od systemu FRET oraz zastosowanych fluoroforów. Można ją wyznaczyć eksperymentalnie, jak pokazano poniżej. Wartość a może zostać przekształcona w 2D-KD zgodnie z równaniem 5, jeżeli znana jest początkowa gęstość ligandów TCR przed dodaniem limfocytów T do dwuwarstwy. Wynika to z wysokiej mobilności białek przyłączonych do SLB oraz z faktu, że SLB stanowią niemal niewyczerpalny rezerwuar ligandów 2.

Równanie dla dwuwymiarowej stałej dysocjacji równowagowej, obejmujące stężenie pMHC i zmienną 'a'.

gdzie [pMHC initial] = początkowe zagęszczenie pMHC przed dodaniem limfocytów T

Wykorzystując równania 4 i 5 można teraz łatwo wyznaczyć synaptyczne 2D-KD pomiędzy TCR a pMHC. Najbardziej wiarygodnie przeprowadza się to za pomocą pomiarów FRET opartych na regeneracji donora po wybieleniu akceptora (patrz sekcja protokołu 3.1).

Aby jednak zmierzyć C, należy określić zależność między intensywnością FRET IFRET (skorygowaną o tło, przenikanie sygnału donora FRET oraz wzbudzenie krzyżowe akceptora FRET) a stopniem zajętości TCR. W tym celu konieczna jest znajomość stosunku R między średnią intensywnością fluorescencji pojedynczych fluoroforów donora FRET związanych z TCR (np. Cy3 lub AF555) sm IFRET donor a średnią intensywnością zdarzeń FRET pojedynczych cząsteczek sm IFRET. Wartość R zależy od rozważanego układu FRET, filtrów emisyjnych oraz kamery użytej do detekcji fluorescencji.

Stopień zajętości TCR można następnie bezpośrednio wyznaczyć zgodnie z równaniem 6.

Obliczanie wiązania TCR-pMHC; równania do analizy FRET; badanie oddziaływań biologicznych.

gdzie R = sm IFRET donor / sm IFRET

R określono jako 1,45 dla układu H57 scFv- Cy3/pMHC-Cy5, co prowadzi do:

a= całkowity IFRET/ całkowity ITCR-cy3 • 1,45

Zależność między stopniem zajętości TCR a wydajnością FRET można określić poprzez odzyskiwanie sygnału donora FRET po wybieleniu akceptora. W tym celu oba parametry naniesiono na wykres dla liczby mikroklastrów TCR, jak pokazano na ryc. 4A. Nachylenie dopasowania liniowego wskazuje współczynnik konwersji C (z równania 4).

Jak pokazano na Rysunku 4A, wartości C dla (a) układu FRET H57 scFV- Cy3/pMHC-Cy5 oraz (b) zastosowanej konfiguracji systemu mikroskopowego wynoszą 1,995. Stopień zajętości TCR a można łatwo wyznaczyć w następujący sposób:

Zajętość TCR a = FRET yield • 1.995

Protokół

1. Produkcja białka

1.1. Białka zakotwiczone w dwuwarstwie: B7-1, ICAM-1, pMHC (np. I-Ek/peptyd)

  1. B7-1 -12H, ICAM-1-12H
    1. Wyrazić konstrukty B7-1-12H i ICAM-1-12H w dużych ilościach jako wydzielane białka natywne z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego bakulowirusowego.
    2. Oczyścić białka z nadsączów hodowlanych za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-NTA, a następnie anionowymiennej chromatografii MonoQ oraz chromatografii wykluczania S200.
    3. Znakować jedną porcję oczyszczonego białka barwnikami reaktywnymi wobec grup aminowych, takimi jak preparaty NHS-esteru sukcynimidylowego Alexa Fluor 488 (lub FITC), Alexa Fluor 555 (lub Cy3), Alexa Fluor 647 (lub Cy5).
    4. Po chromatografii wykluczania S200 określić stopień znakowania białek monomerycznych zgodnie ze specyfikacją producenta barwnika, porównując absorbancję białka przy 280 nm i absorbancję barwnika przy 488 nm (Alexa Fluor 488, FITC), 555 lub 552 nm (Alexa Fluor 555 lub Cy3) lub 647 nm (Alexa Fluor 647 lub Cy5).
      Uwaga: Współczynnik ten będzie później potrzebny do wyznaczenia gęstości białek na SLB na podstawie całkowitego sygnału fluorescencji białka znakowanego barwnikiem.
    5. Przechowywać białka nieznakowane i znakowane fluoroforami w temperaturze -20°C w PBS z dodatkiem 50% glicerolu.
  2. pMHC (tutaj: I-Ek -2x6H lub I-Ek-12H)
    1. Przeprowadzić refolding MHC klasy II z ciałek inkluzyjnych wyrażonych w E.coli w obecności znacznie tańszego, usuwalnego pod wpływem UV zamiennika peptydowego, który może zostać później ilościowo wymieniony na wybrany peptyd sprzężony z fluoroforem 5,7.
    2. Oczyścić zrefoldowane kompleksy pMHC standardowymi technikami (chromatografia powinowactwa Ni-NTA, anionowymienna chromatografia MonoQ, żelowa filtracja S200).
    3. Wymienić peptyd usuwalny pod wpływem UV na peptyd fluorescencyjny 5,7.
    4. Oczyszczać monomeryczne fluorescencyjne kompleksy pMHC końcowo za pomocą żelowej filtracji S200. Reprezentatywny chromatogram przedstawiono na Ryc. 3.
    5. Zweryfikować ilościowe załadowanie peptydów za pomocą spektrofotometrii.
    6. Przechowywać białka w temperaturze -20°C w PBS/50% glicerolu.

