Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

W tym artykule

Podsumowanie

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Streszczenie

Ten protokół opisuje metodę wizualizacji ligandów rozmieszczonych w polu komórek. Łatwość ekspresji białek egzogennych, wraz z dużym rozmiarem ich komórek we wczesnych zarodkach, sprawiają, że Xenopus laevis użytecznym modelem do wizualizacji ligandów oznaczonych GFP. Syntetyczne mRNA są efektywnie przekształcane po wstrzyknięciu we wczesnym stadium Xenopus embriony, a zastrzyki mogą być ukierunkowane na pojedynczą komórkę. W połączeniu ze znacznikiem linii, takim jak RFP na uwięzi błonowej, wstrzyknięta komórka (i jej potomkowie), która wytwarza nadekspresję białka, może być łatwo śledzona. Protokół ten opisuje metodę wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie ligandów Wnt i Shh z wstrzykniętego mRNA. Metody te obejmują mikropreparację eksplantatów ektodermalnych (czapek zwierzęcych) oraz analizę dyfuzji ligandów w wielu próbkach. Za pomocą obrazowania konfokalnego można uzyskać informacje o wydzielaniu i dyfuzji ligandów w polu komórek. Analizy statystyczne obrazów konfokalnych dostarczają danych ilościowych na temat kształtu gradientów ligandów. Metody te mogą być przydatne dla badaczy, którzy chcą przetestować wpływ czynników, które mogą regulować kształt gradientów morfogenu.

Wprowadzenie

Podczas wczesnego rozwoju embrionalnego, komórki są stopniowo zobowiązane do podążania za określonymi liniami różnicowania: oznacza to, że grupa komórek totipotencjalnych (lub pluripotencjalnych) stopniowo ogranicza się do tworzenia populacji komórek progenitorowych zdeterminowanych, aby dać początek jednemu typowi komórek. Sygnalizacja komórka-komórka ma kluczowe znaczenie dla regulacji specyfikacji linii podczas rozwoju embrionalnego. Manipulacja tymi sygnałami będzie konieczna, aby skierować komórki macierzyste w stronę określonego losu, aby wspierać nowatorskie terapie medyczne.

Stosunkowo niewielka liczba ścieżek sygnalizacyjnych jest powtarzana podczas rozwoju, w tym ścieżki reagujące na nadrodzinę TGF (węzły i BMP)1-2, FGFy3, Wnts4 i Jeże5. Te wydzielane białka wiążą receptory obecne na błonie komórkowej, aby aktywować transdukcję sygnału, zmieniając w ten sposób ekspresję genów i/lub zachowanie komórki. Ścisła regulacja sygnalizacji komórkowej jest niezbędna do specyfikacji linii komórkowej i prawidłowego rozwoju. Podczas gdy wzajemne oddziaływanie między tymi szlakami jest ważne w określaniu losu komórki, pojedynczy ligand może sam w sobie wywoływać różne odpowiedzi w różnych stężeniach. Gradienty morfogenów zostały opisane ponad 100 lat temu jako teoria wyjaśniająca, w jaki sposób różne typy komórek mogą wywodzić się z pola komórek6. Cząsteczki sygnałowe wytwarzane przez jedną grupę komórek mogą dyfundować w pewnym zakresie, zmniejszając stężenie wraz z większą odległością od źródła. Komórki wystawione na sygnał będą reagować na lokalne stężenie w swoim położeniu w polu komórek, przy czym komórki w różnych pozycjach będą reagować inaczej na różne poziomy sygnału. Dowody na istnienie morfogenów pochodzą z badań wczesnego zarodka Drosophila7 i dysku skrzydła8, a także kończyny kręgowca9 i cewy nerwowej10.

Potrzebne są metody do zbadania, w jaki sposób powstają gradienty morfogenu i zidentyfikowania innych cząsteczek ważnych w regulacji tych gradientów. Eleganckie eksperymenty wykorzystujące immunohistochemię do wizualizacji endogennych białek in vivo w kontekście różnych środowisk genetycznych zostały wykorzystane do zbadania gradientów morfogenu11-12. Jednak dobre przeciwciała i specyficzne mutanty nie zawsze są dostępne, dlatego opisujemy tutaj protokół wykorzystujący nadekspresję ligandów fluorescencyjnych w Xenopus, aby zapewnić alternatywną, prostą metodę analizy, w jaki sposób produkty genów egzogennych mogą wpływać na dystrybucję ligandów w polu komórek. Xenopus laevis stanowi doskonały system do przeprowadzania tego typu eksperymentów, ponieważ ich zarodki rozwijają się zewnętrznie, dzięki czemu są dostępne na jak najwcześniejszych etapach. Ich duży rozmiar (1-1,5 mm średnicy) upraszcza mikroiniekcję i manipulację chirurgiczną, a w stadiach blastuli komórki są łatwe do zobrazowania, ponieważ są nadal stosunkowo duże (około 20 μm średnicy). Badania nadekspresji u Xenopus są proste do przeprowadzenia: mRNA wstrzyknięte do wczesnego zarodka może być ukierunkowane na określone komórki i jest skutecznie translowane.

