Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Podsumowanie

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Streszczenie

W ciągu jednej dekady mikroskopia pojedynczych cząsteczek zmieniła się z odosobnionej dziedziny, którą dzielą jedynie fizycy z silnym doświadczeniem w optyce i fizyce laserowej, w dyscyplinę, która obecnie cieszy się żywym zainteresowaniem naukowców z różnych dziedzin ¹. Dzieje się tak, ponieważ obrazowanie pojedynczych cząsteczek ma wyjątkowy potencjał do ujawnienia zachowania białek in situ w żywych komórkach i odkrycia organizacji komórkowej z niespotykaną rozdzielczością poniżej limitu dyfrakcji światła widzialnego ². Dwuwarstwy lipidowe płaskie na podłożu szklanym (SLB) są potężnym narzędziem do umieszczania komórek, które w przeciwnym razie rosną w zawiesinie, wystarczająco blisko szkiełka, tak aby można je było łatwo zobrazować w trybie oświetlenia całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów ^3,4. Są one bardzo przydatne do badania dynamiki białek w zdarzeniach związanych z błoną plazmatyczną, tak różnorodnych, jak tworzenie kontaktu komórka-komórka, endocytoza, egzocytoza i rozpoznawanie immunologiczne. Przedstawiono proste procedury, jak w powtarzalny sposób generować wysoce mobilne, funkcjonalizowane białkami SLB, jak określać ruchliwość białek w ich obrębie oraz jak mierzyć gęstości białek z wykorzystaniem detekcji pojedynczych cząsteczek. Pokazano, jak skonstruować ekonomiczny system mikroskopii pojedynczej cząsteczki z możliwością oświetlenia TIRF i jak go obsługiwać w eksperymencie.

Wprowadzenie

Zrozumienie mechanizmów, dzięki którym białka błonowe spełniają swoją funkcję komórkową, często może być trudnym zadaniem, ponieważ ich sposoby działania są często definiowane przez interakcje o niskim powinowactwie, które są trudne do wykrycia i oceny za pomocą konwencjonalnych metodologii biochemicznych. Białka błonowe mogą być ponadto wysoce wzbogacone w specyficzne domeny błonowe ^5,6 lub tworzyć dynamiczne struktury wyższego rzędu, które mogą w zasadzie zmieniać ich aktywność biologiczną ⁷.

Nieinwazyjna, wspomagana laserem mikroskopia fluorescencyjna pojedynczej cząsteczki stała się zatem metodologią wyboru do badania zachowania białek w złożonych środowiskach komórkowych. Dotyczy to w szczególności procesów biochemicznych zachodzących w błonie plazmatycznej, ponieważ można je w zasadzie monitorować w trybie całkowitego odbicia wewnętrznego z redukcją szumów (TIRF). W tym przypadku oświetlenie próbki jest ograniczone do cienkiego wycinka o grubości do 200 nm w bliskiej odległości od powierzchni szkła, co powoduje znaczną utratę tła komórkowego, a ze względu na charakterystykę ulotnego światła wzbudzającego również znaczny wzrost intensywności sygnału fluorescencji ^8,9. Oba aspekty są ważne przy dążeniu do wysokiej rozdzielczości pozycyjnej i czasowej w wykrywaniu pojedynczych cząsteczek.

Planarne SLB są nie tylko kompatybilne z mikroskopią TIRF. Po sfunkcjonalizowaniu odpowiednimi ligandami zapewniają również bezpośredni dostęp do badania dynamiki molekularnej rozpoznawania komórek-komórek w miarę ich występowania w komórkach odpornościowych lub innych komórkach. Można je również po prostu wykorzystać do umieszczenia ruchliwych i w inny sposób nieprzylegających komórek wystarczająco blisko szkiełka, tak aby takie komórki można było obrazować w oświetleniu TIRF, co jest bardzo pożądane w przypadku eksperymentów przewodzących obejmujących śledzenie pojedynczych cząsteczek lub superrozdzielczość opartą na pojedynczej cząsteczce. W tym celu białka muszą zostać załadowane do wysoce mobilnego SLB. Niewątpliwą zaletą zastosowanych lipidów jest to, że w ogóle nie dochodzi do niespecyficznego wiązania białek. Co więcej, SLB można uznać za dwuwymiarowe ciecze z wrodzoną zdolnością do samoleczenia; Nierówności w obrębie szklanego podłoża są do pewnego stopnia kompensowane. Dostępny jest protokół krok po kroku do generowania wysoce mobilnych dwuwarstw naładowanych interesującymi białkami. Opisano powstawanie płaskich SLB, które zawierają 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (POPC) jako główny składnik (90-99%) oraz syntetyczny i funkcjonalizowany lipid 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-{[N(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet] sól niklowa sukcynylu} (DGS NTA-Ni) w niewielkiej ilości (1-10%). POPC przenosi jeden nasycony kwas tłuszczowy i jeden jednonienasycony kwas tłuszczowy i tworzy dwuwarstwy lipidowe o wysokiej płynności nawet w RT. DGS NTA-NI wiąże się ze swoją grupą główną z ogonami polihistydynowymi i służy jako kotwica dla wybranych białek znakowanych polihistydyną (ryc. 1).

Co ważne, sprzęt do mikroskopii musi zawierać kilka urządzeń peryferyjnych, które są opisane poniżej. Dzięki dostarczonym informacjom i podstawowej wiedzy z zakresu optyki i fizyki laserowej, każdy biolog powinien być w stanie zbudować zestaw do obrazowania pojedynczej cząsteczki. Wzbudzenie próbki najlepiej przeprowadzić na mikroskopie odwróconym w trybie całkowitego odbicia wewnętrznego (TIRF), ponieważ ten schemat redukuje fałszywe światło i nadmierne tło wynikające w przeciwnym razie z autofluorescencji komórkowej ⁹. W tym celu potrzebny jest specjalny obiektyw obsługujący TIRF (patrz poniżej) i oświetlenie laserowe. Niektóre eksperymenty będą wymagały czasów oświetlenia w zakresie milisekund i będą działać w krótkich odstępach czasu. Aby zaoszczędzić czas oświetlenia lub uniknąć niepotrzebnego wybielania spowodowanego powtarzającym się oświetleniem, często pomocne jest podzielenie emitowanego światła na dwa lub więcej kanałów spektralnych. Pozwala to na jednoczesny odczyt dwóch lub więcej profili emisji, co może stać się istotnym czynnikiem podczas przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem rezonansowego transferu energii Förstera (FRET). Tutaj emisja wynikająca z pojedynczego impulsu świetlnego wzbudzenia może być rejestrowana zarówno z donora FRET, jak i akceptora FRET (jako emisja uczulona). Kamera powinna uchwycić wystarczającą ilość fotonów o wystarczająco niskim tle, aby uwidocznić pojedyncze fluorofory w czasie oświetlenia. Oprogramowanie komputerowe będzie musiało sprostać zadaniu, aby zsynchronizować wzbudzenie, wyłączanie i akwizycję obrazu. Kompleksowy przegląd znajduje się poniżej oraz na rysunku 2:

Obiektyw obsługujący TIRF: Dla obiektywnego oświetlenia TIRF apertura numeryczna (NA) obiektywu musi być równa lub większa niż 1,4 przy użyciu standardowych szkiełek podstawowych (n=1,515) ⁹. Powiększenie może wynosić od 60x do 150x. Obiektyw powinien być skorygowany chromatycznie, aby umożliwić konfokalność podczas obrazowania różnych fluoroforów.

Lasery: Liczba dostępnych opcji laserowych znacznie wzrosła w ciągu ostatnich lat. Nowoczesne, elektronicznie modulowane lasery diodowe o fali ciągłej są ekonomiczne i mogą być eksploatowane z niespotykaną częstotliwością i szybkością. Droższe lasery gazowo-jonowe wyróżniają się jakością wiązki laserowej, ale wymagają zewnętrznego zamykania (patrz poniżej) i często intensywnego chłodzenia (wodnego).

