Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Streszczenie

Genetyka odwrócona, podejście do całkowitego ratowania zakaźnego wirusa ze sklonowanego cDNA, zrewolucjonizowała dziedzinę wirusów o dodatniej nici RNA, których genomy mają taką samą polaryzację jak mRNA komórkowe. System genetyki odwrotnej oparty na cDNA jest przełomową metodą, która umożliwia bezpośrednią manipulację genomowym RNA wirusa, generując w ten sposób rekombinowane wirusy do badań molekularnych i genetycznych zarówno elementów wirusowego RNA, jak i produktów genowych w replikacji i patogenezie wirusa. Stanowi również cenną platformę, która umożliwia opracowywanie genetycznie zdefiniowanych szczepionek i wektorów wirusowych do dostarczania obcych genów. Jednak w przypadku wielu wirusów o dodatniej nici RNA, takich jak wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV), sklonowane cDNA są niestabilne, co stanowi główną przeszkodę w budowie i rozmnażaniu funkcjonalnego cDNA. W niniejszym raporcie opisano strategiczne rozważania związane z tworzeniem i amplifikacją genetycznie stabilnego zakaźnego cDNA JEV o pełnej długości jako bakteryjnego sztucznego chromosomu (BAC) przy użyciu następujących ogólnych procedur eksperymentalnych: izolacja wirusowego RNA, synteza cDNA, subklonowanie i modyfikacja cDNA, składanie cDNA o pełnej długości, linearyzacja cDNA, in vitro Synteza RNA i odzyskiwanie wirusa. Protokół ten zapewnia ogólną metodologię mającą zastosowanie do klonowania pełnej długości cDNA dla szeregu wirusów o dodatniej nici RNA, w szczególności tych o genomie o długości >10 kb, do wektora BAC, z którego zakaźne RNA mogą być transkrybowane in vitro za pomocą polimerazy RNA bakteriofaga.

Wprowadzenie

Dla wirusologów RNA, pojawienie się technologii rekombinacji DNA pod koniec lat siedemdziesiątych umożliwiło konwersję wirusowych genomów RNA na klony cDNA, które następnie mogły być rozmnażane jako plazmidy w bakteriach do genetycznej manipulacji wirusami RNA. ¹ Pierwszym wirusem RNA, który został sklonowany molekularnie, był bakteriofag Qβ, wirus o dodatniej nici RNA, który infekuje Escherichia coli. Plazmid zawierający kompletną kopię cDNA genomowego RNA Qβ spowodował powstanie zakaźnych fagów Qβ po wprowadzeniu do E. coli. ² Wkrótce potem technikę tę zastosowano do wirusa polio, wirusa o dodatniej nici RNA u ludzi i zwierząt. Plazmid zawierający cDNA genomowego RNA wirusa polio o pełnej długości był zakaźny po transfekacji do komórek ssaków i zdolny do wytwarzania zakaźnych wirionów. ³ W tym podejściu "wystrzelonym przez DNA" sklonowane cDNA powinny być transkrybowane wewnątrzkomórkowo w celu zainicjowania replikacji wirusowego RNA; Nie jest jednak jasne, w jaki sposób inicjowana jest transkrypcja i w jaki sposób transkrypty są przetwarzane do prawidłowej sekwencji wirusa. Obawy te doprowadziły do opracowania alternatywnego podejścia "uruchamianego przez RNA", w którym kompletna kopia cDNA genomu wirusowego RNA jest klonowana pod promotorem rozpoznawanym przez E. coli lub polimerazę RNA faga w celu produkcji syntetycznych RNA in vitro o zdefiniowanych końcach 5' i 3', które przechodzą pełny cykl replikacji wirusa po wprowadzeniu do komórek gospodarza. ^4,5 Pierwszy sukces w zastosowaniu tego podejścia odnotowano w przypadku wirusa mozaiki ^bromu,6,7 wirusa o dodatniej nici RNA roślin. Od tego czasu podejście oparte na RNA zostało opracowane dla szerokiej gamy wirusów o dodatniej nici RNA, w tym kaliciwirusów, alfawirusów, flawiwirusów, arteriwirusów i koronawirusów. ^1,4,5,8

Zarówno w systemach genetyki odwrotnej uruchamianych przez DNA, jak i RNA, budowa pełnowymiarowego klonu cDNA jest kluczem do generowania zakaźnego DNA lub RNA wirusów o dodatniej nici RNA, ale staje się poważnym wyzwaniem technicznym wraz ze wzrostem rozmiaru genomu wirusa. ^9-17 W szczególności duży genom RNA o wielkości ~10-32 kb przedstawia trzy główne przeszkody w klonowaniu funkcjonalnego cDNA o pełnej długości. ¹⁸ Pierwszą trudnością jest synteza wiernej kopii cDNA, ponieważ wierność RT-PCR jest odwrotnie proporcjonalna do długości wirusowego RNA. Drugą przeszkodą jest obecność potencjalnie toksycznych sekwencji, ponieważ długie cząsteczki RNA z większym prawdopodobieństwem zawierają nieoczekiwane sekwencje, które mogą sprawić, że fragment cDNA w plazmidach stanie się niestabilny u E. coli. Trzecią i najważniejszą kwestią jest dostępność odpowiedniego wektora, ponieważ trudno jest znaleźć wektor klonujący, który może pomieścić wstawkę cDNA wirusa o wielkości >10 kb. W ciągu ostatnich trzech dekad bariery te zostały pokonane dzięki kilku postępom w enzymologii, metodologii i wektorologii. ^1,4,5,8 Spośród nich najbardziej obiecującym i innowacyjnym osiągnięciem jest klonowanie wirusów o dużej dodatniej nici RNA jako zakaźnych sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC). Wektor BAC to plazmid klonujący o niskiej liczbie kopii (1-2 kopie / komórkę) oparty na czynniku płodności E. coli, o średnim rozmiarze wstawki DNA ~ 120-350 kb. ^19-21 Fragment DNA jest wprowadzany do wektora BAC w podobny sposób, jak klonowanie do ogólnych wektorów klonowania; powstałe w ten sposób klony BAC są stabilne przez wiele pokoleń u E. coli.^22,23 Do tej pory technologia BAC była wykorzystywana do tworzenia zakaźnych klonów cDNA dla >10 członków trzech rodzin wirusów o dodatniej nici RNA, tj. Flaviviridae,24-29 Arteriviridae,30 i Coronaviridae. ^{9,16,17,31,32}

Na przykładzie wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV), niniejsza praca przedstawia szczegółowe procedury, które mogą być użyte do skonstruowania genetycznie stabilnego zakaźnego BAC o pełnej długości dla różnych wirusów o dodatniej nici RNA. JEV to odzwierzęcy flawiwirus³³, który jest przenoszony w naturze między ptakami, świniami i innymi kręgowcami przez wektory komarów. ^34,35 U ludzi zakażenie JEV może powodować ciężką, często śmiertelną chorobę neurologiczną Japońskie Zapalenie Mózgu (JE)^,36 która występuje w Azji i częściach Zachodniego ^{Pacyfiku,37,38} z szacowaną roczną częstością występowania ~50 000-175 000 przypadków klinicznych. ^39,40 Genom JEV jest ~11-kb, jednoniciową cząsteczką RNA o dodatnim sensie i składa się z pojedynczej otwartej ramki odczytu (ORF) otoczonej dwoma regionami niekodującymi (NCR) na końcach 5' i 3'. ^41,42 ORF koduje poliproteinę, która jest rozszczepiana przez proteazy gospodarza i wirusa w celu wytworzenia 10 pojedynczych białek, oznaczonych jako C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5 w kierunku N- do C-końcowym. ^34,43,44 Również rozszerzona forma NS1 (NS1') jest wyrażana przez -1 rybosomalne przesunięcie ramki w kodonach 8-9 NS2A. ^45,46 Spośród tych 11 białek, trzy białka strukturalne (C, prM i E) są niezbędne do tworzenia zakaźnych ^{wirionów,47,48} a pozostałe osiem białek niestrukturalnych (NS1 do NS5 i NS1') ma kluczowe znaczenie dla replikacji wirusowego ^RNA,49-51 składania ^{cząstek,52-56} i unikania odporności wrodzonej. ^57-59 Zarówno 5', jak i 3' NCR zawierają konserwatywne sekwencje pierwszorzędowe i tworzą drugorzędowe / trzeciorzędowe struktury ^RNA,60-62, które są ważne dla modulacji replikacji wirusowego RNA. ^{Pytanie 63,64}

TGL

Ten protokół opisuje narzędzia, metody i strategie generowania pełnowymiarowego zakaźnego BAC JEV SA_14-14-2. ²⁸ Ten funkcjonalny klon BAC zawiera kompletną kopię cDNA genomowego RNA ^JEV,65 która jest objęta promotorem polimerazy RNA SP6 przed końcem wirusa 5' i unikalnym miejscem restrykcyjnym Xba I za końcem wirusa 3' do transkrypcji in vitro. Ta technologia BAC ma zastosowanie do konstruowania w pełni funkcjonalnego klonu molekularnego cDNA dla szeregu wirusów o dodatniej nici RNA.