Fluorescencyjnie oznaczone konstrukcje Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP zostały wygenerowane przy użyciu pCS2 Wnt8a-HA13, pCS2 Wnt11b-HA14 i eGFP. Peptyd HA jest ważny nie tylko w celu zapewnienia dodatkowego znacznika molekularnego, ale także dlatego, że uważa się, że działa on jako przekładka oddzielająca białka Wnt i eGFP, umożliwiając funkcjonowanie obu produktów genu. Konstrukt wykorzystany do wizualizacji Shh został wcześniej wykorzystany do wygenerowania transgenicznej myszy wykazującej ekspresję białka fuzyjnego Shh-eGFP15; zostało to uprzejmie dostarczone przez Andy'ego McMahona. Co ważne, znacznik GFP dla wszystkich konstrukcji jest klonowany 3' do sekwencji sygnału, tak aby był zachowywany po przetworzeniu. Istotne jest również zapewnienie, że końcowe białko zawiera sekwencje wymagane do modyfikacji, takich jak dodanie lipidów, jak ma to miejsce w przypadku ligandów Shh i Wnt. CDNA poddano subklonowaniu do wektora ekspresyjnego pCS2+, który jest zoptymalizowany pod kątem produkcji syntetycznego mRNA; zawiera promotor SP6 i sygnał poliadenylacji (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Opisana tutaj praca dostarcza prostego protokołu do porównywania wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów Wnt i Shh. Poprzez wstrzykiwanie określonych ilości syntetycznego mRNA, protokół omija wszelkie problemy związane z ekspresją zmiennych z różnych wektorów przy użyciu różnych promotorów. Metody te zostały ostatnio zastosowane do zbadania wpływu endosulfatazy siarczanowej heparanu Sulf1 na wydzielanie i dyfuzję Shh-eGFP i Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP w Xenopus16-17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych dla posła do Parlamentu Europejskiego, a przeprowadzone eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję etyki Uniwersytetu w Yorku zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Strategia generowania fluorescencyjnie oznaczonych ligandów

Poniżej znajduje się przykładowy protokół subklonowania Wnt8a-HA i eGFP do pCS2, w celu utworzenia konstrukcji fuzji w ramce Wnta-HA-eGFP:

  1. Konfigurowanie i uruchamianie reakcji PCR dla Wnt8a-HA i eGFP. Należy wykorzystać informacje o starterze wyświetlane w Tabeli 1 oraz Przykładowa reakcja PCR i Przykładowe warunki PCR przedstawione w Tabeli 2. Uwaga: Matryca DNA będzie się różnić w zależności od produkowanego konstruktu, w tym przykładzie Wnt8a-HA jest używany jako matrycowy DNA.
  2. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, wykonaj końcową elucję w 30 μl wody o jakości cząsteczkowej.
  3. Sprawdź 2 μl produktu PCR na 1% żelu agarozowym przygotowanym w TAE.
  4. Trawić produkty Wnt8a-HA i eGFP PCR oraz pCS2 przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych (patrz Tabela 1), ustawić reakcje zgodnie z opisem w Tabeli 2 (Przykładowy przegląd produktu PCR).
  5. Inkubować reakcje przez 3 godziny w temperaturze 37°C, a następnie przechowywać produkty Wnt8a-HA i GFP PCR na lodzie.
  6. Dodać 1 μl alkalicznej fosfatazy jelitowej cielęcej (CAIP) do trawienia pCS2 i inkubować przez 6 minut w temperaturze 37°C.
  7. Podgrzewać dezaktywację CAIP przez inkubację przez 15 minut w temperaturze 65°C.
  8. Przeprowadzanie trawienia pCS2 i PCR na 1% ultraczystym żelu agarozowym przygotowanym w TAE.
  9. Ekstrakcja żelu i oczyść produkty pCS2 i PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, wykonaj końcową elucję w 30 μl wody o jakości cząsteczkowej.
  10. Ustawić ligację zgodnie z opisem w Tabeli 2 (przykład ligacji T4) i inkubować w temperaturze 12°C przez 16 godzin.

2. Synteza mRNA: Generowanie szablonu

  1. Wytwarzaj matryce za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym następujących plazmidów (wszystkie w wektorze ekspresyjnym pCS2): błona-Cerulean (memCerulean), membrana-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Skonfiguruj skróty ograniczeń zgodnie z opisem w tabeli 2 (przykładowy skrót szablonu).
    2. Delikatnie wymieszać i inkubować reakcje przez 2 godziny w temperaturze 37°C.
  2. Uruchom 2,5 μl strawionego plazmidu na 1% żelu agarozowym (TAE), aby sprawdzić, czy reakcja dobiegła końca.
  3. Oczyść trawione roztwory za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, wykonaj końcową elucję w 50 μl wody o jakości cząsteczkowej.