1.2. Generowanie jednoczynnościowych fragmentów przeciwciał (scFVs), wprowadzanie cystein w celu znakowania specyficznego względem miejsca

  1. Przeprowadzić renaturację scFV z ciałek inkluzyjnych ekspresowanych w E.coli. Zastosowano protokół opracowany przez Tsumoto i współpracowników 8, w którym ciałka inkluzyjne są najpierw rozwijane w 6 M chlorku guanidyny, całkowicie redukowane, a następnie renaturowane w ciągu tygodnia poprzez stopniowe zmniejszanie stężenia denaturującego białka chlorku guanidyny.
  2. Skoncentrować prawidłowo sfałdowane scFV przy użyciu jednostek filtracji molekularnej z progiem odcięcia 10 KDa.
  3. Oczyścić koncentrat metodą filtracji żelowej S200.
  4. Oznakować monomerowe scFV barwnikiem Alexa Fluor 647 w obecności 0,05 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) bezpośrednio po oczyszczaniu. Reakcję znakowania najlepiej przeprowadzić w temperaturze pokojowej (RT) przez nie więcej niż 2 h, zachowując stosunek molowy białka do barwnika nieprzekraczający 1:2.
    Uwaga: TCEP jest reduktorem opartym na fosforze i w tych stężeniach nie reaguje z maleimidami 9. Może zatem być obecny podczas reakcji znakowania, aby utrzymać wolną grupę sulfhydrylową w stanie zredukowanym do momentu jej reakcji z pochodną maleimidu barwnika.
  5. Ostatnio oczyścić oznakowane monomerowe scFV metodą filtracji żelowej S75. Reprezentatywny chromatogram przedstawiono na Rysunku 3.
  6. Wyznaczyć stosunek barwnika do białka spektrofotometrycznie.
  7. Przechowywać białka w temperaturze -20°C w PBS/50% glicerolu.

2. Pomiary strumienia wapnia

  1. Należy pobrać nową fiolkę zawierającą 50 µg fura-2-AM i rozpuścić ją w 50 µl bezwodnego DMSO.
  2. Wirować 106 limfocytów T w 5 ml polipropilenowej probówce z okrągłym dnem przez 2 min przy 250-400 g.
  3. Resuspendować limfocyty T w 200 µl medium do obrazowania zawierającego zrównoważony roztwór soli Hanksa z wapniem/magnezem oraz 1% owalbuminy w RT, dodać 1 µl roztworu stokowego fura-2-AM (rozcieńczenie 1:200), wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować w RT przez 30 min.
  4. Przemyć limfocyty T raz w buforze do obrazowania. W tym celu należy napełnić probówkę z komórkami buforem do obrazowania w RT i odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 2. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 200 µl buforu do obrazowania (t.j. przy końcowej gęstości komórek 5 x 106 cells ml-1). Komórki można wykorzystać natychmiast do pomiarów wapnia lub przechowywać na lodzie do 3 h.
  5. Umieścić komórki na funkcjonalizowanej SLB w buforze do obrazowania (37° C). Gdy tylko limfocyty T zaczną kontaktować się z SLB, należy rejestrować następujący zestaw obrazów co 15 do 30 s przez 30 min:
    pobudzenie przy 340 +/- 5 nm, detekcja emisji przy 510 +/- 40 nm
    pobudzenie przy 380 +/- 5 nm, detekcja emisji przy 510 +/- 40 nm
    DIC (opcjonalnie)
    Uwaga: Odpowiednie czasy ekspozycji zależą od intensywności źródła światła pobudzającego. Satysfakcjonujące wyniki uzyskuje się, gdy intensywności pikseli kanału 340 nm (380 nm) wynoszą około jednej czwartej (połowy) maksymalnej możliwej wartości intensywności. Należy pamiętać, że wartości fura-2 pobudzane przy 340 nm będą wzrastać, a pobudzane przy 380 nm będą spadać po aktywacji limfocytów T.
  6. W 20-25 minucie pomiaru dodać 50-100 µl uprzednio ogrzanego przeciwciała blokującego anti-pMHC w końcowym stężeniu 20-50 µg ml-1. Przeciwciało nasyca wszystkie pMHC, w konsekwencji czego limfocyty T przestają rozpoznawać antygen i zaprzestają napływu wapnia. Kontynuować rejestrację obrazów przez kolejne 5 - 10 min, aby uzyskać poziom bazowy wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, który odpowiada stanowi nieaktywowanemu limfocytów T.
  7. Wyznaczyć średni sygnał fluorescencji tła przy pobudzeniu 340 nm i 380 nm w obszarze zainteresowania o wielkości co najmniej 1000 pikseli, który nie zawiera komórek. Odjąć tło od wszystkich zmierzonych obrazów fura-2 pobudzanych przy 340 nm i 380 nm i obliczyć stosunki intensywności 340 nm/380 nm dla poszczególnych komórek lub grupy komórek. Znormalizować stosunki intensywności, dzieląc wszystkie wartości przez stosunek z pięciu ostatnich klatek czasowych (t.j. przy całkowitej blokadzie pMHC przez przeciwciała).
  8. Wykreślić znormalizowane stosunki fura-2 w funkcji czasu. Uwaga: Gdy komórki i dwuwarstwy są w dobrym stanie, stosunki intensywności fura-2 340 nm/380 nm przyjmują zazwyczaj wartości między 2 a 5 w 15-45 s po nawiązaniu kontaktu komórek z dwuwarstwą. Następnie stosunki spadają do wartości między 1,6 a 2, gdzie pozostają stałe przez co najmniej 20 min lub dłużej. Wartości powinny spaść do 1 dopiero po dodaniu przeciwciał anti-pMHC. Typowy przykład przedstawiono na Rysunku 5.

3. Pomiary zbiorczego FRET

3.1. Dekorowanie TCR za pomocą H57scFV

  1. Wirować 106 limfocytów T w 5 ml polipropylenowej probówce z zaokrąglonym dnem przez 2 min przy 250-400 g.
  2. Odlać pożywkę, delikatnie uderzyć w ścianki probówki, aby rozbić osad komórkowy, i dodać 0,3 µl scFV (stężenie ~ 1 mg/ml) do zawiesiny komórkowej. Do pomiarów FRET w skali masowej należy stosować wyłącznie scFv znakowane barwnikiem. Do pomiarów FRET pojedynczych cząsteczek należy użyć mieszaniny nieznakowanego scFv (od 5 do 9 części, nie zawiera nieparzystej cysteiny) i scFv znakowanego barwnikiem (1 część, zawiera jedną nieparzystą cysteinę sprzężoną z barwnikiem).
  3. Inkubować komórki na lodzie przez 15 min i przemyć je dwukrotnie poprzez następujące po sobie wirowania, używając lodowatego buforu do obrazowania.
    Uwaga: Komórki można przechowywać na lodzie bez znaczącej utraty związanych cząsteczek scFV (t1/2 dysocjacji scFV w 0°C wynosi ~ 4 hr 2). Czystość pierwotnych limfocytów T pochodzących z myszy transgenicznych pod kątem TCR (i opcjonalnie z myszy z niedoborem Rag-1/2) i stymulowanych in vitro jest wyższa niż 98%, ponieważ limfocyty T są jedynymi komórkami proliferującymi (do 7 podziałów komórkowych) w odpowiedzi na peptyd dodany do hodowli limfocytów T w celu stymulacji. Limfocyty B ulegają apoptozie i przestają żyć po 7–10 dniach hodowli. Przeżywa kilka komórek dendrytycznych, które można jednak łatwo odróżnić nie tylko ze względu na ich charakterystyczną morfologię, ale także dlatego, że nie wiążą one fragmentu scFV anty-TCR beta H57.