Protokół

Uwaga: Rysunek 1 przedstawia strategię budowy pełnowymiarowego zakaźnego cDNA JEV jako BAC. ²⁸ Tabela 1 zawiera wykaz oligonukleotydów stosowanych w niniejszym protokole. ²⁸

1. Ekstrakcja wirusowego RNA z cząstek JEV w supernatantach hodowli komórkowych

1. Zacznij od pożywki do hodowli komórkowej zawierającej JEV SA 14-14-2, żywego wirusa szczepionki JE, który wymaga zabezpieczenia biologicznego na poziomie 2 bezpieczeństwa.
   Uwaga: Miano wirusa wynosi około 1-3 × 10⁶ jednostek tworzących płytki nazębne/ml.
2. Przed rozpoczęciem pracy z JEV SA 14-14-2 weź udział w szkoleniu w zakresie bezpieczeństwa biologicznego niezbędnym dla wszystkich standardowych praktyk mikrobiologicznych, sprzętu bezpieczeństwa i obiektów laboratoryjnych.
3. Oczyść wirusowe RNA z podwielokrotności pożywki do hodowli komórkowej zawierającej wirusa za pomocą jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny⁶⁶ (Figura 1A).
   1. Dodać 600 μl odczynnika jednofazowego do 200 μl supernatantu do hodowli w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml. Homogenizować mieszaninę, energicznie potrząsając ręcznie probówką przez 30 sekund i inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Do homogenizowanej próbki dodać 160 μl chloroformu. Dokładnie wymieszaj, energicznie potrząsając ręcznie probówką przez 15 sekund i pozostawiając ją na 2-3 minuty w temperaturze RT.
   3. Odwirować całkowity lizat o stężeniu 13 400 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, co prowadzi do rozdzielenia dwóch faz ciekłych, tj. dolnej fazy organicznej i górnej fazy wodnej. Przenieść górną fazę wodną (mniej niż 200 μl) zawierającą RNA do nowej mikroprobówki.
   4. Wytrącić RNA, dodając 1 μl 5 μg/μl glikogenu i 400 μl 100% izopropanolu i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Odwirować mieszaninę w temperaturze 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA 1 ml 75% etanolu przez pulsacyjne wirowanie trzy do pięciu razy i odwirować w temperaturze 13 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Suszyć na powietrzu granulki RNA przez 10 minut i rozpuścić je w 40 μl_dH2O. Wyekstrahowany RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Zsyntetyzuj zestaw czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA (od F1 do F4) obejmujących cały genomowy RNA wirusa za pomocą odwrotnej transkrypcji (RT)-PCR

1. Przeprowadzić reakcję RT o stężeniu 20 μl z 10 μl podwielokrotnością oczyszczonego wirusowego RNA jako matrycą i zmodyfikowaną formą odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki mysiej Moloneya. ⁶⁷ Rozdział
   1. Przygotuj mieszaninę o objętości 13 μl zawierającą 10 μl oczyszczonego RNA, 1 μl 10 mM mieszaniny dNTP, 1 μl 4 pmol/μl startera i 1 μl dH₂O. Użyj startera specyficznego dla fragmentu dla każdej reakcji RT: 1RT dla F1, 2RT dla F2, 3RT dla F3 i 4RT dla F4.
   2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 5 minut, umieścić na lodzie na 1 minutę, a następnie szybko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
   3. Dodać 4 μl buforu 5× RT, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy 40 U/μl i 1 μl 200 U/μl odwrotnej transkryptazy. Mieszać, pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy.
   4. Pozostawić reakcję w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę, a następnie inaktywować termicznie próbkę w temperaturze 70 °C przez 15 minut. Zsyntetyzowaną pierwszą nić cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
2. Wykonaj reakcję PCR o objętości 100 μl z 5 μl podwielokrotności inaktywowanej termicznie reakcji RT jako matrycy i termostabilnej polimerazy DNA⁶⁸ o wysokiej wierności (Figura 1B).
   1. Przygotować 100 μl reakcji PCR na lodzie, zawierającej 5 μl reakcji RT, 20 μl buforu 5× PCR, 4 μl 10 mM mieszaniny dNTP, 5 μl 10 μM startera do przodu, 5 μl 10 μM startera odwrotnego, 1 μl 2 U/μl polimerazy DNA, i 60 μl dH₂O. Użyj pary starterów specyficznych dla fragmentu dla każdej reakcji PCR: 1F+1R dla F1 (2573 pz), 2F+2R dla F2 (4171 pz), 3F+3R dla F3 (3922 pz) i 4F+4R dla F4 (1798 pz).
   2. Delikatnie wymieszaj, obracając probówkę palcem trzy do pięciu razy i krótko odwiruj, aby zebrać jej zawartość na dnie.
   3. Rozpocznij cykl termiczny od początkowego etapu denaturacji trwającego 30 sekund w temperaturze 98 °C, a następnie 25-30 cykli z następującym profilem PCR: 10 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 60 °C i 1-2 minuty (30 s/kb) w temperaturze 72 °C. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
3. Przeprowadzić 2-5 μl podwielokrotności każdej reakcji PCR na 0,8% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg/ml bromku etydyny (EtBr) (ryc. 2).
   UWAGA: EtBr jest silnym mutagenem i wymaga noszenia fartuchów laboratoryjnych, okularów ochronnych i rękawic oraz zachowania szczególnej ostrożności podczas jego użytkowania, przechowywania i utylizacji.

3. Subklonuj każdy z czterech fragmentów cDNA (od F1 do F4) do wektora BAC, aby utworzyć pBAC/F1 do pBAC/F4 za pomocą technik klonowania molekularnego