Żaluzje wzbudzenia: Modulatory akustyczno-optyczne (AOM) umożliwiają szybkie zamykanie w krótkich odstępach czasu ¹⁰. Do szczelnego zamykania zaleca się połączenie AOM z żaluzjami mechanicznymi. W ten sposób unika się nadmiernego nagrzewania się AOM spowodowanego ciągłą ekspozycją na światło i eliminuje się światło wyciekające z AOM w pozycji wyłączonej.

Soczewki są używane do poszerzania wiązek laserowych i skupiania ich na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. W ten sposób światło wzbudzające opuszcza obiektyw w postaci równoległej wiązki (rysunek 3), która jest wymagana do oświetlenia próbki za pomocą TIRF. Przesunięcie punktu ogniskowego w tylnej płaszczyźnie ogniskowej ze środka na obrzeża obiektywu zmieni kąt, pod jakim wiązka opuszcza obiektyw, ale nie położenie plamki lasera na próbce (rysunek 3), co jest funkcją ogólnej geometrii wiązki. Oświetlenie TIRF następuje pod krytycznym kątem, który można regulować za pomocą zestawu luster pełniących funkcję peryskopu do przesuwania punktu ogniskowego lasera w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Soczewki powinny być korekcją chromatyczną i mogą być używane w zestawie dwóch lub trzech soczewek. System trzech soczewek składa się z dwóch soczewek pełniących rolę teleskopu w celu poszerzenia wiązki laserowej (a tym samym punktu świetlnego w próbce) oraz trzeciej soczewki skupiającej poszerzoną wiązkę w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (rysunek 4). Obie funkcje (teleskop i ustawianie ostrości) można również osiągnąć poprzez połączenie tylko dwóch soczewek (patrz rysunek 4).

Lustra powinny odbijać światło w co najmniej 95%, aby uniknąć utraty światła laserowego. Do każdej regulacji wiązki zwykle stosuje się zestaw dwóch luster, ponieważ taki układ jest wystarczający do precyzyjnego ustawienia dowolnego kąta i położenia wiązki laserowej.

Nakładki dichroiczne odbijają i przepuszczają światło o różnych określonych długościach fal i są używane do nakładania lub rozdzielania wiązek dwóch laserów.

Filtry pochodne są bardziej skomplikowane niż filtry dichroiczne i są potrzebne do odbijania przychodzącego światła wzbudzenia i przekazywania wychodzącego światła emisyjnego z próbki. Umieszcza się je w kostce filtrującej między obiektywem a soczewką tubusu mikroskopu.

Wyczyść filtry: W zależności od rodzaju zastosowanego lasera,filtry laserowe o wąskim paśmie transmisji powinny być umieszczane w wiązce laserowej zaraz po jej opuszczeniu przez laser.

Filtry wycinające są zaprojektowane tak, aby skutecznie pochłaniać światło laserowe o wąskim paśmie i przepuszczać wszystkie inne światła. Są one umieszczane na ścieżce emisji, aby odfiltrować wszelkie fałszywe światło wzbudzenia laserowego. Jednak filtry wycinające działają tylko przy kącie wejściowym 0°. Jeśli szerokość pasma filtra wycinającego jest bardzo ostra, różne kąty wejściowe mogą już nie być odbijane. Nie ma to wpływu na blokowanie skolimowanego laserowego światła laserowego, ale światło rozproszone wstecznie może nie być skutecznie utrudnione przed dotarciem do kamery.

Zmotoryzowane koła filtracyjne wyposażone w odpowiednie koła filtrów mogą być łatwo umieszczone na ścieżce wzbudzenia i emisji i umożliwiają proste przełączanie między różnymi natężeniami światła (gdy są wyposażone w filtry ND) lub kanałami fluorescencyjnymi (gdy są umieszczone przed lampą ksenonową lub rtęciową do ratiometrycznego obrazowania wapnia lub przed kamerą, aby wybrać emitujący fluorofor).

50:50 Rozdzielacz wiązki sześciennej może być używany do rozdzielania wiązek laserowych na dwie oddzielne ścieżki wiązki wzbudzenia, a także do łączenia ich przed peryskopem.

Rozdzielacz wiązki (ścieżka emisji): Dla szybkiej akwizycji obrazu bez potrzeby fizycznej wymiany filtra, wiązka emisyjna jest dzielona na kanał z przesunięciem w niebieski i ku czerwieni. Zasadniczo rozdzielacze wiązki można budować, wykorzystując klin dichroiczny lub zestaw luster i zwierciadło dichroiczne w celu oddzielenia wiązki emisyjnej w sposób zależny od długości fali. Do oczyszczenia emitowanych kanałów potrzebne są dwa filtry emisji.

Filtr przestrzenny: Filtrowanie przestrzenne wiązki wzbudzenia jest czasami wymagane do usunięcia nierównoległych promieni świetlnych emitowanych przez wiązki laserowe niskiej jakości. Filtr przestrzenny składa się z teleskopu dwusoczewkowego z małym otworkiem umieszczonym dokładnie w ognisku obu soczewek. W ten sposób światło nietrafione powstające z nierównoległych części wiązki laserowej zostaje skutecznie zablokowane. Takie warunki muszą być spełnione przy tworzeniu mikroskopii opartej na TIRF. Filtrowanie przestrzenne zwiększa się wraz z mniejszymi otworkami, które są trudniejsze do umieszczenia w ognisku, oraz przy mniejszych ogniskowych pierwszego obiektywu. Aby zmniejszyć efekty spowodowane aberracjami obiektywu, korzystne jest zastosowanie zamiast prostych soczewek wysokiej jakości obiektywów mikroskopowych z korekcją do nieskończoności i małym powiększeniu (10x lub 20x).

Peryskop: Ustawienie peryskopu jest niezbędne do translacji skupionej wiązki laserowej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, co jest warunkiem wstępnym dla obrazowania TIRF. Można go łatwo zbudować z dwóch dwucalowych luster, stolika translacyjnego do regulacji pierwszego lustra i słupka do ustawiania drugiego lustra w celu odbicia poszerzonej i skupionej wiązki wzbudzenia do mikroskopu (ryc. 5).

