Artykuł metodologiczny

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

DOI:

10.3791/53176

⸱

11 lipca 2016

 ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele rzadkich i dlatego niedostatecznie opisanych patogenów bakteryjnych, które według doniesień powodują poważne infekcje, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością. W większości przypadków dostępnych jest tylko kilka danych, w większości publikowanych w formie opisów przypadków, które badają rolę takich patogenów jako czynnika zakaźnego. Dlatego, aby wyjaśnić chorobotwórczy charakter takich mikroorganizmów, konieczne jest przeprowadzenie badań epidemiologicznych, które obejmują dużą liczbę tych bakterii. Metody stosowane w takim badaniu nadzorczym muszą spełniać następujące kryteria: identyfikacja szczepów musi być dokładna zgodnie z obowiązującą nomenklaturą, powinny być łatwe w obsłudze (solidność), ekonomiczne w rutynowej diagnostyce i muszą dawać porównywalne wyniki w różnych laboratoriach. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy strategie identyfikacji szczepów bakteryjnych w rutynowych warunkach: 1) identyfikacja fenotypowa charakteryzująca właściwości biochemiczne i metaboliczne bakterii, 2) techniki molekularne, takie jak sekwencjonowanie genu 16S rRNA oraz 3) spektrometria mas jako nowatorskie podejście oparte na proteomie. Ponieważ spektrometria mas i podejścia molekularne są najbardziej obiecującymi narzędziami do identyfikacji dużej różnorodności gatunków bakterii, opisano te dwie metody. Omówiono postępy, ograniczenia i potencjalne problemy związane ze stosowaniem tych technik.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpieczna identyfikacja rzadkich patogenów w rutynowej diagnostyce jest utrudniona przez fakt, że klasyczne metody kulturowe i biochemiczne są kłopotliwe i czasami wątpliwe. Ponadto laboratorium mikrobiologiczne diagnostyczne musi przetwarzać dużą liczbę patogenów, od kilkuset do kilku tysięcy, dziennie, co wymaga zastosowania zautomatyzowanych systemów. Oprócz zarządzania wysoką dzienną przepustowością potrzebna jest precyzyjna identyfikacja gatunków bakterii. Jest to uzasadnione, ponieważ różnią się one wzorcem wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, a zatem prawidłowa identyfikacja dostarcza klinicystom niezbędnych informacji do wyboru odpowiednich antybiotyków (np. Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) Rozdział 12,43.

Zautomatyzowane systemy identyfikacji mikrobiologicznej (aMIS) stosują standardowe zestawy reakcji enzymatycznych do charakteryzowania właściwości metabolicznych izolatów bakteryjnych 13,15,16,26,27. Chociaż wkłady stosowane w tych systemach wykorzystują dużą liczbę różnych reakcji biochemicznych, np. 47 w karcie GN aMIS użytej w tym badaniu 52, strategia ta pozwala na bezpieczną identyfikację tylko dla ograniczonego zestawu bakterii. Co więcej, baza danych, będąca zaawansowanym systemem eksperckim, jest wyraźnie skoncentrowana na wykrywaniu istotnych i wysoce istotnych bakterii o znaczeniu medycznym 13,15,16,36. Dwa kolejne systemy, szeroko stosowane w laboratoriach, również stosują to biochemiczne podejście do identyfikacji bakterii. Ostatnie badania wykazują porównywalną dokładność identyfikacji między aMIS użytym w tym badaniu a jednym z konkurentów (odpowiednio 93,7% i 93,0%), podczas gdy 3. aMIS ma dokładność identyfikacji wynoszącą zaledwie 82,4% na poziomie gatunku 35. Rozbieżności te można wytłumaczyć jakością podstawowych odniesień do danych identyfikacyjnych, wersjami zestawów i oprogramowania, różnicami w metabolizmie i biegłości personelu technicznego 35,36.