1. Trawić wektor i wstawiać DNA z dwiema odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi, w następujący sposób:
   1. Przeprowadzić sekwencyjne trawienie pBAC/PRRSV/FL (wektor)³⁰, pochodnej plazmidu pBeloBAC11 (7507 pz, numer dostępu GenBank U51113), z Pme I i Not I w całkowitej objętości 60 μl (zawierającej ~500 ng DNA, 10 enzymu U, 1x bufor do wytrawiania i 1× BSA) w temperaturze 37 °C przez 12-15 godzin, co daje fragment wektora 15426-bp.
   2. Przeprowadzić sekwencyjne trawienie każdego z czterech amplikonów cDNA (wstawka) z Sma I i Not I w łącznej objętości 60 μl (zawierającej ~1 μg DNA, 20 U enzymu, 1× buforu do wytrawiania i 1× BSA) w temperaturze 25 °C (Sma I) lub 37 °C (Not I) przez 12-15 godzin, co daje następujące fragmenty wstawki o pożądanym rozmiarze: F1 (2559 pz), F2 (4157 pz), F3 (3908 pz) i F4 (1784 pz).
2. Oczyść żądany wektor i wprowadź fragmenty DNA przez ekstrakcję żelu.
   1. Rozdzielić podwójnie strawione produkty na 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia zawierającym 0,5 μg/ml EtBr. Wytnij pasmo pożądanego fragmentu DNA z minimalną ilością agarozy (zwykle ~200 μl) w długofalowym świetle ultrafioletowym.
   2. Dodać równą objętość buforu TEM (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA i 10 mM MgCl₂) do wyciętej agarozy w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml. Inkubować próbkę w temperaturze 72 °C przez 10-15 minut, z wirowaniem co 2-3 minuty, aż do całkowitego stopienia agarozy.
   3. Dodać równą objętość wstępnie podgrzanego fenolu nasyconego buforem, energicznie wirować przez 1 minutę i odwirować przy 13 400 × g przez 10 minut przy RT.
      Uwaga: Mieszanina rozdziela się na dolną fazę organiczną i górną fazę wodną. Przenieś górną fazę wodną zawierającą DNA do nowej mikroprobówki.
   4. Dodać równą objętość chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1), wirować przez 1 minutę i odwirować przy 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść górną fazę wodną do nowej mikroprobówki.
   5. Dodać 0,5 μl 10 μg/μl tRNA drożdży, 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu. Trzymaj mieszaninę na lodzie przez 20 minut.
   6. Odwirować mieszaninę przy 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i przepłukać osad DNA 1 ml 70% etanolu przez pulsacyjne wirowanie trzy do pięciu razy i odwirowanie przy 13 400 × g przez 10 minut.
   7. Suszyć na powietrzu osad DNA przez 10 minut i rozpuścić go w 20 μl buforu TE (10 mM Tris-Cl i 1 mM EDTA [pH 7,6]).
3. Zwiąż żądany wektor i wstaw fragmenty DNA za pomocą ligazy DNA T4.
   1. Ustaw 20 μl reakcji ligacji zawierającej 50-100 ng wektorowego DNA, ~3-krotny molowy nadmiar wstawienia DNA, 400 U ligazy DNA T4 i 1× bufor ligacyjny. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze 16 °C przez 12–15 godzin.
      Uwaga: Uwzględnij równolegle reakcję kontroli negatywnej, tj. tylko wektor bez wkładki.
   2. Wykonaj cztery oddzielne ligacje, z których każda łączy fragment 15426-bp Pme I-Not I pBAC/PRRSV/FL z 2559-bp (dla F1), 4157-bp (dla F2), 3908-bp (dla F3) lub 1784-bp (dla F4) fragmentu Sma I-Not I jednego z czterech amplikonów cDNA, aby wygenerować subklony pBAC/F1 do pBAC/F4.
4. Przekształć zligowane DNA w E. coli DH10B metodą CaCl_2-szok cieplny.
   1. Pobrać 100 μl podwielokrotności właściwych komórek DH10B⁶⁹ poddanych działaniu CaCl₂, przechowywanych w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.
      Uwaga: Użyj 100 μl komórek na transformację.
   2. Dodać 10 μl podwielokrotności reakcji ligacji DNA do 100 μl rozmrożonych komórek w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml, delikatnie wymieszać, stukając w probówkę i trzymać na lodzie przez 30 minut.
   3. Szok termiczny mieszaniny DNA-komórek przez 45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, umieszczenie na lodzie na 2 minuty, a następnie dodanie 900 μl bulionu LB podgrzanego do temperatury regulowanej.
   4. Inkubować komórki poddane szokowi cieplnemu w temperaturze 35 °C przez 1 godzinę, wytrząsając przy 225–250 obr./min.
   5. Rozprowadzić od 50 do 200 μl podwielokrotności hodowanych komórek na płytkach agarowych LB zawierających 10 μg/ml chloramfenikolu (Cml). Trzymaj talerze w temperaturze pokojowej, prawą stroną do góry, aż wyschną.
   6. Odwrócić płytki do góry nogami i inkubować w temperaturze 35 °C przez 15 godzin.
5. Odzyskaj sklonowane DNA BAC z komórek gospodarza za pomocą metody oczyszczania opartej na kolumnach (Figura 1C).
   1. Wybrać od sześciu do ośmiu kolonii bakteryjnych z płytek agarowych LB-Cml i zaszczepić je w 3 ml bulionu 2xYT zawierającego 10 μg/ml Cml. Inkubować kultury w temperaturze 35 °C przez 10 godzin, energicznie wstrząsając (225-250 obr./min).
   2. Wyizolować rekombinowane DNA BAC z 1-1,5 ml kultur bakteryjnych za pomocą kolumn wirowych, zgodnie z zaleceniami producenta. ⁷⁰ Eluować wyekstrahowane DNA (zwykle 100-200 ng) w 20 μl buforu TE.
   3. Przeprowadzić dwie analityczne mineralizacje enzymem restrykcyjnym izolowanych BAC przez ~6 godzin w całkowitej objętości 10 μl, jedno w celu zidentyfikowania obecności wektora za pomocą właściwej wstawki przy użyciu tych samych enzymów, które użyto do klonowania (patrz protokół 3.1), a drugie w celu zbadania integralności sklonowanych BAC za pomocą odpowiedniego enzymu (np. Bgl powiedział: II, Nco I lub Pst I), generując unikatowy wzór fragmentu ograniczenia.
   4. Rozmnażać prawidłowo sklonowane BAC poprzez zaszczepienie 500 μl dodatnich kultur bakteryjnych (z protokołu 3.5.1) w 500 ml pożywki 2xYT-Cml i hodowlę inokulum przez 6 godzin w temperaturze 35 °C, wytrząsając z prędkością 225-250 obr./min. Oczyścić DNA BAC (zwykle 10-20 μg) z kultury o objętości 500 ml za pomocą kolumn filtrujących, zgodnie z zaleceniami producenta. ⁷¹
      Uwaga: Początkowe cztery subklony BAC, z których każdy zawiera fragment cDNA genomowego RNA JEV, mogą okazać się mieć jedną lub więcej niepożądanych mutacji w porównaniu z sekwencją konsensusu^{genomu wirusa 42} (która służy jako sekwencja referencyjna). Każda taka mutacja musi zostać skorygowana za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na PCR przed złożeniem pełnowymiarowego cDNA JEV. ^{27 Rozdział 27}

