Liniowy kowalencyjnie zamknięty (LCC) miniwektor DNA (zarządzanie DNA) jest niewirusowym wektorem dostarczania genów, oferującym wysoką wydajność transfekcji i jest odpowiedni dla każdej aplikacji dostarczania DNA. System produkcyjny jest prosty, szybki i skalowalny in vivo. Poniższy protokół zawiera wizualne instrukcje krok po kroku dotyczące produkcji ministringów DNA.
Artykuł metodologiczny
Produkcja dwuniciowych ministringów DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skonstruowaliśmy liniowe kowalencyjnie zamknięte (LCC) miniwektory DNA jako alternatywę dla wektora dostarczania genów niewirusowego, wyprodukowaną za pomocą prostej platformy in vivo. Manipulacje DNA mają podwyższony profil bezpieczeństwa, a także skutecznie dostarczają ładunek DNA do docelowych komórek. Konwencjonalne wektory DNA przenoszą niepożądane sekwencje prokariotyczne, w tym geny oporności na antybiotyki, motywy CpG i bakteryjne pochodzenie replikacji, co może prowadzić do stymulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Biodostępność konwencjonalnych wektorów DNA jest również zagrożona ze względu na ich większy rozmiar cząsteczkowy. Ich kolisty charakter może również powodować integrację chromosomową, prowadząc do mutagenezy insercyjnej.
Sekwencje bakteryjne są wycinane z miniwektorów DNA, pozostawiając tylko gen zainteresowania (GOI) i niezbędne eukariotyczne elementy ekspresji. Nasze miniwektory DNA LCC, czyli duszpasterstwa DNA, są pozbawione immunogennych sekwencji bakteryjnych; poprawiając w ten sposób ich biodostępność i ekspresję GOI. W przypadku integracji wektora z chromosomem, posługiwanie DNA LCC śmiertelnie zakłóci chromosom gospodarza, usuwając w ten sposób potencjalnie niebezpiecznego mutanta z proliferującej populacji komórek. W związku z tym posługiwanie DNA oferuje korzyści płynące z "minicircle" DNA, jednocześnie eliminując potencjał niepożądanych zdarzeń integracji wektorów. W porównaniu z konwencjonalnymi plazmidami i ich izogenicznymi kolistymi kowalencyjnie zamkniętymi odpowiednikami (CCC), ministringi DNA wykazują lepszą biodostępność, wydajność transfekcji i kinetykę cytoplazmatyczną - dlatego wymagają mniejszych ilości kationowych środków powierzchniowo czynnych do efektywnej transfekcji komórek docelowych.
Skonstruowaliśmy jednoetapowy, indukowalny in vivo system do produkcji procesów DNA u Escherichia coli, który jest prosty w użyciu, szybki i skalowalny.
Wprowadzenie
Celem jest wyprodukowanie skalowalnych ilości liniowych kowalencyjnie zamkniętych (LCC) miniwektorów DNA przy użyciu prostego i wysoce wydajnego, jednoetapowego, indukowanego ciepłem systemu produkcji DNA in vivo. Posługiwanie DNA zapewnia bezpieczną i skuteczną niewirusową strategię dostarczania DNA. Łączą one bezpieczeństwo wektorów LCC z wydajnością minikręgów DNA, a także stanowią bezpieczniejszą alternatywę dla wektorów pochodzących z wirusów bez uszczerbku dla wydajności transfekcji.
