Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53163

⸱

15 września 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Streszczenie

Konwersja biomasy lignocelulozowej na paliwa, chemikalia i inne towary została zbadana jako jedna z możliwych ścieżek w kierunku zmniejszenia zużycia nieodnawialnych źródeł energii. W celu określenia, które rośliny z różnorodnej puli mają pożądane cechy chemiczne do dalszych zastosowań, należy porównać takie cechy, jak zawartość celulozy i ligniny lub uwalnianie cukru monomerycznego po scukrzaniu enzymatycznym. Protokoły eksperymentalne i analizy danych dotyczące standardowych metod analizy mogą być czasochłonne, co ogranicza liczbę próbek, które można zmierzyć. Metody wysokoprzepustowe (HTP) łagodzą niedociągnięcia metod standardowych i umożliwiają szybkie badanie przesiewowe dostępnych próbek w celu wyizolowania tych posiadających pożądane cechy. Badanie to ilustruje rurociągi uwalniania cukru HTP i pirolizy spektrometrii mas wiązki molekularnej stosowane w Narodowym Laboratorium Energii Odnawialnej. Rurociągi te umożliwiły efektywną ocenę tysięcy instalacji przy jednoczesnym skróceniu czasu i kosztów eksperymentów dzięki redukcji pracy i materiałów eksploatacyjnych.

Wprowadzenie

Ponieważ globalna podaż paliw nieodnawialnych i związanych z nimi produktów maleje, naukowcy stanęli przed wyzwaniem stworzenia podobnych paliw i chemikaliów ze źródeł pochodzenia roślinnego1. Kluczowym aspektem tych prac jest określenie, które gatunki roślin mogą być odpowiednie do produkcji biopaliw i biomateriałów2,3. Zazwyczaj surowce te są oceniane pod kątem zawartości ligniny, celulozy i hemicelulozy; a także ich podatność na dekonstrukcję (oporność) poprzez termiczną, mechaniczną i/lub chemiczną obróbkę wstępną z późniejszym scukrzaniem enzymatycznym lub bez niego. Bardziej szczegółowe analizy są wykorzystywane do określenia specyficznego składu frakcji ligniny i hemicelulozy, a także optymalnej aktywności enzymów. Transgeniczne modyfikacje roślin, które same w sobie nie posiadają idealnych cech do biochemicznej lub termochemicznej konwersji na pożądane towary, zapewniły naukowcom znacznie rozszerzone źródło potencjalnych surowców4. Standardowe metody analityczne do ilościowego określania cech chemicznych rośliny, choć bardzo przydatne w przypadku małych zestawów próbek, nie nadają się do szybkich badań przesiewowych setek lub tysięcy próbek5-7. Opisane w niniejszym dokumencie metody HTP zostały opracowane w celu szybkiej i efektywnej oceny dużej liczby wariantów biomasy pod kątem zmian w oporności ściany komórkowej na degradację termochemiczną i/lub enzymatyczną.

Bardzo ważne jest zrozumienie, że opisane tutaj testy przesiewowe HTP nie zostały zaprojektowane w celu maksymalizacji konwersji lub wydajności. Celem jest określenie względnych różnic w wewnętrznej oporności powiązanych próbek biomasy. W rezultacie, wiele etapów analizy różni się od "typowych" testów konwersji biomasy, których celem jest uzyskanie maksymalnego współczynnika lub zakresu konwersji. Na przykład mniejsze dokładność obróbki wstępnej i krótsze czasy hydrolizy enzymów są stosowane w celu maksymalizacji różnic między próbkami. W większości przypadków stosuje się stosunkowo wysokie ładunki enzymów w celu zmniejszenia różnic spowodowanych eksperymentalną zmiennością aktywności enzymu, co może znacznie zniekształcić wyniki.