4. Stwórz pełnowymiarowe cDNA JEV z 5' Promotorem SP6 i 3' Miejscem Spływu

1. Dokonać trzech modyfikacji genetycznych (patrz poniżej Protokoły 4.1.1-4.1.3) w sklonowanych cDNA, aby umożliwić transkrypcję in vitro RNA o długości genomu z autentycznymi końcami 5' i 3' genomu wirusa.
   1. Wprowadzić promotor SP6 bezpośrednio przed końcem 5' genomu wirusa przez nakładanie się rozszerzeń PCR (Figura 1D, pBAC / F1^SP6).
      1. Amplifikować dwa nakładające się na siebie fragmenty DNA za pomocą pierwszego standardowego PCR pBAC/F1 z dwiema parami starterów SP6F+SP6R (wielkość produktu, 173 pz) i F1F+F1R (wielkość produktu, 676 pz), każdy w reakcji 50 μl zawierającej 1 μl matrycy DNA (~200 pg/μl), 10 μl buforu 5× PCR, 2 μl 10 mM dNTPs, po 2,5 μl starterów 10 μM do przodu i do tyłu, 0,5 μl polimerazy DNA 2 U/μl68 i 31,5 μl dH₂O. Wykonać PCR stosując następujący profil cykliczny: 98 °C przez 30 sekund i 25 cykli 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund, i 72 °C przez 20 sek.
      2. Oczyść żelowo dwa fragmenty DNA amplifikowane PCR po uruchomieniu każdego z dwóch produktów PCR na 1,5% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia, jak opisano w Protokole 3.2.
      3. Połączyć dwa oczyszczone żelem fragmenty DNA za pomocą drugiego PCR fuzyjnego przy użyciu najbardziej zewnętrznych starterów SP6F+F1R (wielkość produktu, 821 pz) w reakcji 100 μl, w tym po 1 μl każdy z dwóch oczyszczonych fragmentów DNA (~100 pg/μl), 20 μl buforu 5× PCR, 4 μl 10 mM dNTP, po 5 μl 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 1 μl 2 U/μL polimerazy ^DNA,68 i 63 μl_dH2O. Użyj następującego profilu cykli termicznych: 98 °C przez 30 sekund i 25 cykli po 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund.
      4. Oczyścić żelem stopiony amplikon PCR z 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, zgodnie z opisem w Protokole 3.2.
      5. Wykonaj pięcioetapową procedurę klonowania opisaną w protokołach 3.1-3.5 w celu podwiązania fragmentu 760-bp Pac I-BsiW I oczyszczonego żelem stopionego amplikonu PCR z 9532-bp Pac I-BsiW I fragmentem pBAC/F1 w celu wygenerowania pBAC/F1^SP6.
   2. Usuń istniejące, wewnętrzne miejsce Xba I w nukleotydzie 9131, wprowadzając cichą mutację punktową (A⁹¹³⁴→T) poprzez nakładanie się rozszerzeń PCR (Figura 1D, pBAC / F3^KO).
      1. Amplifikować dwa nakładające się na siebie fragmenty DNA za pomocą pierwszego standardowego PCR pBAC/F3 z dwiema parami starterów X1F+X1R (wielkość produktu, 746 pz) i X2F+X2R (wielkość produktu, 316 pz) w reakcji 50 μl w warunkach eksperymentalnych opisanych w Protokole 4.1.1.1.
      2. Oczyść żelowo dwa fragmenty DNA amplifikowane PCR po separacji elektroforetycznej na 1,5% żelach agarozowych o niskiej temperaturze topnienia, jak opisano w Protokole 3.2.
      3. Połączyć dwa oczyszczone żelem fragmenty DNA za pomocą drugiego termojądrowego PCR przy użyciu najbardziej zewnętrznych starterów X1F+X2R (wielkość produktu, 1033 pz) w reakcji 100 μl w warunkach eksperymentalnych opisanych w Protokole 4.1.1.3.
      4. Oczyścić żelem stopiony amplikon PCR z 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, jak wyszczególniono w Protokole 3.2.
      5. Wykonaj pięcioetapową procedurę klonowania opisaną w protokołach 3.1-3.5 w celu podwiązania fragmentu 949-bp Avr II-Not I oczyszczonego żelem stopionego amplikonu PCR z fragmentami 16245-bp Not I-BsiW I i 2141-bp BsiW I-Avr II pBAC/F3 w celu wytworzenia pBAC/F3^KO.
   3. Zaprojektuj nowe sztuczne miejsce spływu Xba I tuż za końcem 3' genomu wirusa za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce opartej na PCR (Figura 1D, pBAC / F4^RO).
      1. Wygeneruj jeden fragment DNA metodą PCR pBAC/F4 ze starterami ROF+ROR (wielkość produktu, 324 pz) w reakcji 100 μl zawierającej 1 μl matrycowego DNA (~200 pg/μl), 20 μl buforu 5× PCR, 4 μl 10 mM dNTP, po 5 μl po 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 1 μl 2 U/μl polimerazy DNA, ⁶⁸ i 64 μl dH₂O. Wykonaj PCR przy użyciu następującego profilu cyklicznego: 98 °C przez 30 sekund i 25 cykli po 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 15 sekund.
      2. Oczyść żelem fragment DNA amplifikowany metodą PCR z 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, jak wyszczególniono w Protokole 3.2.
      3. Wykonaj pięcioetapową procedurę klonowania opisaną w protokołach 3.1-3.5 w celu podwiązania fragmentu 283-bp Sfi I-Not I oczyszczonego żelem amplikonu PCR z fragmentem 16933-bp Sfi I-Not I pBAC/F4 w celu wytworzenia pBAC/F4^RO.
2. Złóż zestaw czterech zmodyfikowanych, nakładających się na siebie cDNA w jeden BAC SA 14-14-2 o pełnej długości (pBAC/SA_14-14-2), łącząc się w trzech naturalnych miejscach restrykcyjnych (BsrG I, BamH I i Ava I) w sposób sekwencyjny, stosując pięcioetapowe procedury klonowania opisane w protokołach 3.1-3.5 (Rysunek 1E): F1^SP6 → F1^SP6F2 (zastępując fragment BsrG I-Not I pBAC/F1^SP6 z fragmentem pBAC/F2) → F1^SP6F2F3^KO (poprzez zastąpienie fragmentu BamH I-Not I pBAC/F1^SP6F2 fragmentem pBAC/F3^KO) → F1^SP6F2F3^KOF4^RO (poprzez zastąpienie fragmentu Ava I-Not I pBAC/F1^SP6F2F3^KO fragmentem pBAC/F4^RO).

5. Przygotuj Maxi-prep o wysokiej czystości pełnometrażowego SA 14-14-2 BAC

1. Hodować pojedynczą kolonię E. coli DH10B przenoszącą pBAC/SA 14-14-2 w 3 ml bulionu 2xYT zawierającego 10 μg/ml Cml przez 10 godzin w temperaturze 35 °C z wytrząsaniem przy 225-250 obr./min, a następnie zwiększyć skalę przez zaszczepienie 500 μl 10-godzinnej kultury bakteryjnej w 500 ml pożywki 2xYT-Cml i hodowanie inokulum przez 6 godzin w temperaturze 35 °C z energicznym wstrząsaniem.
2. Odwirować kulturę bakteryjną w dwóch butelkach o pojemności 250 ml w temperaturze 3,107 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić każdą osadkę w 30 ml roztworu GTE (50 mM glukozy, 25 mM Tris-Cl i 10 mM EDTA [pH 8,0]), a następnie dodać 500 μl lizozymu o stężeniu 60 mg/ml. Inkubować dwie zawiesiny komórkowe na lodzie przez 10 minut.
3. Dodać 60 ml świeżo przygotowanego roztworu do lizy (0,2 N NaOH i 1% SDS) do każdej zawiesiny komórek, dobrze wymieszać do uzyskania klarowności i utrzymywać lizaty w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Dodać 45 ml roztworu neutralizującego (100 ml, składającego się z 60 ml 5 M octanu potasu, 11,5 ml lodowatego kwasu octowego i 28,5 ml_dH2O) do każdej butelki, dokładnie wymieszać przez odwrócenie butelek i inkubować zobojętnione lizaty na lodzie przez 10 minut.
5. Odwirować zobojętnione lizaty w temperaturze 18,566 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant z obu butelek do dwóch nowych butelek o pojemności 250 ml; do każdej dodać 0,6 objętości 100% izopropanolu i trzymać je na lodzie przez 20 minut.
6. Odwirować osady w temperaturze 18 566 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić każdą osadkę w 5 ml buforu TE, połączyć je w probówce o pojemności 50 ml (łącznie 10 ml) i wytrącić RNA, dodając równą objętość 5 M chlorku litu. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 10 minut.
7. Odwirować osad RNA w temperaturze 14,636 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 250 ml i wytrącić DNA, dodając 2 objętości 100% izopropanolu. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 20 minut.
8. Odwirować osad DNA w temperaturze 18 566 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad DNA w 9,5 ml buforu TE (pH 7,6) i dodać 10 g chlorku cezu (CsCl) i 390 μl 10 mg/ml EtBr.
9. Załadować roztwór DNA-CsCl-EtBr do zamykanej rurki polipropylenowej o średnicy 16 × 76 mm za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 18 G. Wirować uszczelniony gradient CsCl w ultrawirówce o masie 401 700 × g przez 16 godzin w temperaturze 20 °C (rysunek 3).
10. Pobrać pasmo DNA plazmidu BAC z gradientu CsCl za pomocą igły 18 G, aby utworzyć otwór wentylacyjny w górnej części gradientu i strzykawki wyposażonej w igłę 20 G, aby pobrać DNA BAC z boku gradientu.
11. Dodać 2,5 objętości_dH2nasyconego O-o-butanolem do próbki DNA BAC barwionego EtBr i wymieszać przez wirowanie. Odwirować mieszaninę o sile 13 400 × g przez 1 minutę i przenieść dolną fazę wodną do nowej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Powtórz tę procedurę sześć razy.
12. Wytrącić DNA BAC wolne od EtBr, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu do DNA BAC ekstrahowanego butanolem i inkubując przez 10 minut na lodzie. Odwirować osad o sile 13 400 × g przez 10 minut, przemyć osad DNA 1 ml 70% etanolu i ponownie zagnieździć przez odwirowanie.
13. Wysuszyć na powietrzu osad DNA przez 10 minut i rozpuścić go w 200 μl buforu TE (pH 7,6).
    Uwaga: Rysunek 4 przedstawia przegląd systemu odwrotnej genetyki dla JEV SA_14-14-2.

