Artykuł metodologiczny

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53164

⸱

29 grudnia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Streszczenie

Genetyka odwrócona, podejście do całkowitego ratowania zakaźnego wirusa ze sklonowanego cDNA, zrewolucjonizowała dziedzinę wirusów o dodatniej nici RNA, których genomy mają taką samą polaryzację jak mRNA komórkowe. System genetyki odwrotnej oparty na cDNA jest przełomową metodą, która umożliwia bezpośrednią manipulację genomowym RNA wirusa, generując w ten sposób rekombinowane wirusy do badań molekularnych i genetycznych zarówno elementów wirusowego RNA, jak i produktów genowych w replikacji i patogenezie wirusa. Stanowi również cenną platformę, która umożliwia opracowywanie genetycznie zdefiniowanych szczepionek i wektorów wirusowych do dostarczania obcych genów. Jednak w przypadku wielu wirusów o dodatniej nici RNA, takich jak wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV), sklonowane cDNA są niestabilne, co stanowi główną przeszkodę w budowie i rozmnażaniu funkcjonalnego cDNA. W niniejszym raporcie opisano strategiczne rozważania związane z tworzeniem i amplifikacją genetycznie stabilnego zakaźnego cDNA JEV o pełnej długości jako bakteryjnego sztucznego chromosomu (BAC) przy użyciu następujących ogólnych procedur eksperymentalnych: izolacja wirusowego RNA, synteza cDNA, subklonowanie i modyfikacja cDNA, składanie cDNA o pełnej długości, linearyzacja cDNA, in vitro Synteza RNA i odzyskiwanie wirusa. Protokół ten zapewnia ogólną metodologię mającą zastosowanie do klonowania pełnej długości cDNA dla szeregu wirusów o dodatniej nici RNA, w szczególności tych o genomie o długości >10 kb, do wektora BAC, z którego zakaźne RNA mogą być transkrybowane in vitro za pomocą polimerazy RNA bakteriofaga.

Wprowadzenie

Dla wirusologów RNA, pojawienie się technologii rekombinacji DNA pod koniec lat siedemdziesiątych umożliwiło konwersję wirusowych genomów RNA na klony cDNA, które następnie mogły być rozmnażane jako plazmidy w bakteriach do genetycznej manipulacji wirusami RNA. 1 Pierwszym wirusem RNA, który został sklonowany molekularnie, był bakteriofag Qβ, wirus o dodatniej nici RNA, który infekuje Escherichia coli. Plazmid zawierający kompletną kopię cDNA genomowego RNA Qβ spowodował powstanie zakaźnych fagów Qβ po wprowadzeniu do E. coli. 2 Wkrótce potem technikę tę zastosowano do wirusa polio, wirusa o dodatniej nici RNA u ludzi i zwierząt. Plazmid zawierający cDNA genomowego RNA wirusa polio o pełnej długości był zakaźny po transfekacji do komórek ssaków i zdolny do wytwarzania zakaźnych wirionów. 3 W tym podejściu "wystrzelonym przez DNA" sklonowane cDNA powinny być transkrybowane wewnątrzkomórkowo w celu zainicjowania replikacji wirusowego RNA; Nie jest jednak jasne, w jaki sposób inicjowana jest transkrypcja i w jaki sposób transkrypty są przetwarzane do prawidłowej sekwencji wirusa. Obawy te doprowadziły do opracowania alternatywnego podejścia "uruchamianego przez RNA", w którym kompletna kopia cDNA genomu wirusowego RNA jest klonowana pod promotorem rozpoznawanym przez E. coli lub polimerazę RNA faga w celu produkcji syntetycznych RNA in vitro o zdefiniowanych końcach 5' i 3', które przechodzą pełny cykl replikacji wirusa po wprowadzeniu do komórek gospodarza. 4,5 Pierwszy sukces w zastosowaniu tego podejścia odnotowano w przypadku wirusa mozaiki bromu,6,7 wirusa o dodatniej nici RNA roślin. Od tego czasu podejście oparte na RNA zostało opracowane dla szerokiej gamy wirusów o dodatniej nici RNA, w tym kaliciwirusów, alfawirusów, flawiwirusów, arteriwirusów i koronawirusów. 1,4,5,8

Zarówno w systemach genetyki odwrotnej uruchamianych przez DNA, jak i RNA, budowa pełnowymiarowego klonu cDNA jest kluczem do generowania zakaźnego DNA lub RNA wirusów o dodatniej nici RNA, ale staje się poważnym wyzwaniem technicznym wraz ze wzrostem rozmiaru genomu wirusa. 9-17 W szczególności duży genom RNA o wielkości ~10-32 kb przedstawia trzy główne przeszkody w klonowaniu funkcjonalnego cDNA o pełnej długości. 18 Pierwszą trudnością jest synteza wiernej kopii cDNA, ponieważ wierność RT-PCR jest odwrotnie proporcjonalna do długości wirusowego RNA. Drugą przeszkodą jest obecność potencjalnie toksycznych sekwencji, ponieważ długie cząsteczki RNA z większym prawdopodobieństwem zawierają nieoczekiwane sekwencje, które mogą sprawić, że fragment cDNA w plazmidach stanie się niestabilny u E. coli. Trzecią i najważniejszą kwestią jest dostępność odpowiedniego wektora, ponieważ trudno jest znaleźć wektor klonujący, który może pomieścić wstawkę cDNA wirusa o wielkości >10 kb. W ciągu ostatnich trzech dekad bariery te zostały pokonane dzięki kilku postępom w enzymologii, metodologii i wektorologii. 1,4,5,8 Spośród nich najbardziej obiecującym i innowacyjnym osiągnięciem jest klonowanie wirusów o dużej dodatniej nici RNA jako zakaźnych sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC). Wektor BAC to plazmid klonujący o niskiej liczbie kopii (1-2 kopie / komórkę) oparty na czynniku płodności E. coli, o średnim rozmiarze wstawki DNA ~ 120-350 kb. 19-21 Fragment DNA jest wprowadzany do wektora BAC w podobny sposób, jak klonowanie do ogólnych wektorów klonowania; powstałe w ten sposób klony BAC są stabilne przez wiele pokoleń u E. coli.22,23 Do tej pory technologia BAC była wykorzystywana do tworzenia zakaźnych klonów cDNA dla >10 członków trzech rodzin wirusów o dodatniej nici RNA, tj. Flaviviridae,24-29 Arteriviridae,30 i Coronaviridae. 9,16,17,31,32

Na przykładzie wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV), niniejsza praca przedstawia szczegółowe procedury, które mogą być użyte do skonstruowania genetycznie stabilnego zakaźnego BAC o pełnej długości dla różnych wirusów o dodatniej nici RNA. JEV to odzwierzęcy flawiwirus33, który jest przenoszony w naturze między ptakami, świniami i innymi kręgowcami przez wektory komarów. 34,35 U ludzi zakażenie JEV może powodować ciężką, często śmiertelną chorobę neurologiczną Japońskie Zapalenie Mózgu (JE),36 która występuje w Azji i częściach Zachodniego Pacyfiku,37,38 z szacowaną roczną częstością występowania ~50 000-175 000 przypadków klinicznych. 39,40 Genom JEV jest ~11-kb, jednoniciową cząsteczką RNA o dodatnim sensie i składa się z pojedynczej otwartej ramki odczytu (ORF) otoczonej dwoma regionami niekodującymi (NCR) na końcach 5' i 3'. 41,42 ORF koduje poliproteinę, która jest rozszczepiana przez proteazy gospodarza i wirusa w celu wytworzenia 10 pojedynczych białek, oznaczonych jako C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5 w kierunku N- do C-końcowym. 34,43,44 Również rozszerzona forma NS1 (NS1') jest wyrażana przez -1 rybosomalne przesunięcie ramki w kodonach 8-9 NS2A. 45,46 Spośród tych 11 białek, trzy białka strukturalne (C, prM i E) są niezbędne do tworzenia zakaźnych wirionów,47,48 a pozostałe osiem białek niestrukturalnych (NS1 do NS5 i NS1') ma kluczowe znaczenie dla replikacji wirusowego RNA,49-51 składania cząstek,52-56 i unikania odporności wrodzonej. 57-59 Zarówno 5', jak i 3' NCR zawierają konserwatywne sekwencje pierwszorzędowe i tworzą drugorzędowe / trzeciorzędowe struktury RNA,60-62, które są ważne dla modulacji replikacji wirusowego RNA. Pytanie 63,64

TGL

Ten protokół opisuje narzędzia, metody i strategie generowania pełnowymiarowego zakaźnego BAC JEV SA14-14-2. 28 Ten funkcjonalny klon BAC zawiera kompletną kopię cDNA genomowego RNA JEV,65 która jest objęta promotorem polimerazy RNA SP6 przed końcem wirusa 5' i unikalnym miejscem restrykcyjnym Xba I za końcem wirusa 3' do transkrypcji in vitro. Ta technologia BAC ma zastosowanie do konstruowania w pełni funkcjonalnego klonu molekularnego cDNA dla szeregu wirusów o dodatniej nici RNA.