Aby system dostarczania transgenu był skuteczny, wektor DNA musi wejść do docelowej komórki gospodarza i wyrazić zakodowaną transgen(y). Istnieje kilka barier komórkowych, które należy pokonać w praktyce, szczególnie w systemach ssaków. Aby uniknąć degradacji przez nukleazy surowicy i wykrywania immunologicznego przez układ siateczkowo-śródbłonkowy, wektor DNA musi być bio- i immunologicznie zgodny z układem docelowym. Niezabezpieczone DNA jest szybko trawione przez nukleazy plazmatyczne, a błona plazmidowa składa się z gęstych barier lipoproteinowych, więc wektor DNA musi być zdolny do szybkiego przejścia przez błonę plazmatyczną komórek docelowych. Po dostaniu się do komórki wektory muszą przejść przez cytoplazmę i przejść przez błonę jądrową, aby dostać się do jądra w celu ekspresji transgenu. Niewirusowe techniki dostarczania genów koncentrują się na poprawie celowania w tkanki i komórki. Jednak zastosowanie konwencjonalnych plazmidów w tych technikach zmniejsza wydajność transfekcji ze względu na obecność immunogennych sekwencji bakteryjnych, które szybko wyciszają ekspresję genów1,2. Konwencjonalne plazmidy zazwyczaj przenoszą geny oporności na antybiotyki w celu utrzymania w systemach prokariotycznych. Mogą one jednak powodować potencjalne niekorzystne skutki u ludzkich gospodarzy lub nadawać oporność na naturalnie występującą florę gospodarza poprzez horyzontalne efekty transferu genów. Konwencjonalne plazmidy zawierają również motywy dinukleotydowe CpG2, które mogą wywołać niepożądaną odpowiedź immunostymulującą, potencjalnie zmniejszając lub wyciszając ekspresję transgenu.
Ponieważ składają się wyłącznie z kasety ekspresji eukariotycznej, miniwektory DNA, takie jak minicirclesDNA 3, są lepszą alternatywą dla dostarczania genów, ponieważ wykazują lepszą biodostępność zewnątrzkomórkową i wewnątrzkomórkową oraz lepszą ekspresję genów ze względu na ich zmniejszony rozmiar i brak immunostymulujących elementów prokariotycznych4. Zmniejszony rozmiar wektora wypada lepiej pod względem odporności na siły ścinające związane z podawaniem in vivo do miejsca docelowego5. Wyższa liczba kopii wektora na jednostkę masy wymaga mniejszej ilości odczynnika do transfekcji, co zmniejsza toksyczność. Jednak w przypadku losowej integracji wektora z chromosomem gospodarza, wektory kowalencyjnie zamknięte (CCC), obejmujące zarówno minikręgi DNA, jak i konwencjonalne plazmidy, nadają ciągłość molekularną, a zatem mogą prowadzić do mutagenezy insercyjnej, która może mieć katastrofalne konsekwencje6. Dla porównania, integracja liniowego wektora DNA zaburza chromosom i inicjuje szlaki śmierci komórki, usuwając w ten sposób zmutowaną komórkę z proliferującej populacji komórek i zapobiegając mutagenezie insercyjnej7. Minimalistyczne immunologicznie zdefiniowane wektory ekspresji genów (MIDGE)8 i wektory mikroliniowe9 (MiLV) są wektorami DNA LCC opracowanymi in vitro. Wektory MIDGE wykazały do 17-krotnie lepszą ekspresję transgenu in vivo w porównaniu z konwencjonalnymi plazmidowymi wektorami DNA11 i wykazały obiecujące wyniki w terapii genowej szczepionki10 i raka8. Ponadto, ze względu na pozbawioną skręcania strukturę miniwektora LCC, wymagana jest mniejsza ilość odczynnika do transfekcji w porównaniu z superskręconym odpowiednikiem CCC, co zmniejsza toksyczność7.