3.2. Pomiar FRET poprzez odzyskiwanie sygnału donora po wybieleniu akceptora

Uwaga: Należy pamiętać, że okres półtrwania kompleksów TCR-H57 scFV wynosi 4 hr w lodzie, 50 min w temperaturze 22.5°C oraz 6.8 min w temperaturze 37°C (i około 4 hr w lodzie) 2. Dopóki H57 scFV pełni rolę donora FRET, mierzone wydajności FRET nie są wrażliwe na dysocjację H57 scFV, jednak stosunek sygnału do szumu wzrasta wraz ze zwiększoną dysocjacją H57.

  1. Przygotować SLB zawierającą pMHC znakowane AF647/Cy5 oraz nieznakowane ICAM-1 i B7 zgodnie z metodą Axmann et al. 4.
  2. Wymienić PBS w komorze obrazowania na medium do obrazowania zawierające zrównoważony roztwór soli Hanksa z dodatkiem wapnia/magnezu oraz 1% owalbuminy. W tym celu pipetować 400 µl buforu do obrazowania do dołka, dokładnie wymieszać i usunąć 400 µl z dołka. Powtórzyć tę procedurę 3-4 razy. Nie wystawiać SLB na działanie powietrza w żadnym momencie.
  3. Umieścić komorę obrazowania na stoliku mikroskopu i dostosować ostrość, aż fluorescencyjne (AF647, Cy5) SLB stanie się wyraźnie widoczne.
  4. Ustawić oświetlenie TIRF, przesuwając skupioną wiązkę równolegle do osi optycznej na obrzeża płaszczyzny ogniskowej obiektywu za pomocą stolika translacyjnego peryskopu.
  5. W celu precyzyjnego dostrojenia wiązek lasera wzbudzającego w trybie TIRF dodać limfocyty T znakowane AF555/Cy3 scFV i pozwolić im osiąść na SLB. Uwaga: Warunki oświetlenia TIRF są spełnione, gdy bazalna błona komórkowa znajduje się w ostrości wraz z SLB, a żadne inne części komórki nie stają się widoczne podczas ustawiania ostrości w górę. Jeśli jednak TIRF nie jest odpowiednio ustawiony, fragmenty fluorescencyjnej błony plazmatycznej limfocytu T, które nie stykają się z SLB, pojawią się w postaci pierścienia. W takim przypadku regulować wiązkę lasera za pomocą stolika translacyjnego peryskopu, aż do uzyskania oświetlenia TIRF.
  6. Pozyskać następujące sześć obrazów w indicated kolejności i w krótkich odstępach czasu (Rycina 6):
    (i1, opcjonalnie) światło białe, aby wykonać obraz komórki,
    (i2, opcjonalnie) wzbudzenie 647 nm (niska moc), aby wykonać obraz akceptora FRET (pMHC) przed impulsem wybielającym,
    (i3) wzbudzenie 514 nm (niska moc), aby wykonać obraz donora FRET (TCR) przed impulsem wybielającym,
    (i4) wzbudzenie 647 nm (wysoka moc), aby fotowybielić akceptor FRET,
    (i5) wzbudzenie 514 nm (niska moc), aby wykonać obraz donora FRET (TCR) po impulsie wybielającym,
    (i6) wzbudzenie 647 nm (niska moc), aby zweryfikować całkowite wybielenie akceptora FRET.
  7. Czas między obrazami (i3) a (i5) powinien być jak najkrótszy, aby umożliwić korelację obrazów podczas późniejszej analizy. Należy zminimalizować wybielenie donora FRET, stosując wzbudzenie przy najniższym możliwym poziomie mocy, który wciąż pozwala na prawidłowe obrazowanie limfocytów T.
  8. Wybrać obszar zainteresowania (ROI), np. całą synapsę lub pojedynczy mikroklastr TCR, i wyznaczyć jego średnią intensywność w (i3) (= I(3)) oraz w (i5) (= I(5)). Do odjęcia tła wybrać ROI o tych samych wymiarach poza plamą oświetlenia w (3) lub (5) i wyznaczyć jego średnią intensywność (I(background)). Aby wyznaczyć wydajność FRET, wykonać następujące działanie:
    Wzór na wydajność FRET; obliczenia procentowe w eksperymencie przeniesienia energii rezonansowej fluorescencji. (równanie 7)
    Uwaga: Należy zaznaczyć, że w odniesieniu do absolutnego poziomu FRET może być konieczna korekta wybielenia donora między obrazami (i5) a (i3).