Protokół

Uwaga: Rysunek 1 przedstawia strategię budowy pełnowymiarowego zakaźnego cDNA JEV jako BAC. 28 Tabela 1 zawiera wykaz oligonukleotydów stosowanych w niniejszym protokole. 28

1. Ekstrakcja wirusowego RNA z cząstek JEV w supernatantach hodowli komórkowych

  1. Zacznij od pożywki do hodowli komórkowej zawierającej JEV SA 14-14-2, żywego wirusa szczepionki JE, który wymaga zabezpieczenia biologicznego na poziomie 2 bezpieczeństwa.
    Uwaga: Miano wirusa wynosi około 1-3 × 106 jednostek tworzących płytki nazębne/ml.
  2. Przed rozpoczęciem pracy z JEV SA 14-14-2 weź udział w szkoleniu w zakresie bezpieczeństwa biologicznego niezbędnym dla wszystkich standardowych praktyk mikrobiologicznych, sprzętu bezpieczeństwa i obiektów laboratoryjnych.
  3. Oczyść wirusowe RNA z podwielokrotności pożywki do hodowli komórkowej zawierającej wirusa za pomocą jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny66 (Figura 1A).
    1. Dodać 600 μl odczynnika jednofazowego do 200 μl supernatantu do hodowli w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml. Homogenizować mieszaninę, energicznie potrząsając ręcznie probówką przez 30 sekund i inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Do homogenizowanej próbki dodać 160 μl chloroformu. Dokładnie wymieszaj, energicznie potrząsając ręcznie probówką przez 15 sekund i pozostawiając ją na 2-3 minuty w temperaturze RT.
    3. Odwirować całkowity lizat o stężeniu 13 400 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, co prowadzi do rozdzielenia dwóch faz ciekłych, tj. dolnej fazy organicznej i górnej fazy wodnej. Przenieść górną fazę wodną (mniej niż 200 μl) zawierającą RNA do nowej mikroprobówki.
    4. Wytrącić RNA, dodając 1 μl 5 μg/μl glikogenu i 400 μl 100% izopropanolu i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odwirować mieszaninę w temperaturze 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA 1 ml 75% etanolu przez pulsacyjne wirowanie trzy do pięciu razy i odwirować w temperaturze 13 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Suszyć na powietrzu granulki RNA przez 10 minut i rozpuścić je w 40 μldH2O. Wyekstrahowany RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Zsyntetyzuj zestaw czterech nakładających się na siebie fragmentów cDNA (od F1 do F4) obejmujących cały genomowy RNA wirusa za pomocą odwrotnej transkrypcji (RT)-PCR

  1. Przeprowadzić reakcję RT o stężeniu 20 μl z 10 μl podwielokrotnością oczyszczonego wirusowego RNA jako matrycą i zmodyfikowaną formą odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki mysiej Moloneya. 67 Rozdział
    1. Przygotuj mieszaninę o objętości 13 μl zawierającą 10 μl oczyszczonego RNA, 1 μl 10 mM mieszaniny dNTP, 1 μl 4 pmol/μl startera i 1 μl dH2O. Użyj startera specyficznego dla fragmentu dla każdej reakcji RT: 1RT dla F1, 2RT dla F2, 3RT dla F3 i 4RT dla F4.
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 5 minut, umieścić na lodzie na 1 minutę, a następnie szybko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
    3. Dodać 4 μl buforu 5× RT, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy 40 U/μl i 1 μl 200 U/μl odwrotnej transkryptazy. Mieszać, pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy.
    4. Pozostawić reakcję w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę, a następnie inaktywować termicznie próbkę w temperaturze 70 °C przez 15 minut. Zsyntetyzowaną pierwszą nić cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Wykonaj reakcję PCR o objętości 100 μl z 5 μl podwielokrotności inaktywowanej termicznie reakcji RT jako matrycy i termostabilnej polimerazy DNA68 o wysokiej wierności (Figura 1B).
    1. Przygotować 100 μl reakcji PCR na lodzie, zawierającej 5 μl reakcji RT, 20 μl buforu 5× PCR, 4 μl 10 mM mieszaniny dNTP, 5 μl 10 μM startera do przodu, 5 μl 10 μM startera odwrotnego, 1 μl 2 U/μl polimerazy DNA, i 60 μl dH2O. Użyj pary starterów specyficznych dla fragmentu dla każdej reakcji PCR: 1F+1R dla F1 (2573 pz), 2F+2R dla F2 (4171 pz), 3F+3R dla F3 (3922 pz) i 4F+4R dla F4 (1798 pz).
    2. Delikatnie wymieszaj, obracając probówkę palcem trzy do pięciu razy i krótko odwiruj, aby zebrać jej zawartość na dnie.
    3. Rozpocznij cykl termiczny od początkowego etapu denaturacji trwającego 30 sekund w temperaturze 98 °C, a następnie 25-30 cykli z następującym profilem PCR: 10 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 60 °C i 1-2 minuty (30 s/kb) w temperaturze 72 °C. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
  3. Przeprowadzić 2-5 μl podwielokrotności każdej reakcji PCR na 0,8% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg/ml bromku etydyny (EtBr) (ryc. 2).
    UWAGA: EtBr jest silnym mutagenem i wymaga noszenia fartuchów laboratoryjnych, okularów ochronnych i rękawic oraz zachowania szczególnej ostrożności podczas jego użytkowania, przechowywania i utylizacji.

3. Subklonuj każdy z czterech fragmentów cDNA (od F1 do F4) do wektora BAC, aby utworzyć pBAC/F1 do pBAC/F4 za pomocą technik klonowania molekularnego