Nasze ulepszone wektory DNA LCC, narzędzia DNA, wykazały wyższą efektywność ekspresji i biodostępność7. Co więcej, badania DNA są wytwarzane w jednoetapowym, indukowanym ciepłem systemie produkcji in vivo, co jest celową i opłacalną alternatywą dla wektorów MIDGE i MiLV LCC, które wymagają wielu etapów in vitro. System produkcji DNA, który ma zostać zademonstrowany, jest prostym procesem indukowanym ciepłem, przeprowadzanym in vivo, dzięki czemu jest zarówno opłacalny, jak i łatwo skalowalny. System ten wykorzystuje system rekombinacji protelomerazy Tel / pal 12 pochodzącego z bakteriofaga Yersinia enterocolitica PY54 w celu oddzielenia kasety o minimalnej ekspresji eukariotycznej od szkieletu plazmidu prokariotycznego. Zmodyfikowaliśmy komórki Escherichia coli (W3NN) do ekspresji protelomerazy Tel pod kontrolą indukowanego ciepłem promotora λ bakteriofaga, cI[Ts]85713. Po ekspresji, protelomeraza Tel działa na miejsca docelowe pal obecne w miejscach "Super Sequence" (SS) zlokalizowanych na plazmidzie prekursorowym, aby uzyskać produkty LCC, z których następnie można oczyścić DNA (ryc. 1). Miejsca SS na plazmidzie prekursorowym zarządzającym DNA kodują również miejsca docelowe dla innych rekombinaz, w tym rekombinazy Cre (lox), protelomerazy TelN (telRL) i rekombinazy Flp (FRT), ułatwiając w ten sposób produkcję izogenicznych miniwektorów LCC i CCC z jednego plazmidu prekursorowego. Ponadto każde miejsce SS jest otoczone z obu stron sekwencjami wzmacniającymi SV40 (SV40e), które służą do poprawy translokacji jądrowej14. Wykazaliśmy w innym miejscu, że kolejne dodawanie SV40e stopniowo powoduje odpowiedni wzrost wydajności transfekcji7. Plazmid prekursorowy (pDNA MiniString lub pDMS) zawiera polilinker (ryc. 1), aby ułatwić wprowadzenie dowolnego pożądanego genu zainteresowania w fuzji transkrypcyjnej z zielonym reporterem fluorescencyjnym (GFP).
Technologia miniwektorów DNA może być używana zamiast konwencjonalnych metod transferu genów, ekspresji genów reporterowych i oceny efektywności ekspresji transgenów w systemach eukariotycznych. Manipulacje DNA łączą w sobie korzyści płynące z biokompatybilności i zwiększonej wydajności transfekcji "mini" wektorów z doskonałym profilem bezpieczeństwa liniowych wektorów DNA. Nasza solidna, jednoetapowa platforma produkcyjna szybko i łatwo umożliwia tworzenie próbek DNA do każdego zastosowania w transferze genów i oferuje wyższy profil bezpieczeństwa.
Protokół
1. Przygotowanie mediów i kultur
- Dla LB + Amp: Przygotować 500 ml bulionu Luria-Bertani (LB) wysterylizowanego w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Uzupełnić ampicyliną do uzyskania końcowego stężenia 100 μg/ml ampicyliny i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
- Dla TB + Amp: Przygotuj się na duże (500 ml lub więcej) ilości produkcji duszpasterskiej. Przygotować 600 ml sterylnego bulionu Terrific Bulth (TB) wysterylizowanego w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min. Uzupełnić ampicyliną do uzyskania końcowego stężenia ampicyliny 100 μg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
- Dla agaru LB + Amp: Przygotować sterylne płytki agarowe LB, przygotowując LB + Amp uzupełnione 15 g/l agaru. Podwielokrotność porcji umieścić około 15 - 20 ml na sterylnych szalkach Petriego i przechowywać do góry nogami w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
- Przygotować płytkę smugową W3NN[pDMS] poprzez aseptyczne smugowanie komórek W3NN[pDMS] na agarze LB + Amp. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C, aż będzie można zaobserwować pojedyncze kolonie. Nie inkubować W3NN powyżej tej temperatury, aby uniknąć depresję ekspresji protelomerazy.
- Przenieść aseptycznie 5 ml LB + Amp do sterylnej probówki. Przygotuj nocną kulturę W3NN [pDMS] poprzez zaszczepienie tej objętości pojedynczą kolonią z płytki smugowej. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce z prędkością 230–250 obr./min.
2. Faza wzrostu
- Przenieść aseptycznie 10 ml LB + Amp do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml i zaszczepić 100 μl nocnej kultury W3NN[pDMS] do przygotowanego LB + Amp, wykonując rozcieńczenie 1:100.
- W przypadku większych objętości dodać 500 μl hodowli na noc do 50 ml TB + Amp w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, zamiast LB + Amp.
- Alternatywnie, użyj jako drugiej "reprezentatywnej" kultury w kroku 2.2.
- Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min, aż kultura osiągnie średnią lub późną fazę logarytmiczną, wskazywaną przez gęstość optyczną (OD) lub absorbancję: A600 = 0,8. Po 1-2 godzinach podłoże powinno zacząć wydawać się mętne gołym okiem.
- Przeprowadzić aseptycznie 1 ml kultury do czystej kuwety spektrofotometru.
- Zmierzyć absorbancję światła za pomocą spektrofotometru UV-vis o długości fali ustawionej na 600 nm. Użyj 1 ml pożywki, w której hodowano komórki, aby ustawić ślepą próbę (LB lub TB). Opcjonalnie w tym kroku użyj reprezentatywnej kultury z kroku 2.1.3.
- Jeśli kultura nie osiągnęła jeszcze odpowiedniego OD, wróć do wytrząsarki i sprawdzaj ponownie co pół godziny. Sprawdzaj OD częściej, gdy A600 zbliża się do 0,8.
- Gdy hodowla osiągnie późną fazę logarytmiczną, oznaczoną symbolem A600 = 0,8, należy aseptycznie przenieść kulturę do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
- Zebrać komórki, odwirowując kulturę przy 10 000 x g przez 10 minut. Sprawdź, czy na dnie probówki nie ma osadu.
- Zdekantować oczyszczony supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Nie naruszaj osadu komórkowego.
- Powtarzaj kroki 2.4-2.5, aż wszystkie komórki zostaną zebrane.
- Ponownie zawiesić osad w 100 μl LB + Amp. Zassać za pomocą mikropipety lub użyć mieszalnika wirowego. Aby uzyskać większą produkcję duszpasterską, ponownie zawiesić osad z 50 ml kultury TB + Amp na 1 ml świeżej pożywki LB + Amp.
3. Prowadzenie produkcji
- Aseptycznie dodać 20 ml LB + Amp do 125 ml kolby Erlenmeyera i podgrzać do temperatury 42 °C. Aby uzyskać większą wydajność duszpasterską, przygotuj 500 ml LB + Amp, podgrzanych do 42 °C.
- Przenieść zawiesinę do podgrzanego podłoża.
- Inkubować w temperaturze 42 °C i 250 obr./min aż do minięcia fazy logarytmicznej, oznaczonej symbolem A600 = 1,0. Nie pozostawiać 20 ml kultury w temperaturze 42 °C po upływie 1 godziny.
- Zmniejszyć temperaturę do 37 °C i pozostawić kulturę na dodatkowe 90 minut. Na 500 ml pozostaw kulturę na dodatkowy okres indukcji 90 - 120 minut i nie obniżaj temperatury.
- Zmniejszyć temperaturę do 30 °C i pozostawić kulturę w stanie wstrząsania przy 200 obr./min na dodatkowy okres redukcji temperatury wynoszący 2 godziny. W przypadku 500 ml wydłuż spadek temperatury do 4 godzin lub na noc.
4. Posługi żniwne
- Przeprowadzić kulturę w sposób aseptyczny do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut i sprawdzić, czy nie ma granulki.
- Zdekantować supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, nie naruszając przy tym osadu. Powtarzaj, aż wszystkie komórki zostaną zebrane.
- Zachowaj osad do ekstrakcji plazmidu z dowolnym dostępnym w handlu zestawem do ekstrakcji i usuwania endotoksyn lub błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszej ekstrakcji.
Wyniki
Po ekstrakcji DNA odzyskiwane są pozostałości plazmidu prekursorowego, prokariotyczny szkielet LCC oraz DNA ministring. Całkowita wydajność i czystość plazmidu mogą zostać ocenione za pomocą spektrofotometru. Czystość szacuje się na podstawie stosunku absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/A280), gdzie optymalny stosunek wynosi 1,9-2,0. Wszystkie produkty LCC i CCC można rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (AGE) (Rysunek 2). AGE pozwala na wizualizację wyników produkcji ministringów po indukcji termicznej, przed ich oczyszczaniem. Na tym etapie można dokonać jakościowej oceny produkcji ministringów, porównując intensywność prążka ministringu (2,4 kb) z prążkiem plazmidu macierzystego (5,6 kb) (Rysunek 2). DNA ministring można odzyskać za pomocą standardowych protokołów ekstrakcji plazmidów z żelu po przeprowadzeniu AGE. Rysunek 3 podsumowuje wydajność produkcji ministringów w różnych warunkach, które mogą wystąpić podczas realizacji protokołu. Wydajność produkcji ministringów określono na podstawie intensywności prążków DNA przy użyciu programu analitycznego producenta. Do analizy wyników AGE można użyć dowolnego podobnego programu do densytometrii.