3.3. Pomiar FRET za pomocą emisji uwrażliwionej

  1. Wykonaj przestrzenną kalibrację kanałów donora i akceptora przy użyciu wielokolorowych kulek, które fluorescują we wszystkich kanałach emisji. Przesunięcie przestrzenne między obydwoma kanałami wynikające z aberracji chromatycznej można określić poprzez superpozycję poszczególnych kulek; należy je zastosować do korekcji jednego z dwóch kanałów dla wszystkich kolejnych par obrazów dwukolorowych 10.
  2. Wyznacz stopień przenikania sygnału donora (bleedthrough) przy użyciu SLB zawierającej wyłącznie fluorofor donora FRET. Możliwe jest również zastosowanie limfocytów T znakowanych donorem FRET na lipidowej dwuwarstwie z nieznakowanym pMHC. Tło wyznacza się najpierw poza oświetlonym polem widzenia, a następnie odejmuje od obu kanałów. W ten sposób wyznacza się średnie intensywności skorygowane o tło dla dwóch odpowiadających sobie obszarów ROI (I kanał donora oraz I kanał akceptora). Oblicz współczynnik przenikania (BTC) w następujący sposób:
    Wzór na stosunek BTC dla wzbudzenia 647 nm i 514 nm; schemat pomiaru fluorescencji. (równanie 8)
    Uwaga: Ten BTC jest stałą dla określonego barwnika i kombinacji zestawu filtrów.
  3. Oblicz obraz przenikania donora FRET w następujący sposób:
    Wzór na przenikanie fluorescencji: image_bleedthrough = BTC • image_donor, równanie ze skorygowanym tłem. (równanie 9)
  4. Wyznacz przekrstonne wzbudzenie akceptora, wzbudzając SLB zawierającą wyłącznie fluorofor akceptora FRET (np. I-Ek/MCC-Alexa Fluor 647) najpierw światłem wzbudzającym donora FRET (np. 514 nm), a następnie światłem wzbudzającym akceptora (np. 647 nm). Użyj obrazów ze skorygowanym tłem w kanale akceptora FRET, aby obliczyć współczynnik przekrstonnego wzbudzenia (CEC) w następujący sposób:
    Równanie CEC dla analizy stosunku wzbudzenia w badaniu spektroskopowym, z wykorzystaniem kanałów 514 nm i 647 nm. (równanie 10)
  5. Ponieważ CEC zależy od natężenia lasera użytego do wzbudzenia donora, należy wyznaczać go w każdym dniu pomiarowym. Wykorzystaj wynikowy CEC do obliczenia obrazu generowanego wyłącznie przez przekrstonne wzbudzenie.
    Schemat równania przekrstonnego wzbudzenia, CEC, wzbudzenie 561 nm, analiza kanału receptora. (równanie 11)
  6. Oblicz obraz FRET skorygowany o przenikanie i przekrstonne wzbudzenie w następujący sposób:
    Wzór na obrazowanie FRET; równanie dla obrazu skorygowanego o tło i przekrstonne wzbudzenie. (równanie 12)
    Uwaga: Bezwzględny sygnał FRET (ale nie względna wydajność FRET) jest wrażliwy na dysocjację H57 scFV z TCR związanego z błoną limfocytów T. Aby uniknąć nadmiernej utraty sondy TCR-FRET, należy dążyć do przeprowadzenia pomiarów w 37°C w ciągu pierwszych 2 min po dodaniu limfocytów T do dwuwarstwy. Pomiary z ilościowym znakowaniem TCR (≥ 95%) są możliwe jedynie w temperaturze 22,5°C lub niższej, w ciągu pierwszych 3 min po dodaniu limfocytów T do dwuwarstwy.

4. Pomiary smFRET pojedynczych cząsteczek

  1. Dostosuj moc obu laserów tak, aby uzyskać natężenie w zakresie 1–5 kW/µm2 do preparatu. Więcej informacji można znaleźć w publikacji Axmanna i wsp. 4.
  2. Oznacz limfocyty T zgodnie z powyższym opisem, używając mieszaniny nieoznaczonych scFvV (5–9 części) oraz scF znakowanego Cy3/AF555V (1 część). Uwaga: W ten sposób tylko ułamek TCR zostaje znakowany donorem FRET. Zmniejsza to liczbę wykrywalnych oddziaływań, ale znacząco redukuje również szum generowany przez przenikanie sygnału donora (o około 51/2 do 101/2), co jest kluczowe przy rozdzielaniu pojedynczych zdarzeń smFRET.
    Uwaga: dysocjacja sondy scFV H57 od TCR nie wpływa na pomiary, ponieważ zachodzi w znacznie dłuższym przedziale czasowym (minuty do godzin) niż dysocjacja TCR od pMHC związanego z SLB (przedział od ułamka sekundy do sekundy).
  3. Umieść na stoliku mikroskopu SLB zawierający pMHC znakowane AF647 oraz ICAM i B7, a następnie wyreguluj ostrość tak, aby dwuwarstwa była wyraźnie widoczna.
  4. Opcjonalnie: Wstawić szczelinową aperturę do drogi wzbudzenia (jak pokazano w Axmann) i wsp. 4) w celu zamaskowania większości pola oświetlenia z wyjątkiem synapsy. W ten sposób nieodbarwione I-EkCząsteczki akceptora FRET /MCC (C)-Alexa Fluor 647 mogą przemieszczać się do obszaru oświetlenia.
  5. Dodaj scFv H57V naniesiono zmodyfikowane limfocyty T na dwuwarstwę (w buforze obrazującym) i oczekiwano na pojawienie się synaps w polu widzenia.
  6. Wykonaj w szybkiej sekwencji od 10 do 20 zestawów obrazów, stosując detekcję dwukolorową:
    i1) wzbudzenie 514 nm
    i2) wzbudzenie 647 nm
  7. Naświetlać obrazy przez czas od 1 do 5 ms i pozyskać je jako zestaw obrazów.
  8. Aby ocenić tożsamość zdarzeń smFRET (FRET pojedynczych cząsteczek), należy zastosować tę samą korekcję dotyczącą przesączania donora i wzbudzenia krzyżowego akceptora. Co więcej, zdarzenia smFRET muszą być zgodne z pojedynczymi cząsteczkami akceptora i powinny pojawiać się oraz znikać w jednym kroku (patrz również Rycina 7).
  9. Wyznaczanie stałej szybkości dysocjacji (off-rate)
    1. Rejestruj przebiegi zdarzeń FRET pojedynczych cząsteczek dla kilku ram czasowych akwizycji.
      Uwaga: w tym przykładzie (kursywą) stała szybkości dysocjacji (off-rate) między TCR 5c.c7 a I-EkWartość /K3 jest mierzona przy 25 °C z czterema różnymi czasami opóźnienia (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms).
    2. Uporządkuj ślady FRET według ich długości, zgodnie z tabelą 1.
    3. Przekształć tabelę 1 w odwrotną funkcję skumulowanego rozpadu (tabela 2) zgodnie z przedstawionym schematem (liczby kolorowe zostały przeniesione z tabeli 1).
    4. Aby znormalizować otrzymaną funkcję zaniku, należy podzielić liczbę śladów z tabeli 2 przez sumę wszystkich śladów w danej grupie. Należy nanieść znormalizowane wartości na wykres w funkcji liczby klatek czasowych. Po pominięciu ostatniej klatki czasowej, która zawiera zero, przebiegi zaników można łatwo dopasować do pojedynczej funkcji wykładniczej (Rycina 8A).
    5. Jak pokazano w Rycina 8B, wykreśl wartość oczekiwaną opóźnienie)> , t. j., ujemna odwrotność wykładnika funkcji zaniku wyznaczonego powyżej w funkcji czasu opóźnienia topóźnienie zastosowano (w tym przykładzie: x= topóźnienie = 0,042 s i y= opóźnienie)> = 1/0,662 = 1,511, x = 0,49 s i y = 1/0,902 = 1,101, x = 1,007 s i y = 1/1,131 = 0,884, x = 1,989 s i y = 1/1,591 = 0,629).
    6. Dopasowanie τwyłączony i wybielacz> na podstawie równania 3. Można to przeprowadzić, wykorzystując funkcję dopasowania nieliniowego w programie do analizy danych naukowych, takim jak Origin.
      Uwaga: najlepiej dopasowana krzywa przedstawiona w tym przykładzie daje τwyłączony wynoszącego 2,12 +/- 0,23 s oraz wybielacz> wynoszącego 1,53 +/- 0,06 s.
    7. Oblicz czas połowicznego rozpadu oddziaływania t50% zniżki z t50% taniej = τwyłączony • ln(2) (w tym przykładzie: 1,47 s).
  10. 2D-KD oznaczenie
    1. Wyznaczenie współczynnika konwersji C dla pary barwników FRET zastosowanej z wykorzystaniem równania 6 i zgodnie z powyższym opisem (Rysunek 4A).
    2. Wyznacz wydajności FRET dla poszczególnych mikroklastrów TCR lub całych synaps (Ryciny 3B i 5).
    3. Przy użyciu równania 4 przekształcono wszystkie poszczególne wydajności FRET na stopień zajętości TCR (Rysunek 4C).
    4. Zastosuj równanie 11, aby przeliczyć wszystkie wartości zajętości TCR na 2D-KDJak wskazano poniżej, wiązanie synaptyczne jest niejednorodne. Sensowną miarą dla synaptycznego KDs to mediana (oznaczona na czerwono) wszystkich zmierzonych mikroklastrów (Rysunek 4D).
  11. Obliczanie 2D-kwłączonys
    1. Oblicz kwłączony zgodnie z prawem działania mas z kwłączony = kwyłączony/KD or eksperymentalnie wyznaczona wartość kwyłączony oraz KD wartości.
      Uwaga: synaptyczny kwyłączony dla eksperymentu przedstawionego w       Rysunek 4 (I-EkInterakcja MCC z TCR 5c.c7 w 25 °C) wynosi 0,41 s-1Zatem KD wykres (Rysunek 4D) można przekształcić w kwłączony wykres przedstawiony na Rycina 4E.