Szybkie techniki określania składu ścian komórkowych roślin i cukrów monomerycznych uwalnianych w wyniku scukrzania enzymatycznego obejmują robotykę, dostosowane, termochemicznie kompatybilne płytki 96-dołkowe oraz modyfikacje standardowych metod laboratoryjnych8-11 i protokołów instrumentalnych, takich jak spektroskopia oscylacyjna (podczerwień (IR), bliska podczerwień (NIR) lub Raman) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)12-17. Metodologie te mają kluczowe znaczenie dla izolowania surowców o wysokiej zawartości celulozy lub ligniny lub takich, od których oczekuje się, że dostarczą najwyższą zawartość glukozy, ksylozy, etanolu itp. Metody te umożliwiły analizy na mniejszą skalę, w których wykorzystuje się mniejsze ilości biomasy i materiałów eksploatacyjnych, co doprowadziło do zmniejszenia kosztów eksperymentów18. Inną cechą tego podejścia metodologicznego jest to, że różne warunki eksperymentalne mogą być oceniane szybko, a w niektórych przypadkach równocześnie. Na przykład, można testować wiele różnych strategii obróbki wstępnej lub koktajli enzymatycznych, co pozwala na szybką identyfikację i zastosowanie najbardziej optymalnych parametrów eksperymentalnych. Popularne surowce, takie jak słoma kukurydziana9, topola8,10, wytłoki z trzciny cukrowej8 i proso rózgowate8 zostały pomyślnie ocenione przy użyciu tych metod HTP.

Całkowity skład ligniny i monomerycznej ligniny są również często określane ilościowo dla cech biomasy. Wykazano, że zmniejszenie zawartości ligniny zwiększa strawność enzymatyczną polisacharydów19,20. Rola, jaką odgrywa stosunek monomeryku ligniny (często podawany jako zawartość syrynylu/gwajakylu (S/G)) w dekonstrukcji ściany komórkowej rośliny, jest nadal badana. Niektóre raporty wskazują, że zmniejszenie stosunku S/G doprowadziło do zwiększenia wydajności glukozy po hydrolizie21, podczas gdy inne badania ujawniają odwrotny trend19,22. Wysokoprzepustowe metody oceny ligniny i jej monomerów obejmują spektroskopię wibracyjną (IR, NIR i Raman23-26) w połączeniu z analizą wielowymiarową oraz pirolityczną spektrometrię mas wiązki molekularnej (pyMBMS)27,28.

Podczas opracowywania metod HTP do badania biomasy, należy pamiętać o kilku istotnych kwestiach. Jednym z kluczowych aspektów jest złożoność metody. Jaki jest wymagany poziom umiejętności dla tej techniki? Na przykład analizy chemometryczne wymagają określonych umiejętności w zakresie konstruowania, oceny i utrzymywania modeli predykcyjnych. Standardowe metody wykazują niepożądane etapy przygotowawcze lub analizy danych lub wykorzystują toksyczne odczynniki. Opracowywanie modeli to ciągły proces, w którym nowe dane są z czasem włączane do modelu w celu zwiększenia jego niezawodności. Kolejną kwestią jest oszczędność kosztów i skrócenie czasu analizy eksperymentalnej proponowanych metod o wysokiej przepustowości. Jeśli metoda jest dość szybka, ale bardzo kosztowna, może nie być wykonalną techniką do przyjęcia przez wiele laboratoriów. Metody zilustrowane w tym manuskrypcie są wariantami standardowych technik, zmodyfikowanymi w celu zwiększenia możliwości przepustowości. Protokoły te umożliwiają ilościowy pomiar cech biomasy będących przedmiotem zainteresowania bez konieczności opracowywania modeli predykcyjnych. Jest to kluczowa cecha tych technik, ponieważ metody predykcyjne, choć wykazują silne korelacje ze standardowymi analizami wykorzystanymi do opracowania modeli, nie są tak dokładne, jak faktyczny pomiar ilości interesującej próbek. Podczas gdy stosowane metody są zasadniczo pomniejszonymi wersjami standardowych metod analitycznych stosowanych w skali laboratoryjnej, dokładność i precyzja są wymieniane na szybkość i przepustowość. W większości przypadków wynik ten wynika z większych błędów w pipetowaniu i ważeniu małych objętości; a także zwiększona niejednorodność próbki wraz ze zmniejszaniem się wielkości próby. Chociaż duże zestawy prób mogą być badane przesiewowo i porównywane, należy zachować dużą ostrożność przy dokonywaniu porównań między oddzielnymi kampaniami i wynikami na skali laboratoryjnej.

