Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Zrozumienie mechanizmów, dzięki którym białka błonowe spełniają swoją funkcję komórkową, często może być trudnym zadaniem, ponieważ ich sposoby działania są często definiowane przez interakcje o niskim powinowactwie, które są trudne do wykrycia i oceny za pomocą konwencjonalnych metodologii biochemicznych. Białka błonowe mogą być ponadto wysoce wzbogacone w specyficzne domeny błonowe ^5,6 lub tworzyć dynamiczne struktury wyższego rzędu, które mogą w zasadzie zmieniać ich aktywność biologiczną ⁷.

Nieinwazyjna, wspomagana laserem mikroskopia fluorescencyjna pojedynczej cząsteczki stała się zatem metodologią wyboru do badania zachowania białek w złożonych środowiskach komórkowych. Dotyczy to w szczególności procesów biochemicznych zachodzących w błonie plazmatycznej, ponieważ można je w zasadzie monitorować w trybie całkowitego odbicia wewnętrznego z redukcją szumów (TIRF). W tym przypadku oświetlenie próbki jest ograniczone do cienkiego wycinka o grubości do 200 nm w bliskiej odległości od powierzchni szkła, co powoduje znaczną utratę tła komórkowego, a ze względu na charakterystykę ulotnego światła wzbudzającego również znaczny wzrost intensywności sygnału fluorescencji ^8,9. Oba aspekty są ważne przy dążeniu do wysokiej rozdzielczości pozycyjnej i czasowej w wykrywaniu pojedynczych cząsteczek.

Planarne SLB są nie tylko kompatybilne z mikroskopią TIRF. Po sfunkcjonalizowaniu odpowiednimi ligandami zapewniają również bezpośredni dostęp do badania dynamiki molekularnej rozpoznawania komórek-komórek w miarę ich występowania w komórkach odpornościowych lub innych komórkach. Można je również po prostu wykorzystać do umieszczenia ruchliwych i w inny sposób nieprzylegających komórek wystarczająco blisko szkiełka, tak aby takie komórki można było obrazować w oświetleniu TIRF, co jest bardzo pożądane w przypadku eksperymentów przewodzących obejmujących śledzenie pojedynczych cząsteczek lub superrozdzielczość opartą na pojedynczej cząsteczce. W tym celu białka muszą zostać załadowane do wysoce mobilnego SLB. Niewątpliwą zaletą zastosowanych lipidów jest to, że w ogóle nie dochodzi do niespecyficznego wiązania białek. Co więcej, SLB można uznać za dwuwymiarowe ciecze z wrodzoną zdolnością do samoleczenia; Nierówności w obrębie szklanego podłoża są do pewnego stopnia kompensowane. Dostępny jest protokół krok po kroku do generowania wysoce mobilnych dwuwarstw naładowanych interesującymi białkami. Opisano powstawanie płaskich SLB, które zawierają 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (POPC) jako główny składnik (90-99%) oraz syntetyczny i funkcjonalizowany lipid 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-{[N(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet] sól niklowa sukcynylu} (DGS NTA-Ni) w niewielkiej ilości (1-10%). POPC przenosi jeden nasycony kwas tłuszczowy i jeden jednonienasycony kwas tłuszczowy i tworzy dwuwarstwy lipidowe o wysokiej płynności nawet w RT. DGS NTA-NI wiąże się ze swoją grupą główną z ogonami polihistydynowymi i służy jako kotwica dla wybranych białek znakowanych polihistydyną (ryc. 1).

Co ważne, sprzęt do mikroskopii musi zawierać kilka urządzeń peryferyjnych, które są opisane poniżej. Dzięki dostarczonym informacjom i podstawowej wiedzy z zakresu optyki i fizyki laserowej, każdy biolog powinien być w stanie zbudować zestaw do obrazowania pojedynczej cząsteczki. Wzbudzenie próbki najlepiej przeprowadzić na mikroskopie odwróconym w trybie całkowitego odbicia wewnętrznego (TIRF), ponieważ ten schemat redukuje fałszywe światło i nadmierne tło wynikające w przeciwnym razie z autofluorescencji komórkowej ⁹. W tym celu potrzebny jest specjalny obiektyw obsługujący TIRF (patrz poniżej) i oświetlenie laserowe. Niektóre eksperymenty będą wymagały czasów oświetlenia w zakresie milisekund i będą działać w krótkich odstępach czasu. Aby zaoszczędzić czas oświetlenia lub uniknąć niepotrzebnego wybielania spowodowanego powtarzającym się oświetleniem, często pomocne jest podzielenie emitowanego światła na dwa lub więcej kanałów spektralnych. Pozwala to na jednoczesny odczyt dwóch lub więcej profili emisji, co może stać się istotnym czynnikiem podczas przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem rezonansowego transferu energii Förstera (FRET). Tutaj emisja wynikająca z pojedynczego impulsu świetlnego wzbudzenia może być rejestrowana zarówno z donora FRET, jak i akceptora FRET (jako emisja uczulona). Kamera powinna uchwycić wystarczającą ilość fotonów o wystarczająco niskim tle, aby uwidocznić pojedyncze fluorofory w czasie oświetlenia. Oprogramowanie komputerowe będzie musiało sprostać zadaniu, aby zsynchronizować wzbudzenie, wyłączanie i akwizycję obrazu. Kompleksowy przegląd znajduje się poniżej oraz na rysunku 2:

Obiektyw obsługujący TIRF: Dla obiektywnego oświetlenia TIRF apertura numeryczna (NA) obiektywu musi być równa lub większa niż 1,4 przy użyciu standardowych szkiełek podstawowych (n=1,515) ⁹. Powiększenie może wynosić od 60x do 150x. Obiektyw powinien być skorygowany chromatycznie, aby umożliwić konfokalność podczas obrazowania różnych fluoroforów.