Kamera: Podświetlane od tyłu urządzenia EMCCD (Electron-Multiplying Charge Coupled Devices) są rutynowo używane do rejestrowania sygnałów pojedynczych cząsteczek. Wynika to z ich wysokiej wydajności kwantowej (do 95%), dużej szybkości akwizycji (do 30 MHz) i stosunkowo niskiego poziomu szumów. Chłodzenie do -80 °C redukuje szumy termiczne i jest wspierane przez szereg dostępnych obecnie kamer EMCCD. Ograniczeniem technologii EMCCD jest to, że szum kamery wzrasta liniowo zarówno wraz ze wzmocnieniem kamery, jak i przechwytywanym sygnałem. Inaczej jest w przypadku kamer naukowych CMOS (sCMOS), które są znacznie tańsze i działają dzięki specjalnej architekturze układu sCMOS również znacznie szybciej niż kamery EMCCD. Jednak problem związany z technologią CMOS polega na tym, że akwizycja obrazu nadal nie ma pewnego stopnia odczytu ilościowego na poziomie pojedynczej cząsteczki, ponieważ każdy piksel ma inną czułość wykrywania. Zasadniczo można to skompensować poprzez normalizację pikseli, ale ta procedura w żadnym wypadku nie jest trywialna ¹¹. Dlatego nadal wahamy się, czy polecić kamery sCMOS do mikroskopii jednocząsteczkowej, ale ze względu na szybki rozwój tej technologii, kamery sCMOS mogą wkrótce stać się kamerami pierwszego wyboru. Kamery CCD z wolnym skanowaniem unikają szumów związanych ze wzmocnieniem i zmienności pikseli oraz obsługują najszybsze szybkości akwizycji, jeśli mogą być obsługiwane w tak zwanym trybie "kinetycznym". W tym trybie maskowany jest cały układ aparatu, z wyjątkiem obszaru zainteresowania (ROI), co umożliwia wykorzystanie samego chipa jako urządzenia pamięci masowej. Po pierwszym naświetleniu ROI powstałe ładunki są przenoszone do zamaskowanego obszaru chipa piksel po pikselu, gdzie obraz jest chroniony przed dalszą ekspozycją na światło. Po zakończeniu przesuwania wszystkich linii ROI do zamaskowanego obszaru (w zakresie poniżej milisekundy), sam ROI jest gotowy do następnej ekspozycji. Ten cykl jest powtarzany, aż wszystkie linie pikseli chipa CCD zostaną naładowane. Chip jest następnie odczytywany powoli ze znacznie zmniejszonym szumem odczytu. Na przykład na chipie o wymiarach 1000 x 1300 pikseli można zarejestrować 20 ROI o wymiarach 50x50 pikseli w krótkim odstępie czasu. Ponieważ obrazy pozostają na chipie przez znaczny czas przed odczytaniem, bardzo ważne jest zapewnienie wysokiej jakości maskowania i chłodzenie kamery (np. ciekłym azotem) w celu zmniejszenia nadmiernego szumu termicznego. Niektóre kamery EMCCD obsługują również tryb kinetyczny.

Oprogramowanie: Czas laserów, migawki, AOMS i ekspozycji kamery, a także prawidłowe przechowywanie obrazów są integralną częścią każdego udanego eksperymentu z obrazowaniem. Zasadniczo wiele zdefiniowanych operacji można zaprogramować za pomocą dostępnych pakietów oprogramowania dołączonych do kamery. Komercyjne pakiety oprogramowania obsługują dużą liczbę sprzętowych urządzeń peryferyjnych, które można wdrożyć przy niewielkiej wiedzy technicznej.

Generator impulsów, płytka do akwizycji danych (DAQ) (z analogowymi i cyfrowymi kanałami wyjściowymi) oraz oscyloskop: Generator impulsów to doskonały wybór do zamiany impulsów wyzwalających na impulsy o określonym czasie i napięciu. W ten sposób lasery mogą być precyzyjnie sterowane pod kątem mocy wyjściowej i mierzone w czasie w zakresie od milisekundy do submilisekundy. Karty DAQ z wyjściami analogowymi osiągają to samo i można je łatwo zintegrować z płytą główną komputera za pośrednictwem gniazd PCI. Czas trwania impulsu, amplituda i częstotliwość są weryfikowane za pomocą oscyloskopu.

Zamknięcie całej ścieżki wiązki wzbudzenia: Aby uniknąć wahań profilu wzbudzenia spowodowanych konwekcją powietrza, cała ścieżka wiązki wzbudzenia powinna być zamknięta od środowiska laboratoryjnego. Środek ten jest szczególnie ważny podczas prowadzenia mikroskopii TIRF. Elementy optyczne są również chronione przed kurzem, a ludzkie oko przed ekspozycją na światło lasera. Obudowy można łatwo zbudować z czarnej tektury, którą można kupić w sklepach z artykułami plastycznymi.

Aby określić płynność odzyskiwania fluorescencji SLB po fotowybielaniu (FRAP), wykonuje ^{się 12} pomiarów. W przypadku FRAP wskazane jest istnienie dwóch ścieżek wiązki wzbudzenia (zob. rysunek 3). Pierwsza ścieżka wiązki ma na celu zobrazowanie fluorescencji dwuwarstwy. Można to zrobić w konfiguracji TIRF i przy niskim natężeniu światła. Druga ścieżka wiązki powinna pozwalać na krótki, ale intensywny impuls wybielacza i powinna być skonfigurowana w trybie innym niż TIRF, tak aby opuszczała obiektyw wzdłuż osi optycznej. Okrągły otwór można umieścić w ścieżce wiązki wzbudzenia (patrz rysunek 8), aby uzyskać idealnie okrągły profil wybielacza o zdefiniowanych krawędziach. Aby zobrazować tę przysłonę na płaszczyźnie obiektu, jej optymalne położenie powinno znajdować się w płaszczyźnie ogniskowej soczewki 3 (patrz rysunek 3). Jednak ze względu na długą ogniskową tego obiektywu można również wygenerować obraz przysłony o wystarczającej jakości, gdy przysłona jest umieszczona w nieznacznie przesuniętych pozycjach.

Po przeprowadzeniu eksperymentu z obrazowaniem, surowe dane muszą zostać odpowiednio przeanalizowane. Dostępnych jest kilka protokołów krok po kroku, które obejmują regulację głównych ustawień (np. mocy i czasu oświetlenia, kąta TIRF), pozyskiwanie i analizę danych.