Rycina 1: Przegląd produkcji ministringów. (A) Wektor rodzicielski zawiera polilinker w fuzji transkrypcyjnej z genem reporterowym, ograniczony dwiema sekwencjami SS. Szkielet koduje beta-laktamazę dla oporności na ampicylinę i zawiera również kilka miejsc cięcia unikalnych dla szkieletu do trawienia in vitro. (B) Przegląd głównego protokołu. Krok 2) Faza wzrostu i krok 3) Produkcja ministringów zostały przedstawione na diagramie w celu zapewnienia ogólnego schematu zaangażowanych etapów, podkreślając prostotę protokołu. (C) Indukcja ministringów. Indukcja termiczna dezaktywuje represor wrażliwy na temperaturę, umożliwiając ekspresję tel, a następnie aktywność Tel w miejscach SS w plazmidach rodzicielskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Produkcja ministringów po odstąpieniach od protokołu. 1: Kontrola, 2: Nieindukowane, 3: Przehodowane, 4: Nadindukowane, 5: Wczesne usunięcie. DNA ministring ma wielkość około 2.4 kb, szkielet LCC 3 kb, a plazmid macierzysty pNN9 5.6 kb. Intensywność prążków ministringów i szkieletu LCC spada przy odstępstwach od protokołu, co wskazuje na niższą wydajność produkcji ministringów. Od lewej do prawej: drabinka 1 kb od New England Biolabs; Kontrola, zgodnie z protokołem; Nieindukowane, brak podniesienia temperatury; Przehodowane, podniesienie temperatury podczas fazy stacjonarnej; Nadindukowane, przedłużone podniesienie temperatury; Wczesne usunięcie, brak obniżenia temperatury. Plazmidy wyekstrahowano za pomocą Omega-Biotek E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wpływ odstępstw od protokołu na wydajność produkcji (PE) ministringów. Wyniki stanowią średnią z 3 prób. PE szacowano na podstawie względnej intensywności prążka zmierzonej za pomocą urządzenia AlphaImager HP po elektroforezie w żelu agarozowym (AGE). Odstępstwa występowały w następujących krokach: Kontrola – zgodnie z protokołem; Nieindukowane – brak podniesienia temperatury w kroku 2; Przerośnięte – podniesienie temperatury rozpoczęto w fazie stacjonarnej w kroku 1.6; Nadindukowane – przedłużone podniesienie temperatury w kroku 2.3; Wczesne usunięcie – komórki usunięto i poddano ekstrakcji bez obniżenia temperatury w kroku 2.3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
Opisujemy tutaj prosty system do produkcji manipulacji DNA LCC przy użyciu jednoetapowego protokołu indukowanego ciepłem, który nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu poza tym, który jest używany w typowym wzroście i manipulacji bakteriami. Posługiwanie DNA to wolne od skręcania, stabilne kasety liniowej ekspresji DNA, pozbawione prokariotycznych elementów genetycznych. Mogą być stosowane zamiast konwencjonalnych metod transferu genów, ekspresji genów reporterowych, a także w ocenach efektywności ekspresji transgenów w układach eukariotycznych. Manipulacje DNA łączą w sobie korzyści płynące z biokompatybilności i zwiększonej wydajności transfekcji "mini" wektorów z doskonałym profilem bezpieczeństwa liniowych wektorów DNA. Nasza solidna, jednoetapowa platforma produkcyjna in vivo szybko i łatwo wytwarza dane DNA do dowolnej aplikacji transferu genów bez konieczności przeprowadzania wielu kosztownych procesów in vitro .