  1. Trawić wektor i wstawiać DNA z dwiema odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi, w następujący sposób:
    1. Przeprowadzić sekwencyjne trawienie pBAC/PRRSV/FL (wektor)30, pochodnej plazmidu pBeloBAC11 (7507 pz, numer dostępu GenBank U51113), z Pme I i Not I w całkowitej objętości 60 μl (zawierającej ~500 ng DNA, 10 enzymu U, 1x bufor do wytrawiania i 1× BSA) w temperaturze 37 °C przez 12-15 godzin, co daje fragment wektora 15426-bp.
    2. Przeprowadzić sekwencyjne trawienie każdego z czterech amplikonów cDNA (wstawka) z Sma I i Not I w łącznej objętości 60 μl (zawierającej ~1 μg DNA, 20 U enzymu, 1× buforu do wytrawiania i 1× BSA) w temperaturze 25 °C (Sma I) lub 37 °C (Not I) przez 12-15 godzin, co daje następujące fragmenty wstawki o pożądanym rozmiarze: F1 (2559 pz), F2 (4157 pz), F3 (3908 pz) i F4 (1784 pz).
  2. Oczyść żądany wektor i wprowadź fragmenty DNA przez ekstrakcję żelu.
    1. Rozdzielić podwójnie strawione produkty na 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia zawierającym 0,5 μg/ml EtBr. Wytnij pasmo pożądanego fragmentu DNA z minimalną ilością agarozy (zwykle ~200 μl) w długofalowym świetle ultrafioletowym.
    2. Dodać równą objętość buforu TEM (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA i 10 mM MgCl2) do wyciętej agarozy w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml. Inkubować próbkę w temperaturze 72 °C przez 10-15 minut, z wirowaniem co 2-3 minuty, aż do całkowitego stopienia agarozy.
    3. Dodać równą objętość wstępnie podgrzanego fenolu nasyconego buforem, energicznie wirować przez 1 minutę i odwirować przy 13 400 × g przez 10 minut przy RT.
      Uwaga: Mieszanina rozdziela się na dolną fazę organiczną i górną fazę wodną. Przenieś górną fazę wodną zawierającą DNA do nowej mikroprobówki.
    4. Dodać równą objętość chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1), wirować przez 1 minutę i odwirować przy 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść górną fazę wodną do nowej mikroprobówki.
    5. Dodać 0,5 μl 10 μg/μl tRNA drożdży, 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu. Trzymaj mieszaninę na lodzie przez 20 minut.
    6. Odwirować mieszaninę przy 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i przepłukać osad DNA 1 ml 70% etanolu przez pulsacyjne wirowanie trzy do pięciu razy i odwirowanie przy 13 400 × g przez 10 minut.
    7. Suszyć na powietrzu osad DNA przez 10 minut i rozpuścić go w 20 μl buforu TE (10 mM Tris-Cl i 1 mM EDTA [pH 7,6]).
  3. Zwiąż żądany wektor i wstaw fragmenty DNA za pomocą ligazy DNA T4.
    1. Ustaw 20 μl reakcji ligacji zawierającej 50-100 ng wektorowego DNA, ~3-krotny molowy nadmiar wstawienia DNA, 400 U ligazy DNA T4 i 1× bufor ligacyjny. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze 16 °C przez 12–15 godzin.
      Uwaga: Uwzględnij równolegle reakcję kontroli negatywnej, tj. tylko wektor bez wkładki.
    2. Wykonaj cztery oddzielne ligacje, z których każda łączy fragment 15426-bp Pme I-Not I pBAC/PRRSV/FL z 2559-bp (dla F1), 4157-bp (dla F2), 3908-bp (dla F3) lub 1784-bp (dla F4) fragmentu Sma I-Not I jednego z czterech amplikonów cDNA, aby wygenerować subklony pBAC/F1 do pBAC/F4.
  4. Przekształć zligowane DNA w E. coli DH10B metodą CaCl2-szok cieplny.
    1. Pobrać 100 μl podwielokrotności właściwych komórek DH10B69 poddanych działaniu CaCl2, przechowywanych w temperaturze -80 °C i rozmrozić je na lodzie.
      Uwaga: Użyj 100 μl komórek na transformację.
    2. Dodać 10 μl podwielokrotności reakcji ligacji DNA do 100 μl rozmrożonych komórek w mikroprobówce o pojemności 1,7 ml, delikatnie wymieszać, stukając w probówkę i trzymać na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok termiczny mieszaniny DNA-komórek przez 45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, umieszczenie na lodzie na 2 minuty, a następnie dodanie 900 μl bulionu LB podgrzanego do temperatury regulowanej.
    4. Inkubować komórki poddane szokowi cieplnemu w temperaturze 35 °C przez 1 godzinę, wytrząsając przy 225–250 obr./min.
    5. Rozprowadzić od 50 do 200 μl podwielokrotności hodowanych komórek na płytkach agarowych LB zawierających 10 μg/ml chloramfenikolu (Cml). Trzymaj talerze w temperaturze pokojowej, prawą stroną do góry, aż wyschną.
    6. Odwrócić płytki do góry nogami i inkubować w temperaturze 35 °C przez 15 godzin.
  5. Odzyskaj sklonowane DNA BAC z komórek gospodarza za pomocą metody oczyszczania opartej na kolumnach (Figura 1C).
    1. Wybrać od sześciu do ośmiu kolonii bakteryjnych z płytek agarowych LB-Cml i zaszczepić je w 3 ml bulionu 2xYT zawierającego 10 μg/ml Cml. Inkubować kultury w temperaturze 35 °C przez 10 godzin, energicznie wstrząsając (225-250 obr./min).
    2. Wyizolować rekombinowane DNA BAC z 1-1,5 ml kultur bakteryjnych za pomocą kolumn wirowych, zgodnie z zaleceniami producenta. 70 Eluować wyekstrahowane DNA (zwykle 100-200 ng) w 20 μl buforu TE.
    3. Przeprowadzić dwie analityczne mineralizacje enzymem restrykcyjnym izolowanych BAC przez ~6 godzin w całkowitej objętości 10 μl, jedno w celu zidentyfikowania obecności wektora za pomocą właściwej wstawki przy użyciu tych samych enzymów, które użyto do klonowania (patrz protokół 3.1), a drugie w celu zbadania integralności sklonowanych BAC za pomocą odpowiedniego enzymu (np. Bgl powiedział: II, Nco I lub Pst I), generując unikatowy wzór fragmentu ograniczenia.
    4. Rozmnażać prawidłowo sklonowane BAC poprzez zaszczepienie 500 μl dodatnich kultur bakteryjnych (z protokołu 3.5.1) w 500 ml pożywki 2xYT-Cml i hodowlę inokulum przez 6 godzin w temperaturze 35 °C, wytrząsając z prędkością 225-250 obr./min. Oczyścić DNA BAC (zwykle 10-20 μg) z kultury o objętości 500 ml za pomocą kolumn filtrujących, zgodnie z zaleceniami producenta. 71
      Uwaga: Początkowe cztery subklony BAC, z których każdy zawiera fragment cDNA genomowego RNA JEV, mogą okazać się mieć jedną lub więcej niepożądanych mutacji w porównaniu z sekwencją konsensusugenomu wirusa 42 (która służy jako sekwencja referencyjna). Każda taka mutacja musi zostać skorygowana za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na PCR przed złożeniem pełnowymiarowego cDNA JEV. 27 Rozdział 27