3. Synteza mRNA: transkrypcja in vitro

  1. Zsyntetyzuj funkcjonalne mRNA za pomocą zestawu do transkrypcji mRNA SP6. Zebrać reakcje w 1,5 ml probówek mikrowirówkowych wolnych od DNAzy/RNAzy.
  2. Skonfigurować reakcje transkrypcji mRNA zgodnie z opisem w Tabeli 2 (Przykładowa synteza mRNA).
  3. Reakcje delikatnie wymieszać pipetą, a następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 4 godziny.
  4. Sprawdź 1 μl reakcji na 2% żelu agarozowym (TAE).
  5. Dodać 1 μl DNAzy do reakcji, delikatnie wymieszać z P20 i inkubować reakcję przez kolejne 15 minut w temperaturze 37°C.
  6. Do reakcji dodać 340 μl wody molekularnej, 40 μl octanu amonu i 400 μl chloroformu fenolowego. Wirować reakcje przez 30 sekund.
  7. Wiruj mRNA przez 5 minut, 14 000 x g, 4°C.
  8. Odpipetować górną (wodną) warstwę z każdej reakcji, przenosząc ją do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z nakrętką.
  9. Dodać równą objętość chloroformu do każdej z zdekantowanych reakcji. Wirować próbki przez 30 sekund.
  10. Wiruj mRNA przez 5 minut, 14 000 x g, 4°C
  11. Odpipetować górną warstwę wody z każdej reakcji, przenosząc ją do świeżej probówki wirówkowej z nakrętką o pojemności 1,5 ml.
  12. Do każdej z reakcji dodać równą objętość izopropanolu i wytrącić mRNA w temperaturze -80°C przez 30 minut.
  13. Wiruj każdą z reakcji przez 15 minut w temperaturze 14 000 x g, 4°C, aby uzyskać granulację mRNA
  14. Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulowanego mRNA
  15. Do każdej z reakcji dodać 200 μl 70% etanolu, wymieszać reakcje, a następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 14 000 x g, 4°C.
  16. Usunąć etanol, uważając, aby nie naruszyć mRNA, wysuszyć granulki w temperaturze pokojowej za pomocą eksykatora próżniowego lub speed-vac.
  17. Ponownie zawiesić mRNA w 10-20 μl wody o jakości cząsteczkowej. Krótko odwirować i trzymać próbki na lodzie. Uwaga: Podgrzewanie próbki do temperatury 80 °C przez 1 minutę może pomóc w jej rozpuszczeniu.
  18. Uruchom 1 μl mRNA na 2% żelu agarozowym (TAE) i przeanalizuj 1,2 μl na spektrofotometrze, aby uzyskać dokładny odczyt stężenia.
    ETAP KRYTYCZNY: Do przeprowadzenia następujących eksperymentów wymagane jest stężenie 400 ng/μl syntetycznego mRNA.
    ETAP KRYTYCZNY: Jeśli stosunek 260/280 wykracza poza zakres 2,00-2,20 lub całkowita ilość mRNA przekracza 12 μg, należy przeprowadzić wytrącanie chlorku litu.
  19. Przechowywać mRNA w 1 μl podwielokrotności w temperaturze -80°C. Użyć porcji, a następnie wyrzucić; nie zamrażać mRNA ponownie.

4. Generowanie zarodków Xenopus laevis

  1. Samice Prime Xenopus laevis przez wstrzyknięcie podskórne 50 jednostek ludzkiego hormonu gonadotropiny kosmówkowej (HCG; Chorulon) na tydzień przed eksperymentem.
  2. Indukuj samice Xenopus laevis w noc poprzedzającą eksperyment, wstrzykując 250 jednostek HCG i inkubując je w ciemności, O/N w temperaturze 19 °C.
  3. Wypreparować jądra od poddanego eutanazji samca żaby i przechowywać w 1xNAM w temperaturze 4°C. Uwaga: Samiec żaby jest poddawany eutanazji w znieczuleniu końcowym zgodnie z Załącznikiem 1 do Ustawy o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Masuj samicę Xenopus laevis, aby wywołać owulację, zbierz złożone jaja na okrągłej szalce Petriego o średnicy 55 mm.
  5. Wytworzyć zawiesinę nasienia, rozgniatając 1/4 jądra Xenopus laevis w 1 ml wody dejonizowanej.
  6. Opłucz oocyty Xenopus rozdrobnioną zawiesiną nasienia za pomocą pipety Pasteura i gruszki pipety. ETAP KRYTYCZNY: Przeprowadzić reakcje zapłodnienia około godziny 16:30 w dniu eksperymentu.
  7. Hodowla zarodków w temperaturze 21°C w NAM/10 (roztwory patrz tabela 3) na szalkach Petriego o średnicy 55 mm pokrytych 1% agarozą rozcieńczoną w wodzie (wodzie).
  8. Usuń galaretę z zarodków po 45 minutach za pomocą cysteiny/HCL (Tabela 3). Uwaga: W temperaturze 21°C zarodki osiągają stadium 2 komórek po 90 minutach i rozszczepiają się co 20 minut.