Istnieje kilka kluczowych kroków mających na celu zapewnienie optymalnej produkcji duszpasterskiej (rys. 2 i 3). Indukcja ciepła jest najważniejszym krokiem w zarządzaniu produkcją. Całkowity brak produkcji posługującej jest najprawdopodobniej spowodowany brakiem indukcji ciepła (komórki utrzymywane w temperaturze 30 °C), gdzie tłumienie ekspresji protelomerazy uniemożliwia konwersję plazmidu prekursorowego do posługiwania LCC. Zgodnie z protokołem indukcji ciepła spodziewaj się wydajności produkcji na poziomie około 75%. Indukcja ciepła jest optymalna, gdy ogniwa są w fazie logarytmicznej. Chociaż nie ma statystycznie istotnej różnicy w podawaniu PE podczas korzystania z komórek w fazie stacjonarnej ("Przerośnięte", ryc. 3), zaobserwowaliśmy prawie 50% spadek ogólnej wydajności plazmidu. Wydajność będzie zależeć od zastosowanego protokołu ekstrakcji plazmidu. Aby zapewnić optymalne zarządzanie produkcją, uruchom indukcję ciepła, gdy ogniwa są w fazie logarytmicznej. Słaba produkcja gospodarowania będzie najprawdopodobniej wynikiem długotrwałego wzrostu temperatury lub niewystarczającego obniżenia temperatury. Długotrwała zmiana temperatury w górę jest odradzana, ponieważ aktywuje to reakcję szoku cieplnego E. coli 15, która może hamować aktywność protelomerazy i zakłócać stabilność plazmidu. Dlatego też czas obniżenia temperatury jest kolejnym krytycznym krokiem dla wydajnej produkcji. Bez dodatkowego czasu inkubacji w temperaturze 30 °C stwierdzono, że wydajność produkcji jest bardzo niska ("Wczesne usuwanie", rysunek 3). Można to przypisać ilości czasu potrzebnego na wyrażenie i aktywność Tel. Pierwotny profag PY54 kodujący protelomerazę Tel zwykle infekuje Yersinia, która optymalnie rośnie około 28 °C12, co wskazuje, że 30 °C może być również bardziej optymalna dla aktywności Tel.
System produkcji miniwektorów DNA wykorzystuje platformę in vivo do generowania wysokiej jakości miniwektorów DNA wolnych od sekwencji bakteryjnych. Modyfikacje protokołu mogą obejmować zmianę pożywki wzrostowej w celu optymalizacji produkcji plazmidu i białek w celu promowania wzrostu komórek w fazie wzrostu (TB zamiast LB) lub zwiększenia wydajności produkcji i konwersji. W przypadku większych objętości hodowli (200 ml i więcej) obniżenie temperatury i inkubacja w temperaturze 30 °C mogą zostać przedłużone z dnia na dzień bez poważnego negatywnego wpływu na duszpasterski PE. Jako przykład zawarliśmy modyfikacje w naszym protokole dla kultur o pojemności 500 ml. Oczyszczanie tkanek DNA można przyspieszyć poprzez trawienie endonukleazy w szkielecie prokariotycznym in vitro . Istnieje wiele miejsc docelowych endonukleazy (np. PI-SceI, PvuI, ScaI) dostępnych w szkielecie prokariotycznym plazmidu prekursorowego, które można przeciąć w celu odsłonięcia otwartych końców liniowych, co pozwala na degradację szkieletu prokariotycznego in vitro . Izolację ministringów od innych gatunków wektorów można również osiągnąć za pomocą chromatografii membranowej z anionwymienną16.
Jednym z obecnych ograniczeń związanych z systemem produkcji wektorów DNA LCC jest potrzeba oczyszczania DNA z innych produktów LCC i CCC. Chociaż można go łatwo oczyścić przy użyciu standardowych metod izolacji plazmidu, etap izolacji może nadal być wadą w warunkach na dużą skalę. Rozdzielenie posługiwania może być czasochłonne przy użyciu AGE, jeśli duszpasterstwo i szkielet prokariotyczny LCC są zbyt podobne pod względem wielkości. Alternatywnie, chromatografia membranowa z anionowymiennością może zapewnić lepsze oddzielenie ministringów od gatunków wektorów CCC16. Przesunięcie temperatury w górę może być kolejnym potencjalnym ograniczeniem, ponieważ wysokie temperatury aktywują również reakcję szoku cieplnego u E. coli, co negatywnie wpływa na wydajność rekombinowanych białek17 , a w konsekwencji zmniejsza tempo konwersji plazmidu do służby. W innym miejscu informujemy o optymalizacjach platformy produkcyjnej w celu obejścia i/lub złagodzenia takich skutków szoku cieplnego18. Obecnie optymalizujemy również metody eliminacji lub redukcji zanieczyszczenia szkieletu prokariotycznego LCC in vivo.