Wyniki

Rejestracja wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą barwnika wapniowego fura-2, a także późniejsza analiza komórkowa w celu weryfikacji potencjału stymulującego, a tym samym funkcjonalności SLB, przedstawione są na Rysunku 4. Jak widać, poziomy wapnia w limfocytach T (wyrażone jako znormalizowany stosunek fura-2 340nm/380nm, gdzie poziom bazowy wynosi 1) wzrastają natychmiast po osiadaniu komórek na stymulujących SLB. Poziomy wapnia powracają do wartości bazowych krótko po dodaniu przeciwciała, które blokuje angażowanie pMHC przez TCR, co kończy aktywację limfocytów T.

Rysunek 6 przedstawia typowy eksperyment obejmujący powrót donora FRET po wybieleniu akceptora, który jest wykorzystywany do pomiaru wydajności FRET i służy do obliczania wartości 2D-KD (pokazanych na Rysunku 4). Należy zwrócić uwagę na wzrost intensywności donora FRET, reprezentującego TCR znakowany AF555, po szybkiej i całkowitej ablacji gatunku akceptora FRET (tutaj: AF647 związany z pMHC). Widoczna jest również silna redukcja w kanale FRET, tj. w kanale akceptora FRET przy wzbudzeniu donora FRET, po wybieleniu akceptora FRET. Ledwo widoczny pozostały sygnał odpowiada przesiąkowi (bleedthrough) donora FRET. Wydajność FRET w obrębie pojedynczych mikroklastrów TCR lub całych synaps jest obliczana na podstawie wskazanych zmierzonych wartości intensywności (Rysunek 6B).

Rycina 7 przedstawia trajektorię i sekwencję czasową zdarzenia FRET pojedynczej cząsteczki widocznego w dwóch ramach czasowych. Jak opisano powyżej we wstępie, takie zachowanie jest spowodowane zarówno rozpadem wiązania synaptycznego TCR-pMHC, jak i fotoblakaniem. Aby rozróżnić te dwa wkłady, należy zróżnicować czas trwania ram akwizycji eksperymentalnej: podczas gdy fotoblakanie pozostaje stałe, zmiany w długości trajektorii zdarzenia FRET są powodowane wyłącznie przez kinetykę wiązania. Ilościowe określenie długości śladów, które stanowią podstawę do obliczenia stałych szybkości dysocjacji oraz blakania przedstawionych na Rycynie 7, podano w tabelach 1–3.

Wyznaczenie 2D-KD wymaga zarejestrowania całkowitych wydajności FRET dla TCR znakowanych donorem FRET. Przy użyciu wyznaczonej eksperymentalnie stałej C (Rycina 4), wydajność FRET zmierzoną dla mikroklastra TCR lub całej synapsy można przekształcić w stopień zajętości TCR a, t.j. stosunek TCR związanych z pMHC do całkowitej liczby TCR (Rycina 4C). Znając gęstość pMHC obecną na SLB przed dodaniem limfocytu T, wartości a można wykorzystać do wyznaczenia synaptycznych wartości 2D-KD (Rycina 4D). Stałe szybkości asocjacji można obliczyć zgodnie z prawem działania mas (2D-kon = 2D-koff/2D-KD) na podstawie wyznaczonych synaptycznych wartości stałej szybkości dysocjacji oraz 2D-KD.

