Artykuł metodologiczny

Szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 września 2015

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szybką i uproszczoną metodę hybrydyzacji in situ, idealną dla mózgu z prefiksem paraformaldehydu, zmniejszając w ten sposób potrzebę długotrwałych skomplikowanych etapów podczas korzystania ze świeżo zamrożonych tkanek. Metodę zwalidowano na podstawie identyfikacji genu receptora serotoniny5-HT 2A htr2a u szczurów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA; ecstasy) toksyczność może powodować specyficzne dla regionu zmiany w ekspresji serotoninergicznego mRNA z powodu ostrego zespołu serotoniny (5-hydroksytryptaminy; 5-HT). Hipotezę tę można przetestować za pomocą hybrydyzacji in situ w celu wykrycia genu receptora serotoniny5-HT 2A htr2a. W przeszłości takie procedury, wykorzystujące radioaktywną rybosondę, były trudne ze względu na skomplikowany przebieg pracy, który wymagał kilku dni na wykonanie, a dodatkową trudność polegała na tym, że technika wymagała użycia świeżo zamrożonych tkanek utrzymywanych w środowisku wolnym od RNaz. Ostatnio opracowanie krótkich sond oligonukleotydowych uprościło procedury hybrydyzacji in situ i umożliwiło stosowanie sekcji mózgu z prefiksami paraformaldehydowymi, które są szerzej dostępne w laboratoriach. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół z użyciem nieradioaktywnych sond oligonukleotydowych na tkankach mózgowych z prefiksem. Sondy hybrydyzacyjne użyte w tym badaniu obejmują dapB (bakteryjny gen kodujący reduktazę dihydrodipikolinianu), ppiB (gen porządkujący kodujący izomerazę peptydyloprolilu B) i htr2a (gen serotoniny kodujący receptory 5-HT2A). Ta metoda jest stosunkowo prosta, tania, powtarzalna i zajmuje mniej niż dwa dni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół serotoninowy (5-hydroksytryptamina; 5-HT) jest ostrym zaburzeniem neurologicznym spowodowanym przez leki promujące 5-HT, takie jak leki przeciwdepresyjne1, a także występuje w sytuacjach używania MDMA w celach rekreacyjnych2. Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za wahania nastroju, deficyty w uczeniu się i pamięci, które występują w związku z ostrym zespołem, nie są dobrze poznane3,4. Hybrydyzacja in situ jest potężnym narzędziem badawczym pozwalającym na wykrywanie i kwantyfikację określonych mRNA wyrażanych potencjalnie na poziomie pojedynczej komórki. Konwencjonalnym sposobem przeprowadzenia hybrydyzacji in situ jest wykorzystanie znakowanej radioaktywnie rybosondy, która specyficznie hybrydyzuje gen będący przedmiotem zainteresowania. Jednak główną wadą jest to, że metoda wymaga skomplikowanych i czasochłonnych etapów przygotowania sondy i hybrydyzacji, a także dostępu do świeżo zamrożonych tkanek utrzymywanych w środowisku wolnym od RNaz5,6.

Sondy oligonukleotydowe zostały ostatnio opracowane do hybrydyzacji krótszych fragmentów RNA niż te wymagane dla rybosond7. Co więcej, sondy wytwarzają sygnał o niskim poziomie tła bez poświęcania specyficzności8. Ta nowo opracowana technologia sondy może być stosowana do hybrydyzacji in situ na tkankach mózgowych z prefiksami paraformaldehydowymi, powszechnie dostępnych w laboratoriach immunocytochemicznych.