Lasery: Liczba dostępnych opcji laserowych znacznie wzrosła w ciągu ostatnich lat. Nowoczesne, elektronicznie modulowane lasery diodowe o fali ciągłej są ekonomiczne i mogą być eksploatowane z niespotykaną częstotliwością i szybkością. Droższe lasery gazowo-jonowe wyróżniają się jakością wiązki laserowej, ale wymagają zewnętrznego zamykania (patrz poniżej) i często intensywnego chłodzenia (wodnego).

Żaluzje wzbudzenia: Modulatory akustyczno-optyczne (AOM) umożliwiają szybkie zamykanie w krótkich odstępach czasu ¹⁰. Do szczelnego zamykania zaleca się połączenie AOM z żaluzjami mechanicznymi. W ten sposób unika się nadmiernego nagrzewania się AOM spowodowanego ciągłą ekspozycją na światło i eliminuje się światło wyciekające z AOM w pozycji wyłączonej.

Soczewki są używane do poszerzania wiązek laserowych i skupiania ich na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. W ten sposób światło wzbudzające opuszcza obiektyw w postaci równoległej wiązki (rysunek 3), która jest wymagana do oświetlenia próbki za pomocą TIRF. Przesunięcie punktu ogniskowego w tylnej płaszczyźnie ogniskowej ze środka na obrzeża obiektywu zmieni kąt, pod jakim wiązka opuszcza obiektyw, ale nie położenie plamki lasera na próbce (rysunek 3), co jest funkcją ogólnej geometrii wiązki. Oświetlenie TIRF następuje pod krytycznym kątem, który można regulować za pomocą zestawu luster pełniących funkcję peryskopu do przesuwania punktu ogniskowego lasera w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Soczewki powinny być korekcją chromatyczną i mogą być używane w zestawie dwóch lub trzech soczewek. System trzech soczewek składa się z dwóch soczewek pełniących rolę teleskopu w celu poszerzenia wiązki laserowej (a tym samym punktu świetlnego w próbce) oraz trzeciej soczewki skupiającej poszerzoną wiązkę w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (rysunek 4). Obie funkcje (teleskop i ustawianie ostrości) można również osiągnąć poprzez połączenie tylko dwóch soczewek (patrz rysunek 4).

Lustra powinny odbijać światło w co najmniej 95%, aby uniknąć utraty światła laserowego. Do każdej regulacji wiązki zwykle stosuje się zestaw dwóch luster, ponieważ taki układ jest wystarczający do precyzyjnego ustawienia dowolnego kąta i położenia wiązki laserowej.

Nakładki dichroiczne odbijają i przepuszczają światło o różnych określonych długościach fal i są używane do nakładania lub rozdzielania wiązek dwóch laserów.

Filtry pochodne są bardziej skomplikowane niż filtry dichroiczne i są potrzebne do odbijania przychodzącego światła wzbudzenia i przekazywania wychodzącego światła emisyjnego z próbki. Umieszcza się je w kostce filtrującej między obiektywem a soczewką tubusu mikroskopu.

Wyczyść filtry: W zależności od rodzaju zastosowanego lasera,filtry laserowe o wąskim paśmie transmisji powinny być umieszczane w wiązce laserowej zaraz po jej opuszczeniu przez laser.

Filtry wycinające są zaprojektowane tak, aby skutecznie pochłaniać światło laserowe o wąskim paśmie i przepuszczać wszystkie inne światła. Są one umieszczane na ścieżce emisji, aby odfiltrować wszelkie fałszywe światło wzbudzenia laserowego. Jednak filtry wycinające działają tylko przy kącie wejściowym 0°. Jeśli szerokość pasma filtra wycinającego jest bardzo ostra, różne kąty wejściowe mogą już nie być odbijane. Nie ma to wpływu na blokowanie skolimowanego laserowego światła laserowego, ale światło rozproszone wstecznie może nie być skutecznie utrudnione przed dotarciem do kamery.

Zmotoryzowane koła filtracyjne wyposażone w odpowiednie koła filtrów mogą być łatwo umieszczone na ścieżce wzbudzenia i emisji i umożliwiają proste przełączanie między różnymi natężeniami światła (gdy są wyposażone w filtry ND) lub kanałami fluorescencyjnymi (gdy są umieszczone przed lampą ksenonową lub rtęciową do ratiometrycznego obrazowania wapnia lub przed kamerą, aby wybrać emitujący fluorofor).

50:50 Rozdzielacz wiązki sześciennej może być używany do rozdzielania wiązek laserowych na dwie oddzielne ścieżki wiązki wzbudzenia, a także do łączenia ich przed peryskopem.

Rozdzielacz wiązki (ścieżka emisji): Dla szybkiej akwizycji obrazu bez potrzeby fizycznej wymiany filtra, wiązka emisyjna jest dzielona na kanał z przesunięciem w niebieski i ku czerwieni. Zasadniczo rozdzielacze wiązki można budować, wykorzystując klin dichroiczny lub zestaw luster i zwierciadło dichroiczne w celu oddzielenia wiązki emisyjnej w sposób zależny od długości fali. Do oczyszczenia emitowanych kanałów potrzebne są dwa filtry emisji.

Filtr przestrzenny: Filtrowanie przestrzenne wiązki wzbudzenia jest czasami wymagane do usunięcia nierównoległych promieni świetlnych emitowanych przez wiązki laserowe niskiej jakości. Filtr przestrzenny składa się z teleskopu dwusoczewkowego z małym otworkiem umieszczonym dokładnie w ognisku obu soczewek. W ten sposób światło nietrafione powstające z nierównoległych części wiązki laserowej zostaje skutecznie zablokowane. Takie warunki muszą być spełnione przy tworzeniu mikroskopii opartej na TIRF. Filtrowanie przestrzenne zwiększa się wraz z mniejszymi otworkami, które są trudniejsze do umieszczenia w ognisku, oraz przy mniejszych ogniskowych pierwszego obiektywu. Aby zmniejszyć efekty spowodowane aberracjami obiektywu, korzystne jest zastosowanie zamiast prostych soczewek wysokiej jakości obiektywów mikroskopowych z korekcją do nieskończoności i małym powiększeniu (10x lub 20x).