Schemat dwuwarstwy lipidowej z POPC, DGS NTA-Ni; podłoże szklane; metoda znakowania białek fluorescencyjnie.
Rycina 1. Schematyczny zarys płaskiego systemu lipidowych dwuwarstw wspieranych na szkle (SLB). (A) SLB składają się z POPC (90-99%) oraz syntetycznego lipidu DGS Ni-NTA (1-10%) i tworzą się spontanicznie, gdy czyste powierzchnie szklane zostaną naładowane małymi pęcherzykami jednowarstwowymi (SUVs) składającymi się z odpowiednich lipidów. (B) Po utworzeniu takie SLB mogą zostać funkcjonalizowane rozpuszczalnymi fragmentami zewnątrzkomórkowymi z tagiem polihistydynowym pochodzącymi z pMHC, kostymulującymi białkami B7-1 oraz białkami adhezyjnymi ICAM-1, aby służyć jako APC dla limfocytów T. Więcej informacji na temat przygotowania SLB znajduje się w pracy Axmann et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat oddziaływania TCR-pMHC z wykorzystaniem mikroskopii FRET i TIRF do analizy wiązania białek.
Rysunek 2. Test oparty na transferze energii rezonansowej Förstera (FRET) do ilościowego oznaczania wiązania TCR-pMHC in situ. (A) Złożona struktura kompleksu TCR z fragmentem jednocząsteczkowym H57 wiążącym pMHC ilustruje opisaną tutaj metodę opartą na FRET. Należy zwrócić uwagę na krótką odległość wynoszącą około 41Å, oddzielającą dwa odpowiadające sobie fluorofory podlegające FRET. Miejsca akceptorowe dla fluoroforów-maleimidów zaznaczono kolorem zielonym i czerwonym. (B) Przedstawiono zasadę wykrywania oddziaływań TCR-pMHC in situ. Tylko TCR-y i pMHC (tutaj I-Ek) znakowane scFV, które tworzą specyficzne kompleksy, generują mierzalny sygnał FRET. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny, znakowane peptydy, kolumny Superdex, analiza oczyszczania białek.
Rysunek 3. Chromatogramy końcowego etapu filtracji żelowej prowadzącego do uzyskania monomerycznych scFVs oraz cząsteczek I-Ek -2x6H obciążonych peptydami. Osie X reprezentują objętość retencji w ml, osie Y wskazują absorbancję przy 280 nm w jednostkach arbitralnych (AU). (A) scFV H57 znakowany specyficznie w określonym miejscu maleimidem Alexa Fluor 555 poddano chromatografii S75 w celu oddzielenia niezwiązanego barwnika od białka (krok 1.2.5). Frakcje odpowiadające przedziałowi retencji od 14 do 15 ml (linie przerywane) reprezentują znakowane monomeryczne scFV H57. (B) Cząsteczki I-Ek -2x6H w kompleksie z peptydem ANP-space holder, który jest usuwany pod wpływem UV, zostały naświetlone promieniami UV, inkubowane z peptydem znakowanym specyficznie w określonym miejscu maleimidem Alex 647, a następnie poddane chromatografii S200 w celu oddzielenia białka od wolnego peptydu (krok 1.1.2.4). Przedział między liniami przerywanymi zawiera prawidłowo sfałdowane i monomeryczne pMHC. (A, B) Na początku przebiegu (punkt 0 ml) na kolumnę naniesiono 0,7 ml próbki. Zebrane frakcje zostały skoncentrowane. Stosunek białka do barwnika określono za pomocą fotospektrometrii przed dializą przeciwko PBS/50% glicerolu (do przechowywania w -20°). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza zajętości TCR względem wydajności FRET, histogramy, wykresy pokazujące klastry, dane dotyczące kinetyki wiązania.
Rysunek 4. Wyznaczanie 2D-KD oraz 2D-kon. (A) Korelację między wydajnością FRET, wyznaczoną poprzez odzyskiwanie donora po wybieleniu akceptora, a zajętością TCR zmierzono eksperymentalnie. Zajętość TCR można wyznaczyć dla pojedynczych mikroklastrów TCR, zgodnie z wyjaśnieniami w sekcji 4.2. Dopasowanie liniowe danych przedstawiono linią, której nachylenie odpowiada stosunkowi C między zajętością TCR a wydajnością FRET. C jest stałą specyficzną dla systemu FRET i zastosowanych fluoroforów (tutaj Cy3 i Cy5). W tym przykładzie wyniosła ona 1,988. (B) Dane dotyczące wydajności FRET wyznaczono dla pojedynczych mikroklastrów TCR (N = 187, temperatura = 24 °C) poprzez odzyskiwanie donora po wybieleniu akceptora. Liczby pod słupkami histogramu wskazują górną granicę przedziału. (C) Przeliczenie danych pokazanych w (B) poprzez pomnożenie zmierzonych wydajności FRET przez stałą C wyznaczoną w (A). Liczby pod słupkami wskazują górną granicę przedziału. (D) Histogram (półlogarytmiczny, podstawa = 4) przedstawiający rozkład wartości 2D-KD zmierzonych dla pojedynczych mikroklastrów TCR. Medianę 2D-KD zaznaczono na niebiesko. Liczby pod słupkami wskazują górną granicę przedziału. (E) Histogram pokazany w (D) został przekształcony w histogram 2D-kon (półlogarytmiczny, podstawa = 4) przy zastosowaniu synaptycznej wartości koff dla 24 °C (0,41 s-1). Wyznaczoną medianę wartości 2D-kon zaznaczono na niebiesko. Dane zostały pierwotnie opublikowane w pracy Huppa et al.2 i są tutaj przedstawione w nowym formacie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie wapnia za pomocą Fura-2 i analiza stosunku; odpowiedź limfocytów T w czasie; dane mikroskopowe i wykresy.
Rycina 5. Walidacja funkcjonalna SLB zastosowanych do stymulacji i obrazowania limfocytów T. (A) Blasty limfocytów T transgenicznych TCR naładowane fura-2 zostały poddane działaniu stymulujących SLB zawierających antygenowe pMHC, ICAM-1 i B-7. Zarejestrowano emisję fura-2 z komórek przy pobudzeniu 340 nm i 380 nm oraz obrazy DIC. Jak wskazano, wartości stosunku intensywności emisji pobudzonej przy 340 i 380 nm przedstawiono na prawym panelu. Dodanie przeciwciał blokujących pMHC w 14 minucie przebiegu eksperymentu spowodowało spadek wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia do poziomu porównywalnego z limfocytami T w stanie spoczynku. (B) Typowy profil czasowy średnich stosunków fura-2 w limfocytach T kontaktujących się ze stymulującymi SLB charakteryzuje się początkowym wzrostem wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, który jest od 2 do 4 razy wyższy w porównaniu z nieaktywowanymi limfocytami T lub limfocytami T pozbawionymi antygenu po blokadzie za pośrednictwem przeciwciał. Zielone kółka wskazują punkty czasowe zilustrowane w części (A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopii FRET, wzbudzenie/emisja DNA, schemat kanałów, analiza wydajności FRET w synapsie.
Rysunek 6. Zbiorcze wydajności FRET mierzone poprzez odzyskiwanie donora FRET po wybieleniu akceptora FRET. (A) Przedstawiono przykład typowego pomiaru FRET w synapsie. Jak wskazano po lewej stronie i u góry, seria obrazów została pozyskana przy użyciu dzielnika wiązki emisji, co pozwoliło na uzyskanie kanału donora FRET i kanału akceptora FRET (szczegółowe informacje na temat dzielników wiązki znajdują się u Axmann et al4). Linia pokazana na lewym obrazie DIC wskazuje granicę synapsy komórki T. Należy zwrócić uwagę na spadek intensywności w kanale akceptora FRET, a także wzrost intensywności w kanale donora FRET po wybieleniu akceptora FRET (krok 4). (B) Efektywności FRET mogą być kwantyfikowane, jak wskazano, dla poszczególnych obszarów synaptycznych lub dla całych synaps. Do celów weryfikacji, obrazy przed i po wybieleniu akceptora FRET przedstawiono z użyciem dwóch tabel mapowania kolorów (LUTs, green i physics). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy FRET: kanały sm FRET i Alexa 647 w czasie; fluorescencyjny rezonansowy transfer energii.
Rycina 7. Zdarzenia FRET pojedynczych cząsteczek pojawiają się i znikają w pojedynczych krokach i są idealnie zsynchronizowane z pojedynczym fluorophorem akceptorem FRET. Przedstawiono przebieg czasowy zdarzenia FRET pojedynczej cząsteczki. Obrazy zostały pozyskane przy użyciu kamery EMCCD z podświetleniem tylnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres zaniku wykładniczego pokazujący wpływ opóźnienia czasowego na wykrywalne zdarzenia; analiza danych, dopasowanie krzywych.
Rysunek 8. Wyznaczanie τoff = 1/ koff z pomiarowych trajektorii smFRET. (A) Znormalizowane sumy skumulowane obserwowalnych sygnałów FRET (pochodzące z blastów transgenicznych limfocytów T TCR 5c.c7 znakowanych H57 scFV-AF555 rozpoznających I-Ek/K3-AF647 w 24°C) dla czterech różnych opóźnień czasowych (42 msec, 490 msec, 1,007 msec, 1,989 msec) przedstawiono jako funkcję całkowitej liczby obserwacji. Funkcje dopasowania mono-wykładniczego pozwalają na wyznaczenie odpowiadających im ujemnych odwrotności wartości oczekiwanych lag)>. (B) Wartości oczekiwane wykreślono w funkcji opóźnień tlag i dopasowano za pomocą równania <n(tlag)> = τoff /{(τoff /<nbleach>) + tlag}, aby otrzymać τoff oraz bleach>. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Pomiar interakcji białko-białko in situ jest wysoce pożądany, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z interakcjami o niskim powinowactwie, takimi jak wiązanie TCR-pMHC 11. Dzieje się tak dlatego, że na szybkość i stabilność takich interakcji znaczący wpływ mają szczególne okoliczności, w których odbywa się wiązanie. Minimalnie inwazyjne metody obrazowania oparte na FRET są zatem w zasadzie doskonale przystosowane do takich zadań, ale wiążą się z szeregiem przeszkód, które należy najpierw pokonać. Szum generowany przez autofluorescencję komórkową ogranicza czułość pomiarów i dlatego powinien być utrzymywany na minimalnym poziomie. Mikroskopia TIRF bardzo dobrze zaspokaja tę potrzebę 12 , ale wymaga funkcjonalizacji szkiełek, najlepiej w postaci płaskiej dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym, ozdobionej białkami z wyboru 13-15. Kolejną zaletą podejścia częściowo rekonstytutywnego jest to, że rekombinowani partnerzy FRET rezydujący w dwóch warstwach mogą być znacznie łatwiej znakowani w ilościowy, specyficzny dla miejsca i racjonalny sposób za pomocą mniejszych i jaśniejszych fluoroforów niż byłoby to możliwe w przypadku białek ulegających ekspresji na powierzchni komórki. TCR są znakowane rekombinowanymi scFVs, które nie wpływają na rozpoznawanie limfocytów T, jak to było testowane wcześniej 2. Co więcej, skład białkowy SLB, na przykład gęstość pMHC i wybór czynników dodatkowych, można dostosować do konkretnych potrzeb. Wcześniej przeprowadziliśmy eksperymenty z różnymi gęstościami stymulujących pMHC, ale nie wykryliśmy istotnych różnic w 2D-koff i 2D-KD2.