4. Stwórz pełnowymiarowe cDNA JEV z 5' Promotorem SP6 i 3' Miejscem Spływu

  1. Dokonać trzech modyfikacji genetycznych (patrz poniżej Protokoły 4.1.1-4.1.3) w sklonowanych cDNA, aby umożliwić transkrypcję in vitro RNA o długości genomu z autentycznymi końcami 5' i 3' genomu wirusa.
    1. Wprowadzić promotor SP6 bezpośrednio przed końcem 5' genomu wirusa przez nakładanie się rozszerzeń PCR (Figura 1D, pBAC / F1SP6).
      1. Amplifikować dwa nakładające się na siebie fragmenty DNA za pomocą pierwszego standardowego PCR pBAC/F1 z dwiema parami starterów SP6F+SP6R (wielkość produktu, 173 pz) i F1F+F1R (wielkość produktu, 676 pz), każdy w reakcji 50 μl zawierającej 1 μl matrycy DNA (~200 pg/μl), 10 μl buforu 5× PCR, 2 μl 10 mM dNTPs, po 2,5 μl starterów 10 μM do przodu i do tyłu, 0,5 μl polimerazy DNA 2 U/μl68 i 31,5 μl dH2O. Wykonać PCR stosując następujący profil cykliczny: 98 °C przez 30 sekund i 25 cykli 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund, i 72 °C przez 20 sek.
      2. Oczyść żelowo dwa fragmenty DNA amplifikowane PCR po uruchomieniu każdego z dwóch produktów PCR na 1,5% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia, jak opisano w Protokole 3.2.
      3. Połączyć dwa oczyszczone żelem fragmenty DNA za pomocą drugiego PCR fuzyjnego przy użyciu najbardziej zewnętrznych starterów SP6F+F1R (wielkość produktu, 821 pz) w reakcji 100 μl, w tym po 1 μl każdy z dwóch oczyszczonych fragmentów DNA (~100 pg/μl), 20 μl buforu 5× PCR, 4 μl 10 mM dNTP, po 5 μl 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 1 μl 2 U/μL polimerazy DNA,68 i 63 μldH2O. Użyj następującego profilu cykli termicznych: 98 °C przez 30 sekund i 25 cykli po 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund.
      4. Oczyścić żelem stopiony amplikon PCR z 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, zgodnie z opisem w Protokole 3.2.
      5. Wykonaj pięcioetapową procedurę klonowania opisaną w protokołach 3.1-3.5 w celu podwiązania fragmentu 760-bp Pac I-BsiW I oczyszczonego żelem stopionego amplikonu PCR z 9532-bp Pac I-BsiW I fragmentem pBAC/F1 w celu wygenerowania pBAC/F1SP6.
    2. Usuń istniejące, wewnętrzne miejsce Xba I w nukleotydzie 9131, wprowadzając cichą mutację punktową (A9134→T) poprzez nakładanie się rozszerzeń PCR (Figura 1D, pBAC / F3KO).
      1. Amplifikować dwa nakładające się na siebie fragmenty DNA za pomocą pierwszego standardowego PCR pBAC/F3 z dwiema parami starterów X1F+X1R (wielkość produktu, 746 pz) i X2F+X2R (wielkość produktu, 316 pz) w reakcji 50 μl w warunkach eksperymentalnych opisanych w Protokole 4.1.1.1.
      2. Oczyść żelowo dwa fragmenty DNA amplifikowane PCR po separacji elektroforetycznej na 1,5% żelach agarozowych o niskiej temperaturze topnienia, jak opisano w Protokole 3.2.
      3. Połączyć dwa oczyszczone żelem fragmenty DNA za pomocą drugiego termojądrowego PCR przy użyciu najbardziej zewnętrznych starterów X1F+X2R (wielkość produktu, 1033 pz) w reakcji 100 μl w warunkach eksperymentalnych opisanych w Protokole 4.1.1.3.
      4. Oczyścić żelem stopiony amplikon PCR z 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, jak wyszczególniono w Protokole 3.2.
      5. Wykonaj pięcioetapową procedurę klonowania opisaną w protokołach 3.1-3.5 w celu podwiązania fragmentu 949-bp Avr II-Not I oczyszczonego żelem stopionego amplikonu PCR z fragmentami 16245-bp Not I-BsiW I i 2141-bp BsiW I-Avr II pBAC/F3 w celu wytworzenia pBAC/F3KO.
    3. Zaprojektuj nowe sztuczne miejsce spływu Xba I tuż za końcem 3' genomu wirusa za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce opartej na PCR (Figura 1D, pBAC / F4RO).
      1. Wygeneruj jeden fragment DNA metodą PCR pBAC/F4 ze starterami ROF+ROR (wielkość produktu, 324 pz) w reakcji 100 μl zawierającej 1 μl matrycowego DNA (~200 pg/μl), 20 μl buforu 5× PCR, 4 μl 10 mM dNTP, po 5 μl po 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 1 μl 2 U/μl polimerazy DNA, 68 i 64 μl dH2O. Wykonaj PCR przy użyciu następującego profilu cyklicznego: 98 °C przez 30 sekund i 25 cykli po 98 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 15 sekund.
      2. Oczyść żelem fragment DNA amplifikowany metodą PCR z 1% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, jak wyszczególniono w Protokole 3.2.
      3. Wykonaj pięcioetapową procedurę klonowania opisaną w protokołach 3.1-3.5 w celu podwiązania fragmentu 283-bp Sfi I-Not I oczyszczonego żelem amplikonu PCR z fragmentem 16933-bp Sfi I-Not I pBAC/F4 w celu wytworzenia pBAC/F4RO.
  2. Złóż zestaw czterech zmodyfikowanych, nakładających się na siebie cDNA w jeden BAC SA 14-14-2 o pełnej długości (pBAC/SA14-14-2), łącząc się w trzech naturalnych miejscach restrykcyjnych (BsrG I, BamH I i Ava I) w sposób sekwencyjny, stosując pięcioetapowe procedury klonowania opisane w protokołach 3.1-3.5 (Rysunek 1E): F1SP6 → F1SP6F2 (zastępując fragment BsrG I-Not I pBAC/F1SP6 z fragmentem pBAC/F2) → F1SP6F2F3KO (poprzez zastąpienie fragmentu BamH I-Not I pBAC/F1SP6F2 fragmentem pBAC/F3KO) → F1SP6F2F3KOF4RO (poprzez zastąpienie fragmentu Ava I-Not I pBAC/F1SP6F2F3KO fragmentem pBAC/F4RO).

5. Przygotuj Maxi-prep o wysokiej czystości pełnometrażowego SA 14-14-2 BAC

  1. Hodować pojedynczą kolonię E. coli DH10B przenoszącą pBAC/SA 14-14-2 w 3 ml bulionu 2xYT zawierającego 10 μg/ml Cml przez 10 godzin w temperaturze 35 °C z wytrząsaniem przy 225-250 obr./min, a następnie zwiększyć skalę przez zaszczepienie 500 μl 10-godzinnej kultury bakteryjnej w 500 ml pożywki 2xYT-Cml i hodowanie inokulum przez 6 godzin w temperaturze 35 °C z energicznym wstrząsaniem.
  2. Odwirować kulturę bakteryjną w dwóch butelkach o pojemności 250 ml w temperaturze 3,107 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić każdą osadkę w 30 ml roztworu GTE (50 mM glukozy, 25 mM Tris-Cl i 10 mM EDTA [pH 8,0]), a następnie dodać 500 μl lizozymu o stężeniu 60 mg/ml. Inkubować dwie zawiesiny komórkowe na lodzie przez 10 minut.
  3. Dodać 60 ml świeżo przygotowanego roztworu do lizy (0,2 N NaOH i 1% SDS) do każdej zawiesiny komórek, dobrze wymieszać do uzyskania klarowności i utrzymywać lizaty w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  4. Dodać 45 ml roztworu neutralizującego (100 ml, składającego się z 60 ml 5 M octanu potasu, 11,5 ml lodowatego kwasu octowego i 28,5 mldH2O) do każdej butelki, dokładnie wymieszać przez odwrócenie butelek i inkubować zobojętnione lizaty na lodzie przez 10 minut.
  5. Odwirować zobojętnione lizaty w temperaturze 18,566 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant z obu butelek do dwóch nowych butelek o pojemności 250 ml; do każdej dodać 0,6 objętości 100% izopropanolu i trzymać je na lodzie przez 20 minut.
  6. Odwirować osady w temperaturze 18 566 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić każdą osadkę w 5 ml buforu TE, połączyć je w probówce o pojemności 50 ml (łącznie 10 ml) i wytrącić RNA, dodając równą objętość 5 M chlorku litu. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 10 minut.
  7. Odwirować osad RNA w temperaturze 14,636 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 250 ml i wytrącić DNA, dodając 2 objętości 100% izopropanolu. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 20 minut.
  8. Odwirować osad DNA w temperaturze 18 566 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad DNA w 9,5 ml buforu TE (pH 7,6) i dodać 10 g chlorku cezu (CsCl) i 390 μl 10 mg/ml EtBr.
  9. Załadować roztwór DNA-CsCl-EtBr do zamykanej rurki polipropylenowej o średnicy 16 × 76 mm za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 18 G. Wirować uszczelniony gradient CsCl w ultrawirówce o masie 401 700 × g przez 16 godzin w temperaturze 20 °C (rysunek 3).
  10. Pobrać pasmo DNA plazmidu BAC z gradientu CsCl za pomocą igły 18 G, aby utworzyć otwór wentylacyjny w górnej części gradientu i strzykawki wyposażonej w igłę 20 G, aby pobrać DNA BAC z boku gradientu.
  11. Dodać 2,5 objętościdH2nasyconego O-o-butanolem do próbki DNA BAC barwionego EtBr i wymieszać przez wirowanie. Odwirować mieszaninę o sile 13 400 × g przez 1 minutę i przenieść dolną fazę wodną do nowej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Powtórz tę procedurę sześć razy.
  12. Wytrącić DNA BAC wolne od EtBr, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu do DNA BAC ekstrahowanego butanolem i inkubując przez 10 minut na lodzie. Odwirować osad o sile 13 400 × g przez 10 minut, przemyć osad DNA 1 ml 70% etanolu i ponownie zagnieździć przez odwirowanie.
  13. Wysuszyć na powietrzu osad DNA przez 10 minut i rozpuścić go w 200 μl buforu TE (pH 7,6).
    Uwaga: Rysunek 4 przedstawia przegląd systemu odwrotnej genetyki dla JEV SA14-14-2.