Peryskop: Ustawienie peryskopu jest niezbędne do translacji skupionej wiązki laserowej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, co jest warunkiem wstępnym dla obrazowania TIRF. Można go łatwo zbudować z dwóch dwucalowych luster, stolika translacyjnego do regulacji pierwszego lustra i słupka do ustawiania drugiego lustra w celu odbicia poszerzonej i skupionej wiązki wzbudzenia do mikroskopu (ryc. 5).

Kamera: Podświetlane od tyłu urządzenia EMCCD (Electron-Multiplying Charge Coupled Devices) są rutynowo używane do rejestrowania sygnałów pojedynczych cząsteczek. Wynika to z ich wysokiej wydajności kwantowej (do 95%), dużej szybkości akwizycji (do 30 MHz) i stosunkowo niskiego poziomu szumów. Chłodzenie do -80 °C redukuje szumy termiczne i jest wspierane przez szereg dostępnych obecnie kamer EMCCD. Ograniczeniem technologii EMCCD jest to, że szum kamery wzrasta liniowo zarówno wraz ze wzmocnieniem kamery, jak i przechwytywanym sygnałem. Inaczej jest w przypadku kamer naukowych CMOS (sCMOS), które są znacznie tańsze i działają dzięki specjalnej architekturze układu sCMOS również znacznie szybciej niż kamery EMCCD. Jednak problem związany z technologią CMOS polega na tym, że akwizycja obrazu nadal nie ma pewnego stopnia odczytu ilościowego na poziomie pojedynczej cząsteczki, ponieważ każdy piksel ma inną czułość wykrywania. Zasadniczo można to skompensować poprzez normalizację pikseli, ale ta procedura w żadnym wypadku nie jest trywialna ¹¹. Dlatego nadal wahamy się, czy polecić kamery sCMOS do mikroskopii jednocząsteczkowej, ale ze względu na szybki rozwój tej technologii, kamery sCMOS mogą wkrótce stać się kamerami pierwszego wyboru. Kamery CCD z wolnym skanowaniem unikają szumów związanych ze wzmocnieniem i zmienności pikseli oraz obsługują najszybsze szybkości akwizycji, jeśli mogą być obsługiwane w tak zwanym trybie "kinetycznym". W tym trybie maskowany jest cały układ aparatu, z wyjątkiem obszaru zainteresowania (ROI), co umożliwia wykorzystanie samego chipa jako urządzenia pamięci masowej. Po pierwszym naświetleniu ROI powstałe ładunki są przenoszone do zamaskowanego obszaru chipa piksel po pikselu, gdzie obraz jest chroniony przed dalszą ekspozycją na światło. Po zakończeniu przesuwania wszystkich linii ROI do zamaskowanego obszaru (w zakresie poniżej milisekundy), sam ROI jest gotowy do następnej ekspozycji. Ten cykl jest powtarzany, aż wszystkie linie pikseli chipa CCD zostaną naładowane. Chip jest następnie odczytywany powoli ze znacznie zmniejszonym szumem odczytu. Na przykład na chipie o wymiarach 1000 x 1300 pikseli można zarejestrować 20 ROI o wymiarach 50x50 pikseli w krótkim odstępie czasu. Ponieważ obrazy pozostają na chipie przez znaczny czas przed odczytaniem, bardzo ważne jest zapewnienie wysokiej jakości maskowania i chłodzenie kamery (np. ciekłym azotem) w celu zmniejszenia nadmiernego szumu termicznego. Niektóre kamery EMCCD obsługują również tryb kinetyczny.

Oprogramowanie: Czas laserów, migawki, AOMS i ekspozycji kamery, a także prawidłowe przechowywanie obrazów są integralną częścią każdego udanego eksperymentu z obrazowaniem. Zasadniczo wiele zdefiniowanych operacji można zaprogramować za pomocą dostępnych pakietów oprogramowania dołączonych do kamery. Komercyjne pakiety oprogramowania obsługują dużą liczbę sprzętowych urządzeń peryferyjnych, które można wdrożyć przy niewielkiej wiedzy technicznej.

Generator impulsów, płytka do akwizycji danych (DAQ) (z analogowymi i cyfrowymi kanałami wyjściowymi) oraz oscyloskop: Generator impulsów to doskonały wybór do zamiany impulsów wyzwalających na impulsy o określonym czasie i napięciu. W ten sposób lasery mogą być precyzyjnie sterowane pod kątem mocy wyjściowej i mierzone w czasie w zakresie od milisekundy do submilisekundy. Karty DAQ z wyjściami analogowymi osiągają to samo i można je łatwo zintegrować z płytą główną komputera za pośrednictwem gniazd PCI. Czas trwania impulsu, amplituda i częstotliwość są weryfikowane za pomocą oscyloskopu.

Zamknięcie całej ścieżki wiązki wzbudzenia: Aby uniknąć wahań profilu wzbudzenia spowodowanych konwekcją powietrza, cała ścieżka wiązki wzbudzenia powinna być zamknięta od środowiska laboratoryjnego. Środek ten jest szczególnie ważny podczas prowadzenia mikroskopii TIRF. Elementy optyczne są również chronione przed kurzem, a ludzkie oko przed ekspozycją na światło lasera. Obudowy można łatwo zbudować z czarnej tektury, którą można kupić w sklepach z artykułami plastycznymi.

Aby określić płynność odzyskiwania fluorescencji SLB po fotowybielaniu (FRAP), wykonuje ^{się 12} pomiarów. W przypadku FRAP wskazane jest istnienie dwóch ścieżek wiązki wzbudzenia (zob. rysunek 3). Pierwsza ścieżka wiązki ma na celu zobrazowanie fluorescencji dwuwarstwy. Można to zrobić w konfiguracji TIRF i przy niskim natężeniu światła. Druga ścieżka wiązki powinna pozwalać na krótki, ale intensywny impuls wybielacza i powinna być skonfigurowana w trybie innym niż TIRF, tak aby opuszczała obiektyw wzdłuż osi optycznej. Okrągły otwór można umieścić w ścieżce wiązki wzbudzenia (patrz rysunek 8), aby uzyskać idealnie okrągły profil wybielacza o zdefiniowanych krawędziach. Aby zobrazować tę przysłonę na płaszczyźnie obiektu, jej optymalne położenie powinno znajdować się w płaszczyźnie ogniskowej soczewki 3 (patrz rysunek 3). Jednak ze względu na długą ogniskową tego obiektywu można również wygenerować obraz przysłony o wystarczającej jakości, gdy przysłona jest umieszczona w nieznacznie przesuniętych pozycjach.