Do tej pory rozpoznawanie cząsteczek MHC klasy II zajmowało się tylko tym, głównie ze względu na charakter ich szczeliny wiążącej peptydy, która jest otwarta na obu końcach, a zatem mieści większe peptydy, w tym łącznik do przyłączania fluoroforu. W niektórych przypadkach takie podejście może również sprawdzić się w przypadku znakowania cząsteczek MHC klasy I 16 , ale należy zachować dużą ostrożność w celu sprawdzenia ich zastosowania w eksperymentach. Dodanie łącznika i fluoroforu do peptydu nie powinno mieć wpływu na wrażliwość limfocytów T na antygeny, które można zmierzyć za pomocą testów proliferacji komórek T, jak również kinetykę wiązania pMHC-TCR mierzoną in vitro za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Alternatywnie, same cząsteczki MHC klasy I mogą być znakowane w sposób specyficzny dla miejsca z wprowadzeniem niesparowanej cysteiny w sekwencji łańcucha ciężkiego (niepublikowane obserwacje).

Za pomocą odpowiednich sond molekularnych każde oddziaływanie białko-białko synaptyczne może być w zasadzie badane w sposób opisany w niniejszym dokumencie. Takie sondy, np. scFVs lub Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins)17, powinny być monowalentne i powinny stabilnie wiązać swój cel bez wpływu na interakcję będącą przedmiotem zainteresowania. Oczywiście, informacje strukturalne są wysoce pożądane dla racjonalnego projektowania sondy, ale nie są absolutnie wymagane. Podczas ustanawiania nowej pary partnerów FRET zaleca się, aby najpierw zbiorczo rejestrować i analizować FRET. Miejsca mocowania etykiet mogą się znacznie różnić, aby zmaksymalizować sygnał FRET, a także sprawdzić, czy zmierzona wydajność FRET różni się w zależności od odległości między barwnikami. Po zoptymalizowaniu systemu sygnały FRET z pojedynczą cząsteczką mogą być rejestrowane poprzez ograniczenie znakowania partnera FRET o wysokiej obfitości do 10-30% i wybielanie partnera FRET o niskiej obfitości, aż pojedyncze cząsteczki będą rozdzielalne w dziedzinie oświetlenia.