Dwa zautomatyzowane systemy MS MALDI-TOF (system identyfikacji mikrobiologicznej MALDI-TOF, mMIS) są głównie używane. Systemy te pozwalają na wykrywanie dużej liczby gatunków bakterii na podstawie widm masowych ich odcisków palców białek. Na przykład baza danych użytego mMIS zawiera 6 000 widm referencyjnych. Systemy identyfikacji oparte na spektrometrii mas oferują szybkie i niezawodne wykrywanie szerokiej gamy mikroorganizmów, w tym rzadkich patogenów 11,48,51. Do tej pory dostępnych jest tylko kilka bezpośrednich porównań między mMIS zastosowanym w tym badaniu a jego konkurentem 19,33. Według Daeka i wsp. oba systemy zapewniają podobnie wysoki wskaźnik dokładności identyfikacji, ale mMIS zastosowany w tym badaniu wydaje się być bardziej wiarygodny w identyfikacji gatunków 19.

Podobnie, techniki molekularne dotyczące dobrze zachowanych, ale także odrębnych genów (np. 16S rDNA lub rpoB) pozwalają na jasną identyfikację gatunku 3,22,61. Wśród nich 16S rDNA jest najczęściej używanym genem porządkowym ze względu na jego obecność we wszystkich bakteriach 34. Jego funkcja pozostaje niezmieniona i wreszcie, przy około 1 500 pz, jest wystarczająco długi, aby nadawać się do bioinformatyki 14,34. Wielu badaczy uważa analizę genu 16S rRNA za "złoty standard" w identyfikacji bakterii 21. Wynika to z faktu, że do tej pory niewiele laboratoriów stosuje techniki hybrydyzacji DNA-DNA do identyfikacji rzadkich lub nowych bakterii 14,34. Dodatkowo dostępnych jest coraz więcej baz danych, które można wykorzystać do analizy genów 16S rRNA 50. Należy jednak wziąć pod uwagę, że systemy detekcji oparte na 16S rDNA mają ograniczoną czułość w porównaniu ze standardowymi protokołami PCR. Co więcej, podejście molekularne jest wyrafinowane, czasochłonne i wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu, a także dedykowanego zaplecza laboratoryjnego, a zatem nie jest łatwe do wdrożenia w rutynowej diagnostyce 55. Ponadto wykazano, że połączenie co najmniej dwóch różnych metod identyfikacji bakterii prowadzi do bardzo dokładnej identyfikacji szczepu. Połączenie sekwencjonowania MALDI-TOF MS i 16S rDNA pozwala na identyfikację dużej liczby różnych gatunków bakterii z dużą dokładnością. Niedawno zaprezentowano połączenie analizy genów MALDI-TOF MS i 16S rRNA w celu identyfikacji bakterii, badania nad kwestiami epidemiologicznymi i rzadkimi patogenami 56.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja DNA bakterii