Protokół

1. Generacja i funkcjonalizacja planarnych SLB

1. Mieszanie lipidów
   1. Aby otrzymać 10% skład lipidowy DGS NTA-Ni/90% POPC, rozpuścić 45 mg POPC i 6,9 mg DGS NTA-Ni w chloroformie w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml. Utrzymuj objętość chloroformu na niskim poziomie (zaledwie kilka ml), aby odparować go w następnym kroku. Dla składu lipidowego 1% DGS NTA-Ni/99% POPC należy użyć 49,5 mg POPC i 0,69 mg DGS NTA-Ni.
   2. Chloroform należy usuwać powoli za pomocą wyparki obrotowej – wzrost powyżej temperatury otoczenia nie jest konieczny. Alternatywnie, zdmuchnij go wewnątrz okapu chemicznego w strumieniu gazu obojętnego, takiego jak azot lub argon. Robiąc to, stale obracaj kolbę, aby umożliwić równomierne osadzanie się suszącego lipidu na dolnej połowie kolby okrągłodennej.
   3. Po odparowaniu większości chloroformu, należy podłączyć kolbę do podciśnienia O/N w celu ilościowego usunięcia chloroformu.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć zanieczyszczenia białek i komórek toksycznym chloroformem na późniejszych etapach i zapewnić płynność dwuwarstw lipidowych.
2. Wytwarzanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) z wysuszonych lipidów
   UWAGA: Małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV) mają średnicę od 20 nm do 100 nm i mogą być łatwo wytwarzane przez sonikację w kąpieli. Wytłaczanie lipidów, alternatywna metoda, może prowadzić do powstawania SUV i, w zależności od wielkości porów filtra zastosowanego do wytłaczania, również dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV), które mają wielkość od 100 nm do 1000 nm. Jednak SUV-y najlepiej nadają się do tworzenia SLB.
   1. SUV-y poprzez sonikację kąpieli (pokazane na filmie):
      1. Degass PBS. Zawiesić wysuszoną mieszaninę lipidów w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml w 10 ml odgazowanego PBS.
      2. Napełnić kolbę gazem obojętnym, takim jak azot lub argon, zamknąć ją korkiem i uszczelnić kolbę taśmą autoklawową.
      3. Umieścić szczelnie zamkniętą kolbę w sonikatorze kąpielowym i sonikować zawiesinę lipidową o mocy 120 do 170 W, aż stanie się klarowna. Trwa to od 30 do 60 minut.
      4. Monitorować spektrofotometrycznie postęp tworzenia pęcherzyków: Wynika z tego, że absorpcja nierozcieńczonej emulsji w porównaniu z PBS pozostaje stała przy 234 nm (jako przybliżony wskaźnik stężenia lipidów), ale powinna znacznie spaść przy 550 nm (ze względu na zmniejszone rozpraszanie światła przez większe cząstki).
      5. W celu osadzania ciężkich, niejednowarstwowych pęcherzyków, które zakłócają tworzenie się ciągłego SLB, zawiesinę pęcherzyków należy osadzać przez odwirowanie, w temperaturze 150 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C, a następnie przez 8 godzin w temperaturze 288 000 x g, 4 °C.
      6. Przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy porów 0,2 μm.
      7. Zmierzyć OD przy 234 nm i 550 nm, aby monitorować klarowność preparatu pęcherzykowego i ilość pozostałego lipidu.
      8. Przechowywać pęcherzyki w temperaturze 4 °C w atmosferze argonu lub azotu. Opcjonalnie stosować zawiesinę pęcherzykową do przygotowania dwuwarstwowego przez kilka miesięcy.
   2. SUV-y poprzez wytłaczanie lipidów:
      1. Krótko mówiąc, przepuść zawiesinę lipidową kilka razy przez filtr o wielkości porów 0,1 μm. Niezależnie od metody wytwarzania, odwiruj zawiesinę pęcherzyków dwukrotnie (1 godzina, 150 000 g, 25 °C; następnie 8 godzin, 4 °C, 288 000 g) w celu osadzenia pęcherzyków niejednowarstwowych, które są cięższe .
         UWAGA: Pęcherzyki przechowywane w temperaturze 4 °C w atmosferze gazu obojętnego mogą być używane do przygotowania dwuwarstwowego przez kilka miesięcy.
3. Tworzenie SLB i ładowanie białkiem
   1. Szkiełka podstawowe o wymiarach 24 x 50 mm #1,5 należy potraktować mieszaniną stężonego kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru w proporcji 3:1 przez 30 minut
      UWAGA: Ze względu na agresywny charakter mieszanki należy zachować szczególną ostrożność, tj. nosić fartuch laboratoryjny i okulary ochronne, jak pokazano na filmie!
   2. Wypłukać szkiełka podstawowe pod strumieniem ddH₂O z butelki ze spryskiwaczem. Umieść je na teflonowym stojaku i pozostaw do wyschnięcia na 10 do 30 minut.
   3. Zdejmij dolne szkiełko z 8 lub 16 studzienek komory, wypełnij dno klejem epoksydowym i ostrożnie umieść czyste i suche szkiełko na pokrytym klejem dnie komory. Pozostaw klej do stwardnienia na około 10 minut. Usuń nadmiar kleju z dna.
      UWAGA: Szczelne uszczelnienie między szkiełkiem podstawowym a komorą można również łatwo uzyskać za pomocą dentystycznej dwuskładnikowej silikonowej pasty modelarskiej, która twardnieje w ciągu 10 do 30 minut. Uszczelka ta nie jest tak mocna jak klej epoksydowy, ale wytrzymuje regularne obciążenia fizyczne. Po eksperymencie można go łatwo wyjąć z komory, co następnie nadaje się do ponownego wykorzystania w przyszłych eksperymentach.
   4. Odpipetować 120 μl (60 μl) 10-krotnej zawiesiny lipidowej rozcieńczonej PBS do każdego dołka w komorze 8 (16) dołków (przygotowanych w sposób opisany powyżej) i pozostawić dwuwarstwę na 20 minut. Ostrożnie przepłukać dwuwarstwę dwukrotnie 15 ml PBS. Po uformowaniu się dwuwarstwy należy ją zawsze zanurzyć w buforze i nigdy nie wystawiać na działanie powietrza.
   5. Napełnij każdą studzienkę do końca PBS, a następnie wyjmij 330 μl (komora 8-dołkowa) lub 165 μl (komora 16-dołkowa). W studni pozostało 350 μl (175 μl). Dodać 50 μl (25 μl) koktajlu zawierającego białka znakowane przez Hisa rozcieńczone w PBS do każdej studzienki (400 lub 200 μl końcowej) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut w ciemności. Gęstość białka powierzchniowego można regulować, zmieniając stężenie białka na tym etapie inkubacji.
   6. Przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 15 ml PBS.
      UWAGA: Zazwyczaj SLB powinny być używane w eksperymentach nie dłużej niż 6 godzin po ich naładowaniu białkiem. W tym okresie odzysk fluoroforu po fotowybielaniu utrzymuje się na poziomie do 95% i nie można wykryć utraty białka związanego z dwuwarstwą. Gęstość białka należy określić przed eksperymentem (patrz poniżej).
   7. Krok opcjonalny: W celu zbadania niespecyficznego wiązania białka DGS NTA-Ni zawierającego SLB, należy przemyć SLB raz PBS zawierającym 300 mM imidazolu. Białko powinno całkowicie zejść.

2. Konfiguracja mikroskopu

1. W celu zbudowania systemu mikroskopowego zdolnego do wykrywania fluorescencji pojedynczych fluorochromów należy zapoznać się z zaleceniami podanymi we wstępie.

3. Pomiary mocy

UWAGA: Fluorofory mogą być łatwo nasycone nadmiarem światła wzbudzającego. Przyspiesza to fotowybielanie bez dalszego wzrostu emisji i dlatego należy tego unikać. Aby zoptymalizować oświetlenie próbki, gęstość mocy wzbudzenia powinna być mierzona bezpośrednio na próbce. Takie pomiary mogą również służyć jako punkt odniesienia dla przyszłych eksperymentów. Co więcej, znajomość stosunku między wejściową i wyjściową mocą lasera jest pomocna przy ocenie strat światła w systemie obrazowania.

1. Przesuń wiązkę wzbudzenia do pozycji pionowej, tak aby opuszczała obiektyw pod kątem 90°.
2. Umieść głowicę miernika mocy na górze wiązki i zmierz moc wiązki (=P). Udokumentuj wynik.
3. Za pomocą peryskopu obróć wiązkę do pozycji TIRF i zobrazuj nienaruszoną jednorodną dwuwarstwę fluorescencyjną. Aby uniknąć bielenia i nasycenia sygnału CCD, umieść filtr o neutralnej gęstości (ND) o gęstości optycznej (OD) od 2 do 3 na ścieżce światła wzbudzającego.
   1. Zmierzyć zintegrowane zliczenia całego oświetlonego pola (= I_całkowita). Zmierz również rozmiar oświetlanego obszaru (=_{A całkowita}). Zmierz zintegrowane liczby (= I_środek) maksymalnie oświetlonego punktu środkowego, a także rozmiar plamki (=_środek A).
4. Zmierz sygnał tła na piksel (=B) albo poza oświetlonym obszarem, albo bez oświetlenia próbki.
5. Odejmij sygnał tła od wyników zmierzonych w 3.). W tym celu należy pomnożyć liczbę pikseli danego obszaru (całego oświetlonego obszaru lub punktu środkowego) przez liczbę tła na piksel. (=I_total -_Suma . B i I_centrum - A_centrum . B).
6. Podziel zintegrowany i skorygowany sygnał tła punktu środkowego przez zintegrowany i skorygowany w tle sygnał całego pola oświetlenia.
   UWAGA: Wynik wskazuje ułamek całkowitej mocy znajdującej się w punkcie środkowym (= (I_{środek - środek A} . B) / (I_total -_{A total} . B) ). Pomnożenie tego wyniku przez potęgę P mierzoną w 2.) skutkuje mocą światła oświetlającego centralny punkt.
7. Określ rozmiar_środka plamki A w μm². W tym celu podziel rozmiar piksela aparatu w μm przez powiększenie obiektywu, weź kwadrat wyniku jako μm² na piksel.
   1. Alternatywnie można zmierzyć rozmiar piksela w obrazie za pomocą szkiełka mikrometrycznego umieszczonego na mikroskopie i przyjąć kwadrat wyniku jako obszar na piksel. Pomnóż tę wartość przez liczbę pikseli znajdujących się w centrum punktu, aby dotrzeć do oświetlonego obszaru punktu.
8. Podziel moc P oświetlającą środkową plamkę przez rozmiar środkowej plamki A_{środek, μm²,} aby obliczyć intensywność oświetlenia na μm². Przykład przedstawiono na rysunku 6.
9. Wartości gęstości mocy mierzone w oświetleniu innym niż TIRF są zazwyczaj niższe niż te obecne w oświetleniu TIRF ¹³, które również zależą od dokładnego kąta, pod jakim światło laserowe jest całkowicie odbijane. Aby uzyskać gęstości mocy występujące w oświetleniu TIRF, skalibrowano obraz koralików fluorescencyjnych o średnicy 0,1 μm zarówno w trybie bez TIRF, jak i TIRF. Stosunek intensywności fluorescencji kulek mierzonych w trybie TIRF i bez TIRF wynosi współczynnik konwersji C, który umożliwia przeliczenie zmierzonych wartości gęstości mocy na te efektywne przy oświetleniu TIRF (równanie 1).
   gęstość mocy _TIRF = C • gęstość mocy _nie-TIRF (równanie 1)
   gdzie C = intensywność ściegu _TIRF / intensywność ściegu _{bez TIRF}