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ za pomocą sond oligonukleotydowych na mózgu szczura z prefiksem paraformaldehydu i porównujemy wyniki z tymi odnotowanymi w świeżo zamrożonym mózgu5,6. Protokół ten służy do testowania hipotezy, że nadużywanie substancji MDMA powoduje zmiany w geniereceptora 5-HT 2A mRNA htr2a w mózgu. Procedurę rozpoczęliśmy od leczenia MDMA, a następnie perfuzji tkanek paraformaldehydowych zwierzęcia, hybrydyzacji in situ sondy thr2a i analizy danych. Należy zauważyć, że dapB (bakteryjny gen kodujący reduktazę dihydrodipifolinianu) jest stosowany jako kontrola negatywna, a ppiB (gen porządkowy kodujący izomerazę peptydyloprolilu B) jako kontrola pozytywna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury wykorzystania zwierząt opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Ross University School of Veterinary Medicine i Florida Atlantic University. Chociaż wymagane są sterylne techniki i rękawice, środowisko wolne od RNaz nie jest konieczne podczas korzystania z tego protokołu.

1. Przygotowanie

  1. Przygotowanie i cięcie tkanek
    1. Szczury należy losowo podzielić na trzy grupy: świeże/sola fizjologiczna (SAL; 0,9% NaCl), z prefiksem/SAL i z prefiksem/3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA; szczegóły w tabeli 1).
    2. Podawać trzy dawki 1 ml/kg SAL i 10 mg/kg MDMA odpowiednio dootrzewnowo grupom SAL i MDMA w odstępie 2 godzin. Pozwól zwierzętom przetrwać leczenie przez 6 dni.
    3. W dniu 7 należy podać szczurom 100 mg/kg ketaminy w połączeniu z 5 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo w celu głębokiego znieczulenia (tj. utraty mrugania rogówką i odruchów szczypania ogona).
    4. W przypadku grupy świeżej/SAL należy szybko odciąć głowy szczurom i usunąć mózg w celu przeprowadzenia nowego testu mózgu (patrz szczegóły w odnośniku5).
    5. W przypadku grup z prefiksem/SAL i z prefiksem/MDMA wykonaj nacięcie wzdłuż mostka około 10 -12 cm, a następnie odsłoń koniec mostka.
    6. Przytrzymaj koniec mostka hemostatem i przetnij przeponę bocznie po obu stronach ostrymi nożyczkami, a następnie przetnij w górę przez żebra i równolegle do płuc.
    7. Jedną ręką przytrzymaj brzuszny koniec serca małymi kleszczami. Drugą ręką przekłuć lewą komorę igłą strzykawkową 18 G (należy zauważyć, że strona adaptera igły jest połączona silikonowym wężem w kształcie litery Y z lodowatymi pojemnikami SAL i paraformaldehydu oraz pompami perystaltycznymi; patrz odniesienie9).
    8. Włączyć pompę SAL na średnim poziomie natężenia przepływu (~5 ml/min) i przekłuć prawy przedsionek kleszkami, aby umożliwić ucieczkę z krążenia powrotnego. Utrzymuj perfuzję SAL przez 30 minut.
    9. Włącz pompę paraformaldehydu na średnim poziomie i pozwól, aby lodowaty 4% paraformaldehyd przenikał zwierzę przez 30 minut.
    10. Wyjmij narzędzie do perfuzji i odetnij głowę zwierzęciu. Wykonaj tylne przednie przecięcie przez linię środkową czaszki, a następnie klapnij czaszką, aby odsłonić jamę czaszki 10.
    11. Wyjąć mózg szpatułką z jamy czaszki i umieścić mózg w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml 4% paraformaldehydu. Przechowywać mózg w probówce zawierającej paraformaldehyd w temperaturze 4 ºC w lodówce przez 24 godziny.
    12. Przenieść mózg do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4 °C przez 3 dni. Na koniec przechowuj mózg w plastikowych torebkach w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    13. Zamontuj mózg na uchwycie z pożywką do zatapiania i zamroź pożywkę zawierającą mózg w kriostacie w temperaturze -26 ºC. Pokrój świeżo zamrożony mózg na sekcje 20 μm, a mózg z prefiksem paraformaldehydu na sekcje 10 μm. Przenieś przekrój na szkiełko mikroskopu RT, dotykając szkiełka do sekcji.
    14. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Przechowywać szkiełka sekcyjne w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  2. odwodnienie
    1. Pobrać szkiełka podstawowe z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przypisać sekcje do jednego z trzech testów: ht2a, ppiB (kontrola dodatnia) lub dapB (kontrola ujemna); oznaczyć i oznaczyć sekcje długopisem (nie używać ołówka). Zanurz szkiełka w 100% alkoholu o temperaturze pokojowej na 5 minut. Suszyć szkiełka przez 5 minut w dygestorium.
  3. Wstępnej obróbki
    1. Odpipetować 20 μl odczynnika Pretreat-1 (inaktywacja fosfatazy alkalicznej) do skrawków na szkiełkach. Umieść szkiełka na szynie stojaka w tacce na wilgoć (należy pamiętać, że taca jest przykryta pokrywką, aby utrzymać wysoką wilgotność, aby zapobiec parowaniu z roztworu reakcyjnego).
    2. Delikatnie potrząsać tacką na wilgoć na wytrząsarce poziomej z małą prędkością przez 10 minut. Umyć szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) przez 2 minuty. Zanurzyć szkiełko w zlewce o pojemności 200 ml zawierającej 150 ml odczynnika Pretreat-2 (zerwanie wiązań krzyżowych wywołane wiązaniem paraformaldehydu). Gotować szkiełka w sumie przez 5 minut w temperaturze 100 ºC (odbudowa struktury RNA wywołana ciepłem11).
    3. Umyć szkiełka dwukrotnie za pomocą ddH2O przez 2 min. Umieścić szkiełka w 100% alkoholu na 5 min. Suszyć szkiełka przez 5 min w dygestorium. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół wybranego obszaru w sekcji tkanki (np. struktury niekorowe, w tym wzgórze i podwzgórze, jak pokazano na rysunku 2).
    4. Odpipetować 10 μl odczynnika Pretreatment-3 (zwiększa penetrację sondy) do każdego wybranego obszaru i przykryć tackę na wilgoć pokrywką. Umieścić blachę w piecu do hybrydyzacji wyposażonym w wytrząsarkę poziomą i ustawić temperaturę piekarnika na 40 °C; Delikatnie potrząsaj tacką przez 30 minut. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą ddH2O przez 2 minuty.