6. Transkrybuj syntetyczne RNA in vitro z linearyzowanego JEV BAC DNA

1. Przeprowadzić wytrawianie enzymem restrykcyjnym na dużą skalę pBAC/SA 14-14-2 z Xba I w całkowitej objętości 100 μl (zawierającej 3 μg DNA, 60 enzymu U, 1× buforu do wytrawiania i 1× BSA) w temperaturze 37 °C przez 12-15 godzin. Zbadać 3 μl podwielokrotności reakcji trawienia na 0,8% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg/ml EtBr.
2. Kontynuować inkubację reakcji trawienia z 25 U nukleazy fasoli mung (MBN) w temperaturze 30 °C przez 2 godziny (ryc. 4A).
3. Doprowadzić objętość próbki strawionej przez Xba I, poddanej działaniu MBN do 300 μl za pomocą_dH2O. Do rozcieńczonej próbki dodać równą objętość alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1), energicznie wirować przez 1 minutę, wirować w temperaturze 13 400 × g przez 10 minut, a następnie przenieść górną fazę wodną do nowej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać równą objętość chloroformu i powtórzyć procedurę ekstrakcji.
4. Odzyskać wyekstrahowany fenolem/chloroformem, zlinearyzowany BAC przez wytrącanie etanolu: Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu i inkubować na lodzie przez 20 minut. Odwirować osad o sile 13 400 × g przez 10 minut, przepłukać osad DNA 1 ml 70% etanolu, a następnie odwirować go przez ponowne odwirowanie.
5. Wysuszyć na powietrzu osad DNA przez 10 minut i rozpuścić go w 30 μl dH₂O. Zbadać 1 μl podwielokrotności odzyskanego BAC na 0,8% żelu agarozowym z 0,5 μg/ml EtBr (ryc. 5A).
6. Wykonaj spływową transkrypcję zlinearyzowanego DNA BAC w całkowitej objętości 25 μl (zawierającej ~ 200 ng matrycowego DNA, 0,8 mM analog kapka [m⁷G(5')ppp(5')A], 1 mM rNTPs, inhibitor RNazy 40 U, polimerazę RNA 20 U SP6, ⁷² i bufor transkrypcyjny 1×) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (Figura 4B). Uwzględnij 0,5 μM [³H]UTP do kwantyfikacji RNA na podstawie inkorporacji [³H]UTP, monitorowanej przez adsorpcję na bibule filtracyjnej DE-81. ^{Rozdział 69}
7. Przeprowadzić 1-2 μl podwielokrotności spływającej reakcji transkrypcji na 0,6% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg / ml EtBr (Figura 5B).

7. Określ zakaźność RNA i wydajność wirusa

1. Hodować komórki BHK-21 w 150 mm szalkach hodowlanych o gęstości 3 × 10⁶ komórek/szalkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
   Uwaga: Utrzymuj komórki BHK-21 w pożywce niezbędnej alfa minimal uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminą, witaminami i penicyliną/streptomycyną.
2. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml zimnego roztworu A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ i 1,5 mM KH₂PO₄). Oderwij komórki od szalek przez potraktowanie 4 ml trypsyny-EDTA (0,25%) i zbierz je przez odwirowanie w stężeniu 270 × g w wirówce stacjonarnej przez 2 minuty.
3. Zawiesić osad komórkowy z 50 ml zimnego roztworu A w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 270 × g przez 2 minuty. Powtórzyć tę procedurę mycia trzy razy; po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad komórek o gęstości 2 × 10⁷ komórek/ml w Sol A.
4. Wymieszaj 400 μl podwielokrotności zawiesiny komórkowej z 2 μg syntetycznego RNA w kuwecie o szczelinie 2 mm i niezwłocznie elektroporuj mieszaninę za pomocą elektroporatora w optymalnych warunkach elektroporacji: 980 V, długość impulsu 99 μs i 5 impulsów (Rysunek 4C).
   Uwaga: Użyj ³znakowanego H RNA zsyntetyzowanego w Protokole 6.5 bezpośrednio do elektroporacji bez dalszego oczyszczania.
5. Pozostawić elektroporowane ogniwa w temperaturze pokojowej na 10 minut i przenieść do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 600 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
6. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenie elektroporowanych komórek w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej i rozsiać 100 μl podwielokrotności każdego rozcieńczenia na monowarstwach nieelektroporowanych komórek BHK-21 (5 × 10⁵) na płytce 6-dołkowej.
7. Po 4-6 godzinach inkubacji nałożyć na komórki 0,5% agarozy w minimalnym niezbędnym pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
8. Wizualizacja ośrodków zakaźnych (blaszek) poprzez utrwalenie 7% formaldehydem i barwienie 1% fioletem krystalicznym w 5% etanolu²⁷ (ryc. 6A).
   1. Opcjonalnie: Zbadaj komórki elektroporowane RNA w 18-20 godzin po transfekcji pod kątem ekspresji białka JEV za pomocą testów immunofluorescencyjnych^27,73 (Figura 6B) i zbierz supernatanty z komórek elektroporowanych RNA w 22 i 40 godzinach po transfekcji w celu miareczkowania wirusa za pomocą testów płytki nazębnej^27,63 (Figura 6C).

Wyniki

Dla wszystkich wirusów o dodatniej nici RNA, niezawodność i skuteczność systemu odwrotnej genetyki zależy od stabilności genetycznej sklonowanego cDNA o pełnej długości, którego sekwencja jest równoważna sekwencji konsensusu wirusowego genomowego RNA. ²⁷ Rysunek 1 przedstawia pięcioetapową strategię budowy zakaźnego cDNA o pełnej długości jako BAC dla JEV SA 14-14-2²⁸: Krok 1, oczyszczanie wirusowego RNA z supernatantu hodowli komórkowej komórek BHK-21 zakażonych JEV (Figura 1A); Krok 2, synteza czterech nakładających się na siebie amplikonów cDNA (od F1 do F4) obejmujących cały genom wirusa (ryc. 1B); Krok 3, subklonowanie każdego z czterech sąsiadujących fragmentów cDNA do wektora BAC, tworząc pBAC/F1 do pBAC/F4 (figura 1C); Krok 4, modyfikacja sklonowanych cDNA w celu transkrypcji in vitro za pomocą polimerazy RNA SP6, tj. umieszczenie sekwencji promotora SP6 bezpośrednio przed końcem 5' wirusa (pBAC/F1^SP6), eliminacja istniejącego wcześniej wewnętrznego miejsca Xba I w nukleotydzie 9131 poprzez wprowadzenie mutacji cichego punktu, A⁹¹³⁴→T (pBAC/F3^KO), oraz wprowadzenie nowego sztucznego miejsca spływu Xba I bezpośrednio za wirusowym końcem 3' (pBAC/F4^RO) (Figura 1D); oraz Krok 5, montaż pełnowymiarowego SA 14-14-2 cDNA BAC, pBAC/SA_14-14-2 (Figura 1E). W tabeli 1 wymieniono oligonukleotydy użyte w tej procedurze klonowania. ²⁸

Dla budowy funkcjonalnego cDNA JEV, pierwszym ważnym krokiem jest synteza czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA przy użyciu oczyszczonego wirusowego RNA jako matrycy dla RT-PCR. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny wynik dla czterech produktów RT-PCR, które poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Żel ten wyraźnie pokazuje, że cDNA JEV o pełnej długości jest amplifikowane do czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA. Czasami reakcje RT-PCR mogą dawać jeden lub więcej dodatkowych produktów specyficznych dla wirusa lub niespecyficznych, które są w większości mniejsze niż oczekiwany produkt, ze względu na niespecyficzne wyżarzanie starterów podczas syntezy/amplifikacji cDNA. Z drugiej strony, niewielki lub żaden oczekiwany produkt RT-PCR nie zostałby wzmocniony z powodu przypadkowego zanieczyszczenia RNazą podczas izolacji wirusowego RNA lub niewłaściwej wydajności RT-PCR.