Najbardziej czasochłonne kroki obejmują fizyczną manipulację biomasą. Mielenie próbek może trwać kilka minut na próbkę, łącznie z czyszczeniem młyna między próbkami. Ręczny załadunek, rozładunek i czyszczenie lejów samowyładowczych oraz napełnianie i opróżnianie torebek z herbatą i torebek na próbki jest również bardzo pracochłonne. Podczas gdy każdy krok może zająć minutę lub dłużej, wykonanie tysięcy próbek może zająć wiele godzin, a nawet dni. Roboty mogą załadować typową płytę reaktora biomasą w około 3 do 4 godzin lub od 6 do 8 płyt w ciągu dnia 1 robota-1. Sytuacja ta zależy od zastosowanych parametrów precyzji, a także rodzaju i ilości badanej biomasy. Napełnianie płyt reaktora wodą, rozcieńczonym kwasem lub enzymem odbywa się szybko za pomocą robota do obsługi cieczy. Wstępna obróbka stosu płyt (od 1 do 20 płyt reaktora) trwa od 1 do 3 godzin, jeśli obejmuje montaż, schładzanie i demontaż. Hydroliza enzymatyczna trwa 3 dni, a analiza cukru wymaga około 1 godziny czasu przygotowania plus 10 minut na płytkę reaktora, aby zakończyć test i odczytać wyniki. Tygodniowy harmonogram ustalonych dni obróbki wstępnej i analizy uwzględnia rozsądny harmonogram pracy, minimalizując wysiłek związany z godzinami nieparzystymi i weekendami dla ludzkiego komponentu testu i pozwala na przetwarzanie od ~ 800 do 1,000 próbek tygodniowo na bieżąco. Maksymalna przepustowość zależy od kilku czynników, przede wszystkim od ilości sprzętu (roboty, płyty reaktorów itp.) oraz od ilości "oprogramowania" (tj. personelu) dostępnego do wykonywania pracy ręcznej. Praktyczny górny limit wynosi od 2 500 do 3 000 próbek tygodniowo; Jednak ta wydajność wymaga pracy przez 7 dni w tygodniu oraz wielu stażystów i techników. Dla porównania, 3000 próbek za pomocą HPLC wymagałoby około 125 dni analizy próbki plus dodatkowa praca związana z ręcznym ważeniem próbek do reaktorów i filtrowaniem próbek przed analizą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysokoprzepustowe oznaczanie wydajności glukozy i ksylozy po scukrzaniu enzymatycznym9,29