  1. Przygotowanie roztworu PBS
    1. Odważyć 1,65 g Na2HPO4 x 2H2O, 0,22 g NaH2PO4 x 2H2O i 8,80 g NaCl w kolbie i napełnić wodą destylowaną do końcowej objętości 1 000 ml. Doprowadzić pH do 7,4. Do końcowego użycia przefiltrować roztwór przez filtr odporny na bakterie (0,22 μm).
  2. Ekstrakcja DNA bakterii Gram-ujemnych
    1. Umieść materiał pacjenta na odpowiednich pożywkach hodowlanych (np. agarze z krwią Columbia), zidentyfikuj i wyizoluj potencjalne patogeny.
    2. Przygotować czystą kulturę i przeprowadzić barwienie metodą Grama w celu określenia morfotypu i potwierdzenia czystości kultury 49.
    3. Wybrać pojedynczą kolonię bakteryjną i przenieść ją za pomocą 1 μl jednorazowej pętli inokulacyjnej do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 2,0 ml, która zawiera 1 ml roztworu PBS.
    4. Zawiesinę tę inkubować w termomieszalniku w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Po inkubacji pozostawić ekstrakt bakteryjny (zawierający rozpuszczone DNA) do ostygnięcia do temperatury pokojowej i użyć go bezpośrednio do amplifikacji lub przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użycia (ryc. 1a).
  3. Ekstrakcja DNA bakterii Gram-dodatnich
    1. Umieść materiał pacjenta na odpowiednich pożywkach hodowlanych (np. Columbia), zidentyfikuj i wyizoluj potencjalne patogeny. Wykonaj barwienie metodą Grama w celu potwierdzenia morfotypu kultury.
    2. Przygotować czystą kulturę i przeprowadzić barwienie metodą Grama w celu określenia morfotypu i potwierdzenia czystości kultury.
    3. Wybrać pojedynczą kolonię bakteryjną ze sterylną pętlą inokulacyjną o pojemności 1 μl i zawiesić ją w roztworze 500 μl PBS w probówce reakcyjnej o pojemności 2,0 ml.
    4. Dodać 500 μl szklanych kulek i przenieść probówkę do homogenizatora oscylacyjnego, pracującego z maksymalną częstotliwością i amplitudą (50 Hz), na 5 minut. Użyj szklanych kulek o średnicy 1,0 mm, aby rozbić ściany komórkowe bakterii.
    5. Inkubować tę probówkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C i schłodzić do temperatury pokojowej. Ekstrakt należy stosować bezpośrednio do reakcji PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.

2. 16S rDNA PCR

  1. Przygotowanie podkładów wzmacniających
    1. Użyj starterów TPU1 (5'-AGA, GTT, TGA, TCM, TGG, CTC, AG-3' [M = A/C]) jako startera do przodu i RTU4 (5'-TAC, CAG, GGT, ATC, TAA, TCC, TGT, T-3') jako startera odwrotnego 25. Przygotować roztwór podstawowy startera z wodą wolną od DNAzy i RNAzy o stężeniu 100 pmol/μl (100 μM) i rozcieńczyć go dalej do roztworu roboczego o stężeniu 10 pmol/μl. Przechowywać podkład i roztwór roboczy w temperaturze -20 °C lub użyć bezpośrednio.
  2. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR
    1. Odpipetować 1 μl każdego startera, 1 μl dNTP-mix (100 mM), 2,5 μl ekstraktu DNA, 5 μl 10x buforu PCR (zawierającego 25 mM MgCl2), 0,25 μl polimerazy Taq (5 jednostek/μl) i 39,25 μl wody PCR wolnej od DNA i RNAse do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 200 μl.
  3. Protokół PCR
    1. Uruchom program PCR zbudowany w następujący sposób: Najpierw wstępny etap inkubacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut, który jest niezbędny do aktywacji polimerazy Taq. Po drugie, 35 cykli amplifikacji, zawierających 1-minutowy etap denaturacji w temperaturze 95 °C, 1-minutowy etap wyżarzania podkładu w temperaturze 50 °C i 1,5-minutowy etap przedłużania podkładu w temperaturze 72 °C. Po trzecie, końcowe przedłużenie trwające 10 minut w temperaturze 72 °C. Na koniec reakcja PCR jest schładzana do 4 °C.
      UWAGA: Staphylococcus aureus iH2Osłużą jako kontrola pozytywna i negatywna (ryc. 1b).
    2. Umieść probówkę z mieszanką reakcyjną PCR w termocyklerze i uruchom program.
  4. Oczyszczanie produktu PCR
    UWAGA: W celu oczyszczenia produktu PCR można zastosować kilka protokołów, opartych na enzymach lub z matrycą adsorpcji krzemionki. Zastosowane tutaj jednoetapowe oczyszczanie PCR wykorzystuje dwie hydrolityczne reakcje enzymatyczne. Podczas gdy egzonukleaza I (Exo I) usuwa jednoniciowe DNA, fosfataza alkaliczna krewetek (SAP) hydrolizuje nieinkorporowane dNTP. Druga procedura opiera się na technice adsorpcji membrany krzemionkowej z cyklem szybkiego wiązania - mycia - elucji o wysokiej zawartości soli.
    1. Dodać 1,5 μl mieszaniny enzymatycznej zawierającej zarówno Exo I, jak i SAP do 25 μl produktu PCR, dokładnie wymieszać i przenieść do termocyklera, stosując prosty protokół, zgodnie z którym najpierw 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie 15 minut w temperaturze 80 °C. Oczyszczony produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub użyć go bezpośrednio jako celu do znakowania PCR.