6. Transkrybuj syntetyczne RNA in vitro z linearyzowanego JEV BAC DNA

  1. Przeprowadzić wytrawianie enzymem restrykcyjnym na dużą skalę pBAC/SA 14-14-2 z Xba I w całkowitej objętości 100 μl (zawierającej 3 μg DNA, 60 enzymu U, 1× buforu do wytrawiania i 1× BSA) w temperaturze 37 °C przez 12-15 godzin. Zbadać 3 μl podwielokrotności reakcji trawienia na 0,8% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg/ml EtBr.
  2. Kontynuować inkubację reakcji trawienia z 25 U nukleazy fasoli mung (MBN) w temperaturze 30 °C przez 2 godziny (ryc. 4A).
  3. Doprowadzić objętość próbki strawionej przez Xba I, poddanej działaniu MBN do 300 μl za pomocądH2O. Do rozcieńczonej próbki dodać równą objętość alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1), energicznie wirować przez 1 minutę, wirować w temperaturze 13 400 × g przez 10 minut, a następnie przenieść górną fazę wodną do nowej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać równą objętość chloroformu i powtórzyć procedurę ekstrakcji.
  4. Odzyskać wyekstrahowany fenolem/chloroformem, zlinearyzowany BAC przez wytrącanie etanolu: Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu i inkubować na lodzie przez 20 minut. Odwirować osad o sile 13 400 × g przez 10 minut, przepłukać osad DNA 1 ml 70% etanolu, a następnie odwirować go przez ponowne odwirowanie.
  5. Wysuszyć na powietrzu osad DNA przez 10 minut i rozpuścić go w 30 μl dH2O. Zbadać 1 μl podwielokrotności odzyskanego BAC na 0,8% żelu agarozowym z 0,5 μg/ml EtBr (ryc. 5A).
  6. Wykonaj spływową transkrypcję zlinearyzowanego DNA BAC w całkowitej objętości 25 μl (zawierającej ~ 200 ng matrycowego DNA, 0,8 mM analog kapka [m7G(5')ppp(5')A], 1 mM rNTPs, inhibitor RNazy 40 U, polimerazę RNA 20 U SP6, 72 i bufor transkrypcyjny 1×) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (Figura 4B). Uwzględnij 0,5 μM [3H]UTP do kwantyfikacji RNA na podstawie inkorporacji [3H]UTP, monitorowanej przez adsorpcję na bibule filtracyjnej DE-81. Rozdział 69
  7. Przeprowadzić 1-2 μl podwielokrotności spływającej reakcji transkrypcji na 0,6% żelu agarozowym zawierającym 0,5 μg / ml EtBr (Figura 5B).

7. Określ zakaźność RNA i wydajność wirusa

  1. Hodować komórki BHK-21 w 150 mm szalkach hodowlanych o gęstości 3 × 106 komórek/szalkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    Uwaga: Utrzymuj komórki BHK-21 w pożywce niezbędnej alfa minimal uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminą, witaminami i penicyliną/streptomycyną.
  2. Przepłukać monowarstwę komórek 10 ml zimnego roztworu A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4). Oderwij komórki od szalek przez potraktowanie 4 ml trypsyny-EDTA (0,25%) i zbierz je przez odwirowanie w stężeniu 270 × g w wirówce stacjonarnej przez 2 minuty.
  3. Zawiesić osad komórkowy z 50 ml zimnego roztworu A w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 270 × g przez 2 minuty. Powtórzyć tę procedurę mycia trzy razy; po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad komórek o gęstości 2 × 107 komórek/ml w Sol A.
  4. Wymieszaj 400 μl podwielokrotności zawiesiny komórkowej z 2 μg syntetycznego RNA w kuwecie o szczelinie 2 mm i niezwłocznie elektroporuj mieszaninę za pomocą elektroporatora w optymalnych warunkach elektroporacji: 980 V, długość impulsu 99 μs i 5 impulsów (Rysunek 4C).
    Uwaga: Użyj 3znakowanego H RNA zsyntetyzowanego w Protokole 6.5 bezpośrednio do elektroporacji bez dalszego oczyszczania.
  5. Pozostawić elektroporowane ogniwa w temperaturze pokojowej na 10 minut i przenieść do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 600 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
  6. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenie elektroporowanych komórek w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej i rozsiać 100 μl podwielokrotności każdego rozcieńczenia na monowarstwach nieelektroporowanych komórek BHK-21 (5 × 105) na płytce 6-dołkowej.
  7. Po 4-6 godzinach inkubacji nałożyć na komórki 0,5% agarozy w minimalnym niezbędnym pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  8. Wizualizacja ośrodków zakaźnych (blaszek) poprzez utrwalenie 7% formaldehydem i barwienie 1% fioletem krystalicznym w 5% etanolu27 (ryc. 6A).
    1. Opcjonalnie: Zbadaj komórki elektroporowane RNA w 18-20 godzin po transfekcji pod kątem ekspresji białka JEV za pomocą testów immunofluorescencyjnych27,73 (Figura 6B) i zbierz supernatanty z komórek elektroporowanych RNA w 22 i 40 godzinach po transfekcji w celu miareczkowania wirusa za pomocą testów płytki nazębnej27,63 (Figura 6C).

Wyniki

W przypadku wszystkich wirusów RNA o dodatnej polarności nici, niezawodność i wydajność systemu genetyki odwrotnej zależą od stabilności genetycznej sklonowanego pełnowymiarowego cDNA, którego sekwencja jest równoważna sekwencji konsensusowej wirusowego RNA genomowego.27 Rycina 1 przedstawia pięcioetapową strategię konstrukcji pełnowymiarowego infekcyjnego cDNA w formie BAC dla JEV SA14-14-228Krok 1, oczyszczanie wirusowego RNA z supernatantu hodowli komórek BHK-21 zakażonych JEV (Rycina 1A); Krok 2, synteza czterech nakładających się amplikonów cDNA (F1 do F4), obejmujących cały genom wirusa (Rycina 1B); Krok 3, subklonowanie każdego z czterech sąsiednich fragmentów cDNA do wektora BAC, w celu stworzenia pBAC/F1 do pBAC/F4 (Rycina 1C); Krok 4, modyfikacja sklonowanych cDNAs w celu in vitro transkrypcja run-off z użyciem polimerazy RNA SP6, t. j.umieszczając sekwencję promotora SP6 bezpośrednio przed końcem 5' wirusa (pBAC/F1SP6), eliminując istniejący wcześniej wewnętrzny XbaI Wprowadź miejsce restrykcyjne w nukleotydzie 9131 poprzez wprowadzenie cichej mutacji punktowej A9134→T (pBAC/F3Wyciszenie (knockout)), a następnie wprowadzenie nowej sztucznej XbaI Przebieg kończy się bezpośrednio za 3'-końcem wirusa (pBAC/F4RO) (Rysunek 1D); oraz Krok 5, montaż pełnowymiarowego SA14-14-2 cDNA BAC, pBAC/SA14-14-2 (Rycina 1E). Tabela 1 zawiera wykaz oligonukleotydów użytych w tej procedurze klonowania.28

W celu konstrukcji funkcjonalnego cDNA JEV pierwszym ważnym krokiem jest synteza czterech nakładających się fragmentów cDNA z wykorzystaniem oczyszczonego RNA wirusa jako matrycy dla RT-PCR. Rycina 2 przedstawia reprezentatywny wynik dla czterech produktów RT-PCR, które poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Żel ten wyraźnie pokazuje, że pełnowartościowe cDNA JEV zostało zamplifikowane do czterech nakładających się fragmentów cDNA. Sporadycznie reakcje RT-PCR mogą przynieść jeden lub więcej dodatkowych produktów specyficznych dla wirusa lub niespecyficznych, które są zazwyczaj mniejsze od oczekiwanego produktu, co wynika z niespecyficznego przyłączania starterów podczas syntezy/amplifikacji cDNA. Z drugiej strony, oczekiwany produkt RT-PCR może zostać zamplifikowany w niewielkiej ilości lub wcale z powodu przypadkowego zanieczyszczenia RNazą podczas izolacji RNA wirusa lub nieprawidłowego przeprowadzenia RT-PCR.

Kolejnym kluczowym krokiem jest klonowanie i modyfikacja częściowego lub pełnego cDNA JEV w BAC, co jest stosunkowo prostą procedurą z wykorzystaniem standardowych technik rekombinacji DNA.69 Rycina 3 przedstawia reprezentatywny wynik oczyszczania klonu BAC zawierającego pełnowymiarowy cDNA JEV SA14-14-2 poprzez frakcjonowanie w gradiencie CsCl-EtBr. W tym doświadczeniu, po wirowaniu przez 16 h przy 401 700 × g, dwa wyraźne prążki, t. j., the E. coli DNA chromosomalne powyżej oraz superzwinięte DNA plazmidowe BAC poniżej są widoczne w środkowej części probówki w świetle ultrafioletowym o długiej fali. Minimalna objętość (~400 µl) dolnego prążka DNA z BAC ostrożnie pobrano, przebijając ściankę probówki strzykawką. Następnie EtBr usunięto z DNA z BAC poprzez ekstrakcję butanolem, a wolne od EtBr DNA z BAC zagęszczono metodą precypitacji etanolem.