2. Hybrydyzacja i amplifikacja

  1. Odpipetować 10 μl odpowiednio odczynników do sondy htr2a, ppiB i dapB na wybrane obszary. Przykryj tackę na wilgoć pokrywką, aby zapobiec parowaniu odczynnika. Delikatnie potrząśnij wytrząsarką poziomą ustawioną na niską prędkość. Inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C w piekarniku przez 2 godziny.
  2. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-1 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 30 minut.
  3. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-2 na każdym wybranym obszarze, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
  4. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-3 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 30 minut.
  5. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-4 na każdym wybranym obszarze, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
  6. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-5 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  7. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-6 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 min. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem do przemywania przez 2 min.

3. Wykrywanie sygnału

  1. Odpipetować 10 μl odczynnika Red do każdego wybranego obszaru (Należy pamiętać, że odczynnik jest mieszaniną Red-B i Red-A w stosunku 1:60 i należy go natychmiast zużyć). Umieść szkiełko w tacce na wilgoć na wytrząsarce poziomej w pozycji RT i delikatnie potrząsaj niską prędkością przez 10 minut.
  2. Umyć szkiełka dwukrotnie (ddH2O) przez 10 min. Suszyć szkiełka w temperaturze 60 ºC w piekarniku przez 15 min. Umieścić szkiełka w ksylenie pod wyciągiem na 5 minut. Odpipetować 20 μl materiału montażowego na bazie ksylenu na każdy wybrany obszar i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

4. Przechwytywanie obrazu

  1. Wykonaj cyfrowe mikrofotografie wybranych obszarów (np. podwzgórze, rysunki 1 i 3) w powiększeniu 4× i 20× soczewek obiektywowych. Zapisz plik obrazu.