3. Elektroforeza w żelu agarozowym DNA

  1. Przygotowanie buforu do elektroforezy (bufor TBE)
    1. Miareczkować 54,0 g (445 mM) zasady TRIS, 27,5 g (445 mM) kwasu borowego i 20 ml 0,5 M roztworu EDTA (10 mM) o pH 8,0 z NaOH w kolbie i napełnić ją wodą destylowaną do całkowitej objętości 1000 ml. Następnie rozcieńczyć ten 5x bufor 1:10 wodą destylowaną (0,5x TBE) do elektroforezy.
  2. Przygotowanie bufora załadowczego
    1. Zmieszać 250 mg błękitu bromofenolowego, 250 mg ksylenu cyjanolu FF i 15 g polisacharozy (tabela materiałów) w kolbie. Następnie napełnij go 0,5x buforem TBE do całkowitej objętości 100 ml. Barwnik nasycający rozdzielić na porcje o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.
  3. Odlewanie żelu agarozowego
    1. Odważyć 6 g agarozy wzorcowej do elektroforezy na 300 ml 0,5 x buforu TBE (patrz sekcja 3.1.1) w kolbie, aby przygotować 2% (m/v) żel agarozowy. Następnie włóż mieszaninę agarozy do kuchenki mikrofalowej, podgrzej ją do temperatury bliskiej, aż agaroza całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny.
    2. Pozostawić stopioną agarozę do odpowiedniego ostygnięcia i dodać 10 μl 1% (w/v) roztworu podstawowego bromku etydyny. Wlej roztwór do odlewu i umieść grzebień żelowy (pozwalając na 30 dołków) w gipsie. Wyjmij grzebień, gdy żel całkowicie zastygnie i włóż żel do komory elektroforetycznej zawierającej 0,5x bufor TBE.
      UWAGA: Bromek etydyny jest toksyczny i mutagenny. Dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. Wskazane jest używanie rękawic nitrylowych. Istnieją alternatywne interkalacyjne barwniki kwasów nukleinowych, które można stosować jako nietoksyczną alternatywę.
  4. Elektroforeza w żelu agarozowym produktów PCR
    UWAGA: W celu sprawdzenia prawidłowej wielkości amplikonów PCR i oszacowania stężenia DNA, oczyszczony produkt PCR rozdziela się w żelu agarozowym.
    1. Odpipetować 2 μl buforu ładującego do probówki reakcyjnej PCR i dodać 8 μl produktu PCR. Odpipetować tę mieszaninę do dołków żelu. Dodać 8 μl markera wielkości cząsteczkowej (drabinki DNA) do oddzielnego dołka, aby oszacować wielkość produktu PCR.
    2. Zastosować stałe napięcie 10 V/cm i przerwać elektroforezę, gdy tylko niebieski marker bromofenolowy osiągnie około 3/4 całkowitej długości żelu. Wizualizacja oddzielonych fragmentów PCR za pomocą transiluminatora UV (długość fali 302 nm) i udokumentowanie ich za pomocą systemu dokumentacji żelowej. Oszacuj ilość DNA przez wizualne porównanie z drabiną DNA. Użyj około 10 ng jako celu do etykietowania PCR.