5. Mikroiniekcja zarodków Xenopus

  1. Używając szklanych kapilar 1 x 90 mm i dwustopniowego szklanego ściągacza do mikropipet Narishige PC-10, wyciągnij mikropipety do wstrzykiwań. Dostosuj ustawienia empirycznie, aby uzyskać cienką końcówkę (o średnicy mniejszej niż jeden mikron).
  2. Podłącz mikropipetę (igłę) do mikrowtryskiwacza gazowego (na przykład PICO-INJECTOR Harvard Appartaus PLI-100), aby wielokrotnie dostarczać precyzyjne objętości cieczy, stosując regulowane ciśnienie przez cyfrowo ustawiony okres czasu. Dostosuj ciśnienie pneumatyczne, aby dostarczyć objętość od 1,25 do 10 nanolitrów, zgodnie z ustaleniami za pomocą siatki celowniczej lub szkiełka kalibracyjnego.
  3. Pokryj szalkę Petriego o średnicy 55 mm 5 ml 1% agarozy (wody). Wytnij z naczynia kwadrat agarozy o średnicy 35-35 mm, co zapewni stabilną powierzchnię do mikrowstrzykiwania zarodków.
  4. Przenieść zarodki do NAM/3 + Ficoll (Tabela 3) i przenieść do naczynia iniekcyjnego.
  5. Wstrzyknąć zarodki do półkuli zwierzęcej, gdy osiągną etap wymagany do eksperymentu.
    1. Aby przeanalizować rozmieszczenie ligandów znakowanych GFP na powierzchni komórki, należy wstrzyknąć zarodki obustronnie na etapie dwukomórkowym, po 10 nl na komórkę. Przykładowe rozcieńczenia mRNA pokazane poniżej dla Wnt8a-HA-eGFP. KROK KRYTYCZNY: Upewnij się, że wszystkie stężenia mRNA zaczynają się od 400 ng/μl.
      Uwaga: Ilość mRNA do wstrzyknięcia należy określić empirycznie, badając stężenia i znajdując minimalną ilość potrzebną do wizualizacji ligandu fluorescencyjnego. Western blot przy użyciu przeciwciała anty-HA jest niezbędnym krokiem do ustalenia, czy mRNA ulegają translacji na podobne poziomy, aby umożliwić porównanie dwóch różnych fluorescencyjnie znakowanych ligandów; zrobiliśmy to dla Wnt8a-HA-eGFP i Wnt11b-HA-eGFP w Fellgett et al., 2015.
      Uwaga: Podczas oceny wpływu wstrzykniętego mRNA (takiego jak kodowanie dla kandydującego regulatora), typową kontrolą jest wstrzyknięcie nieaktywnego RNA, takiego jak LacZ, do zarodków rodzeństwa w celu kontroli wszelkich skutków dodatkowych transkryptów w zarodku.
      1. Rozcieńczyć mRNA memRFP 1 do 4 (1 μl + 3 μl dH2O) wodą o jakości cząsteczkowej, aby zmniejszyć stężenie do 100 ng / μl.
      2. Rozcieńczyć mRNA Wnt8a-HA-eGFP 1 do 4 (1 μl + 3 μl dH2O) wodą o jakości cząsteczkowej, aby zmniejszyć stężenie do 100 ng / μl.
      3. Wymieszaj mRNA memRFP w stosunku 1:1 z mRNA Wnt8a-HA-eGFP.
      4. Wymieszaj mRNA z 5.5.1.3 w stosunku 1:1 z kontrolnym mRNA LacZ lub modulatorem, takim jak Sulf1.
      5. Wstrzyknąć zarodki obustronnie na etapie 2 komórek z 10 nl mRNA na komórkę (łącznie 20 nl). Uwaga: Powoduje to wstrzyknięcie do każdej komórki 250 pg m RFP, 250 pg Wnt8a-HA-e GFP, 500 pg Wnt11b-HA-e GFP i 2 ng mRNA LacZ lub Sulf1
        6. .
    2. Aby przeanalizować dyfuzję ligandów znakowanych GFP, wstrzyknij mRNA kodujące ligand-GFP wraz z markerem linii, takim jak memRFP, na etapie 16-32 komórek, 1,25 nl na komórkę.
    3. Aby przeanalizować wpływ dowolnego potencjalnego modulatora dyfuzji ligandów, należy wstrzyknąć kodowanie mRNA dla modulatora wraz z ligandem i znacznikiem linii. Alternatywnie, wstrzyknij sąsiednie komórki: jedną z mRNA kodującymi ligand znakowany GFP i znacznikiem linii (memRFP), a drugą z mRNA kodującymi modulator i inny znacznik linii (memCerulean).
  6. Przenieś zarodki do inkubatora w temperaturze 12,5°C i posiewu do następnego dnia, etap 8 Nieuwkoopa i Fabera (NF).