4. Pomiary gęstości

1. Określ średni sygnał poszczególnych fluoroforów znajdujących się na dwuwarstwie. Dwuwarstwowe cząsteczki MHC obciążone peptydami fluorescencyjnymi są idealne do tego celu, ponieważ stechiometria białko:etykieta jest dokładnie jedna. W razie potrzeby wybiel wszystkie etykiety na dwuwarstwie w polu view i pozwól, aby fluorescencja wróciła do normy, aby uwidocznić pojedyncze fluorofory.
   1. Rejestruj obrazy w krótkich odstępach czasu (np. zastosuj protokół akwizycji strumieniowej) i monitoruj ruchliwość pojedynczych cząsteczek w ciągu kilku klatek. Aby uzyskać więcej informacji, patrz rysunek 7.
2. Oznacz centralny punkt oświetlenia w dwuwarstwie jako ROI. Zmierz ROI, wariancja gęstości mocy oświetlenia (która jest proporcjonalna do intensywności fluorescencji) powinna być idealnie mniejsza niż 15%.
   1. Określ fluorescencję pojedynczej cząsteczki i fluorescencji masowej tylko w ramach tego ROI. Zintegruj sygnał ROI, który jest wystarczająco duży, aby uchwycić 99% lub więcej funkcji rozproszenia punktowego pojedynczego emitera. W przypadku korzystania z aparatu o rozmiarze piksela 16-20 μm (podanym w specyfikacji aparatu producenta), obiektywu o 100-krotnym powiększeniu i aperturze numerycznej równej lub większej niż 1,45, należy przyjąć obszar o wymiarach 7 na 7 pikseli, przy czym szczyt intensywności znajduje się w środku kwadratu.
   2. Aby określić sygnał tła, zintegruj zliczenia sąsiedniego kwadratu o wymiarach 7 na 7 pikseli, który nie zawiera sygnału fluorescencji. Odejmij tło od sygnału pojedynczej cząsteczki, aby określić skorygowaną wartość fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Zaznacz tylko te sygnały, które są nadal widoczne w następnej ramce.
3. Powtórz krok 4.2 pięćdziesiąt do kilkuset razy. Uśrednianie sygnału skorygowanego w tle. W razie potrzeby wykreśl wartości intensywności pojedynczej cząsteczki jako histogram. Opcjonalnie: skorzystaj z odpowiedniej wtyczki do pakietów oprogramowania open-source (np. ImageJ) lub przetwarzaj dane za pomocą komercyjnego oprogramowania (np. Metamorph, Molecular Devices). Doświadczeni użytkownicy mogą napisać własny program analityczny w Matlabie lub podobnych pakietach oprogramowania.
4. Umieść filtr o neutralnej gęstości 2 lub wyższej na ścieżce wzbudzenia i wykonaj zdjęcia dwuwarstwy fluorescencyjnej zawierającej białka znakowane tym samym fluoroforem. Zapisz średnią intensywność pikseli w ramach tego samego zwrotu z inwestycji, który jest używany do pomiarów intensywności pojedynczej cząsteczki. Zapisz czas ekspozycji pomiarów fluorescencji masowej. Zmierz to samo miejsce bez oświetlenia w celu odjęcia tła.
5. Aby określić gęstość białka w dwuwarstwie, pomnóż średnią intensywność pikseli fluorescencji objętościowej z korekcją tła określoną w kroku 4 przez liczbę pikseli na mikron kwadratowy (np. 41,5), przez 100 (jeśli zastosowano filtr ND o OD 2) lub 1 000 (jeśli zastosowano filtr ND o OD 3) i czas ekspozycji zastosowany w kroku 2 i podziel go przez średni sygnał pojedynczej cząsteczki określony w krok 3, czas ekspozycji zastosowany w kroku 2 i liczba fluoroforów na białko.

5. Testowanie integralności dwuwarstwy

1. Przygotuj dwuwarstwę fluorescencyjną i umieść ją na stoliku mikroskopu, jak opisano powyżej.
2. Dostosuj ostrość i zrób zdjęcie dwuwarstwy w trybie TIRF. Zastosuj krótki, ale intensywny impuls wybielacza w trybie innym niż TIRF, aby usunąć fluorescencję w małym pierścieniu ROI w kształcie dysku.
3. Zrób zdjęcie dwuwarstwy w trybie TIRF o niskiej intensywności natychmiast po wybielaniu, a następnie co pięć do dziesięciu sekund, aby monitorować szybkość odzyskiwania fluorescencji.
4. Przejdź do innego obszaru na dwuwarstwie i wykonaj kroki 2 i 3. Zrób kolejne zdjęcie w trybie TIRF o niskiej intensywności 5 minut po impulsie wybielacza. Określ intensywność_wybielania po wybielaniu w obszarze wybielacza i porównaj ją z intensywnością przed wybielaniem I₀ na początku eksperymentu (wybielanie nie powinno było wystąpić), aby obliczyć frakcję nieruchomą (IF) w następujący sposób:
   Frakcja nieruchoma IF (%) = (I₀ -_{I post bleach} ) / (I₀– tło) x 100,
   z tłem = zmierzona intensywność w ROI bez zastosowanego światła wzbudzenia
   IF powinien wynosić mniej niż 10% (najlepiej mniej niż 5%).

Wyniki

Architektura systemu mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek została szczegółowo przedstawiona na Rysunku 2. Poszczególne elementy, takie jak komponenty optyczne i inne części sprzętowe, zostały omówione we wstępie. Ścieżki wiązki wzbudzenia optycznego, które w określony sposób generują oświetlenie TIRF i non-TIRF, są pokazane i wyjaśnione na Rysunkach 3 do 5. Należy zwrócić uwagę na położenie dzielnika wiązki 50:50 przed pierwszym lustrem peryskopowym umieszczonym na przesuwnym stoliku mikrometrycznym (Rysunek 5). Dzielnik wiązki ten nakłada na siebie wiązkę TIRF wykorzystywaną do obrazowania (oznaczoną kolorem zielonym) oraz wiązkę non-TIRF (oznaczoną kolorem czerwonym) wykorzystywaną do blaknięcia lub lokalnej, zdefiniowanej przez aperturę aktywacji próbki za pomocą światła (jak przedstawiono na Rysunku 3). Połączone ścieżki światła (Rysunek 5, oznaczone kolorem pomarańczowym) są odbijane przez drugie lustro peryskopowe do tylnego portu mikroskopu odwróconego. Jak wyjaśniono na Rysunku 4 i przedstawiono na Rysunku 2, zastosowanie dwóch lub trzech soczewek wypukłych poszerza profile wiązki laserowej i skupia wiązki laserowe na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, co prowadzi do powstania dwóch wiązek kolimowanych oświetlających próbkę odpowiednio w trybie TIRF i non-TIRF.