4. Sekwencjonowanie Sangera

  1. Sekwencjonowanie cyklu PCR
    UWAGA: Wykonaj znakowanie PCR w reakcji 10 μl przy użyciu zestawu handlowego (tabela materiałów).
    1. Dodać 2 μl 5x mastermixu reakcyjnego, 2 μl preparatu DNA, 1,5 μl roztworu roboczego TPU1 lub RTU4 (10 pmol/μl) i 4,5 μl wody wolnej od DNAzy i RNAzy.
    2. Umieść tę mieszankę reakcji sekwencjonowania w termocyklerze i uruchom kolejny PCR. W sumie proces składa się z 25 cykli składających się z etapu denaturacji (96 °C, 10 sekund), etapu wyżarzania (45-60 °C, 5 sekund) i etapu przedłużania (60 °C, 2 min). Na koniec schłodzić reakcję do temperatury 4 °C.
  2. Oczyszczanie reakcji sekwencjonowania
    1. Oczyść mieszaninę reakcyjną znakowania za pomocą komercyjnych kolumn wirowych do oczyszczania PCR (tabela materiałów).
    2. Załadować 10 μl reakcji sekwencjonowania na wstępnie uwodnioną matrycę do filtracji żelowej i przeprowadzić etap wirowania przy 750 x g przez 3 min.
      UWAGA: Dzięki zastosowaniu tej procedury nieinkorporowane terminatory barwnika są zatrzymywane w matrycy żelowej.
    3. Następnie wysuszyć wodny eluat w koncentratorze próżniowym. Wirować przy 2.500 x g przez 20 do 30 minut w temperaturze 40 °C aż do całkowitego wyschnięcia.
    4. Dodać 10 μl wysoce zdejonizowanego formamidu, następnie denaturować w temperaturze 90 °C przez 2 minuty i schłodzić mieszaninę na lodzie. Pobrać pipetą 10 μl zdenaturowanych próbek na 96-dołkową płytkę μl. Wysuszony i oczyszczony produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeżeli analiza ma być przeprowadzona w późniejszym czasie.
  3. Sekwencjonowanie genu 16S rRNA i analiza sekwencji DNA
    UWAGA: Wykonaj analizę sekwencji na automatycznym sekwencerze (Tabela materiałów). Zastosowany tutaj sekwencer to zautomatyzowany system elektroforezy kapilarnej oparty na fluorescencji, który analizuje jednocześnie 4 próbki (50 cm 4-kapilarny układ) z ciekłym polimerem 67 (ryc. 1c).
    1. Umieścić płytkę do mikromiareczkowania w sekwencerze. Napisz przykładowy arkusz (zapis płyty) zgodnie z opisem w 2, zapisz go i rozpocznij sekwencjonowanie/analizę, postępując zgodnie z krokami podanymi w 1.
      UWAGA: Czas trwania sekwencji wynosi 2 godziny i dostarcza danych od 800 do 1 000 pz.
    2. Otwórz oprogramowanie do analizy sekwencjonowania (Tabela materiałów). Dane sekwencji są podawane w postaci pliku tekstowego (.seq) oraz pliku zawierającego elektroferogram wraz z wartościami jakości (QV) (.ab1).
      UWAGA: Wywołanie bazy jest automatycznie wykonywane przez oprogramowanie do analizy sekwencjonowania, a podstawowy elektroferogram jest sprawdzany wizualnie (np. wysokość piku, separacja pików) przed wykorzystaniem sekwencji do dalszych zastosowań.
    3. Porównaj przechowywany plik sekwencji DNA z bazą danych NCBI nr za pomocą algorytmu BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

UWAGA: Spektrometr mas wykorzystuje laser N2 o długości fali 337 nm i jest obsługiwany przez specjalne oprogramowanie sterujące (tabela materiałów). Widma są rejestrowane w trybie liniowym i obejmuje zakres mas od 2 000 do 20 000 Da. Interpretacja danych i przypisywanie punktów do próbek odbywa się w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania analitycznego (tabela materiałów) (rysunek 1d).