Ostatnim etapem jest oznaczenie swoistej zakaźności syntetycznych RNA transkrybowanych in vitro z pełnowymiarowego BAC SA14-14-2 (pBAC/SA14-14-2) po transfekcji RNA do komórek permisywnych (Rycyna 4). Etap ten składa się z trzech następujących po sobie kroków: Krok 1, linearyzacja pełnowymiarowego cDNA SA14-14-2 na końcu 3' genomu wirusa (Rycina 4A); Krok 2, produkcja syntetycznych RNA z linearyzowanego cDNA poprzez transkrypcję typu run-off (Rycina 4B); oraz Krok 3, odzyskanie rekombinowanych wirusów w komórkach BHK-21 transfekowanych syntetycznymi RNA (Rycina 4C). W warunkach eksperymentalnych dwa niezależne klony pBAC/SA14-14-2 zlinearyzowano za pomocą trawienia enzymem Xba I, a następnie poddano działaniu MBN w celu usunięcia czteronukleotydowego nawisu 5' powstałego w wyniku trawienia Xba I. Zlinearyzowane BAC-i oczyszczono metodą ekstrakcji fenol-chloroformowej, a następnie wytrącono etanolem. Linearyzację dwóch oczyszczonych BAC-ów wykazano na żelu agarozowym 0,8% (Rycina 5A). Ekstrakcję fenol-chloroformową należy przeprowadzić ostrożnie, aby upewnić się, że zlinearyzowane BAC-i są wolne od RNaz. Każdy z dwóch zlinearyzowanych BAC-ów posłużył jako matryca cDNA do transkrypcji typu run-off z użyciem polimerazy RNA SP6 w obecności analogu czapeczki m7G(5')ppp(5')A. Integralność syntetycznych RNA wykazano, nanosząc alikwoty z dwóch mieszanin reakcyjnych transkrypcji na żel agarozowy 0,6% wraz z referencyjną drabiną DNA 1 kb (Rycina 5B). W tym prostym teście główny, wyraźny prążek RNA zawsze migrował tuż poniżej referencyjnego prążka DNA 3 kb i był ostry. Natomiast zdegradowany RNA miałby postać rozmytej smug na tym samym żelu.

Test centrów infekcyjnych jest złotym standardem w określaniu swoistej zakaźności syntetycznych RNA. Analizę tę przeprowadzono poprzez elektroporację komórek BHK-21 próbkami RNA, wysianie równych alikwotów 10-krotnie rozcieńczanych seryjnie elektroporowanych komórek na płytki 6-dołkowe zawierające naiwne komórki BHK-21 (3 × 105 komórek/dołek) oraz nałożenie agarozy na monowarstwy komórkowe. Po 4-dniowej inkubacji przeżyłe komórki utrwalono formaldehydem i zabarwiono roztworem fioletu krystalicznego, aby określić liczbę centrów infekcyjnych (plaque), co odpowiada liczbie zakaźnych cząsteczek RNA wprowadzonych do komórek (Rysunek 6A). Ponieważ udowodniono, że matryca cDNA użyta do transkrypcji in vitro jest nieinfekcyjna,27 alikwot mieszaniny reakcyjnej transkrypcji wykorzystano bezpośrednio do elektroporacji. Elektroporacja jest preferowaną metodą transfekcji RNA; alternatywnie RNA można transfekować innymi metodami z użyciem DEAE-dekstranu i liposomów kationowych. Elektroporacja RNA jest bardzo skuteczna, jednak rzadko dochodzi do „przeskoku” (arcing) impulsu elektrycznego, jeśli w mieszaninie do elektroporacji znajdują się sole lub jeśli kuweta do elektroporacji jest używana ponownie. Ekspresję białek wirusowych w komórkach transfekowanych RNA badano za pomocą testów immunofluorescencji z użyciem przeciwciał króliczych przeciwko NS1 (Rysunek 6B). Produkcję cząstek wirusowych gromadzących się w supernatantach komórek transfekowanych RNA analizowano za pomocą testów plackowych (Rysunek 6C). Wyniki tych eksperymentów jasno pokazują, że syntetyczne RNA pochodzące z cDNA są zakaźne w podatnych komórkach BHK-21, generując wysoki miano wirusów rekombinowanych.

OligonukleotydSekwencjaa (5' do 3')PozycjabPolarność
1RTTAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT		2578–2603Antysensowna
1FaatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT		1–22Sensowna
1RattgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT		2532–2553Antysensowna
2RTTTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA		5975–6000Antysensowna
2FaatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT		1800–1821Sensowna
2RattgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC		5929–5950Antysensowna
3RTACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT		9426–9451Antysensowna
3FaatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT		5500–5521Sensowna
3RattgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT		9380–9401Antysensowna
4RTAGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA		10952–10977Antysensowna
4FaatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA		9200–9221Sensowna
4RattgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC		10956–10977Antysensowna
SP6Fcataccccgcgtattcccac
ta		Sensowna
SP6RACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa		1–14Antysensowna
F1FaggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG		1–17Sensowna
F1RTGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA		638–662Antysensowna
X1FCGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG		8403–8427Sensowna
X1RAAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC		9120–9148Antysensowna
X2FGGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT		9120–9148Sensowna
X2Rcacgtggacgagggcatgcc
tgcag		Antysensowna
ROFCCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC		10670–10694Sensowna
RORagggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC		10954–10977Antysensowna
aSekwencje JEV zapisano wielkimi literami, a sekwencje BAC małymi literami.
bPozycja nukleotydu odnosi się do pełnej sekwencji genomu JEV SA14-14-2 (numer dostępu Genbank JN604986).

Tabela 1: Oligonukleotydy użyte do syntezy cDNA, amplifikacji PCR i mutogenezy BAC.