Przykład wartości zmierzonej intensywności wymaganych do obliczenia gęstości mocy na próbce przedstawiono na Rysunku 6. Średni sygnał tła, który należy odjąć od intensywności zmierzonych w obszarze oświetlonym i centralnym (wykorzystywanym do obrazowania), wyznacza się w regionie w obrębie pola widzenia, który nie jest oświetlony wiązką lasera (tutaj 7089 counts). Średnie intensywności skorygowane o tło dla obszaru oświetlonego (1684 counts) oraz obszaru centralnego (4830 counts) mnoży się następnie przez odpowiadające im wielkości regionów, aby uzyskać intensywności całkowite (1,471 x 10⁸ counts dla obszaru oświetlonego i 3,424 x 10⁷ counts dla obszaru centralnego). Stosunek intensywności całkowitych w obszarach centralnym i oświetlonym pozwala wyznaczyć ułamek całkowitej mocy oświetlającej obszar centralny (0,23 lub 23%). Jak pokazano w filmie, całkowitą moc należy wyznaczyć przy obiektywie za pomocą miernika mocy w trybie oświetlenia innym niż TIRF. W naszym przykładzie została ona ustawiona na 5 mW, co daje moc 5 mW x 0,23 = 1,15 mW w obszarze centralnym. Ponieważ 41,5 pikseli odpowiada w naszym przykładzie 1 µm², obszar centralny ma wielkość 7089 pikseli / 41,5 pikseli x µm² = 170,8 µm². Dzieląc moc światła oświetlającego obszar centralny (1,15 mW) przez tę powierzchnię (170,8 µm²), otrzymuje się średnią gęstość mocy wynoszącą 0,7 kW/cm² w obszarze centralnym.

Rysunek 7 przedstawia obrazy i odpowiadające im wyniki intensywności pojedynczych fluoroforów pozyskane w szybkim następstwie (100 klatek na sekundę, tj. z ramą czasową 10 msec). W celu ilościowej oceny intensywności wyznacza się średni sygnał z prostokątnego obszaru o wymiarach siedem na siedem (=49) pikseli, który obejmuje sygnał fluorescencyjny. Ponadto średni sygnał tła wyznacza się w obrębie prostokątnego obszaru o wymiarach siedem na siedem pikseli w bliskim sąsiedztwie sygnału pojedynczej cząsteczki. Średni sygnał skorygowany o tło mnoży się przez liczbę pikseli w obrębie obszaru (= 49), aby uzyskać sygnał pojedynczej cząsteczki (zaznaczony pogrubieniem).

Reprezentatywny eksperyment FRAP zaprojektowany w celu oceny mobilności białek znakowanych fluorescencyjnie związanych z SLB przedstawiono na Rysunku 8. Należy zwrócić uwagę na Rysunku 8A na wielokrotne użycie poszerzonej wiązki obrazującej o niskim natężeniu oraz jednorazowe użycie drugiej, węższej wiązki o wysokim natężeniu z zdefiniowaną aperturą w celu szybkiego wygaszenia fluorochromu w punkcie czasowym zero sekund. Średnie natężenia wewnątrz żółtego okręgu po odjęciu tła, które zostały znormalizowane względem początkowej wartości średniego natężenia przed impulsem wygaszającym, przedstawiono na Rysunku 8B w funkcji czasu, aby zarejestrować szybkość i zakres powrotu fluorescencji. Jak pokazano, ponad 90% (oznaczone zieloną linią) początkowego natężenia dwuwarstwy powróciło w ciągu 75 sec po wygaszeniu fluorochromu. W konsekwencji mniej niż 10% białek osadzonych w pokazanej SLB jest nieruchomych.