  1. Przygotowanie próbki (mielenie, odkrochmalenie, ekstrakcja, obróbka wstępna)
    1. Zmielić co najmniej 300 mg każdej próbki biomasy za pomocą młyna Wiley, tak aby cząstki przeszły przez sito o oczkach 20 (850 μm). Przenieś do antystatycznych torebek strunowych (zwykle z kodem kreskowym) i zapisz informacje o próbce w bazie danych kodów kreskowych.
    2. Dodaj około 250 mg lub więcej zmielonej biomasy z torebki antystatycznej do ponumerowanej (ołówkiem, nie używaj tuszu ani markera) torebki herbaty, ostrożnie zwiń torebki herbaty, upewniając się, że końce są złożone na biomasie, aby zapobiec stratom podczas odkrochmalania i ekstrakcji.
    3. Owiń torebkę herbaty szczelnie za pomocą drutu miedzianego pokrytego cyną. Zapisz numer torebki herbaty dla każdej próbki oznaczonej kodem kreskowym.
    4. Przygotuj roztwór enzymu odkrochmalającego z dostępnych w handlu enzymów (zazwyczaj 0,25% (v/v) glukoamylazy (~1,600 AGU/L) i 1,5% (v/v) alfa-amylazy (~2,900 KNU-S/L) w 0,1 M octanie sodu (pH 5,0)). Przygotować 16 ml na g biomasy luzem lub 500 ml na 120 próbek z torebek herbaty. Uwaga: Ładunki zdolne do usunięcia skrobi z biomasy mielonej powinny być określone empirycznie poprzez badanie na obecność skrobi po trawieniu przy użyciu różnych ładunków enzymatycznych i proporcji.
    5. W plastikowym pojemniku dodać 16 ml roztworu enzymu odkrochmalającego na 1 g zmielonej biomasy luzem. W przypadku protokołu odkrochmalania partiami dodaj 120 torebek herbaty do 500 ml roztworu enzymu buforowego.
    6. Inkubować w wytrząsarce w temperaturze 55 °C przez 24 (± 4) godziny, przy 120 obr./min w celu usunięcia ewentualnej skrobi.
    7. Po inkubacji dekrochmalowej spłucz i namocz biomasę w kilku litrach wody dejonizowanej przez 30 minut. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aby usunąć sole buforowe, które mogą powodować uderzenie (tworzenie się pęcherzyków gazu w roztworze, które mogą spowodować nagły i gwałtowny wzrost poziomu roztworu, powodując kaskadowe wydostawanie się gorącego ciekłego etanolu z naczynia reakcyjnego) podczas ekstrakcji.
    8. Po wyczerpującym wypłukaniu odskrobionej biomasy umieść torebki herbaty w kolumnie Soxhleta w celu ekstrakcji. Do tego kroku nie jest wymagana gilza.
    9. Ustawić refluks Soxhleta, używając 95% etanolu i ekstrahować próbki przez 24 godziny.
    10. Wyjmij torebki herbaty z reaktora Soxhleta i rozłóż w jednej warstwie na płaskiej tacy.
    11. Pozostawić próbki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w dygestorium.
    12. Rozwiń torebki herbaty i włóż wysuszoną biomasę do oryginalnych torebek antystatycznych z kodem kreskowym.
      Uwaga: Worki antystatyczne skutecznie redukują elektryczność statyczną w biomasie, poprawiając właściwości przenoszenia. W przypadku stosowania innych opcji przechowywania może być potrzebna dodatkowa biomasa ze względu na to, że biomasa przylega do boku pojemnika do przechowywania.
    13. Przenieś co najmniej 50 mg wysuszonej biomasy do leja z kodem kreskowym (użycie większej ilości materiału jest lepsze do dokładnego dozowania). Skanuj kody kreskowe worków antystatycznych i kosza przyjęciowego, aby zapewnić dokładne śledzenie próbki.
    14. Załaduj leje samowyładowcze na robota do ważenia ciał stałych, zwracając szczególną uwagę na kolejność próbek w stojakach. Załaduj tyle płytek reaktora, aby pomieścić wszystkie próbki i wybierz protokół dozowania na podstawie liczby użytych płytek.
    15. Zautomatyzować 5 mg wysuszonych próbek (± 0,3 mg) na kwasoodporne płytki 96-dołkowe ze stali nierdzewnej. Odważyć 3 powtórzenia każdej próbki rozmieszczone wokół płytki, aby zminimalizować wszelkie zlokalizowane różnice.
    16. Uwzględnij 8 kontrolnych próbek biomasy z dobrze scharakteryzowanego materiału wzorcowego biomasy w celu śledzenia wydajności testu. W przypadku wielu płytek zastosowanie wielu standardowych zbiorników na biomasę zminimalizuje dryft wielkości cząstek spowodowany przesiewaniem w lejach samowyładowczych w powtarzających się cyklach dozowania.
      Uwaga: Na każdej płytce powinny znajdować się 24 próbki z 3 powtórzeniami, 4 ślepe próby składające się z wody dejonizowanej i enzymu oraz 8 próbek, przy użyciu wcześniej scharakteryzowanej standardowej biomasy. 3 dołki narożne każdego z 4 rogów talerza są zarezerwowane dla standardów cukru.
    17. Sprawdzić puste studzienki i studzienki z wzorcem cukru pod kątem błędnych cząstek biomasy i usunąć, jeśli są obecne.
    18. Dodaj 250 μl wody dejonizowanej do każdej studzienki i uszczelnij płytki silikonową taśmą klejącą z politetrafluoroetylenu (PTFE).