6. Wycinanie eksplantatów czapek zwierzęcych

  1. Przenieść zarodki na szalkę Petriego o średnicy 55 mm pokrytą 5 ml 1% agarozy (wody). Napełnij naczynie NAM/2 (Tabela 3).
  2. Weź okrągłe czapki zwierzęce za pomocą igieł wolframowych. KROK KRYTYCZNY: Na tym etapie weź duże kapitaliki, ponieważ będą się one lepiej goić i będą łatwiejsze do zobrazowania, zachowaj kontrolki, aby upewnić się, że nie występuje zbieżne rozszerzenie.
  3. Przenieś eksplantaty zwierząt na 55-milimetrowe szalki Petriego pokryte 1% agarozą (wodą) i hoduj zarodki w temperaturze 21°C przez 4 godziny. ETAP KRYTYCZNY: Wymagana jest 4-godzinna inkubacja, aby białka fluorescencyjne mogły dojrzeć.
  4. Generuj szkiełka odciążające, przyklejając dwie warstwy taśmy izolacyjnej PVC na szkiełka mikroskopowe. Wytnij z taśmy prostokąt o wymiarach 14 mm na 10 mm, aby pozostawić komorę do montażu nasadek zwierzęcych. KROK KRYTYCZNY: Przed przecięciem prostokąta dokładnie spłaszcz obie warstwy taśmy na szkiełku.
  5. Odpipetować 2 oddzielne krople NAM/2 (Tabela 3) do szkiełka odciążającego, około 30 μl na kroplę.
  6. Przenieś eksplantaty zwierząt na szkiełka reliefowe za pomocą odciętej końcówki P20 i ustaw tak, aby strona wierzchołkowa była skierowana do góry. Uwaga: Każde szkiełko może pomieścić 10-15 czapek zwierzęcych. KROK KRYTYCZNY: Na tym etapie czapki zwierząt powinny być częściowo zagojone, co oznacza, że są mniej delikatne i można je zorientować za pomocą kleszczy.
  7. Delikatnie opuść szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełko odciążające i pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia na 20 minut. KROK KRYTYCZNY: Rozmiar czapki zwierzęcia ma kluczowe znaczenie; Upewnij się, że nasadka jest na tyle duża, że gdy szklane szkiełko nakrywkowe zostanie opuszczone na szkiełko odciążające, ściska wierzchołkową warstwę komórek kapelusza zwierzęcego na tyle, aby uzyskać płaską powierzchnię do obrazu. Jeśli nakrętki zwierząt są nadal za małe, zredukuj taśmę PVC do jednej warstwy.
  8. Uszczelnij szkiełko za pomocą lakieru do paznokci. KROK KRYTYCZNY: Nie używaj zbyt dużej ilości lakieru do paznokci do uszczelniania szkiełek reliefowych, ponieważ jeśli taśma PVC stanie się zbyt wilgotna, podniesie się i zniszczy szkiełko.
  9. Suche reliefy szkiełkują przez 20 minut w ciemności i są gotowe do obrazowania, zazwyczaj czapki zwierzęce pozostają zdrowe przez 4-6 godzin po zamknięciu w szkiełku.

7. Obrazowanie

Uwaga: Obrazowanie zostało przeprowadzone przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Do obrazowania wybrano tryb Lambda, ponieważ pozwolił on na użycie wielu fluoroforów z nakładającymi się sygnaturami i wyeliminował problem potencjalnego ruchu próbki między skanami.

  1. Znajdź eksplantaty za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, a następnie przełącz się na obiektyw olejowy 63x/1,4, aby uzyskać obrazowanie w wyższej rozdzielczości.
  2. Włącz wymagane lasery; w tym przykładzie laser 405 został użyty do wzbudzenia memCerulean, laser 488 został użyty do wzbudzenia GFP, a laser 561 do wzbudzenia memRFP za pomocą zwierciadeł dichroicznych 405 i 488/561.
  3. Użyj trybu lambda (w Zen 2011 wybierz tryb lambda – 32 pojemniki).
  4. Wybierz lasery 405 nm, 488 nm i 561 nm. Aby uzyskać szersze pole widzenia, pomniejsz obraz (do 0,6x).
  5. Ustaw rozmiar klatki na żądany rozmiar obrazu (dla tego zestawu danych użyto 1024 x 1024 z rozmiarami pikseli 220 nm).
  6. Ustaw uśrednianie na typowo od 4 do 8, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
  7. Zoptymalizuj otwór otworkowy (do tego zestawu danych użyto 1 przewiewnej jednostki zgodnie z laserem 561 nm).
  8. Zoptymalizuj moce lasera. KROK KRYTYCZNY: Zrównoważ lasery 405 nm, 488 nm i 561 nm tak, aby wszystkie fluorofory można było wykryć za pomocą 32 matrycy detektorów, jednocześnie minimalizując wymaganą ilość napięcia i wzmocnienia.
  9. Zbierz światło emitowane przez memCerulean, GFP i memRFP. Do tej pracy światło było zbierane co ~10nm od 415-720nm, chociaż możliwe są również większe interwały zbierania (np. co ~20 nm).