Po przeprowadzeniu eksperymentu z obrazowaniem, surowe dane muszą zostać odpowiednio przeanalizowane. Dostępnych jest kilka protokołów krok po kroku, które obejmują regulację głównych ustawień (np. mocy i czasu oświetlenia, kąta TIRF), pozyskiwanie i analizę danych.

1. Generacja i funkcjonalizacja planarnych SLB

1. Mieszanie lipidów
   1. Aby otrzymać 10% skład lipidowy DGS NTA-Ni/90% POPC, rozpuścić 45 mg POPC i 6,9 mg DGS NTA-Ni w chloroformie w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml. Utrzymuj objętość chloroformu na niskim poziomie (zaledwie kilka ml), aby odparować go w następnym kroku. Dla składu lipidowego 1% DGS NTA-Ni/99% POPC należy użyć 49,5 mg POPC i 0,69 mg DGS NTA-Ni.
   2. Chloroform należy usuwać powoli za pomocą wyparki obrotowej – wzrost powyżej temperatury otoczenia nie jest konieczny. Alternatywnie, zdmuchnij go wewnątrz okapu chemicznego w strumieniu gazu obojętnego, takiego jak azot lub argon. Robiąc to, stale obracaj kolbę, aby umożliwić równomierne osadzanie się suszącego lipidu na dolnej połowie kolby okrągłodennej.
   3. Po odparowaniu większości chloroformu, należy podłączyć kolbę do podciśnienia O/N w celu ilościowego usunięcia chloroformu.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć zanieczyszczenia białek i komórek toksycznym chloroformem na późniejszych etapach i zapewnić płynność dwuwarstw lipidowych.
2. Wytwarzanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) z wysuszonych lipidów
   UWAGA: Małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV) mają średnicę od 20 nm do 100 nm i mogą być łatwo wytwarzane przez sonikację w kąpieli. Wytłaczanie lipidów, alternatywna metoda, może prowadzić do powstawania SUV i, w zależności od wielkości porów filtra zastosowanego do wytłaczania, również dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV), które mają wielkość od 100 nm do 1000 nm. Jednak SUV-y najlepiej nadają się do tworzenia SLB.
   1. SUV-y poprzez sonikację kąpieli (pokazane na filmie):
      1. Degass PBS. Zawiesić wysuszoną mieszaninę lipidów w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml w 10 ml odgazowanego PBS.
      2. Napełnić kolbę gazem obojętnym, takim jak azot lub argon, zamknąć ją korkiem i uszczelnić kolbę taśmą autoklawową.
      3. Umieścić szczelnie zamkniętą kolbę w sonikatorze kąpielowym i sonikować zawiesinę lipidową o mocy 120 do 170 W, aż stanie się klarowna. Trwa to od 30 do 60 minut.
      4. Monitorować spektrofotometrycznie postęp tworzenia pęcherzyków: Wynika z tego, że absorpcja nierozcieńczonej emulsji w porównaniu z PBS pozostaje stała przy 234 nm (jako przybliżony wskaźnik stężenia lipidów), ale powinna znacznie spaść przy 550 nm (ze względu na zmniejszone rozpraszanie światła przez większe cząstki).
      5. W celu osadzania ciężkich, niejednowarstwowych pęcherzyków, które zakłócają tworzenie się ciągłego SLB, zawiesinę pęcherzyków należy osadzać przez odwirowanie, w temperaturze 150 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C, a następnie przez 8 godzin w temperaturze 288 000 x g, 4 °C.
      6. Przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy porów 0,2 μm.
      7. Zmierzyć OD przy 234 nm i 550 nm, aby monitorować klarowność preparatu pęcherzykowego i ilość pozostałego lipidu.
      8. Przechowywać pęcherzyki w temperaturze 4 °C w atmosferze argonu lub azotu. Opcjonalnie stosować zawiesinę pęcherzykową do przygotowania dwuwarstwowego przez kilka miesięcy.
   2. SUV-y poprzez wytłaczanie lipidów:
      1. Krótko mówiąc, przepuść zawiesinę lipidową kilka razy przez filtr o wielkości porów 0,1 μm. Niezależnie od metody wytwarzania, odwiruj zawiesinę pęcherzyków dwukrotnie (1 godzina, 150 000 g, 25 °C; następnie 8 godzin, 4 °C, 288 000 g) w celu osadzenia pęcherzyków niejednowarstwowych, które są cięższe .
         UWAGA: Pęcherzyki przechowywane w temperaturze 4 °C w atmosferze gazu obojętnego mogą być używane do przygotowania dwuwarstwowego przez kilka miesięcy.
3. Tworzenie SLB i ładowanie białkiem
   1. Szkiełka podstawowe o wymiarach 24 x 50 mm #1,5 należy potraktować mieszaniną stężonego kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru w proporcji 3:1 przez 30 minut
      UWAGA: Ze względu na agresywny charakter mieszanki należy zachować szczególną ostrożność, tj. nosić fartuch laboratoryjny i okulary ochronne, jak pokazano na filmie!
   2. Wypłukać szkiełka podstawowe pod strumieniem ddH₂O z butelki ze spryskiwaczem. Umieść je na teflonowym stojaku i pozostaw do wyschnięcia na 10 do 30 minut.
   3. Zdejmij dolne szkiełko z 8 lub 16 studzienek komory, wypełnij dno klejem epoksydowym i ostrożnie umieść czyste i suche szkiełko na pokrytym klejem dnie komory. Pozostaw klej do stwardnienia na około 10 minut. Usuń nadmiar kleju z dna.
      UWAGA: Szczelne uszczelnienie między szkiełkiem podstawowym a komorą można również łatwo uzyskać za pomocą dentystycznej dwuskładnikowej silikonowej pasty modelarskiej, która twardnieje w ciągu 10 do 30 minut. Uszczelka ta nie jest tak mocna jak klej epoksydowy, ale wytrzymuje regularne obciążenia fizyczne. Po eksperymencie można go łatwo wyjąć z komory, co następnie nadaje się do ponownego wykorzystania w przyszłych eksperymentach.
   4. Odpipetować 120 μl (60 μl) 10-krotnej zawiesiny lipidowej rozcieńczonej PBS do każdego dołka w komorze 8 (16) dołków (przygotowanych w sposób opisany powyżej) i pozostawić dwuwarstwę na 20 minut. Ostrożnie przepłukać dwuwarstwę dwukrotnie 15 ml PBS. Po uformowaniu się dwuwarstwy należy ją zawsze zanurzyć w buforze i nigdy nie wystawiać na działanie powietrza.
   5. Napełnij każdą studzienkę do końca PBS, a następnie wyjmij 330 μl (komora 8-dołkowa) lub 165 μl (komora 16-dołkowa). W studni pozostało 350 μl (175 μl). Dodać 50 μl (25 μl) koktajlu zawierającego białka znakowane przez Hisa rozcieńczone w PBS do każdej studzienki (400 lub 200 μl końcowej) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut w ciemności. Gęstość białka powierzchniowego można regulować, zmieniając stężenie białka na tym etapie inkubacji.
   6. Przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 15 ml PBS.
      UWAGA: Zazwyczaj SLB powinny być używane w eksperymentach nie dłużej niż 6 godzin po ich naładowaniu białkiem. W tym okresie odzysk fluoroforu po fotowybielaniu utrzymuje się na poziomie do 95% i nie można wykryć utraty białka związanego z dwuwarstwą. Gęstość białka należy określić przed eksperymentem (patrz poniżej).
   7. Krok opcjonalny: W celu zbadania niespecyficznego wiązania białka DGS NTA-Ni zawierającego SLB, należy przemyć SLB raz PBS zawierającym 300 mM imidazolu. Białko powinno całkowicie zejść.