    19. Za pomocą końcówki lutownicy 1/8" przebij taśmę PTFE w każdym porcie pary (łącznie 117) dla każdej płyty. Użyj pustej płytki ułożonej na szczelnej płycie reaktora jako prowadnicy i ogranicz ruch folii PTFE.
    20. Mocno zaciśnij płyty za pomocą uszczelek PTFE wzmocnionych włóknem szklanym o grubości 0,031 cala (wstępnie wybitych z otworami na porty pary) między płytami a pustymi płytami na górze i na dole stosu. Próbki należy poddać wstępnej obróbce za pomocą reaktora parowego ustawionego na 180 °C przez 17,5 minuty lub innych kombinacji temperatura/czas w zależności od pożądanej intensywności.
    21. Schłodzić płyty reaktora do temperatury 50 °C poprzez zalanie wodą dejonizowaną.
  2. Scukrzania enzymatyczne
    1. Przygotować enzymatyczny roztwór do scukrzania składający się z 8% (v/v) roztworu enzymatycznego w 1,0 M roztworze cytrynianu sodu o pH 5,0. Przygotować 5 ml na płytkę reaktora. Uwaga: Wymagane rozcieńczenie należy określić na podstawie aktywności i zawartości białka w określonym roztworze enzymu podstawowego.
    2. Gdy płytki ostygną, odwirować je w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 1 500 x g przez 20 minut. Usunąć folię uszczelniającą. Uwaga: Płyty te są ciężkie i należy sprawdzić specyfikacje wirówki pod kątem kompatybilności.
    3. Dodać 40 μl 8% roztworu podstawowego enzymu do każdej studzienki (70 mg enzymu na g biomasy).
    4. Ponownie uszczelnić nową taśmą PTFE. Umieść zapieczętowaną płytkę w płycie magnetycznej clamp.
    5. Delikatnie wymieszać próbki przez odwrócenie (co najmniej 15 razy) i inkubować w temperaturze 50 °C przez 70 godzin.
    6. Po zakończeniu scukrzania wymieszać przez odwrócenie i odwirować płytki o sile 1 500 x g przez 20 minut.
  3. Test cukru
    1. Przygotuj zestaw 6 połączonych wzorców kalibracyjnych glukozy i ksylozy w 0,014 M buforze cytrynianowym (pH 5,0) w zakresie od 0 do 0,750 mg/ml (zalecane 0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 i 0,75 mg/ml) i od 0 do 0,600 mg/ml (zalecane 0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 i 0,6 mg/ml) dla glukozy i ksylozy.
    2. Przygotuj odczynniki oksydazy/peroksydazy glukozowej (GOPOD) i dehydrogenazy ksylozy (XDH) zgodnie z instrukcją w zestawie.
    3. Za pomocą pipety usunąć 200 μl cieczy z 4 dołków narożnych i studzienek krawędziowych przylegających do dołków narożnych (łącznie 12 studzienek) płyty reaktora.
    4. Za pomocą pipety dozować 180 μl wody dejonizowanej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki rozcieńczającej z płaskiego dna z polistyrenu. Nie dodawaj wody do 12 studzienek cukrowych i narożnych (usuń te końcówki, jeśli używasz głowicy 96-kanałowej).
    5. Za pomocą pipety dozować 180 μl odczynnika GOPOD do każdego dołka płytki do oznaczania glukozy.
    6. Za pomocą pipety dozować 180 μl odczynnika XDH do każdego dołka płytki do oznaczania ksylozy.
    7. Za pomocą pipety przenieść 20 μl porcji hydrolizatu z płytki reaktora 96-dołkowego na płytkę rozcieńczającą. Pipetować z górnej części studzienek, aby uniknąć ciał stałych z biomasy i resztek cieczy w studzienkach narożnych. Mieszać przez rozcieranie przez co najmniej 10 cykli.
    8. Za pomocą pipety przenieść 110 μl wzorców cukru, w dwóch egzemplarzach, do narożnych dołków płytki rozcieńczającej.
    9. Za pomocą pipety przenieść 20 μl podwielokrotności z płytki rozcieńczającej na płytki do oznaczania glukozy i ksylozy. Wymieszać przez rozcieranie.
    10. Inkubować płytki do oznaczania glukozy i ksylozy w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przed odczytem ostrożnie rozbić wszelkie pęcherzyki na powierzchni. Dobrze sprawdza się opalarka przesunięta na chwilę po powierzchni płyty.
    11. Korzystając z 96-dołkowego czytnika płytek w ultrafiolecie/widzialnym, ustaw zmierzoną długość fali na 510 nm i zapisz absorbancję w stosunku do ślepej próby odczynnika. Pomiar ten monitoruje tworzenie chinoniminy, która jest proporcjonalna do stężenia glukozy. Stężenie glukozy oblicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej opartej na wzorcach wzorcowych przygotowanych w ppkt 1.3.1.
    12. Za pomocą ultrafioletowego/widzialnego 96-dołkowego czytnika płytek ustaw zmierzoną długość fali na 340 nm i zapisz absorbancję. Pomiar ten monitoruje redukcję NAD+ do NADH, która jest proporcjonalna do stężenia ksylozy. Stężenie ksylozy oblicza się na podstawie krzywej kalibracyjnej opartej na wzorcach kalibracyjnych przygotowanych w ppkt 1.3.1.