8. Analiza obrazu

  1. Badanie wpływu modulatorów na ekspresję na powierzchni komórki ligandów znakowanych GFP
    UWAGA: Poniższe kroki stanowią szczegółowy przewodnik po tym, jak analiza została przeprowadzona w naszym laboratorium. Użytkownik końcowy może chcieć usprawnić proces, pisząc skrypt ImageJ lub FIJI, aby usunąć niektóre z ręcznych kroków.
    ETAP KRYTYCZNY: Ważne jest, aby użytkownik końcowy pobierał próbki widm wszelkich fluoroforów użytych w tych samych warunkach, w których przeprowadzany jest eksperyment końcowy, w celuprzeprowadzenia skutecznego wymieszania widmowego wielu fluoroforów użytych w eksperymencie końcowym.
    W tej sekcji wykonywane są dwa główne typy analiz:
    1. Obliczanie całkowitej liczby pikseli Wnt-HA-eGFP kolokalizujących się z błoną komórkową.
      1. Rozmieszaj kanały zielony, czerwony i błękitny, używając widm pobranych z pojedynczych wstrzyknięć tych fluoroforów w oprogramowaniu ZEN. Zapisz te obrazy jako osobne dokumenty LSM, aby użyć ich we wszystkich poniższych krokach.
      2. Otwieraj pliki LSM bezpośrednio w oprogramowaniu do edycji obrazów. Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą obrazu FIJI J.
      3. Zapisz obrazy LSM jako dokumenty sekwencji obrazów, co spowoduje automatyczne podzielenie obrazów na osobne kanały.
      4. Zapisz sekwencję obrazu w tym samym folderze, w którym znajdują się skrypty oprogramowania do analizy skryptów, które będzie używane do analizy danych (zobacz dodatkowe pliki kodu dla rzeczywistego skryptu). Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą Matlaba.
      5. Otwórz oprogramowanie do analizy skryptów i otwórz katalog, w którym są napisane skrypty.
      6. Wprowadź nazwę pliku w polu Analiza lokalizacji, oprogramowanie pobierze nazwę pliku i wykona analizę.
        Uwaga: Nazwy plików będą zawierać ImageA0000 i ImageA0001 dla każdego obrazu. Oprogramowanie do analizy skryptów użyje obrazu oznaczonego jako 0001 jako maski i przeanalizuje procent pikseli na obrazie 0000, które współlokalizują się z tą maską.
      7. Weź procentową liczbę kolokalizacji (oznaczoną jako Wypełniona błona komórkowa) i skopiuj ją do arkusza kalkulacyjnego. Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą programu Excel.
      8. Wykreśl procentową liczbę kolokalizacji na wykresie słupkowym jako wartość bezwzględną lub względną.
    2. Analiza liczby, wielkości i kształtu punkcji Wnt-HA-eGFP.
      1. Otwieraj niezmieszane pliki LSM bezpośrednio w oprogramowaniu do edycji obrazów. Uwaga: poniższe instrukcje dotyczą obrazu FIJI J.
      2. Podziel każdy obraz na osobne kanały (Obraz > Kolor > Podziel kanały).
      3. Proguj zarówno kanały Wnt-HA-eGFP, jak i kanały znaczników membranowych (Obraz > Dostosuj > Automatyczny próg). KROK KRYTYCZNY: Wypróbuj kilka progów, aby zobaczyć, który z nich daje reprezentatywny obraz, bez prześwietlania kanału.
      4. Przekonwertuj kanał znacznika membrany na maskę (Proces > Binarny > Utwórz maskę).
      5. Odwróć tę maskę (Edytuj > Odwróć
        6. ).
      6. Przekonwertuj punkt punktowy Wnt-HA-eGFP na maskę jak powyżej.
      7. Odejmij maskę znacznika błonowego od maski liganda-GFP (Kalkulator obrazu > procesu > maska Wnt w górnym polu, maska membranowa w dolnym polu).
      8. Użyj funkcji analizy cząstek. W tym miejscu wybierz wymagane parametry i przeanalizuj dane (Analizuj > Analizuj cząstki).
      9. Skopiuj dane dotyczące liczby cząstek, średniej wielkości cząstek i cyrkularności do arkusza kalkulacyjnego, a następnie wykreśl wykresy na podstawie tych danych. Uwaga: Na potrzeby tej analizy analizowano tylko cząstki o wielkości od 0,1 do 10μm2, nie nałożono żadnych ograniczeń dotyczących okrągłości cząstek. Ta instrukcja dotyczy programu Excel.
  2. Analiza zakresu dyfuzji ligandów
    1. Otwórz wszystkie niezmiksowane obrazy w oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego, a następnie wyeksportuj pliki w formacie TIF, jako surowe dane i jako obraz RGB. Uwaga: Ta instrukcja dotyczy Zen lite 2011. KROK KRYTYCZNY: Umieść podziałkę liniową na co najmniej jednym z obrazów, aby można było obliczyć odległość podczas analizy.
    2. Otwórz obrazy do analizy w oprogramowaniu do analizy obrazu. Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą programu Photoshop. 8.2.3) Kliknij prawym przyciskiem myszy tło obrazu i wybierz "warstwa z tła", aby utworzyć nową warstwę.