Następnym kluczowym krokiem jest klonowanie i modyfikacja częściowego lub pełnego cDNA JEV w BAC, co jest stosunkowo prostą procedurą, wykorzystującą standardowe techniki rekombinacji DNA. ⁶⁹ Rysunek 3 przedstawia reprezentatywny wynik oczyszczania klonu BAC zawierającego pełnowymiarowe cDNA JEV SA_14-14-2 poprzez prążkowanie w gradiencie CsCl-EtBr. W tym eksperymencie, po odwirowaniu przez 16 godzin w temperaturze 401 700 × g, w środku długofalowego światła ultrafioletowego widoczne są dwa odrębne prążki, tj. DNA chromosomalne E. coli powyżej i superskręcone plazmidowe DNA BAC poniżej. Minimalną objętość (~400 μl) dolnego pasma DNA BAC ostrożnie pobrano, przebijając otwór strzykawką z boku probówki. Następnie EtBr został wyekstrahowany z DNA BAC przez ekstrakcję butanolem, a DNA BAC wolny od EtBr został zagęszczony przez wytrącanie etanolu.

Ostatnim krokiem jest określenie specyficznej zakaźności syntetycznych RNA transkrybowanych in vitro z pełnej długości SA 14-14-2 BAC (pBAC/SA_14-14-2) po transfekcji RNA do komórek permisywnych (Rysunek 4). Ten etap obejmuje trzy sekwencyjne etapy: Krok 1, linearyzacja pełnowymiarowego cDNA SA 14-14-2 na końcu 3' genomu wirusa (Figura 4A); Krok 2, produkcja syntetycznych RNA ze zlinearyzowanego cDNA przez transkrypcję odpływową (Figura 4B); i etap 3, ratowanie rekombinowanych wirusów w komórkach BHK-21 transfekowanych syntetycznymi RNA (Figura 4C). Eksperymentalnie, dwa niezależne klony pBAC/SA_14-14-2 zostały zlinearyzowane z mineralizacją Xba I i potraktowane MBN w celu usunięcia czterozasadowego zwisu 5' generowanego przez mineralizację Xba I. Zlinearyzowane BAC oczyszczono przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie przez wytrącanie etanolu. Linearyzację dwóch oczyszczonych BAC wykazano na 0,8% żelu agarozowym (ryc. 5A). Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa musi być wykonana ostrożnie, aby upewnić się, że zlinearyzowane BAC są wolne od RNazy. Każdy z dwóch zlinearyzowanych BAC służył jako matryca cDNA do transkrypcji odpływowej przy użyciu polimerazy RNA SP6 w obecności analogu kapu m⁷G (5') ppp (5') A. Integralność syntetycznych RNA wykazano, przeprowadzając podwielokrotności dwóch mieszanin reakcji transkrypcji na 0,6% żelu agarozowym, wraz z referencyjną drabinką DNA 1 kb (Figura 5B). W tym prostym teście główne wyraźne prążko RNA zawsze migrowało tuż poniżej referencyjnego pasma DNA o wielkości 3 kb i wydawało się być ostre. Jednak zdegradowane RNA miałoby rozmazany wygląd na tym samym żelu.

Test centrum zakaźnego jest złotym standardem do określania specyficznej zakaźności syntetycznych RNA. Test ten przeprowadzono poprzez elektropostację komórek BHK-21 z próbkami RNA, wysiewanie równych porcji 10-krotnie seryjnie rozcieńczonych elektroporowanych komórek na 6-dołkowych płytkach zawierających naiwne komórki BHK-21 (3 × 10⁵ komórek / studzienkę) i nakładanie agarozy na monowarstwy komórek. Po inkubacji przez 4 dni, komórki, które przeżyły, utrwalono formaldehydem i wybarwiono roztworem fioletu krystalicznego w celu ilościowego określenia liczby centrów zakaźnych (blaszek), co odpowiada liczbie zakaźnych cząsteczek RNA dostarczonych do komórek (ryc. 6A). Ponieważ udowodniono, że matryca cDNA używana do transkrypcji in vitro jest niezakaźna,27 podwielokrotność mieszaniny reakcji transkrypcyjnej została bezpośrednio użyta do elektroporacji. Elektroporacja jest preferowaną metodą transfekcji RNA; alternatywnie, RNA mogą być transfekowane innymi metodami przy użyciu DEAE-dekstranu i liposomów kationowych. Elektroporacja RNA jest bardzo skuteczna, ale "wyładowanie łukowe" impulsu elektrycznego występuje rzadko, jeśli sole są obecne w reakcji elektroporacji lub jeśli kuweta elektroporacyjna jest ponownie używana. Ekspresję białek wirusowych w komórkach transfekowanych RNA badano za pomocą testów immunofluorescencyjnych przy użyciu surowicy anty-NS1 królika (Figura 6B). Wytwarzanie cząstek wirusa zgromadzonych w supernatantach komórek transfekowanych RNA analizowano za pomocą testów płytki nazębnej (ryc. 6C). Wyniki tych eksperymentów pokazują wyraźnie, że syntetyczne RNA pochodzące z cDNA są zakaźne w permisywnych komórkach BHK-21, generując wysokie miano rekombinowanych wirusów.

Oligonukleotyd Sekwencja^A (od 5' do 3') Pozycja^b biegunowość 1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT (Biblioteka Główna) 2578–2603 Antysens 1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT powiedział: TGTGTGAACTT 1–22 zmysł 1R attgcggccgccccccgt
TGTGCACGAAGAT powiedział: 2532–2553 Antysens 2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA (Międzynarodowa Organizacja Języka T 5975–6000 TGL Antysens 2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT (Szpital) Lata 1800–1821 zmysł 2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC powiedział: 5929–5950 Antysens Technologia 3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT powiedział: 9426–9451 Antysens 3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT powiedział: 5500–5521 zmysł 3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT powiedział: 9380–9401 Antysens Rozdzielczość 4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA (Międzynarodowa Organizacja Przemysłowa 10952–10977 Antysens 4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA powiedział: 9200–9221 zmysł 4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC powiedział: 10956–10977 Antysens Dodatek SP6F cataccccgcgtattcccac
dziękuję zmysł SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa powiedział: 1–14 Antysens F1F aggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG powiedział: 1–17 zmysł F1R (Klasa F1R) TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA (Biblioteka GCTTA) 638–662 Antysens X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG powiedział: 8403–8427 zmysł X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC (Jednostka Elektryczna CCGTGCTCC) 9120–9148 Antysens X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT powiedział: 9120–9148 zmysł Technologia X2R cacgtggacgagggcatgcc
TGCAG powiedział: Antysens ROF (Język Żydowski CCAGGAGGACTGGGTTACCA
Kontroler AAGCC (Kontroler Praw T 10670–10694 zmysł ROR (Wyspa Łacińsk agggcgggctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC powiedział: 10954–10977 Antysens ^aSekwencje JEV są pokazane wielkimi literami, a sekwencje BAC są oznaczone małymi literami.
^bPozycja nukleotydów odnosi się do pełnej sekwencji genomu JEV SA 14-14-2 (numer dostępu do Genbank JN604986).

Tabela 1: Oligonukleotydy używane do syntezy cDNA, amplifikacji PCR i mutagenezy BAC.