Rycina 1. Schematyczny opis systemu SLB. (A) SLB są zbudowane z POPC (90-99%) i syntetycznego lipidu DGS NTA-Ni (1-10%). Tworzą się one samoistnie, gdy czyste powierzchnie szklane zostaną pokryte SUV składającymi się z odpowiednich lipidów. (B) Po utworzeniu SLB te mogą być łatwo funkcjonalizowane rozpuszczalnymi białkami z jednym znacznikiem C- lub N-końcowym zawierającym dwanaście histydyn (12H, np. cząsteczka kostymulująca B7-1 i cząsteczka adhezyjna ICAM-1) lub dimerami białkowymi z dwoma znacznikami zawierającymi po sześć histydyn każdy (2x6H, np. dimer αβMHC klasy II). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Przegląd ścieżek wiązki wzbudzenia i emisji. Gazowe lasery jonowe (np. Ar⁺ lub Kr⁺) mogą być wykorzystywane do szybkiego wyłączania przy użyciu modulatorów akustyczno-optycznych. Diody laserowe są obecnie dostępne w wielu długościach fal i stanowią doskonałą alternatywę, ponieważ mogą być modulowane elektronicznie w zakresie mikrosekund. Należy zauważyć, że wiązki laserowe można łatwo korygować za pomocą dwóch luster (dichroicznych) oraz dzielić i łączyć przy użyciu prostych dzielników wiązki, aby stworzyć dwie lub więcej ścieżek wiązki. W tym przykładzie zastosowano wiązkę obrazowania TIRF (do monitorowania zdarzeń) oraz wiązkę wybielającą (do wybielania fluoroforów lub fotoaktywacji cząsteczek w klatkach w sposób zdefiniowany przez aperturę). Obie ścieżki wzbudzenia mogą być obsługiwane niezależnie od siebie dzięki zastosowaniu dodatkowych migawek. Peryskop umożliwia przesuwanie skupionych wiązek laserowych w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, aby wygenerować oświetlenie TIRF próbki. Obraz fluorescencyjny może zostać rozdzielony spektralnie przy użyciu dzielnika wiązki emisji przed akwizycją za pomocą ultraszybkiej kamery (np. kamery EM-CCD lub sCMOS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Regulacja oświetlenia TIRF poprzez przesuwanie skupionej wiązki w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Jak pokazano, punkt ogniskowy wiązki laserowej jest przesuwany w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu z centrum na peryferie poprzez translację wiązki (z wykorzystaniem układu luster peryskopowych). W rezultacie równoległa wiązka opuszcza obiektyw pod kątem, aż do osiągnięcia kąta krytycznego, przy którym następuje całkowite wewnętrzne odbicie. Pole ewanescentne powstaje na granicy szkło-medium, gdzie zachodzi całkowite odbicie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Proste układy optyczne do ogniskowania wiązki laserowej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Do rozszerzenia wiązki laserowej i jej ogniskowania w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu TIRF potrzebne są albo trzy, albo dwie soczewki. Układy dwusoczewkowe generują mniej błędów związanych z soczewkami niż układy trójsoczewkowe i mogą być lepiej dostosowane do generowania wiązki obrazowania TIRF. Trzy soczewki mogą być preferowane w przypadku dążenia do zdefiniowanego rozszerzenia wiązki i plamki oświetlenia o ostrych krawędziach, co jest wymagane w badaniach wykorzystujących fotoaktywację lub fotobleaching. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Opisana fotografia drogi wiązki z tyłu mikroskopu fluorescencyjnego. Jak już wskazano na Rycynie 2, można łatwo zaimplementować dwie wiązki wzbudzenia: jedną w trybie TIRF (oznaczoną kolorem zielonym), a drugą w trybie poza TIRF (oznaczoną kolorem czerwonym). Zostają one nałożone na siebie przy użyciu dzielnika wiązki 50:50 (BS). Soczewki skupiające (L1 i L2) są rozmieszczone w odpowiednich wiązkach, aby skupić je na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (niewidocznej na rysunku). Peryskop składający się z dwóch luster (M1 i M2) prowadzi obie wiązki przez port wejściowy do mikroskopu. Pierwsze lustro (M1) może być przesuwane za pomocą stołu translacyjnego (TS) (poprzez obrót śruby mikrometrycznej, jak wskazano), aby wprowadzić jedną z wiązek w pozycję TIRF. Po ustanowieniu TIRF drugą wiązkę (wykorzystywaną do fotowybielania lub fotoaktywacji, tutaj zaznaczoną kolorem czerwonym) można regulować niezależnie od wiązki TIRF, tak aby obiektyw pozostał w trybie poza TIRF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6. Pomiar mocy w obszarze centralnym plamki oświetlenia. Zgodnie ze wskazówkami wybrano odpowiednie obszary zainteresowania (ROI), które odzwierciedlają tło, cały obszar oświetlony (IA) oraz obszar centralny (CA), w którym później rejestrowane będą zdarzenia. Od wartości zarejestrowanych dla IA i CA odjęto wartości tła, a następnie zintegrowano intensywności, mnożąc skorygowane średnie intensywności przez liczbę pikseli znajdujących się w każdym obszarze (= intensywności zintegrowane). Zintegrowaną intensywność CA podzielono przez zintegrowaną intensywność IA, aby uzyskać proporcję mocy wiązki oświetlającej CA (w tym przykładzie: 23%). Moc światła oświetlającego CA wyznaczono poprzez pomnożenie całkowitej mocy wiązki (tutaj: 5 mW) przez proporcję oświetlającą CA (tutaj: 0,23). Aby określić rozmiar obszaru centralnego, pomnożono powierzchnię (tutaj: 7089 pikseli) przez współczynnik konwersji wielkości piksela na powierzchnię (tutaj: 1/41,5 µm² piksel^-1). Aby obliczyć średnią gęstość mocy światła wzbudzenia oświetlającego CA, podzielono moc (tutaj: 1,15 mW) przez rozmiar CA (tutaj: 170,8 µm²). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7. Ilościowe oznaczenie sygnałów pojedynczych cząsteczek. (A) Przebieg czasowy pojedynczych fluoroforów na SLB. Obszar zainteresowania (roi, żółty) o rozmiarze 7 x 7 pikseli zostaje umieszczony wokół sygnału w celu jego kwantyfikacji. Tło jest wyznaczane z sąsiedniego roi o rozmiarze 7 x 7 pikseli (zielony). (B) Wymieniono obliczone średnie intensywności pikseli. Aby wyznaczyć sygnał pojedynczej cząsteczki, wartości tła (zielony roi) odejmuje się od wartości sygnału (żółty roi), a następnie mnoży przez 49. (C) Intensywności pojedynczych cząsteczek jednego fluoroforu są przedstawione w funkcji czasu. Należy zauważyć, że punkt czasowy 90 msec został pominięty, ponieważ fluorofor znajduje się w procesie wybielania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rysunek 8. Analiza powrotu fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) w celu określenia integralności SLB. (A) FRAP przeprowadzono na dwuwarstwie zawierającej IEk/MCC-Alexa Fluor 647. Przedstawiono co dziesiąty obraz z eksperymentu. (B) Ilościowa analiza FRAP eksperymentu pokazanego w (A). Wartości wskazują średnie intensywności (I) wewnątrz żółtego ROI pokazanego w (A) podzielone przez intensywność początkową (I_o) przed wybielaniem. Czerwone punkty danych są wyświetlone w (A), zielona linia oznacza 0,9 powrotu intensywności pierwotnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Mikroskopia jednocząsteczkowa daje wyjątkową możliwość zbadania zachowania białek w ich naturalnym środowisku komórkowym. Obrazowanie molekularne staje się zatem coraz bardziej atrakcyjne dla szerokiej społeczności naukowej, jednak wielu naukowców nadal wzbrania się przed początkowymi inwestycjami w technologię i wiedzę. Główną korzyścią wynikającą z montażu własnego systemu obrazowania jest to, że można go łatwo dostosować do konkretnych potrzeb każdego.

Jak zasugerowano w niniejszym dokumencie, wiązka wzbudzenia inna niż TIRF może być łatwo zaimplementowana jako dodatek do istniejącej ścieżki światła TIRF, jeśli pożądane jest szybkie i zdefiniowane fotowybielanie (lub aktywacja) fluoroforów i ligandów, np. podczas wykonywania eksperymentów FRAP lub odkrzętowania ligandów ¹⁴. Wprowadzenie rozdzielacza wiązki emisyjnej pozwala na jednoczesny zapis co najmniej dwóch, a w niektórych przypadkach nawet czterech kanałów fluorescencyjnych. Lista rozszerzeń jest w zasadzie ograniczona tylko własną wyobraźnią.

Na przykład zastosowanie zmotoryzowanego koła filtrów emisji w ścieżce emisji pozwala na szybkie przełączanie między nawet dziesięcioma różnymi kanałami fluorescencyjnymi. W przypadku szeregowego połączenia dwóch zmotoryzowanych kół filtrów emisji (każde wyposażone w 10 szczelin na filtry) można odczytać do 18 kanałów fluorescencyjnych. Obrazowanie oparte na TIRF może być uzupełnione pomiarami mobilizacji wapnia i mikroskopią interferencyjno-refleksyjną (IRM) po zintegrowaniu ścieżki lampy wzbudzającej ksenonowej lub rtęciowej. IRM jest metodą z wyboru do wizualizacji stopnia, w jakim komórki są przymocowane do powierzchni szkła lub SLB, a tym samym może dostarczyć krytycznych informacji podczas interpretacji danych obrazowania opartych na TIRF. Wyznaczenie poszerzonej wiązki wzbudzenia za pomocą prostego zwierciadła dichroicznego i dodatkowego lasera o długości fali 405 nm pozwala na przeprowadzenie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji (PALM) lub stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM), czyli dwóch metodyk nadrozdzielczych o dokładności pozycyjnej poniżej granicy dyfrakcji światła widzialnego ^15,16.

Sukces eksperymentalny to jednak nie tylko kwestia odpowiedniego sprzętu. Aby w pełni wykorzystać obrazowanie oparte na TIRF z redukcją szumów, komórki powinny stykać się z powierzchnią w sposób, który nie nakłada ograniczeń na powierzchnię komórki ani nie zakłóca fizjologii ich błony komórkowej. SLB funkcjonalizowane odpowiednimi białkami do adhezji komórek są bardzo dobrze przystosowane do tego celu, ponieważ wszystkie ligandy osadzone w SLB są bocznie ruchome i dostosowują swoje boczne położenie w dwuwarstwie w odpowiedzi na dynamikę wiązania i segregacji receptorów.

Aby produkować SLB w powtarzalny sposób, najlepiej zacząć od SUV-ów o wysokiej czystości. Jak opisano w niniejszym dokumencie, niezwykle ważne jest usunięcie pęcherzyków wielopłytkowych, które również powstają podczas sonikacji, w dwóch etapach ultrawirowania, ponieważ zakłócają one tworzenie się ciągłych SLB o wysokiej płynności. Wysokiej jakości SLB tworzą się tylko na czystych powierzchniach szklanych. Po oczyszczeniu szkiełka należy natychmiast zużyć lub przechowywać w próżni. Co ważne, SLB nigdy nie wolno wystawiać na działanie powietrza, ponieważ doprowadziłoby to do ich zakłócenia. Mycie SLB polega, jak pokazano, na płukaniu buforowym za pomocą pipety serologicznej, ponieważ jest to procedura nie tylko oszczędzająca, ale także oszczędzająca czas.