    3. Ustaw kanały znacznika membrany na 0, tak aby widoczny był tylko kanał ligand-GFP (Warstwa > Nowa warstwa dopasowania > Mikser kanałów). KROK KRYTYCZNY: Przytnij nową warstwę dopasowania do analizowanego obrazu, opcja przycięcia nowej warstwy do tego obrazu jest dostępna jako pole wyboru po kliknięciu opcji miksera kanałów.
    4. Otwórz nowy obszar roboczy. Ustaw rozdzielczość na 300 pikseli na cal, a tryb kolorów na kolor RGB (Plik > Nowy > Schowku).
    5. Skopiuj wszystkie analizowane obrazy do pojedynczej przestrzeni roboczej (kliknij na obraz i jego przycięty mikser kanałów, przytrzymując Control, a następnie przytrzymaj Control i Alt i przeciągnij obraz do obszaru roboczego).
    6. Zorientuj wszystkie obrazy tak, aby maksymalna długość dyfuzji dla każdego obrazu mogła być mierzona wzdłuż osi poziomej, z komórkami wyrażającymi Wnt-HA-eGFP zorientowanymi w lewo.
    7. Zapisz przestrzeń roboczą jako TIF, a następnie otwórz ją w oprogramowaniu do analizy obrazu. Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą obrazu FIJI J.
    8. Otwórz okno Menedżer zwrotu z inwestycji (Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji).
    9. Narysuj prostokąt na pierwszym obrazie, można określić dokładny rozmiar prostokąta (narzędzie Wybierz prostokąt i narysuj dowolny prostokąt > Edytuj > Zaznaczenie > Określ). Uwaga: W tym badaniu użyto rozmiaru 650 x 100 pikseli długości x szerokości.
    10. Umieść prostokąt na samej krawędzi domeny, w której wyrażono wartość Wnt-HA-eGFP. Umieść prostokąt nad obszarem o maksymalnej odległości dyfuzji Wnt-HA-eGFP. ETAP KRYTYCZNY: Nawet bez markera membranowego obszary wyrażające Wnt-HA-e GFP powinny być widoczne ze względu na fluorescencję tła; jeśli nie, skonsultuj się z surowymi obrazami.
    11. Przesuń pole o 10 μM w prawo. Określ liczbę mikrometrów, mierząc długość podziałki liniowej znajdującej się na jednym z obrazów (Narysuj linię śledzącą podziałkę liniową > Analizuj > ustawić skalę). Uwaga: Daje to wartość 10 uM w pikselach.
    12. Dodaj pole do menedżera ROI, naciskając przycisk dodawania w oknie menedżera ROI.
    13. Przenieś prostokąt do następnego obrazu, który ma być mierzony, klikając z powrotem narzędzie prostokąta, aby przesunąć prostokąt. Powtórz kroki 8.2.10-11.
    14. Po zmierzeniu wszystkich paneli wybierz opcję wielodziałkowy z menu Menedżer ROI (Menedżer ROI > Więcej > Lista > wielodziałkowych).
      Uwaga: dane reprezentują intensywność pikseli Wnt (Y) wraz ze wzrostem odległości wzdłuż osi poziomej (X, mierzone w Piksele). Wartość Y jest średnią intensywnością sygnału ligand-GFP w punkcie X, a średnia jest obliczana ze wszystkich pikseli na osi Y dla każdej wartości X. W związku z tym im wyższe pudełko, tym więcej pikseli zostanie przeanalizowanych w celu uzyskania tej średniej. Małe pudełko (w osi Y) będzie głośniejsze; Wysokie pudełko będzie miało bardzo niską średnią intensywność pikseli.
    15. Skopiuj dane z pola wielowątkowego do arkusza kalkulacyjnego i ponownie oznacz je etykietą. Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą programu Excel.
    16. Odrzuć pierwsze 10-20 μm danych z każdej analizy, ponieważ reprezentuje to fluorescencję tła z komórek wyrażających ligand-GFP i zniekształca wykresy.
    17. Otwórz oprogramowanie do analizy naukowej i tworzenia wykresów i utwórz nowy notatnik. Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą Sigmaplot 13.
    18. Oznacz wymaganą liczbę kolumn dla danych, klikając dwukrotnie poziome liczby w arkuszu roboczym i oznaczając je odległością w μm, Wnt8a-HA-eGFP i Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Skopiuj dane z arkusza kalkulacyjnego do odpowiednich kolumn w oprogramowaniu do analizy naukowej i tworzenia wykresów.
    20. Utwórz wykres punktowy (Utwórz wykres > Rozproszenie > Wiele > Rozproszenie Wybierz X wielu Y > Wybierz kolumnę odległości dla X > Wybierz Wnt8a-HA-eGFP i Wnt11b-HA-eGFP dla wartości Y > Zakończ).
    21. Wykonaj analizę regresji na krzywej Wnt8a-HA-eGFP, klikając lewym przyciskiem myszy punkt Wnt8a-HA-eGFP na wykresie punktowym. Wszystkie punkty powinny być podkreślone. Kliknij Kreator analizy > regresji.
    22. Wybierz kategorię równania krzywej (Rozkład wykładniczy) i nazwę równania (Pojedynczy, 3 parametry), a następnie naciśnij przycisk Dalej.
    23. Wybierz wartości X i Y, do których ma być dopasowana krzywa (jeśli dane były wcześniej podświetlone, powinno to zostać zrobione automatycznie), a następnie naciśnij przycisk Dalej.