  1. Przygotowanie bakterii do analizy MS MALDI-TOF
    1. Hoduj interesujące nas bakterie (np. Myroides odoratimimus) na agarze z krwią Columbia zawierającym 5% krwi końskiej w temperaturze 37 °C przez 18 do 24 godzin, w zależności od szczepu bakteryjnego (ryc. 2a). Przeprowadzić barwienie metodą Grama w celu zweryfikowania morfotypu badanego organizmu, a także czystości kultury.
    2. Użyj drewnianej wykałaczki, aby przenieść pojedynczą kolonię bakterii do studzienki z 96-dołkową stalową tarczą (ryc. 2b i 2c). Umieścić 1 μl 70 % kwasu mrówkowego na wierzchu wysuszonego na powietrzu organizmu na stalowej tarczy i pozostawić do wyschnięcia na około 2-3 minuty.
    3. Następnie pokryć miejsce 1 μl roztworu matrycowego, zawierającego 50 mg/ml CHCA (kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy) w rozpuszczalniku organicznym (50% acetonitrylu, 2,5% kwasu trifluorooctowego, 47,5% H2O).
      UWAGA: Metoda nakładania kwasem (metoda przygotowania płytki) może być stosowana w celu poprawy jakości widm masowych. Wykazano, że dla bakterii Gram-dodatnich taki "atak kwasem" zwiększa wartości punktowe mierzonych widm o 45,
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system przygotowania próbki (tabela materiałów), w którym na rozmaz bakteryjny nakłada się bezkontaktowe plamki z 1 μl 70% roztworu kwasu mrówkowego, a po pierwszym cyklu suszenia 1 μl roztworu matrycowego. Próbki są następnie suszone w znormalizowanych warunkach przy wilgotności względnej 60% i są gotowe do użycia do analizy.
    4. Pozostaw rozmazany z matrycą nałożoną na powietrze do ponownego wyschnięcia przez około 5 minut w kapturze. Ten rozmaz bakteryjny po nałożeniu matrycy jest teraz stabilny przez wiele godzin.
      UWAGA: Rozmazy bakteryjne bez matrycy mogą nie być stabilne z powodu degradacji białek.
  2. Przeprowadzanie analizy MS MALDI-TOF
    1. Wprowadzenie próbek
      1. Otwórz oprogramowanie sterujące naszego mMIS (Tabela Materiałów).
      2. Napowietrzyć port ładowania próbki spektrometru masowego, naciskając przycisk IN/OUT przyrządu.
      3. Po kliknięciu otwórz port ładowania i włóż płytkę docelową MALDI-TOF MS z wysuszonym rozmazem bakteryjnym i matrycą.
      4. Zamknij port i ponownie się ewakuuj. Obserwuj podciśnienie, a gdy osiągnie 4,5 x 10-6 mbar, rozpocznij pomiar
        5. .
    2. Analiza próbki
      1. Otwórz oprogramowanie analityczne naszego mMIS (Tabela materiałów) i kliknij menu "Plik". Wybierz "Nowa klasyfikacja", a otworzy się nowe okno "Kreator klasyfikacji w czasie rzeczywistym MALDI biotyper". Wpisz nazwę projektu, na przykład "Myroides measurement project_1", w polu "Nazwa projektu" i naciśnij przycisk "Nowy". W nowym oknie dialogowym o nazwie "Nowy projekt" sprawdź nazwę projektu i kontynuuj, naciskając przycisk "OK".
      2. W "Kreatorze klasyfikacji w czasie rzeczywistym biotyper MALDI" obserwuj, jak otwiera się okno "Umieszczanie analitu". Wybierz pozycje docelowe (np. A1, A2, A3...), kliknij prawym przyciskiem myszy dowolną zaznaczoną pozycję (oznaczoną niebieskim kwadratem) i wybierz "Dodaj próbki". W automatycznie otwieranym widoku tabeli wpisz nazwę próbki, identyfikator próbki i opcjonalnie komentarz. Kliknij przycisk "Dalej", aby kontynuować.
      3. W "Kreatorze klasyfikacji biotyper MALDI w czasie rzeczywistym" należy obserwować otwarte okno "Wybór metod biotyper MALDI". Wybierz "Taksonomia Bruker" z "MSP z drzew taksonomii" i kliknij "Dalej", aby kontynuować.