Schemat izolacji viralnego RNA i asemblacji pełnowymiarowego cDNA, obejmujący syntezę cDNA, subklonowanie oraz procesy modyfikacji.
Rycina 1. Strategia konstrukcji pełnowymiarowego cDNA JEV SA14-14-2 w formie BAC. (A) Izolacja viralnego RNA z cząsteczek JEV. Przedstawiono schematyczną strukturę genomowego RNA JEV SA14-14-2. (B) Synteza czterech nakładających się fragmentów cDNA (F1 do F4) obejmujących cały genom wirusa. (C) Subklonowanie czterech nakładających się fragmentów cDNA do wektora BAC, z utworzeniem pBAC/F1 do pBAC/F4. (D) Modyfikacja sklonowanych cDNA w celu transkrypcji run-off in vitro. pBAC/F1SP6 jest pochodną pBAC/F1 zawierającą sekwencję promotora SP6 powyżej 5'-końca wirusowego. pBAC/F3KO jest pochodną pBAC/F3 zawierającą cichą mutację punktową (A9134→T, gwiazdka). pBAC/F4RO jest pochodną pBAC/F4 zawierającą sztuczne miejsce run-off Xba I poniżej 3'-końca wirusowego. (E) Asemblacja pełnowymiarowego BAC SA14-14-2 (pBAC/SA14-14-2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy żelowej; rozdział DNA według wielkości w kilobazach; pokazano markery masy cząsteczkowej.
Rycina 2. Synteza czterech nakładających się fragmentów cDNA (F1 do F4) obejmujących pełną długość genomowego RNA JEV SA14-14-2. Cztery produkty RT-PCR oceniono za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. M, drabinka DNA 1 kb. Przewidywane rozmiary czterech fragmentów cDNA są zaznaczone na dole obrazu żelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Centryfugacja w gradiencie gęstości chlorku cezu rozdzielająca DNA chromosomalne, DNA BAC oraz RNA; schemat.
Rysunek 3. Oczyszczanie BAC zawierającego pełny cDNA JEV SA14-14-2. Plazmid BAC jest izolowany z E. coli DH10B metodą lizy alkalicznej z SDS, a następnie dodatkowo oczyszczany poprzez wycinanie pasma w gradiencie CsCl-EtBr. Przedstawiono przykład gradientu CsCl-EtBr z wykorzystaniem szczelnej probówki polipropylenowej o wymiarach 16 × 76 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat linearyzacji cDNA i syntezy RNA; odzyskiwanie wirusa poprzez transfekcję RNA; proces genetyczny.
Rysunek 4. Przegląd odzyskiwania zakaźnych wirusów z pełnowymiarowego cDNA JEV SA14-14-2 zmontowanego w BAC. (A) Linearyzacja matrycy cDNA. Pełnowymiarowy BAC JEV jest cięty enzymem Xba I i traktowany MBN. (B) Synteza transkryptów RNA. Zlinearyzowane cDNA jest transkrybowane przez polimerazę RNA SP6 w obecności analogu czapeczki m7G(5')ppp(5')A. (C) Odzyskiwanie syntetycznych JEV. RNA transkrybowane in vitro jest transfekowane do komórek BHK-21 poprzez elektroporację, co generuje wysoki miano syntetycznego wirusa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat elektroforezy żelowej matrycy cDNA i transkryptów RNA; rozdział DNA według liczby par zasad.
Rycina 5. Synteza RNA poprzez transkrypcję in vitro z wykorzystaniem pełnowymiarowego BAC JEV jako matrycy cDNA. (A) Generowanie zlinearyzowanego pełnowymiarowego BAC JEV, pBAC/SA14-14-2. Dwa niezależne klony pBAC/SA14-14-2 (Cl.1 i Cl.2) są linearyzowane poprzez trawienie enzymem Xba I i następującą po nim obróbkę MBN. Zlinearyzowane BAC są analizowane za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. (B) Produkcja syntetycznego RNA poprzez transkrypcję run-off. Każdy z dwóch zlinearyzowanych BAC jest używany jako matryca dla transkrypcji run-off przy użyciu polimerazy RNA SP6. Alikwoty z dwóch reakcji transkrypcji są rozdzielane w 0,6% żelu agarozowym. M, drabinka DNA 1 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza zakaźności RNA i wydajności wirusa; wykresy, plaki, mikroskopia fluorescencyjna w badaniu wirusowym.
Rysunek 6. Specyficzna zakaźność syntetycznych RNA otrzymanych w wyniku transkrypcji pełnowymiarowego BAC JEV oraz odzyskiwanie syntetycznego wirusa. Komórki BHK-21 poddano pozornej elektroporacji (Mock) lub elektroporacji transkryptami RNA pochodzącymi z każdego z dwóch niezależnych klonów pełnowymiarowego BAC JEV (Cl.1 i Cl.2). (A) Zakaźność RNA. Komórki pokryto agarozą i zabarwiono fioletem krystalicznym 4 dni po transfekcji. Zakaźność RNA określono za pomocą testów centrów infekcyjnych w celu oszacowania ilości zakaźnego RNA wprowadzonego do komórek drogą elektroporacji (panel lewy). Przedstawiono również reprezentatywne obrazy centrów infekcyjnych (panel prawy). (B) Ekspresja białka. Komórki hodowano na szkiełkach komorowych z 4 studniami. Ekspresję białek wirusowych w komórkach po elektroporacji RNA w 20 hr po transfekcji (hpt) przeanalizowano za pomocą testów immunofluorescencyjnych z użyciem pierwszorzędowego przeciwciała króliczego anty-NS1 oraz drugorzędowego przeciwciała koziego anty-króliczego IgG sprzężonego z Cy3 (czerwony). Jądra komórkowe zabarwiono przeciwbarwionym 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (niebieski). Obrazy immunofluorescencyjne nałożono na odpowiadające im obrazy z kontrastu interferencyjnego (DIC). (C) Wydajność wirusa. Komórki hodowano w szalkach hodowlanych o średnicy 150 mm. Produkcję zakaźnych wirionów nagromadzonych w nadsączach hodowlanych komórek po elektroporacji RNA w 22 i 40 hpt zbadano za pomocą testów plackowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Obecny protokół został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania pełnej długości zakaźnych klonów cDNA dla dwóch różnych szczepów (CNU/LP227 i SA 14-14-228) JEV, flawiwirusa, którego funkcjonalne cDNA okazało się z natury trudne do skonstruowania i namnażania ze względu na toksyczność komórek gospodarza i niestabilność genetyczną sklonowanego cDNA. 8,74-76 Protokół ten obejmuje trzy główne elementy: po pierwsze, maksymalizację syntezy/amplifikacji wiernej kopii cDNA wirusowego RNA przy użyciu wysokiej jakości odwrotnej transkryptazy/polimerazy DNA; po drugie, klonowanie wirusowego regionu kodującego prM-E zawierającego toksyczne sekwencje (dane niepublikowane)74,77,78 w wektorze BAC o bardzo niskiej liczbie kopii od początkowego subklonowania cDNA do końcowych etapów składania cDNA na pełnej długości; i po trzecie, wykorzystując wektor klonujący BAC, który może pomieścić obce DNA o średnim rozmiarze 120-350 kb,19-21, który najwyraźniej toleruje większe wstawki DNA niż inne wektory klonujące. To podejście do klonowania będzie ogólnie stosowane do wielu innych wirusów o dodatniej nici RNA, szczególnie tych z dużym genomem RNA od ~10 do 32 kb. Wygenerowanie zakaźnego klonu cDNA jest kluczowym krokiem w rozwoju systemu odwrotnej genetyki dla wirusów RNA, zwłaszcza dla wirusów o dodatniej nici RNA, ponieważ jego genom działa jak wirusowe mRNA, które jest tłumaczone na białka przez rybosomy komórek gospodarza. W ten sposób replikacja wirusa może zostać zainicjowana przez wprowadzenie cząsteczki RNA o długości genomu pochodzącej z cDNA do podatnej komórki gospodarza. Dostępność zakaźnego klonu cDNA JEV, w połączeniu z technologią rekombinacji DNA, zwiększyła naszą wiedzę na temat różnych aspektów cyklu życia wirusa na poziomie molekularnym, takich jak ekspresja genów73,79 i replikacja genomu. 63,64 Również pełnowymiarowy klon cDNA JEV okazał się cennym narzędziem do rozwoju szczepionek przeciwwirusowych28 i wektorów dostarczania genów. 80,81 zł

Podobnie jak w przypadku wszystkich wirusów o dodatniej nici RNA, istnieje wiele krytycznych etapów konstruowania niezawodnego funkcjonalnego cDNA dla JEV, z którego można zsyntetyzować wysoce zakaźne RNA in vitro. Idealnie byłoby, gdyby sekwencja syntetycznych RNA transkrybowanych z klonu cDNA o pełnej długości była identyczna z sekwencją genomowego RNA wirusa, w szczególności sekwencje 5'- i 3'-końcowe, które są wymagane do zainicjowania replikacji wirusowego RNA. 60-62 W obecnym protokole autentyczne końce 5' i 3' zapewniono poprzez umieszczenie sekwencji promotora SP6 przed pierwszym nukleotydem adeninowym genomu wirusa i umieszczenie unikalnego sztucznego miejsca restrykcyjnego Xba I za ostatnim nukleotydem tyminowym genomu wirusa, odpowiednio. Syntetyczne RNA z autentycznymi końcami 5' i 3' wyprodukowano przez spływową transkrypcję matrycy cDNA Xba I-linearyzowanej i poddanej działaniu MBN przy użyciu polimerazy SP6 RNA zagruntowanej analogiem kapu m7G (5') ppp (5') A. Protokół ten można modyfikować na kilka sposobów. Do transkrypcji in vitro można użyć innej polimerazy RNA bakteriofaga (np. T3 lub T7) w połączeniu z jej dobrze zdefiniowaną sekwencją promotorową. 27 Jako miejsce spływu, można wykorzystać inne miejsce restrykcyjne, jeśli nie jest ono obecne w genomie wirusa i jeśli syntetyczne RNA ze zlinearyzowanego cDNA kończy się autentycznym końcem 3'. Znaczenie sekwencji nukleotydowej końca 3' wykazano przez ~10-krotny spadek zakaźności RNA, gdy syntetyczny RNA zawiera trzy lub cztery nukleotydy niezwiązane z wirusem na końcu 3'. 27 W reakcji transkrypcji in vitro zarówno analog kapu m7G(5')ppp(5')A, jak i m7G(5')ppp(5')G cap analog, chociaż ten ostatni umieszcza niepowiązany dodatkowy nukleotyd G przed wirusowym końcem 5', ale ten dodatek nie zmienia zakaźności ani replikacji syntetycznego RNA. 27 Ponadto usunięcie matrycy cDNA z transkryptów RNA przez trawienie DNazą I nie jest konieczne do przeprowadzenia testów zakaźności RNA, ponieważ sama matryca cDNA nie jest zakaźna. 27 Rozdział 27