Podczas zbioru i oczyszczania białek rezydujących w SLB należy unikać stosowania detergentów. Dzieje się tak, ponieważ detergent znacznie zmniejsza ruchliwość białka, nawet jeśli jest obecny w śladowych ilościach. Aby całkowicie obejść potrzebę stosowania detergentu, zaleca się rozpuszczalną ekspresję wydzielanych ligandów wyposażonych w znaczniki polihistydyny w komórkach ssaków lub owadów. Jeśli wymagane jest ponowne składanie z ciał inkluzyjnych E. coli, należy zachować ostrożność, aby skutecznie usunąć detergenty z ciał inkluzyjnych przed ich wyjęciem i ponownym złożeniem.

Główną zaletą stosowania SLB jest ich modułowy i rekonstytutywny charakter, co pozwala na precyzyjne przeanalizowanie roli danej interakcji receptor-ligand dla aktywacji i adhezji komórek. W związku z tym należy wspomnieć, że DGS NTA-Ni powinien być obecny w 10% w SLB, aby zapobiec rywalizacji białek o miejsca wiązania NTA-NI. W przypadku stosowania SLB zawierających tylko 1% lub 2% DGS NTA-Ni, można zauważyć zmniejszenie asocjacji danego gatunku białka znakowanego polihistydyną, zwłaszcza podczas jednoczesnej inkubacji rosnących ilości drugiego gatunku białka znakowanego polihistydyną (obserwacja niepublikowana). Zjawisko to nie występuje podczas pracy z SLB z 10% DGS NTA-Ni.

Chociaż nigdy nie zaobserwowaliśmy niespecyficznego wiązania jakiegokolwiek badanego białka znakowanego polihistydyną z SLB zawierającymi DGS NTA-Ni, możliwość ta powinna być testowana przy wprowadzaniu białka po raz pierwszy, W tym celu zalecamy stosowanie SLB pozbawionych DGS NTA-Ni (białko nie powinno się wiązać). Po drugie, w przypadku stosowania SLB zawierającego DGS NTA-Ni, białko powinno całkowicie odpadnąć po umyciu SLB PBS zawierającym 300 mM imidazolu.

Inną istotną zaletą stosowania SLB jest to, że przejściowe interakcje i zdarzenia sygnalizacyjne mogą być monitorowane z ulepszoną rozdzielczością czasoprzestrzenną ^17-19. Dzieje się tak przynajmniej częściowo dlatego, że proces wiązania trójwymiarowego jest zasadniczo zredukowany do dwóch wymiarów obrazowania, zwłaszcza podczas nagrywania w trybie TIRF z tłumieniem szumów. Zastosowanie SLB jest kompatybilne z detekcją sygnału pojedynczej cząsteczki, co jest warunkiem wstępnym dla mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej fotoaktywem (PALM) lub stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM), tj. mikroskopii nadrozdzielczej z rozdzielczością poniżej granicy dyfrakcji ^15,16. Te specjalne metody obrazowania umożliwiają eksperymenty z transferem energii rezonansu Förstera dla pojedynczych cząsteczek, mające na celu wizualizację indywidualnych interakcji białko-białko w środowisku synaptycznym ²⁰. Podejście to zostało szczegółowo wyjaśnione w publikacji JoVE zatytułowanej "Pomiar wiązania TCR-pMHC za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET" ²¹.

Interpretując eksperymenty oparte na SLB, należy zawsze pamiętać, że nie wszystkie właściwości błony plazmatycznej żywej komórki są charakterystyczne dla SLB, a niektóre z brakujących cech mogą wpływać na badaną fizjologię. W końcu białka osadzone w SLB swobodnie dyfundują i nie są zorganizowane w mikrodomenach błonowych, ponieważ większość ich komórkowych odpowiedników to ^5,6,22. Unieruchomione arkusze błony plazmatycznej pochodzące z komórek przylegających, które do pewnego stopnia zachowują architekturę błony plazmatycznej żywych komórek, zostały z powodzeniem wykorzystane do zbadania wychwytu antygenów osadzonych w błonie przez limfocyty B ²³. Jednak nawet takie membrany nie oddziałują z wysoce dynamicznym cytoszkieletem i nie charakteryzują się elastycznością, ponieważ są podtrzymywane przez sztywną szklaną powierzchnię. W związku z tymi rozbieżnościami istnieje wyraźna potrzeba inżynierii SLB, które oferują środki do podziału białek w określony sposób i które są wspierane przez powierzchnie o regulowanej elastyczności lub przez powierzchnie, które zmieniają swoją sztywność w odpowiedzi na lokalnie stosowane impulsy świetlne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#1.5 szkiełka	szklane VWR	631-0853
Kolba okrągłodenna 250ml	VWR	201-1357
50:50 kostki rozdzielacza wiązki	Thorlabs	BS013
Modulator akustyczno-opitalny C1205-2	Isomet		jest niezbędny tylko wtedy, gdy używane są lasery CW, których nie można modulować,
Alexa Fluor 488-NHS	Life technologies	A-20000
Alexa Fluor 555-NHS	Life technologies	A-20009
Alexa Fluor 647-NHS	Life technologies	A-20006
taśma autoklawu	VWR	489-1312	lub dowolna inna termostabilna lepka
tabe Avanti Mini-Extruder	Avanti Lipids	610000	alternatywa dla sonikatora do kąpieli Sonikator
do kąpieli QSONICA Q700	QSONICA	Rozdzielacz wiązki Q700
	Cairn	P280/210/MLS
Bü parownik obrotowy chi	VWR	531-0837
kamera	Andor	iXon Ultra 897	zobacz tekst rękopisu, aby zapoznać się z alternatywami
skoncentrowany nadtlenek wodoru	Roth	9683.1
skoncentrowany kwas siarkowy	Roth	X944.2
klej epoksydowy	Uhu	45705	Uhu plus sofortfest 2min
koło	filtrów Sutter instrumenty	Lambda 10-2
LabTek komory	VWR	734-2062
laser	Toptica		(długości fal 375 - 785 nm)
	Thorlabs,	Newport-DGS
NTA-Ni (lipid)	Avanti Lipids	790404C	już w wersji dostarczonej z roztworem Choroform zalecany jest wariant soli Nicekl
POPC (lipid)	Avanti Lipids	850457C	już w wersji
dostarczonej z rozwiązaniem Choroformmikroskop Zeiss Axiovert 200	Zwierciadła Zeissa
	Thorlabs	BB1-E02
filtry optyczne	AHF, Chroma, Semrock		zestawy filtrów są dostępne dla wielu różnych kombinacji barwników
oscyloskop	BK Precision	2120C
sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Technologie życia	14190-136	odgazowuje przed użyciem
peryskop	Thorlabs	RS99/M
picodent twinsil 22	Picodent	13001000	alternatywa dla miernika mocy kleju epoksydowego
Lasermate-Q	Koherentny	-	wystarczy dowolny miernik mocy czuły w używanym zakresie
widmowymgenerator impulsów	Stanford Research Systems	SRS DG535
filtr przestrzenny	Thorlabs	KT310/M
filtr strzykawkowy 0,2&mikro; m	Millipore	GVWP04700
Obiektyw apochromatyczny z obsługą TIRF 100x, NA 1.46	Zeiss	440782-9800-000
trichlorometan/chloroform	Roth	3313.1
rurki do ultrawirowania poliwęglanu 1,00 mm, 11 mm x 32 mm	Ultrawirówka Thermo Fisher	45237
Sorvall	Wirnik	RC M150GX
	Thermo Fisher	S120-AT2
Nanodrop 2000c	Thermo	Fisher-pompa
próżniowa	VWR	181-0248

Dostępne są różne warianty soczewka - ultrawirówkowy Thermo Fisher Spektrofotometr UV