2. Konfiguracja mikroskopu

1. W celu zbudowania systemu mikroskopowego zdolnego do wykrywania fluorescencji pojedynczych fluorochromów należy zapoznać się z zaleceniami podanymi we wstępie.

3. Pomiary mocy

UWAGA: Fluorofory mogą być łatwo nasycone nadmiarem światła wzbudzającego. Przyspiesza to fotowybielanie bez dalszego wzrostu emisji i dlatego należy tego unikać. Aby zoptymalizować oświetlenie próbki, gęstość mocy wzbudzenia powinna być mierzona bezpośrednio na próbce. Takie pomiary mogą również służyć jako punkt odniesienia dla przyszłych eksperymentów. Co więcej, znajomość stosunku między wejściową i wyjściową mocą lasera jest pomocna przy ocenie strat światła w systemie obrazowania.

1. Przesuń wiązkę wzbudzenia do pozycji pionowej, tak aby opuszczała obiektyw pod kątem 90°.
2. Umieść głowicę miernika mocy na górze wiązki i zmierz moc wiązki (=P). Udokumentuj wynik.
3. Za pomocą peryskopu obróć wiązkę do pozycji TIRF i zobrazuj nienaruszoną jednorodną dwuwarstwę fluorescencyjną. Aby uniknąć bielenia i nasycenia sygnału CCD, umieść filtr o neutralnej gęstości (ND) o gęstości optycznej (OD) od 2 do 3 na ścieżce światła wzbudzającego.
   1. Zmierzyć zintegrowane zliczenia całego oświetlonego pola (= I_całkowita). Zmierz również rozmiar oświetlanego obszaru (=_{A całkowita}). Zmierz zintegrowane liczby (= I_środek) maksymalnie oświetlonego punktu środkowego, a także rozmiar plamki (=_środek A).
4. Zmierz sygnał tła na piksel (=B) albo poza oświetlonym obszarem, albo bez oświetlenia próbki.
5. Odejmij sygnał tła od wyników zmierzonych w 3.). W tym celu należy pomnożyć liczbę pikseli danego obszaru (całego oświetlonego obszaru lub punktu środkowego) przez liczbę tła na piksel. (=I_total -_Suma . B i I_centrum - A_centrum . B).
6. Podziel zintegrowany i skorygowany sygnał tła punktu środkowego przez zintegrowany i skorygowany w tle sygnał całego pola oświetlenia.
   UWAGA: Wynik wskazuje ułamek całkowitej mocy znajdującej się w punkcie środkowym (= (I_{środek - środek A} . B) / (I_total -_{A total} . B) ). Pomnożenie tego wyniku przez potęgę P mierzoną w 2.) skutkuje mocą światła oświetlającego centralny punkt.
7. Określ rozmiar_środka plamki A w μm². W tym celu podziel rozmiar piksela aparatu w μm przez powiększenie obiektywu, weź kwadrat wyniku jako μm² na piksel.
   1. Alternatywnie można zmierzyć rozmiar piksela w obrazie za pomocą szkiełka mikrometrycznego umieszczonego na mikroskopie i przyjąć kwadrat wyniku jako obszar na piksel. Pomnóż tę wartość przez liczbę pikseli znajdujących się w centrum punktu, aby dotrzeć do oświetlonego obszaru punktu.
8. Podziel moc P oświetlającą środkową plamkę przez rozmiar środkowej plamki A_{środek, μm²,} aby obliczyć intensywność oświetlenia na μm². Przykład przedstawiono na rysunku 6.
9. Wartości gęstości mocy mierzone w oświetleniu innym niż TIRF są zazwyczaj niższe niż te obecne w oświetleniu TIRF ¹³, które również zależą od dokładnego kąta, pod jakim światło laserowe jest całkowicie odbijane. Aby uzyskać gęstości mocy występujące w oświetleniu TIRF, skalibrowano obraz koralików fluorescencyjnych o średnicy 0,1 μm zarówno w trybie bez TIRF, jak i TIRF. Stosunek intensywności fluorescencji kulek mierzonych w trybie TIRF i bez TIRF wynosi współczynnik konwersji C, który umożliwia przeliczenie zmierzonych wartości gęstości mocy na te efektywne przy oświetleniu TIRF (równanie 1).
   gęstość mocy _TIRF = C • gęstość mocy _nie-TIRF (równanie 1)
   gdzie C = intensywność ściegu _TIRF / intensywność ściegu _{bez TIRF}