Technologia BAC została obecnie zastosowana do konstruowania zakaźnych klonów cDNA dla garstki wirusów o dodatniej nici RNA, a mianowicie dwóch JEV, CNU/LP227 i SA 14-14-228 (rozmiar genomu, ~11 kb); dwa wirusy dengi, BR/9026 i NGC29 (~11 kb); wirus wirusowej biegunki bydła, SD1 (~12 kb); 25 dwa wirusy klasycznego pomoru świń, C i Paderborn (~12 kb); 24 wirus choroby granicznej, Gifhorn (~12 kb); 24 wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń, PL97-1/LP1 (~15 kb); 30 wirus zakaźnego zapalenia żołądka i jelit, PUR46-MAD (~29 kb); 16 wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, DF-2 (~29 kb); 32 koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, Urbani (~30 kb); 9 koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego, EMC/2012 (~30 kb); 17 i ludzki koronawirus, OC43 (~31 kb). 31 Główną zaletą stosowania BAC do budowy cDNA jest wysoka stabilność genetyczna dużych, 1- lub 2-kopijnych plazmidów BAC; jednak nieodłączny charakter jego wyjątkowo niskiej liczby kopii jest również wielką wadą ze względu na bardzo niską wydajność DNA BAC i wynikające z tego zmniejszenie czystości DNA BAC w odniesieniu do chromosomalnego DNA gospodarza. W obecnym protokole wydajność DNA BAC jest maksymalizowana poprzez hodowlę E. coli DH10B przekształconego za pomocą zakaźnego BAC pBAC/SA 14-14-2 w pożywce bogatej w składniki odżywcze, 2xYT. Mimo tego wysiłku średni plon to tylko ~15 μg DNA BAC z 500 ml bulionu 2xYT. Ponadto czystość DNA BAC najlepiej osiągnąć przy użyciu wirowania w gradicynie gęstości CsCl-EtBr do oczyszczania, a nie powszechnie stosowanej izolacji plazmidu opartego na kolumnie. Należy jednak pamiętać, że bakteria E. coli przekształcona przez BAC nie powinna przerastać, ponieważ może to zagrozić stabilności genetycznej sklonowanego cDNA, a wyższy wzrost niekoniecznie prowadzi do większych plonów lub wyższej czystości DNA BAC.

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowaną, wydajną i usprawnioną metodą budowy i rozmnażania genetycznie stabilnego zakaźnego klonu cDNA o pełnej długości jako BAC dla JEV, procedura kiedyś uważana za praktycznie niemożliwą. Ta sama strategia klonowania może być również stosowana do wielu innych wirusów o dodatniej nici RNA. Ogólnie rzecz biorąc, zakaźne klony cDNA umożliwiają nam wprowadzenie różnych mutacji (np. delecji, insercji i mutacji punktowych) do genomu wirusowego RNA w celu zbadania ich funkcji biologicznych w replikacji i patogenezie wirusa. Ten oparty na cDNA system genetyki odwrotnej umożliwia opracowywanie i testowanie kandydatów na szczepionki i terapie ukierunkowanych na czynnik wirulencji określonego wirusa o dodatniej nici RNA. Ponadto ta zakaźna technologia cDNA może być również wykorzystywana jako wektor wirusowy, zdolny do ekspresji obcego genu (genów) będącego przedmiotem zainteresowania w wielu zastosowaniach w badaniach biomedycznych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczyli, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować funduszowi Utah Science Technology and Research za wsparcie YML oraz grantom Korea National Research Foundation (2009-0069679 i 2010-0010154) za wsparcie SIY. Badania te były wspierane przez Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University i zatwierdzone jako artykuł numer czasopisma UAES #8753. Autorzy dziękują również dr Deborah McClellan za pomoc redakcyjną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Klonowanie molekularne
2xYT RosółSigma-AldrichY2377[
3H]UTPPerkinElmerNET380250UCRadioactive
50 ml TubkaThermo Scientific (Nalgene)3114-0050
250 ml ButelkaBeckman Coulter356011
AgarozaLonza50004
Agaroza (niska temperatura topnienia)Life Technologies (Invitrogen)16520-100
AvaINowa Anglia BioLabsR0152S
AvrIINowa Anglia BioLabsR0174S
BamHINowa Anglia BioLabsR0136S
BsiWINowa Anglia BioLabsR0553S
BsrGINowość Anglia BioLabsR0575S
ButanolFisher ScientificA399-1 
Chlorek cezuFisher ScientificBP1595-1
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
ChloroformSigma-AldrichC2432Racerotwórczość
DE-81 Bibuła filtracyjnaGE Healthcare Life Sciences3658-023
Mieszanka dNTPLife Technologies (Invitrogen)18427-088
E. coli DH10B Life Technologies (Invitrogen)18297-010
EDTASigma-AldrichE5134
Etanol Sigma-AldrichE7023
Bromek etydynySigma-AldrichE7637Toksyczna i wysoce mutagenna
kolumna filtrująca (zestaw Plasmid Maxiprep)Life Technologies (Invitrogen)K2100-26
Lodowaty kwas octowySigma-AldrichA6283Drażniąca
glukozaSigma-AldrichG5400
Glikogen Roche10901393001
Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BioLabsM0491S
Alkohol izoamylowySigma-AldrichI9392Łatwopalny
izopropanol Amresco0918Łatwopalny
bulion LB LifeTechnologies (Invitrogen)12795-027
Chlorek lituSigma-AldrichL9650
LizozymAmresco0663
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
M-MLV Technologie odwrotnej transkryptazyżycia (Invitrogen)18080-044
Nukleaza fasoli mungNowa Anglia BioLabsM0250S
Igła (18G, 20G)BD305196, 305175Niebezpieczne biologicznie (odpady ostrych narzędzi)
NotINew England BioLabsR0189S
Zintegrowane technologie oligonukleotydoweDNANiestandardowa synteza
PacINew England BioLabsR0547S
pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
Fenol (nasycony buforem)Life Technologies (Invitrogen)15513-039Toksyczny i silnie
Fenol:Chloroform:Isoamyl AlcoholTechnologies (Invitrogen)15593-031Toksyczny i silnie
Fenol:Guanidine IsothiocyanateLife Technologies (Ambion)10296-010Toksyczny, i drażniący
Pme INew England BioLabsR0560S
Octan potasuAmresco0698
Inhibitor RNazyLife Technologies (Invitrogen)10777-019
Zestaw rNTPGE Healthcare Life Sciences27-2025-01
Uszczelniana rurka polipropylenowa (16 & razy; 76 mm)& nbsp;Beckman Coulter342413
SfiINowa Anglia BioLabsR0123S
Sma INowa Anglia BioLabsR0141S
Octan soduSigma-AldrichS2889
Dodecylosiarczan soduAmresco0227
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881
SP6 Polimeraza RNANew England BioLabsM0207S Kolumna
wirowa (zestaw do miniprzygotowania plazmidu)Life Technologies (Invitrogen)K2100-11
HSW NORM-JECT4200.000V0
Ligaza DNA T4New England BioLabsM0202S
TrisAmresco0826
tRNA (drożdże)Life Technologies (Invitrogen)15401-011
XbaI New England BioLabsR0145S
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>2. Hodowla komórkowa
Alpha Minimal EssentialMedium Life Technologies (Gibco)12561-049
Probówka stożkowa (50 ml)VWR21008-242
Crystal Violet Naczynie hodowlane Sigma-AldrichC0775
(150 mm) TPP93150 
Kuweta (odstęp 2 mm)Aparat Harvarda450125 
Surowica bydlęca płodu Life Technologies (Gibco)16000-044
FormaldehydSigma-AldrichF1635Toksyczna i rakotwórcza
glutaminaLife Technologies (Gibco)25030-081
Minimal Essential MediumLife Technologies (Gibco)61100-061
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies (Gibco)15070-063
Chlorek potasuSigma-AldrichP3911
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP9791
Płytka sześciodołkowaTPP92006
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS3264
Trypsyna-EDTA (0,25%)Technologie życia ( Gibco)25200-056
WitaminySigma-AldrichM6895
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
3. Sprzęt
Agaroza Żel ElektroforezaMupidMPDEXU-01
CO2 InkubatorThermo ScientificHeracell 150i
Wirówka stołkowa ElectroporatorThermo Scientific ST16R
Aparatura HarvarduECM 830
Długofalowe lampy ultrafioletowe (ręczne)UVPUVGL-58
Wirówka stołowaBeckman Coulter368826
ThermocyclerLife Technologies (Biosystemy stosowane)GeneAmp PCR System 9700
VortexerPrzemysł naukowyG-560
Kąpiel wodnaJeio TechWB-10E
oligonukleotydów Life Strzykawka System

Bibliografia

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290(2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14(2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248(2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318(2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Genetyka odwrotnawirus zapalenia mózgu u ludziizolacja viralnego RNAsynteza cDNAlinearyzacja plazmidutranskrypcja in vitroodzyskiwanie wirusagradient chlorku cezu
Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.