2. Wysokoprzepustowe oznaczanie całkowitej zawartości ligniny i monomerycznej ligniny za pomocą pyMBMS 28

  1. Przygotowanie próbki
    1. Zmielić i wyekstrahować biomasę metodami opisanymi w krokach 1.1.1 i 1.1.6-1.1.8. Obejmuje to mielenie i ekstrakcję zestawu wzorców do wykorzystania jako kontrole eksperymentalne.
      Uwaga: Pomiary pyMBMS nie są zależne od wielkości cząstek, więc jeśli tylko przy użyciu protokołu pyMBMS, należy przeprowadzić przygotowanie biomasy, aby próbka mogła zmieścić się w uchwycie na próbkę <4 mm.
    2. Za pomocą małej szpatułki dozować około 4 mg (najlepiej 3 do 5 mg) przygotowanej biomasy do kubka ze stali nierdzewnej o pojemności 80 μl przeznaczonego do automatycznego próbnika.
    3. Upewnij się, że co najmniej 10% analizowanych próbek to wzorce kontrolne, takie jak te dostępne w Narodowym Instytucie Standaryzacji i Technologii (wytłoki z trzciny cukrowej-8491; topola-8492; sosna-8493; lub słoma pszenna-8494). Wzorcem może być również dowolny gatunek analogiczny do analizowanych próbek, które zostały już scharakteryzowane przy użyciu standardowych metod.
    4. Losowo załaduj próbki do kubków automatycznego pobierania próbek za pomocą pęsety, aby uniknąć odchyleń spowodowanych możliwym dryftem spektrometru w czasie. Uwaga: Typowa randomizacja próbek obejmowałaby jednokrotny pomiar wszystkich próbek, a następnie ponowną randomizację kolejności próbek w celu podwójnego pomiaru. Programy randomizacji są dostępne online.
    5. Za pomocą standardowego dziurkacza należy ręcznie wyprodukować szklane tarcze filtracyjne z arkuszy z włókna szklanego typu A/D, bez spoiwa. Przytrzymaj okrągły filtr z włókna szklanego pęsetą, wyśrodkuj go nad kubkiem na próbkę i wepchnij do próbki za pomocą klucza imbusowego 3.5 mm, aby ograniczyć materiał w każdym kubku podczas eksperymentu.
  2. Protokół instrumentalny
    1. Skalibrować spektrometr masowy przy użyciu znanego wzorca, który ma natężenia pików w całym zakresie związków, które mogą występować w próbkach doświadczalnych. W przypadku typowych próbek biomasy należy użyć perfluorotributyloaminy (PFTBA).
    2. Ustaw natężenie przepływu helu nośnego na 0.9 l/min za pomocą przepływomierza gazu.
    3. Ustaw piec z automatycznym samplerem na temperaturę pirolizy 500 °C, a temperaturę interfejsu na 350 °C za pomocą oprogramowania automatycznego próbnika. Uwaga: Podgrzewana linia przesyłowa ze stali nierdzewnej 1/8" owinięta taśmą termiczną, która łączy automatyczny próbnik ze spektrometrem masowym, jest sterowana za pomocą regulatora ciepła w temperaturze 250 °C.
    4. Rozpocznij akwizycję danych na spektrometrze masowym i odczekaj co najmniej 60 sekund, aby uzyskać wystarczające dane do zebrania widm tła.
    5. Uruchomić metodę automatycznego automatycznego pobierania próbek zgodnie ze specyfikacjami podanymi w ppkt 2.2.2. Uwaga: Automatyczny próbnik wrzuca każdą próbkę indywidualnie do pieca z automatycznym próbnikiem. Całkowity czas pozyskiwania danych wynosi około 1,5 minuty; Jednak piroliza typowej próbki o stężeniu 4 mg jest zakończona po 30 sekundach.
    6. Zapisz całkowitą zawartość jonów (TIC) w każdej próbce za pomocą oprogramowania spektrometru mas z szybkością skanowania 0,5 sekundy. Rekordowe intensywności od m/z 30 do 450,