      4. W "Kreatorze klasyfikacji biotyper MALDI w czasie rzeczywistym" obserwuj otwarte okno "Podsumowanie projektu". Sprawdź wstawione wpisy podane powyżej, aby zapoznać się z rzeczywistym projektem klasyfikacji. Rozpocznij klasyfikację, naciskając przycisk "Zakończ" (Rysunek 2d-f). Pomiar rozpoczyna się automatycznie po osiągnięciu odpowiedniej próżni.
      5. Postępuj zgodnie z przebiegiem klasyfikacji, aż pomiar zostanie pomyślnie zakończony. Wyświetl tabelę wyników w project_1 pomiarowym "MALDI Biotyper Realtime Classification Project Myroides measurement ", otwórz menu "Widok" i kliknij "Wyniki".
      6. Wyświetl "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification Results" jako plik HTML w domyślnej przeglądarce internetowej. Wydrukuj i zapisz wyniki.
    3. Codziennie mierz wzorzec testowy przed analizą próbki, aby skalibrować przyrząd i przeprowadzaj walidację przyrządu co tydzień (autotest urządzenia).
      UWAGA: Podczas pomiaru widma MALDI-TOF są analizowane w czasie rzeczywistym przez oprogramowanie analityczne (Tabela materiałów). Podaje się listę dziesięciu gatunków wraz z ich odpowiednimi wynikami, która jest wprowadzana do systemu informacji laboratoryjnej (LIS) w celu sporządzenia raportu.
    4. Krytycznie ocenić wyniki MS MALDI-TOF (patrz reprezentatywne wyniki) i, w razie potrzeby, uwzględnić inne testy, takie jak profile wrażliwości biochemicznej i antybiotykowej lub sekwencjonowanie genu 16S rRNA i, jeśli to konieczne, barwienie metodą Grama w celu przypisania gatunku bakterii do raportu mikrobiologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS to nowatorska, szybka i tania metoda rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej. Identyfikacja gatunków bakterii za pomocą MALDI-TOF MS daje widma składające się głównie z białek rybosomalnych, ale także innych "bardzo konserwatywnych białek z funkcjami utrzymania domu, na które warunki środowiskowe wpływają w minimalnym stopniu" 17. Baza danych tego mMIS zawiera duży zestaw widm referencyjnych i nawet bakterie, które rzadko występują w izolatach klinicznych, mogą być...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno sekwencjonowanie genów MALDI-TOF MS, jak i 16S rRNA daje możliwość identyfikacji dużej liczby różnych bakterii. MALDI-TOF MS to szybka i niedroga metoda, która jest łatwa w obsłudze i dostępna jest duża baza danych widm mas bakteryjnych. Z tego powodu MALDI-TOF MS jest szybką, opłacalną i niezawodną metodą przeprowadzania badań przesiewowych skoncentrowanych na rzadkich patogenach bakteryjnych 17,20,39,51. W prospektywnym badaniu porównującym MALDI-TOF MS z innymi metodami identyfikacji fenotypowej, Se...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Enno Jacobsowi za jego nieustające wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CHROMASOLV, Woda do HPLC, 1 LSigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Niemcy270733
Tissue Lyser LTQiagen, Hilden, Niemcy85600Homogenizator oscylacyjny
Kulki szklane 1,0 mmVWR International, Darmstadt, Niemcy412-2917
Thermomixer 5436Eppendorf, Hamburg, Niemcy2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Niemcy51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U)Qiagen, Hilden, Niemcy201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')biomers.net, Ulm, Niemcy -
Podkład odwrotny RTU4 (5´-TAC, CAG, GGT, ATC, TAA, TCC, TGT, T-3´)biomers.net, Ulm, Niemcy -
Mistrz cyklu Eppendorf, Hamburg, Niemcy- Termocyklik
Probówka reakcyjna 1,5 mlSARSTEDT, Nü mbrecht, Niemcy72,692
Probówka reakcyjna 2 mlSARSTEDT, Nü mbrecht, Niemcy72,693,005
PCR 8er-CapStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy711040X