4. Pomiary gęstości

1. Określ średni sygnał poszczególnych fluoroforów znajdujących się na dwuwarstwie. Dwuwarstwowe cząsteczki MHC obciążone peptydami fluorescencyjnymi są idealne do tego celu, ponieważ stechiometria białko:etykieta jest dokładnie jedna. W razie potrzeby wybiel wszystkie etykiety na dwuwarstwie w polu view i pozwól, aby fluorescencja wróciła do normy, aby uwidocznić pojedyncze fluorofory.
   1. Rejestruj obrazy w krótkich odstępach czasu (np. zastosuj protokół akwizycji strumieniowej) i monitoruj ruchliwość pojedynczych cząsteczek w ciągu kilku klatek. Aby uzyskać więcej informacji, patrz rysunek 7.
2. Oznacz centralny punkt oświetlenia w dwuwarstwie jako ROI. Zmierz ROI, wariancja gęstości mocy oświetlenia (która jest proporcjonalna do intensywności fluorescencji) powinna być idealnie mniejsza niż 15%.
   1. Określ fluorescencję pojedynczej cząsteczki i fluorescencji masowej tylko w ramach tego ROI. Zintegruj sygnał ROI, który jest wystarczająco duży, aby uchwycić 99% lub więcej funkcji rozproszenia punktowego pojedynczego emitera. W przypadku korzystania z aparatu o rozmiarze piksela 16-20 μm (podanym w specyfikacji aparatu producenta), obiektywu o 100-krotnym powiększeniu i aperturze numerycznej równej lub większej niż 1,45, należy przyjąć obszar o wymiarach 7 na 7 pikseli, przy czym szczyt intensywności znajduje się w środku kwadratu.
   2. Aby określić sygnał tła, zintegruj zliczenia sąsiedniego kwadratu o wymiarach 7 na 7 pikseli, który nie zawiera sygnału fluorescencji. Odejmij tło od sygnału pojedynczej cząsteczki, aby określić skorygowaną wartość fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Zaznacz tylko te sygnały, które są nadal widoczne w następnej ramce.
3. Powtórz krok 4.2 pięćdziesiąt do kilkuset razy. Uśrednianie sygnału skorygowanego w tle. W razie potrzeby wykreśl wartości intensywności pojedynczej cząsteczki jako histogram. Opcjonalnie: skorzystaj z odpowiedniej wtyczki do pakietów oprogramowania open-source (np. ImageJ) lub przetwarzaj dane za pomocą komercyjnego oprogramowania (np. Metamorph, Molecular Devices). Doświadczeni użytkownicy mogą napisać własny program analityczny w Matlabie lub podobnych pakietach oprogramowania.
4. Umieść filtr o neutralnej gęstości 2 lub wyższej na ścieżce wzbudzenia i wykonaj zdjęcia dwuwarstwy fluorescencyjnej zawierającej białka znakowane tym samym fluoroforem. Zapisz średnią intensywność pikseli w ramach tego samego zwrotu z inwestycji, który jest używany do pomiarów intensywności pojedynczej cząsteczki. Zapisz czas ekspozycji pomiarów fluorescencji masowej. Zmierz to samo miejsce bez oświetlenia w celu odjęcia tła.
5. Aby określić gęstość białka w dwuwarstwie, pomnóż średnią intensywność pikseli fluorescencji objętościowej z korekcją tła określoną w kroku 4 przez liczbę pikseli na mikron kwadratowy (np. 41,5), przez 100 (jeśli zastosowano filtr ND o OD 2) lub 1 000 (jeśli zastosowano filtr ND o OD 3) i czas ekspozycji zastosowany w kroku 2 i podziel go przez średni sygnał pojedynczej cząsteczki określony w krok 3, czas ekspozycji zastosowany w kroku 2 i liczba fluoroforów na białko.

5. Testowanie integralności dwuwarstwy

1. Przygotuj dwuwarstwę fluorescencyjną i umieść ją na stoliku mikroskopu, jak opisano powyżej.
2. Dostosuj ostrość i zrób zdjęcie dwuwarstwy w trybie TIRF. Zastosuj krótki, ale intensywny impuls wybielacza w trybie innym niż TIRF, aby usunąć fluorescencję w małym pierścieniu ROI w kształcie dysku.
3. Zrób zdjęcie dwuwarstwy w trybie TIRF o niskiej intensywności natychmiast po wybielaniu, a następnie co pięć do dziesięciu sekund, aby monitorować szybkość odzyskiwania fluorescencji.
4. Przejdź do innego obszaru na dwuwarstwie i wykonaj kroki 2 i 3. Zrób kolejne zdjęcie w trybie TIRF o niskiej intensywności 5 minut po impulsie wybielacza. Określ intensywność_wybielania po wybielaniu w obszarze wybielacza i porównaj ją z intensywnością przed wybielaniem I₀ na początku eksperymentu (wybielanie nie powinno było wystąpić), aby obliczyć frakcję nieruchomą (IF) w następujący sposób:
   Frakcja nieruchoma IF (%) = (I₀ -_{I post bleach} ) / (I₀– tło) x 100,
   z tłem = zmierzona intensywność w ROI bez zastosowanego światła wzbudzenia
   IF powinien wynosić mniej niż 10% (najlepiej mniej niż 5%).