Integracja chromosomalna DNA LCC zakłóca działanie chromosomu gospodarza i poddaje komórkę apoptozie. Nie tylko zmniejsza to potencjalne negatywne konsekwencje mutagenezy insercyjnej, takie jak onkogeneza i wyciszanie sąsiednich genów, poprawiając w ten sposób jej bezpieczeństwo; Efekt śmiertelny może również służyć jako idealna metoda do badań nad efektem dominacji i wymianą genów bez związanych z tym skutków ubocznych i uszkodzeń związanych z integracją. Wektory zarządzające DNA mogą być stosowane do transferu i ekspresji genów białek terapeutycznych, RNA, przeciwciał lub antygenów do danego celu in vivo lub zastępowania wadliwego lub niefunkcjonalnego allelu. Prosty, jednoetapowy, indukowany ciepłem system produkcji in vivo umożliwia łatwe wytwarzanie wektorów do zastosowań klinicznych lub przemysłowych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) za sfinansowanie tej pracy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| E. coli W3NN | Szczep Mediphage | do przetwarzania duszpasterskiego: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP Plazmid | Mediphage | do przetwarzania duszpasterskiego: określany również jako pDNA Ministring (pDMS) | |
| BD Difco Dehydrated Culture Podłoża: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents Wspaniały bulion | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD Bacto Dehydrated | Agar Fisher Scientific | 214010 | |
| Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| Ultrapure Milipore | Water Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Rękawice chirurgiczne systemu oczyszczania wody Mili-Q Advantage A10 |
| VWR | ( | S) 82026-424, (M) 82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand Szalki Petriego z przezroczystą pokrywą z podniesionym grzbietem (100 x 15 mm) | Fisher Scientific FB0875712 | ||
| 30 ml Probówki KIMAX | VWR | 89001-448 | |
| Spektrofotometr Kuweta | Sarstedt | 67.74 | |
| Sterylne 15 ml probówki Falcon | nbsp; BD Falcon | 62406-200, | |
| sterylne probówki wirówkowe 50 ml | FroggaBio | 2930-S0 | |
| Jednorazowe pipety serologiczne polistyrenowe Falcon 10 ml | BD Falcon | 13-675-20 | |
| Jednorazowe pipety serologiczne polistyrenowe Falcon 25 ml | BD Falcon | 13-668-2 | |
| Mikropipetor (100-1,000 μ l) | Mikropipeta FroggaBio | C1000-1 | |
| (20-200 μ l) | FroggaBio | C200-1 | |
| (100-1,250 μ l) | VWR | 89079-472 | |
| Sterylne końcówki do pipet (1-200 μ l) | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific Ekonomiczny palnik | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| Wytrząsarka inkubatora | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| Sterylna kolba Erlenmeyera (125 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| Sterylna kolba Erlenmeyera (250 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| Sterylna kolba Erlenmeyera (500 ml) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| Spektrofotometr | Thermo Fisher Scientific | 335901 | podłogowa Genesys 10 Vis |
| Beckman Coulter | 369001 | model: Wirówka stołowa Avanti J-E | |
| Beckman | 362114 | Model: GS-6R | |
| Fisher Scientific Analogowy mikser wirowy | Fisher Naukowy | 02-215-365 | |
| 1 kb Drabina DNA | New England BioLabs | N3232S |
Bibliografia
- Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
- Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
- Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
- Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
- Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
- Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
- Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
- Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
- Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
- López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
- Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
- Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
- Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154(2012).
- Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
- Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
- Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
- Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).
Przedruki i uprawnienia