Rysunek 1. Strategia budowy pełnowymiarowego cDNA JEV SA_14-14-2 jako BAC. (A) Izolacja wirusowego RNA z cząstek JEV. Pokazano schemat ideowy genomowego RNA JEV SA 14-14-2. (B) Synteza czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA (od F1 do F4) pokrywających cały genom wirusa. (C) Subklonowanie czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA do wektora BAC, tworząc pBAC/F1 do pBAC/F4. (D) Modyfikacja sklonowanych cDNA w celu transkrypcji odpływowej in vitro. pBAC/F1^SP6 jest pochodną pBAC/F1, która zawiera sekwencję promotora SP6 przed końcem 5' wirusa. pBAC/F3^KO jest pochodną pBAC/F3, która zawiera cichą mutację punktową (A⁹¹³⁴→T, gwiazdka). pBAC/F4^RO jest pochodną pBAC/F4, która zawiera sztuczne miejsce spływu Xba I za końcem wirusa 3'. (E) Montaż pełnowymiarowego SA 14-14-2 BAC (pBAC/SA_14-14-2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Synteza czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA (od F1 do F4) obejmujących genomowy RNA o pełnej długości JEV SA_14-14-2. Cztery produkty RT-PCR ocenia się za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. M, 1 kb drabinka DNA. Oczekiwane rozmiary czterech fragmentów cDNA są wskazane na dole obrazu żelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Oczyszczanie BAC zawierającego pełnowymiarowe cDNA JEV SA14-14-2. Plazmid BAC jest izolowany z E. coli DH10B metodą lizy alkalicznej SDS i dalej oczyszczany przez pasmowanie w gradiencie CsCl-EtBr. Przedstawiono przykład gradientu CsCl-EtBr z wykorzystaniem zgrzewanej rurki polipropylenowej o średnicy 16 × 76 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Przegląd odzyskiwania zakaźnych wirusów z pełnowymiarowego cDNA JEV SA_14-14-2 złożonego w BAC. (A) Linearyzacja matrycy cDNA. Pełnowymiarowy JEV BAC jest cięty za pomocą Xba I i poddawany obróbce MBN. (B) Synteza transkryptów RNA. Zlinearyzowany cDNA jest transkrybowany przez polimerazę SP6 RNA w obecności analogu kapu m⁷G (5') ppp (5') A. (C) Odzysk syntetycznych pojazdów JEV. Transkrybowane in vitro RNA są transfekowane do komórek BHK-21 za pomocą elektroporacji, co generuje wysokie miano syntetycznego wirusa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Synteza RNA metodą transkrypcji in vitro przy użyciu pełnowymiarowego JEV BAC jako matrycy cDNA. (A) Generacja zlinearyzowanego pełnowymiarowego JEV BAC, pBAC/SA 14-14-2. Dwa niezależne klony pBAC/SA 14-14-2 (Cl.1 i Cl.2) są linearyzowane przez trawienie Xba I, a następnie traktowanie MBN. Zlinearyzowane BAC są badane za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. (B) Wytwarzanie syntetycznych RNA przez transkrypcję odpływową. Każdy z dwóch zlinearyzowanych BAC jest używany jako matryca do transkrypcji spływu polimerazy SP6 RNA. Podwielokrotności dwóch reakcji transkrypcyjnych przeprowadza się na 0,6% żelu agarozowym. M, 1 kb drabinka DNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Specyficzna zakaźność syntetycznych RNA transkrybowanych z pełnowymiarowego JEV BAC i odzyskiwanie syntetycznego wirusa. Komórki BHK-21 są pozorowane elektroporowane (Mock) lub elektroporowane transkryptami RNA pochodzącymi z każdego z dwóch niezależnych klonów pełnej długości JEV BAC (Cl.1 i Cl.2). (A) Zakaźność RNA. Komórki pokrywa się agarozą i barwi fioletem krystalicznym po 4 dniach od transfekcji. Zakaźność RNA jest określana za pomocą testów centrum zakaźnego w celu oszacowania ilości zakaźnego RNA elektroporowanego do komórek (lewy panel). Pokazane są również reprezentatywne obrazy ośrodków zakaźnych (prawy panel). (B) Ekspresja białka. Komórki są hodowane w 4-dołkowych szkiełkach komórkowych. Ekspresja białka wirusowego w komórkach elektroporowanych RNA w 20 godzinach po transfekcji (hpt) jest analizowana za pomocą testów immunofluorescencyjnych przy użyciu pierwszorzędowej surowicy króliczej anty-NS1 i drugorzędowej koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z Cy3 (czerwonej). Jądra są barwione przeciwstawnie 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (niebieskim). Obrazy immunofluorescencyjne są nakładane na odpowiadające im obrazy kontrastu różnicowego interferencyjnego. (C) Wydajność wirusa. Komórki hoduje się na szalkach hodowlanych o średnicy 150 mm. Wytwarzanie zakaźnych wirionów nagromadzonych w supernatantach hodowlanych komórek elektroporowanych RNA przy 22 i 40 hpt bada się za pomocą testów płytki nazębnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Obecny protokół został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania pełnej długości zakaźnych klonów cDNA dla dwóch różnych szczepów (CNU/LP2²⁷ i SA 14-14-2²⁸) JEV, flawiwirusa, którego funkcjonalne cDNA okazało się z natury trudne do skonstruowania i namnażania ze względu na toksyczność komórek gospodarza i niestabilność genetyczną sklonowanego cDNA. ^8,74-76 Protokół ten obejmuje trzy główne elementy: po pierwsze, maksymalizację syntezy/amplifikacji wiernej kopii cDNA wirusowego RNA przy użyciu wysokiej jakości odwrotnej transkryptazy/polimerazy DNA; po drugie, klonowanie wirusowego regionu kodującego prM-E zawierającego toksyczne sekwencje (dane niepublikowane)^74,77,78 w wektorze BAC o bardzo niskiej liczbie kopii od początkowego subklonowania cDNA do końcowych etapów składania cDNA na pełnej długości; i po trzecie, wykorzystując wektor klonujący BAC, który może pomieścić obce DNA o średnim rozmiarze 120-350 ^kb,19-21, który najwyraźniej toleruje większe wstawki DNA niż inne wektory klonujące. To podejście do klonowania będzie ogólnie stosowane do wielu innych wirusów o dodatniej nici RNA, szczególnie tych z dużym genomem RNA od ~10 do 32 kb. Wygenerowanie zakaźnego klonu cDNA jest kluczowym krokiem w rozwoju systemu odwrotnej genetyki dla wirusów RNA, zwłaszcza dla wirusów o dodatniej nici RNA, ponieważ jego genom działa jak wirusowe mRNA, które jest tłumaczone na białka przez rybosomy komórek gospodarza. W ten sposób replikacja wirusa może zostać zainicjowana przez wprowadzenie cząsteczki RNA o długości genomu pochodzącej z cDNA do podatnej komórki gospodarza. Dostępność zakaźnego klonu cDNA JEV, w połączeniu z technologią rekombinacji DNA, zwiększyła naszą wiedzę na temat różnych aspektów cyklu życia wirusa na poziomie molekularnym, takich jak ekspresja genów^73,79 i replikacja genomu. ^63,64 Również pełnowymiarowy klon cDNA JEV okazał się cennym narzędziem do rozwoju szczepionek przeciwwirusowych²⁸ i wektorów dostarczania genów. ^80,81 zł

Podobnie jak w przypadku wszystkich wirusów o dodatniej nici RNA, istnieje wiele krytycznych etapów konstruowania niezawodnego funkcjonalnego cDNA dla JEV, z którego można zsyntetyzować wysoce zakaźne RNA in vitro. Idealnie byłoby, gdyby sekwencja syntetycznych RNA transkrybowanych z klonu cDNA o pełnej długości była identyczna z sekwencją genomowego RNA wirusa, w szczególności sekwencje 5'- i 3'-końcowe, które są wymagane do zainicjowania replikacji wirusowego RNA. ^60-62 W obecnym protokole autentyczne końce 5' i 3' zapewniono poprzez umieszczenie sekwencji promotora SP6 przed pierwszym nukleotydem adeninowym genomu wirusa i umieszczenie unikalnego sztucznego miejsca restrykcyjnego Xba I za ostatnim nukleotydem tyminowym genomu wirusa, odpowiednio. Syntetyczne RNA z autentycznymi końcami 5' i 3' wyprodukowano przez spływową transkrypcję matrycy cDNA Xba I-linearyzowanej i poddanej działaniu MBN przy użyciu polimerazy SP6 RNA zagruntowanej analogiem kapu m⁷G (5') ppp (5') A. Protokół ten można modyfikować na kilka sposobów. Do transkrypcji in vitro można użyć innej polimerazy RNA bakteriofaga (np. T3 lub T7) w połączeniu z jej dobrze zdefiniowaną sekwencją promotorową. ²⁷ Jako miejsce spływu, można wykorzystać inne miejsce restrykcyjne, jeśli nie jest ono obecne w genomie wirusa i jeśli syntetyczne RNA ze zlinearyzowanego cDNA kończy się autentycznym końcem 3'. Znaczenie sekwencji nukleotydowej końca 3' wykazano przez ~10-krotny spadek zakaźności RNA, gdy syntetyczny RNA zawiera trzy lub cztery nukleotydy niezwiązane z wirusem na końcu 3'. ²⁷ W reakcji transkrypcji in vitro zarówno analog kapu m⁷G(5')ppp(5')A, jak i m⁷G(5')ppp(5')G cap analog, chociaż ten ostatni umieszcza niepowiązany dodatkowy nukleotyd G przed wirusowym końcem 5', ale ten dodatek nie zmienia zakaźności ani replikacji syntetycznego RNA. ²⁷ Ponadto usunięcie matrycy cDNA z transkryptów RNA przez trawienie DNazą I nie jest konieczne do przeprowadzenia testów zakaźności RNA, ponieważ sama matryca cDNA nie jest zakaźna. ^{27 Rozdział 27}