    24. Kontynuuj pracę kreatora, aż pojawi się strona opcji wyjścia numerycznego, upewnij się, że zaznaczona jest opcja "utwórz raport", a następnie naciśnij przycisk Dalej. Uwaga: Parametry dopasowanej krzywej zostaną przedstawione w raporcie 1*.
    25. Na stronie Opcje wykresu upewnij się, że zaznaczona jest opcja "dodaj równanie do tytułu wykresu", a następnie naciśnij przycisk Zakończ. Uwaga: Kreator utworzy zakładki Raport 1* i Wykres 1* w górnej części notatnika. Ponadto krzywa zostanie dodana do wykresu utworzonego w (8.2.20).
    26. Powtórz kroki 8.2.21-8.2.25, aby dopasować krzywą do Wnt11b-HA-eGFP. KROK KRYTYCZNY: spróbuj dopasować do danych wiele kategorii równań i nazw równań. Uwaga: Krzywa o najlepszym dopasowaniu powinna dawać najwyższą wartość R2 przy najniższej resztkowej sumie kwadratów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza konfokalna eksplantów czapy zwierzęcej zwierząt wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie stanowi skuteczny system wizualizacji rozkładu ligandów w różnych warunkach eksperymentalnych. W jednym z przykładów przedstawiono rozkład Shh znakowanego GFP (Rysunek 1). Na etapie 2 komórek do obu komórek embrionów Xenopus wstrzyknięto mRNA kontrolne lub mRNA kodujące Sulf1 – enzym modyfikujący heparan siarczan na powierzchni komórek i wpływający na gradient morfogenu Shh16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istotną częścią tego protokołu jest generowanie biologicznie aktywnych ligandów, które są normalnie przetwarzane, wydzielane i zdolne do wywołania odpowiedzi w komórce odbiorczej, pomimo dołączonej części fluorescencyjnej. Bardzo ważne jest ustalenie, że produkt genu znakowany fluorescencyjnie jest biologicznie aktywny przy użyciu odpowiedniego testu. W przypadku Shh-GFP potwierdzono zdolność do aktywacji ekspresji ptc1 16. Wnt8a ma niezwykle silną zdolność do indukowania osi drugorzędowej, gdy ulega ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu BBSRC dla MEP (BB/H010297/1), stypendium BBSRC dla SAR oraz stypendium MRC dla SWF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaMelfordMB 1200
Octan amonuAmbionz zestawu Megascript SP6 Zestaw AM 1330
WodorowęglanVWR InternationalRC-091
Azotan wapniaSigmaC13961
Analog kapsla (m7G(5'))Applied BiosystemsAM 8050
ChloroformSigmaC 2432
Jednowodny chlorowodorek L-cysteinySigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)SigmaO3690
EtanolVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fidżi obraz J oprogramowanieDarmowe pobieranie http://fiji.sc/Fiji
GentamycinMelfordG 0124
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificA/0400/PB17
Szkiełka nakrywkowe, nr 1.5 Materiały do laboratoriów naukowych22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Ściągacz do igieł do szkłaNarishigeNarishige PC -10
Igły do ciągnięcia szkłaDrummond Scientific3-000-203-G/X
Ludzka przewlekła gonadotropina (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Chlorek litu (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 i Oprogramowanie Zen (2008-2010)Oprogramowanie Carl Zeiss
MatlabMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Woda klasy molekularnej Fisher ScientificBP 2819-10
Lakier do paznokci ButyKod kreskowy 3600530 373048
SpektrofotometrLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
szalka Petriego (55 mm)VWR International391-0865
Chloroform fenolowySigmaP3803
Oprogramowanie PhotoshopAdobehttp://www.photoshop.com/products
Polimeraza DNA o wysokiej wierności i  BiolabsM0530S  Bufor - M0531S
Chlorek potasu (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
Taśma izolacyjna PVCOnecallSH5006MPK
Zestaw do ekstrakcji żelu QiagenS28704
enzymów restrykcyjnychRocheSuRE/CUT Zestaw 11082 035 001
DNAzyda bez RNAzowePromegaME10A
Stalowe tylne ostrza jednokrawędziowePersonna66-0403-0000
Chlorek sodu (NaCl)Fisher Scientific27810.364
Zestaw do transkrypcji SP6AmbionAM1330
Szkiełka szklaneThermo FisherSHE 2505
Tris baseInvitrogen15504-020
Igłydomowej roboty
oprogramowanie Zen liteCarl ZeissDarmowe pobieranie  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html
wolframowe

Bibliografia

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnadyfuzja ligand wznakowanie fluorescencyjneligandy Wntligandy Shhmikrosekcjonowaniekapturki zwierz ceanaliza obrazu

Powiązane artykuły