Architektura systemu mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki jest szczegółowo opisana na rysunku 2. Poszczególne części, takie jak komponenty optyczne i inne komponenty sprzętowe, są wyjaśnione we wprowadzeniu. Ścieżki wiązki wzbudzenia optycznego, które w określony sposób powodują powstanie oświetlenia TIRF i innego oświetlenia, przedstawiono i wyjaśniono na rysunkach 3–5. Zwróć uwagę na położenie rozdzielacza wiązki 50:50 przed pierwszym zwierciadłem peryskopowym umieszczonym na stoliku z mikrometrem translacyjnym (rysunek 5). Ten rozdzielacz wiązki nakłada na siebie wiązkę TIRF używaną do obrazowania (oznaczoną na zielono) i wiązkę inną niż TIRF (oznaczoną na czerwono) używaną do wybielania lub aktywacji próbki za pośrednictwem światła zdefiniowanej przez lokalną aperturę (jak pokazano na rysunku 3). Połączone ścieżki światła (rysunek 5, zaznaczony na pomarańczowo) są odbijane przez drugie zwierciadło peryskopowe do tylnego portu odwróconego mikroskopu. Jak wyjaśniono na rysunku 4 i przedstawiono na rysunku 2, zastosowanie dwóch lub trzech wypukłych soczewek poszerza profile wiązki laserowej i skupia wiązki laserowe na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, powodując powstanie dwóch skolimowanych wiązek oświetlających próbkę odpowiednio w trybie TIRF i, bez TIRF.

Przykład zmierzonych wartości intensywności wymaganych do obliczenia gęstości mocy na próbce jest pokazany na rysunku 6. Średni sygnał tła, który należy odjąć od natężeń mierzonych w oświetlonym i centralnym obszarze (używanym do obrazowania), jest określany w obszarze w polu widzenia, który nie jest oświetlony wiązką laserową (tutaj zlicza się 7089). Skorygowane o tło średnie intensywności oświetlonego obszaru (1684 zliczenia) i obszaru centralnego (4830 zliczeń) są następnie mnożone przez odpowiednie rozmiary obszarów, aby uzyskać zintegrowane intensywności (1,471 x 10, 8 zliczeń dla oświetlonego obszaru i 3,424 x 10, 7 zliczeń dla obszaru centralnego). Stosunek zintegrowanych intensywności w obszarach centralnych i oświetlonych daje ułamek całkowitej mocy oświetlającej obszar centralny (0,23 lub 23%). Jak pokazano na filmie, całkowita moc musi być określona na obiektywie za pomocą miernika mocy w trybie oświetlenia innym niż TIRF. W naszym przykładzie jest on ustawiony na 5 mW, co daje moc 5 mW x 0,23 = 1,15 mW w obszarze centralnym. Ponieważ ilość 41,5 pikseli w naszym przykładzie wynosi 1 μm2, obszar centralny ma rozmiar 7089 pikseli / 41,5 pikseli x μm2 = 170,8 μm2. Dzieląc moc światła oświetlającego obszar centralny (1,15 mW) przez ten obszar (170,8 μm2) otrzymujemy średnią gęstość mocy 0,7 kW/cm2 w obszarze centralnym.

Rysunek 7 przedstawia obrazy i odpowiadające im wyniki intensywności pojedynczych fluoroforów zdobytych w krótkim odstępie czasu (100 klatek na sekundę, tj. z ramką czasową 10 ms). Do oznaczania ilościowego intensywności określa się średni sygnał prostokątnego obszaru o wymiarach siedem na siedem (= 49) pikseli, który obejmuje sygnał fluorescencyjny. Ponadto średni sygnał tła jest określany w prostokątnym obszarze o wymiarach siedem na siedem pikseli w bliskiej odległości od sygnału pojedynczej cząsteczki. Średni sygnał skorygowany o tło jest mnożony przez liczbę pikseli w regionie (= 49), aby uzyskać sygnał pojedynczej cząsteczki (zaznaczony pogrubioną czcionką).

Reprezentatywny eksperyment FRAP mający na celu ocenę ruchliwości białek znakowanych fluorescencyjnie związanych z SLB jest pokazany na rysunku 8. Zwróć uwagę na rysunek 8A powtarzające się użycie poszerzonej wiązki obrazowania o niskiej intensywności i jednorazowe użycie drugiej, węższej i zdefiniowanej przez aperturę wiązki o wysokiej intensywności do szybkiej ablacji fluorochromu w punkcie czasowym zero sekund. Odjęte od tła średnie intensywności w żółtym okręgu, które zostały znormalizowane przez początkową średnią wartość intensywności przed impulsem wybielacza, są wykreślone na rysunku 8B w funkcji czasu rejestrowania prędkości i zakresu, w jakim fluorescencja powróciła. Jak pokazano, ponad 90% (oznaczone zieloną linią) początkowej intensywności dwuwarstwy powróciło w ciągu 75 sekund po ablacji fluorochromowej. W konsekwencji mniej niż 10% białek osadzonych w pokazanym SLB jest nieruchomych.