PCR 8er-SoftStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy711030X
Sharp R-ZV11 Sharp Electronics, Hamburg, Niemcy-Mikrofalówka
Titriplex III (EDTA Na2-sól odwodniona; 1 kg)Merck, Darmstadt, Niemcy1084211000
SeaKem LE AgaroseBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Niemcy849006
SmartLadder SF - 100 do 1,000 bpEurogentec, Lü ttich, BelgiaMW-1800-04
Błękit bromofenolowy (25 g)Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, NiemcyB0126
Xylene cyanol FF (10 g)Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, NiemcyX4126
ComPhor L Maxi Biozym, Hessisch Oldendorf,Niemcy-Bromek
etydyny, roztwór 1% (10 ml)Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, Mü nchen,Niemcy-Żel-system dokumentacji 
ExoSAP-IT (500 reakcji)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Wielka Brytania78201
Bufor (10x) z EDTA Life Technologies, Darmstadt, Niemcy402824
BigDye Terminator Kit v1.1Life Technologies, Darmstadt, Niemcy4337450
Formamid Hi-Di (25 ml)Life Technologies, Darmstadt, Niemcy4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)Qiagen, Hilden, Niemcy63206
3130 Analizator genetycznyLife Technologies, Darmstadt, Niemcy-Sequencer
MicroAmp optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowymLife Technologies, Darmstadt, Niemcy4306737
3130 Analizator genetyczny, podstawa płytki 96-dołkowaLife Technologies, Darmstadt, Niemcy4317237
3130 Analizator genetyczny, ustalacz płytki 96-wellLife Technologies, Darmstadt, Niemcy4317241
3130 Analizator genetyczny, dobrze przegrodapłytkowa Life Technologies, Darmstadt, Niemcy4315933
3130 Analizator genetyczny, polimer POP-7, 7 mlLife Technologies, Darmstadt, Niemcy4352759
3130 Analizator genetyczny, 4-kapilarna matryca, 50 cmLife Technologies, Darmstadt, Niemcy4333466
Oprogramowanie do analizy sekwencjonowania 5.4Life Technologies, Darmstadt, Niemcy-
microflexBruker Daltonik, Brema,Niemcy-NaszmMIS
VITEK MSbioMé rieux, Nü rtingen, Niemcy 2nd mMIS
flexControl 3.4Bruker Daltonik, Brema,Niemcy-Oprogramowaniedo sterowania urządzeniami
Biotyper Klasyfikacja w czasie rzeczywistym 3.1 (RTC)Bruker Daltonik, Brema,Niemcy-Oprogramowanieanalityczne
&kwas alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy, HCCA, 1  gBruker Daltonik, Brema, Niemcy201344
Norma kalibracji peptydów IIBruker Daltonik, Brema, Niemcy222570
MSP 96 stal polerowana docelowaBruker Daltonik, Brema, Niemcy8224989
peqGREENpeqlab 37-5010
MALDI Biotyper Galaxy Bruker Daltonik, Brema, NiemcyNr części 1836007 Zautomatyzowany system przygotowywania próbek
Vitek 2 bioMé rieux, Nü rtingen, Niemcy Nasz aMIS
MicroScan Beckman Coulter, Krefeld, Niemcy2nd aMIS
BD Phoenix™ Zautomatyzowany system mikrobiologicznyBD, Heidelberg, Niemcy3rd aMIS
i>Staphylococcus aureus subsp.  złocisty  Rosenbach (ATCC®   25923&handel ;)American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, FrancjaKontrola pozytywna dla PCR 
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521(2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491(2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412(2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289(2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985(2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095(2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie genu 16S rRNAidentyfikacja patogen w bakteryjnychwykrywanie rzadkich bakteriianaliza spektrometrii mastechniki molekularnemikrobiologia diagnostycznapodej cie oparte na proteomieprofilowanie biochemicznesekwencjonowanie metod Sangera

Powiązane artykuły