5. Analiza cząstek obrazu

  1. Przeciągnij i upuść plik obrazu do głównego okna ImageJ. Przejdź do paska menu i wybierz "Obraz", następnie wybierz "Typ" z menu rozwijanego i wybierz "8-bitowy".
  2. Wybierz "Dostosuj", a następnie wybierz "Próg", aby otworzyć okno dialogowe. Dostosuj dolną wartość paska w oknie dialogowym, aby usunąć niechciane tło. Przejdź do paska menu i wybierz "Analizuj", a następnie wybierz "Analizuj cząstki", aby otworzyć drugie okno dialogowe.
  3. Ustaw wielkość cząstek na 10, następnie wybierz "Pokaż kontury" i wybierz pola "Wyświetl wyniki" i "Podsumuj". Na koniec kliknij "OK", aby wyświetlić dane cząstek w oknach dialogowych.

6. Obliczanie w arkuszu kalkulacyjnym

  1. Wprowadź dane do arkusza Excela i uśrednij liczbę cząstek w grupie SAL jako linię bazową. Oblicz poziom procentowy każdej sekcji i wykonaj odpowiedni wykres (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za pomocą oligonukleotydowych sond RNA (<25 nt), hybrydyzacja może być wykryta jako czerwone kropki w komórkach podwzgórza przygotowanych z prefiksu paraformaldehydu i świeżo zamrożonych mózgów. Cząsteczki mRNA htr2a są obecne w niektórych komórkach (oznaczone stałymi strzałkami), ale nie w innych (otwarte strzałki). Zaobserwowaliśmy, że nie ma różnicy między prefiksem paraformaldehydu a świeżo zamrożonymi tkankami (ryc. 1). Udana hybrydyzacja może być najpierw oceniona gołym okiem (r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych problemów związanych z testem hybrydyzacji in situ jest wybór odpowiednich technik stosowanych do zachowania RNA ze względu na enzymy RNazy. Powszechnie wiadomo, że enzymy te są powszechnie obecne w komórkach i środowisku, co może wpływać na wyniki. Jednak aktywność enzymu można szybko rozróżnić, umieszczając tkankę w roztworze suchego lodu/alkoholu5,12. Chociaż szybkie zachowanie ma kluczowe znaczenie dla hybrydyzacji przy użyciu sondy rybonukleotydowej13, niewiele wiadom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant NIH (R15DA029863), grant na badania licencjackie Florida Atlantic University (M30014) oraz grant badawczy Ross University School of Veterinary Medicine. Chcielibyśmy podziękować Narodowemu Instytutowi ds. Nadużywania Narkotyków (Rockville, MD) za dostarczenie (±)3,4-metylenodioksymetamfetaminy (±MDMA) dla tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sonda kontroli negatywnej RNAscope-DapBZaawansowana diagnostyka komórek, INC310098
RNAscope Pretreat 4Zaawansowana diagnostyka komórek, INC320046
Zestaw odczynników RNAscope 2.0 HD - czerwonyZaawansowana diagnostyka komórek, INC310036
Sonda RNAscope - Rn-PpibZaawansowana diagnostyka komórek, INC313921
Rat Htr2aZaawansowana diagnostyka komórek, INC300031
KriostatLeicaCM 1850
Wytrząsarka poziomaVWR88032-088
Piec do hybrydyzacjiThermo Fisher Scientific222000
Szkiełko mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
Długopis hydrofobowyVectorH-4000
MikroskopOlympusProvis AX70

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234(2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

M zg utrwalony paraformaldehydemekspresja genu HTR2Aodczynniki do wst pnego traktowaniaetapy amplifikacjidetekcja Fast Redanaliza w programie Image Jilo ciowe oznaczanie RNA

Powiązane artykuły