      Uwaga: Typowe związki biomasy wykorzystują miękką jonizację przy 17 eV. Przyrząd może rejestrować większe interwały od m/z 1 do 1,000; jednak szybkość skanowania będzie ograniczona przez moc procesora komputera.
    7. Usuń tło z widm za pomocą funkcji ręcznego ulepszania w oprogramowaniu. Uwaga: Do obliczenia średniej wartości tła używana jest część 60 skanów linii bazowej na początku zbierania danych. To średnie widma tła są automatycznie usuwane z widm próbki eksperymentalnej w oprogramowaniu spektrometru masowego.
    8. Zaimportuj jednokolumnowy plik tekstowy utworzony przez oprogramowanie spektrometru mas, zawierający dane spektralne dla każdej próbki, do programu bazy danych i połącz wszystkie próbki w jedną bazę danych. Dodaj do arkusza kalkulacyjnego wszystkie odpowiednie metadane. Zaimportuj sformatowane dane (arkusz kalkulacyjny/plik CSV) do pakietu oprogramowania statystycznego i znormalizuj widma, aby uwzględnić zmiany w masach próbek pirolizowanych.
    9. Użyj pakietu oprogramowania statystycznego, aby przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) przy użyciu danych spektralnych do analizy grupowania replikowanych próbek wzorcowych użytych w pomiarach, a także do oceny, które piki są integralne z klasyfikacją związków chemicznych na wykresie obciążeń28.
      Uwaga: PCA grupuje próbki na podstawie podobieństwa ich widm i umożliwia sprawdzenie wzorców w celu zmierzenia błędu eksperymentalnego spowodowanego dryftem przyrządu podczas pracy.
    10. Aby obliczyć stosunek ligniny syringylowej (S) do gwajakylu (G), zsumuj obszary pików S (m/z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 i 210) i podziel przez sumę pików G w punktach 124, 137, 138, 150, 164 i 178.
    11. Aby obliczyć całkowitą zawartość ligniny, zsumuj piki ligniny z m/z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 i 210.
    12. Obliczyć współczynnik korygujący dla skalowania pomiaru pyMBMS do standardowej metody szacowania ligniny całkowitej, takiej jak lignina Klason. Podzielić wartość ligniny Klason dla poszczególnych wzorców przez całkowitą zawartość ligniny zmierzoną dla tej próbki wzorcowej za pomocą pyMBMS.
    13. Współczynnik korygujący należy zastosować do wszystkich podobnych gatunków w zbiorze danych. Powtórz te czynności dla każdego rodzaju analizowanej biomasy. Uwaga: Współczynnik korygujący może się znacznie różnić w zależności od S/G analizowanej biomasy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Łączny efekt obróbki termochemicznej i następującej po niej sacharyfikacji enzymatycznej mierzy się jako funkcję masy uwolnionej glukozy i ksylozy na koniec analizy. Wyniki podawane są w miligramach uwolnionej glukozy i ksylozy na gram biomasy. Stoi to w wyraźnej sprzeczności z danymi z analiz w skali laboratoryjnej, które zazwyczaj raportuje się jako procent teoretycznej wydajności na podstawie analizy składu materiału wyjściowego. Ponieważ przeprowadzanie analizy składu tysięcy próbek tygodniowo nie jest jeszcze prakty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe etapy przygotowania próbki w celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych danych podczas przeprowadzania wysokoprzepustowych eksperymentów przesiewowych są następujące:

Test uwalniania cukru:

Na ogół próbki przygotowywane są jednorazowo w partiach liczących od kilkudziesięciu do kilku tysięcy. Każdy główny etap jest zwykle przeprowadzany dla wszystkich próbek przed przejściem do przodu, aby zminimalizować różnice w przygotowaniu między próbkami. Odkrochmalenie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować stażystce Evelyn Von Neida, która dostarczyła najważniejszych spostrzeżeń dotyczących przygotowania próbek biomasy dla obu rurociągów o wysokiej przepustowości omawianych w tym manuskrypcie. Wsparcia w opracowaniu tej pracy i manuskryptu udzieliło Centrum Nauki Bioenergia. Centrum Naukowe Bioenergii jest Centrum Badań Bioenergetycznych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych wspierane przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych w Biurze Nauki DOE. Narodowe Laboratorium Energii Odnawialnej (NREL) jest krajowym laboratorium Biura ds. Efektywności Energetycznej i Energii Odnawialnej Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych, prowadzonym dla DOE przez Alliance for Sustainable Energy, LLC. Prace te były wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych w ramach umowy nr 1. DE-AC36-08-GO28308 z Narodowym Laboratorium Energii Odnawialnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zautomatyzowana stacja robocza Biomek FXBeckman CoulterBiomek FXAutomatyczna ładowarka do cieczy
Młyn WileyThomas Scientific3375E15 (Model 4) lub 3383L20 (Mini-frezarka)
Worki antystatyczneMinigrip*MGST4P025032,5x3", dostępnych u wielu dostawców
drut miedziany pokryty cynąMcMaster-Carr8871K84o średnicy 0,016", Torebki na herbatę z drutu giętego i trzymanego
Herbcopress n' brew torebki na herbatę3,5x5 cali
glukoamylazaNovozymesSpirizyme Fuel 
alfa-amylazaNovozymesLiquozyme SC DS
octan sodu trójwodnydostawcaklasa odczynnika
kwas octowydowolny dostawcaklasa odczynnika
190 proof (95%) etanoldowolny dostawcaklasy odczynnika
Freeslate
96- cóż C-276 Płyty Hastelloy AspenMachining (Lafayette, Kolorado)Nie dotyczy (na zamówienie)
Końcówka lutownicy 1/8 "Sears
klejem silikonowym3M5180o szerokości 3 cali (rolki 36 jardów)
roztwór enzymatycznyNovozymesCellic CTec2
monohydrat kwasu cytrynowegodowolny dostawca
cytrynian trisodowy dwuwodnydowolny dostawca
jednorazowe, polistyrenowe płytki 96-dołkoweGreiner Bio-One655101lub równoważny; dostępnych jest wielu dostawców
Oksydaza glukozowa/peroksydaza MegazymeK-GlucMegazyme Zestaw do oznaczania D-glukozy Megazyme
Dehydrogenaza ksylozyMegazymeK-ksylozaMegazyme Zestaw do oznaczania D-ksylozy
roztwór wzorcowy glukozyMegazymeK-GlucMegazyme Zestaw do oznaczania D-glukozy Megazyme
wzorcowy ksylozyMegazymeK-ksylozaZestaw do oznaczania D-ksylozy
kubki na próbki ze stali nierdzewnejFrontier LaboratoriesPY1-EC80F
Arkusze z włókna szklanegoPall66227Arkusze 8x10"; kółka dziurkowane standardowym dziurkaczem
Wytłoki z trzciny cukrowej Cały surowiec biomasyNIST8491
Bawełna wschodnia (topola) Cały surowiec z biomasyNIST8492
Sosna Monterey Surowiec z całej biomasyNIST8493
Pszenica Surowiec z całej biomasy słomyNIST8494
dowolny chemiczny chemiczny chemiczny zbiorniki Taśma teflonowa z chemicznychemikaliów Roztwór

Bibliografia

  1. U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
  3. Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
  6. Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
  7. Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
  8. DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
  9. Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
  10. Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
  11. Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
  12. Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
  13. Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
  14. Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
  15. Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
  16. Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
  17. Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
  18. Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
  19. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
  20. Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
  21. Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
  22. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
  23. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).
  24. Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
  25. Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
  26. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
  27. Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
  28. Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
  29. Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
  30. Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

oporno biomasywst pna obr bka paroznaczanie ilo ci glukozy i ksylozypiroliza z wi zk molekularnspektrometria masanaliza cian kom rkowychrobotyczna obs uga pr bek

Powiązane artykuły