Na koniec należy zauważyć, że SLB przybliżają niektóre, ale nie wszystkie aspekty fizjologicznej błony plazmatycznej. Cechy takie jak krzywizna i elastyczność błony, podział domeny, przegrupowania cytoszkieletu i ruchliwość komórek, a także duża różnorodność białek błonowych o ekspresji powierzchniowej nie są reprezentowane przez SLB, ale mogą wpływać na badany proces. Konieczne będzie podjęcie wielu wysiłków w celu ustanowienia metod obrazowania, które umożliwią monitorowanie interakcji białko-białko z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki w synapsach fizjologicznych, które są niedostępne dla obrazowania TIRF.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

M.A. był wspierany przez stypendium Schrödingera Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF, J3086-B11) i dziękuje Towarzystwu Maxa Plancka za wsparcie finansowe i administracyjne. G.S. i J.H. byli wspierani przez Wiedeński Fundusz Nauki i Technologii (WWTF, LS13-030).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LB-mediaFisher Scientific10000713ekspresję bakteryjną
Sf900 II LifeTechnologies10227402pożywki komórkowe owadów do produkcji wirusa baculo
Insect-XPRESS z L-glutaminą (Lonza)Pożywka komórkowa dla owadów 10564038 Fisher Scientific do ekspresji wirusa baculo
Komórki Sf9Life Technologies11496-015komórki dla wirusa Produkcja i ekspansja
High Five CellsLife TechnologiesB855-02komórki do ekspresji poteiny
LB-mediaFisher Scientific10000713ekspresję bakterii
System CentramateKoncentracja białka Pallaz dużych objętości
Kaseta Centramate 10kDa odcięciePallOS010T12z dużych objętości
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 KoncentratbiałekEMD MilliporeUFC900308
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4 KoncentratbiałekEMD MilliporeUFC800308
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mLEMD Millipore5123koncentrat białek
Ä kta pure 25LGE Healthcare29-0182-24oczyszczanie białka
Superdex 200 10/300 GLGE Healthcare17-5175-01oczyszczanie białka
Superdex 75 10/300 GLGE Healthcare17-5174-01oczyszczanie białka
Mono Q 5/50GLGE Healthcare17-5166-01oczyszczanie białka
Ni Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare17-5318-01oczyszczanie białek
Tricorn 10/20 kolumnaGE Healthcare28-4064-13oczyszczanie białek
System HPLC GilsonaGilsonapeptydów sprzężonych z fluorochromem
Pursuit XR C18, 5 i mikro; m wielkość cząstek, rozmiar kolumny 21,2 * 250 mmAgilentA6000250X212oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem
Pursuit XR C18, 5 i mikro; m wielkość cząstek, rozmiar kolumny 21,2 * 50 mmAgilentA6000050G212oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem
Kolumna Tricorn 10/20 GE Healthcare28-4064-13oczyszczanie białek
System HPLC GilsonGilsonapeptydów sprzężonych z fluorochromem
Pursuit XR C18, 5 i mikro; m wielkość cząstek, rozmiar kolumny 21,2 * 250 mmAgilentA6000250X212oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem
Pursuit XR C18, 5 i mikro; Rozmiar cząstek m, rozmiar kolumny 21,2 * 50 mmAgilentA6000050G212oczyszczanie peptydów sprzężonych z fluorochromem
Cy3 maleimidGE HealthcarePA23031znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych, niesparowanych cystein
Cy5 maleimidGE HealthcarePA25031znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych, niesparowanych cystein
Alexa Fluor 555 C2 TechnologieżyciaA-20346znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych niesparowanych cystein
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideLife TechnologiesA-20347znakowanie białek specyficznych dla miejsca za pomocą zmutowanych niesparowanych cystein
Fura-2, AM, przenikanie komórkoweLife TechnologiesF-1221barwnik wrażliwy na wapń do znakowania komórek
dimetylosulfotlenekSigma Aldrich 151874do rozpuszczania fury-2 am
Zbilansowany roztwór soli Hanka plus wapń/magnezFisher Scientific10225362bufor do obrazowania
PBSLife Technologies14190-136
Surowica bydlęca Albumina liofilizowana proszekSigma AldrichA2153suplement do obrazowania bufor
14-4-4S przeciwciałoaffimetrix eBioscience14-5980-81przeciwciało blokujące dla H2-I-Ek (rozpoznawane przez 5c.c7, 2B4 i AND TCR)
5 ml polipropylenowa probówka okrągłodennaBecton DickinsonFALCON 352063
0,22 μ m Filtr odśrodkowy Ultrafree-MCEMD MilliporeUFC30GV0S
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; mMikrosfery MilliporeGVWP04700
TetraSpeck, 0,1 i mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwonyLife technologiesT-7279
Mikroskop do pomiarów wapnia na bazie fura-2 Mikroskop LEICADMI4000B
do pomiarów (pojedynczych cząsteczek) FRETLEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUSszczegółowe informacje można znaleźć w równoległym artykule JoVE autorstwa Axmanna i wsp.
lipidowe podparte planarnie, aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z równoległym wkładem JoVE autorstwa Axmanna i wsp.
RPMI 1640, z L-GlutamineLife Technologies11554416pożywka z komórek T
aminokwas endogenny 100XHycloneSH30238.01Suplement pożywki dla komórek T
penicylina / streptomycyna / L-glutamina 100xLife Technologies12000226Suplement pożywki dla komórek T
2-merkaptoetanolSigma AldrichM6250
rekombinowane białko interleukiny-2 myszyBPS Bioscience90185-BSuplement pożywki dla komórek T
Klasa badawcza Hyklon płodowej surowicy bydlęcejSV30160.03
Pochodzenie (program analizy)OrigenLabhttp://www.originlab.com/nieliniowe dopasowanie dwóch parametrów (tauoff, [ntlag])
białka Oczyszczanie Oczyszczanie Dwuwarstwy

Bibliografia

  1. Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple. Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).
  2. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature.. 463, 963-967 (2010).
  3. Huppa, J. B., Davis, M. M. The interdisciplinary science of T-cell recognition. Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).
  4. Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers. Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158(2015).
  5. Xie, J., et al. Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC. Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).
  6. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).
  7. Toebes, M., et al. Design and use of conditional MHC class I ligands. Nat Med. 12, 246-251 (2006).
  8. Tsumoto, K., et al. Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment. J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).
  9. Ruegg, U. T., Rudinger, J. Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine. Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).
  10. Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes. Soft Matter. 6, 568-581 (2010).
  11. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).
  12. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
  13. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  14. Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).
  15. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
  16. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).
  17. Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia FRETFRET pojedynczych cz steczekwspierana dwuwarstwa lipidowareceptor limfocyt w Tkompleks peptydowo MHCkinetyka wi zaniaca kowite wewn trzne odbiciemikroskopia fluorescencyjnasynaptyczna sta a dysocjacji

Powiązane artykuły