Technologia BAC została obecnie zastosowana do konstruowania zakaźnych klonów cDNA dla garstki wirusów o dodatniej nici RNA, a mianowicie dwóch JEV, CNU/LP2²⁷ i SA 14-14-2²⁸ (rozmiar genomu, ~11 kb); dwa wirusy dengi, BR/90²⁶ i NGC²⁹ (~11 kb); wirus wirusowej biegunki bydła, SD1 (~12 kb); ²⁵ dwa wirusy klasycznego pomoru świń, C i Paderborn (~12 kb); ²⁴ wirus choroby granicznej, Gifhorn (~12 kb); ²⁴ wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń, PL97-1/LP1 (~15 kb); ³⁰ wirus zakaźnego zapalenia żołądka i jelit, PUR46-MAD (~29 kb); ¹⁶ wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, DF-2 (~29 kb); ³² koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, Urbani (~30 kb); ⁹ koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego, EMC/2012 (~30 kb); ¹⁷ i ludzki koronawirus, OC43 (~31 kb). ³¹ Główną zaletą stosowania BAC do budowy cDNA jest wysoka stabilność genetyczna dużych, 1- lub 2-kopijnych plazmidów BAC; jednak nieodłączny charakter jego wyjątkowo niskiej liczby kopii jest również wielką wadą ze względu na bardzo niską wydajność DNA BAC i wynikające z tego zmniejszenie czystości DNA BAC w odniesieniu do chromosomalnego DNA gospodarza. W obecnym protokole wydajność DNA BAC jest maksymalizowana poprzez hodowlę E. coli DH10B przekształconego za pomocą zakaźnego BAC pBAC/SA 14-14-2 w pożywce bogatej w składniki odżywcze, 2xYT. Mimo tego wysiłku średni plon to tylko ~15 μg DNA BAC z 500 ml bulionu 2xYT. Ponadto czystość DNA BAC najlepiej osiągnąć przy użyciu wirowania w gradicynie gęstości CsCl-EtBr do oczyszczania, a nie powszechnie stosowanej izolacji plazmidu opartego na kolumnie. Należy jednak pamiętać, że bakteria E. coli przekształcona przez BAC nie powinna przerastać, ponieważ może to zagrozić stabilności genetycznej sklonowanego cDNA, a wyższy wzrost niekoniecznie prowadzi do większych plonów lub wyższej czystości DNA BAC.

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowaną, wydajną i usprawnioną metodą budowy i rozmnażania genetycznie stabilnego zakaźnego klonu cDNA o pełnej długości jako BAC dla JEV, procedura kiedyś uważana za praktycznie niemożliwą. Ta sama strategia klonowania może być również stosowana do wielu innych wirusów o dodatniej nici RNA. Ogólnie rzecz biorąc, zakaźne klony cDNA umożliwiają nam wprowadzenie różnych mutacji (np. delecji, insercji i mutacji punktowych) do genomu wirusowego RNA w celu zbadania ich funkcji biologicznych w replikacji i patogenezie wirusa. Ten oparty na cDNA system genetyki odwrotnej umożliwia opracowywanie i testowanie kandydatów na szczepionki i terapie ukierunkowanych na czynnik wirulencji określonego wirusa o dodatniej nici RNA. Ponadto ta zakaźna technologia cDNA może być również wykorzystywana jako wektor wirusowy, zdolny do ekspresji obcego genu (genów) będącego przedmiotem zainteresowania w wielu zastosowaniach w badaniach biomedycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. Klonowanie molekularne
2xYT Rosół	Sigma-Aldrich	Y2377[
3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radioactive
50 ml Tubka	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
250 ml Butelka	Beckman Coulter	356011
Agaroza	Lonza	50004
Agaroza (niska temperatura topnienia)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	Nowa Anglia BioLabs	R0152S
AvrII	Nowa Anglia BioLabs	R0174S
BamHI	Nowa Anglia BioLabs	R0136S
BsiWI	Nowa Anglia BioLabs	R0553S
BsrGI	Nowość Anglia BioLabs	R0575S
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chlorek cezu	Fisher Scientific	BP1595-1
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Racerotwórczość
DE-81 Bibuła filtracyjna	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
Mieszanka dNTP	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Bromek etydyny	Sigma-Aldrich	E7637	Toksyczna i wysoce mutagenna
kolumna filtrująca (zestaw Plasmid Maxiprep)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Lodowaty kwas octowy	Sigma-Aldrich	A6283	Drażniąca
glukoza	Sigma-Aldrich	G5400
Glikogen	Roche	10901393001
Polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England BioLabs	M0491S
Alkohol izoamylowy	Sigma-Aldrich	I9392	Łatwopalny
izopropanol	Amresco	0918	Łatwopalny
bulion LB Life	Technologies (Invitrogen)	12795-027
Chlorek litu	Sigma-Aldrich	L9650
Lizozym	Amresco	0663
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Technologie odwrotnej transkryptazy	życia (Invitrogen)	18080-044
Nukleaza fasoli mung	Nowa Anglia BioLabs	M0250S
Igła (18G, 20G)	BD	305196, 305175	Niebezpieczne biologicznie (odpady ostrych narzędzi)
NotI	New England BioLabs	R0189S
Zintegrowane technologie oligonukleotydowe	DNA	Niestandardowa synteza
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Fenol (nasycony buforem)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Toksyczny i silnie
Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Technologies (Invitrogen)	15593-031	Toksyczny i silnie
Fenol:Guanidine Isothiocyanate	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Toksyczny, i drażniący
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Octan potasu	Amresco	0698
Inhibitor RNazy	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
Zestaw rNTP	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
Uszczelniana rurka polipropylenowa (16 & razy; 76 mm)& nbsp;	Beckman Coulter	342413
SfiI	Nowa Anglia BioLabs	R0123S
Sma I	Nowa Anglia BioLabs	R0141S
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889
Dodecylosiarczan sodu	Amresco	0227
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 Polimeraza RNA	New England BioLabs	M0207S Kolumna
wirowa (zestaw do miniprzygotowania plazmidu)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
	HSW NORM-JECT	4200.000V0
Ligaza DNA T4	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (drożdże)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>2. Hodowla komórkowa
Alpha Minimal Essential	Medium Life Technologies (Gibco)	12561-049
Probówka stożkowa (50 ml)	VWR	21008-242
Crystal Violet	Naczynie hodowlane Sigma-Aldrich	C0775
(150 mm)	TPP	93150
Kuweta (odstęp 2 mm)	Aparat Harvarda	450125
Surowica bydlęca płodu	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635	Toksyczna i rakotwórcza
glutamina	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicylina/Streptomycyna	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P3911
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P9791
Płytka sześciodołkowa	TPP	92006
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Technologie życia ( Gibco)	25200-056
Witaminy	Sigma-Aldrich	M6895
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
3. Sprzęt
Agaroza Żel Elektroforeza	Mupid	MPDEXU-01
CO2 Inkubator	Thermo Scientific	Heracell 150i
Wirówka stołkowa	Electroporator	Thermo Scientific ST16R
	Aparatura Harvardu	ECM 830
Długofalowe lampy ultrafioletowe (ręczne)	UVP	UVGL-58
Wirówka stołowa	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Life Technologies (Biosystemy stosowane)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Przemysł naukowy	G-560
Kąpiel wodna	Jeio Tech	WB-10E