Rysunek 1. Schemat systemu SLB. (A) SLB są zbudowane z POPC (90-99%) i syntetycznego lipidu DGS NTA-Ni (1-10%). Tworzą się spontanicznie, gdy czyste szklane powierzchnie są ładowane SUV-ami składającymi się z odpowiednich lipidów. (B) Po uformowaniu, te SLB mogą być łatwo ozdobione rozpuszczalnymi białkami rozszerzonymi o jeden C- lub N-końcowy znacznik zawierający dwanaście histydyn (12H, na przykład cząsteczka kostymulująca B7-1 i cząsteczka adhezyjna ICAM-1) lub dimery białkowe rozszerzone dwoma znacznikami zawierającymi sześć histydyn każdy (2x6H, na przykład dimer αβMHC klasy II). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Przegląd ścieżek wiązki wzbudzenia i emisji. Lasery gazowo-jonowe (np. Ar+ lub Kr+) mogą być eksploatowane do szybkiego zamykania za pomocą akustycznych modulatorów optycznych. Diody laserowe są obecnie dostępne w wielu długościach fal i stanowią doskonałą alternatywę, ponieważ mogą być elektronicznie modulowane w tempie mikrosekundowym. Należy pamiętać, że wiązki laserowe można łatwo regulować za pomocą dwóch (dichroicznych) luster i dzielić oraz łączyć za pomocą prostych rozdzielaczy wiązki, aby uzyskać dwie lub więcej ścieżek wiązki. W tym przykładzie użyto wiązki obrazowania TIRF (do monitorowania zdarzeń) i wiązki wybielacza (do wybielania fluoroforów lub fotoaktywowanych cząsteczek w klatkach w sposób zdefiniowany przez aperturę). Obie tory wzbudzenia mogą być obsługiwane niezależnie od siebie poprzez zastosowanie dodatkowych żaluzji. Peryskop pozwala na translację skupionych wiązek laserowych w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu w celu wygenerowania oświetlenia TIRF próbki. Obraz fluorescencyjny może być podzielony spektralnie za pomocą rozdzielacza wiązki emisyjnej przed akwizycją za pomocą ultraczułej kamery (np. EM-CCD lub naukowej kamery CMOS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Regulacja oświetlenia TIRF poprzez translację skupionej wiązki w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Jak pokazano, ognisko wiązki laserowej jest przesunięte w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu ze środka na obrzeża poprzez translokację wiązki (przy użyciu układu zwierciadeł peryskopowych). W rezultacie równoległa wiązka opuszcza obiektyw w pochylonym oświetleniu, aż do osiągnięcia krytycznego kąta, przy którym następuje całkowite wewnętrzne odbicie. Pole ulotne jest generowane na granicy faz szkło-media, gdzie następuje całkowite odbicie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Proste układy optyczne do skupiania wiązki laserowej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Potrzebne są trzy lub dwie soczewki, aby poszerzyć wiązkę lasera i skupić ją na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu TIRF. Systemy dwusoczewkowe zawierają mniej błędów związanych z soczewkami niż systemy z trzema soczewkami i mogą lepiej nadawać się do generowania wiązki obrazowania TIRF. Trzy soczewki mogą być preferowane, gdy dąży się do zdefiniowanego poszerzenia wiązki i plamki świetlnej o ostrych krawędziach, co byłoby potrzebne w badaniach wykorzystujących fotoaktywację lub wybielanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5. Zdjęcie z adnotacjami przedstawiające drogę wiązki z tyłu mikroskopu fluorescencyjnego. Jak już pokazano na rysunku 2, jedna laska z łatwością realizuje dwie belki wzbudzające, jedną w trybie TIRF (oznaczoną na zielono), drugą w trybie bez TIRF (oznaczoną na czerwono). Są one nakładane za pomocą rozdzielacza wiązki (BS) w proporcji 50:50. Soczewki wypukłe (L1 i L2) są ustawione w odpowiednich wiązkach, aby skupić je na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (nie pokazano). Peryskop składający się z dwóch luster (M1 i M2) prowadzi obie wiązki przez port wejścia do mikroskopu. Pierwsze zwierciadło (M1) można przesunąć za pomocą stolika translacyjnego (TS) (poprzez przekręcenie mikrometrycznej zgodnie z opisem) w celu przesunięcia jednej z belek do pozycji TIRF. Po ustanowieniu TIRF, druga wiązka (używana do fotowybielania lub aktywacji, tutaj oznaczona na czerwono) może być regulowana niezależnie od wiązki TIRF, aby pozostawić obiektyw w trybie innym niż TIRF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Pomiar mocy w centralnym obszarze punktu oświetleniowego. Jak wskazano, należy wybrać odpowiednie obszary zainteresowania, które odbijają tło, cały oświetlony obszar (IA) oraz obszar centralny (CA), w którym zdarzenia będą później rejestrowane. Odejmij wartości tła od wartości zarejestrowanych dla IA i CA i zsumuj intensywności, mnożąc skorygowane średnie intensywności przez liczbę pikseli obecnych w każdym obszarze (= zintegrowane intensywności). Podziel zintegrowane natężenie CA przez natężenie IA, aby otrzymać proporcję mocy wiązki oświetlającej CA (w tym przykładzie: 23%). Moc światła oświetlającego CA należy wyznaczyć mnożąc całkowitą moc wiązki (tutaj: 5 mW) przez proporcję oświetlającą CA (tutaj: 0,23). Aby określić rozmiar obszaru centralnego, pomnóż obszar (tutaj: 7089 pikseli) przez współczynnik konwersji rozmiaru piksela na obszar (tutaj: 1/41,5 μm2 piksel-1). Aby uzyskać średnią gęstość mocy światła wzbudzającego oświetlającego CA, należy podzielić moc (tutaj: 1,15 mW) przez wielkość CA (tutaj: 170,8μm2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Kwantyfikacja sygnałów jednocząsteczkowych. (A) Przebieg czasowy pojedynczych fluoroforów na SLB. Obszar zainteresowania o wymiarach 7 x 7 pikseli (roi, żółty) jest umieszczany wokół sygnału w celu oceny ilościowej. Tło jest określane na podstawie sąsiedniego roi o wymiarach 7 x 7 pikseli (zielony). (B) Podane są ilościowo średnie intensywności pikseli. Aby określić sygnał pojedynczej cząsteczki, wartości tła (zielony roi) odejmuje się od wartości sygnału (żółty roi) i mnoży przez 49. (C) Intensywności pojedynczych cząsteczek jednego fluoroforu są wykreślane w funkcji czasu. Należy pamiętać, że punkt czasowy 90 ms jest pomijany, ponieważ fluorofor jest w trakcie wybielania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Analiza odzysku fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) w celu określenia integralności SLB. (A) FRAP przeprowadzono na dwuwarstwie przenoszącej IEk/MCC-Alexa Fluor 647. Pokazywany jest co 10 obraz eksperymentu. (B) Kwantyfikacja FRAP doświadczenia pokazana w (A). Wartości wskazują średnią intensywność (I) w ramach żółtego ROI pokazanego w (A) podzieloną przez początkową intensywność (Io) przed bieleniem. Czerwone punkty danych są wyświetlane w (A), zielona linia oznacza 0,9 odzysku pierwotnych intensywności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.