Bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych

Summary

Opracowaliśmy bezznacznikowy system biodetekcji oparty na technologii rezonatora optycznego, znanej jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), który jest w stanie wykrywać pojedyncze cząsteczki w roztworze. Tutaj opisano i przedstawiono procedury stojące za tą pracą.

Abstract

Wykrywanie małych stężeń cząsteczek aż do limitu pojedynczej cząsteczki ma wpływ na takie obszary, jak wczesne wykrywanie chorób i podstawowe badania nad zachowaniem molekuł. Techniki wykrywania pojedynczych cząsteczek często wykorzystują etykiety, takie jak znaczniki fluorescencyjne lub kropki kwantowe, jednak znaczniki nie zawsze są dostępne, zwiększają koszty i złożoność oraz mogą zakłócać badane zdarzenia. Rezonatory optyczne okazały się obiecującym sposobem wykrywania pojedynczych cząsteczek bez użycia znaczników. Obecnie najmniejszą cząstką wykrytą przez niewzmocniony plazmonicznie system gołego rezonatora optycznego w roztworze jest kula z polistyrenu o długości fali²⁵ nm 1. Opracowaliśmy technikę znaną jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), która może przekroczyć ten limit i osiągnąć bezznacznikową detekcję pojedynczej cząsteczki w roztworze wodnym². Ponieważ siła sygnału skaluje się wraz z ilością cząstek, nasze prace zapewniają > 100-krotną poprawę stosunku sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z obecnym stanem techniki. Tutaj przedstawiono procedury stojące za FLOWER w celu zwiększenia jego wykorzystania w terenie.

Introduction

Eksperymenty z wykrywaniem pojedynczych cząsteczek są przydatne do zmniejszania ilości analitu używanego w biosensorach, do wczesnego wykrywania chorób i do badania podstawowych właściwości cząsteczek³. Takie eksperymenty są zwykle przeprowadzane przy użyciu znaczników, jednak nie zawsze jest możliwe uzyskanie znaczników dla określonego białka, zwiększa koszty, może zaburzać badane zdarzenia i może być niewygodne, szczególnie w przypadku eksperymentów w czasie rzeczywistym na miejscu lub diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem.

Obecnym złotym standardem dla biodetekcji bez znaczników jest powierzchniowy rezonans plazmonowy⁴, jednak komercyjne systemy powierzchniowego rezonansu plazmonowego zazwyczaj mają typową dolną granicę wykrywania rzędu nM. Ostatnio rezonatory optyczne stały się obiecującą technologią do bezznacznikowej biodetekcji pojedynczych cząsteczek⁵. Rezonatory optyczne działają w oparciu o długotrwałe (ns) uwięzienie światła^6,7. Światło jest ulotnie sprzężone z tymi urządzeniami, zwykle za pomocą światłowodu. Gdy długość fali światła przechodzącego przez światłowód odpowiada długości fali rezonansowej rezonatora, światło efektywnie sprzęga się z rezonatorem. To sprzężone światło całkowicie wewnętrznie odbija się we wnęce rezonatora, generując ulotne pole w pobliżu obwodu rezonatora. Gdy cząstki wchodzą w pole ulotne i wiążą się z rezonatorem, długość fali rezonansowej rezonatora zmienia się proporcjonalnie do objętości cząstki⁸.

Jeśli chodzi o zdolność wykrywania, rezonatory mikrosferyczne były wcześniej używane do wykrywania pojedynczych cząsteczek wirusa grypy A (100 nm)^9,10. Ostatnio plazmonicznie wzmocnione rezonatory optyczne mikrosfery zostały wykorzystane do wykrywania pojedynczych cząsteczek albuminy surowicy bydlęcej¹¹ i 8-merowych oligonukleotydów¹², jednak podejście to ogranicza obszar wychwytywania cząstek do 0,3^μm2 na urządzenie. Bioczujniki o większym obszarze przechwytywania są idealne do maksymalizacji szansy na wykrycie cząstek. Obecne technologie biodetekcji oparte na rozwiązaniach, bez etykiet, z dużymi obszarami wychwytywania (> 100^μm2) są ograniczone do wykrywania cząstek polistyrenu ≥ 25 nm.

Opracowaliśmy bezznacznikowy system biodetekcji oparty na technologii rezonatora optycznego, znanej jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER)¹³ (Rysunek 1), który jest zdolny do czasowego wykrywania pojedynczych cząsteczek w roztworze. FLOWER wykorzystuje długi czas życia fotonów mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych w połączeniu z kontrolą sprzężenia zwrotnego z blokowaniem częstotliwości, zrównoważoną detekcją i filtrowaniem obliczeniowym do wykrywania małych cząstek aż do pojedynczych cząsteczek białka. Zastosowanie blokowania częstotliwości pozwala systemowi zawsze śledzić przesuwający się rezonans mikrotoroidu podczas wiązania cząstek, bez konieczności przemiatania lub skanowania długości fali lasera w dużych zakresach. Zasady FLOWER mogą być wykorzystane do zwiększenia możliwości wykrywania innych technik, w tym wzmacniania plazmonicznego. W dalszej części opisano procedury wykonywania FLOWER.

Protocol

1. Konfiguracja eksperymentalna i przygotowanie próbki

1. Wytwarzaj mikrotoroidy przy użyciu procedury litografii, trawienia i topienia, jak opisano wcześniej⁶. Wytwarzaj mikrotoroidy na wierzchu płytki krzemowej (chipa), które zwykle mają główną średnicę 80-100 μm i mniejszą średnicę 2 μm.
2. Rozwiń około metra światłowodu jednomodowego (okładzina 125 μm, średnica pola 4,3 μm) ze szpuli światłowodu.
3. W środku rozwiniętej części światłowodu usuń mały segment (2,5 cm) powłoki polimerowej wokół światłowodu za pomocą ściągaczy izolacji. Uwaga: Jest to część światłowodu, która zostanie użyta do ulotnego sprzężenia światła z mikrotoroidem.
4. Wyczyść pozbawione włókien alkoholem izopropanolowym i niestrzępiącą się chusteczką.
5. Przytrzymaj tę część włókna na miejscu za pomocą uchwytu na światłowód wykonanego z zacisków magnetycznych.
6. Rozcieńczyć odizolowane włókno do ~500 nm poprzez topienie i ciągnięcie za pomocą palnika wodorowego i dwóch silników krokowych poruszających się w przeciwnych kierunkach z prędkością 60 μm/min. Umieść światłowód wewnątrz górnej części płomienia, która powinna mieć wysokość ~10 mm. Przestań ciągnąć światłowód, gdy transmisja przez światłowód przestanie się wahać, co można monitorować wizualnie (obserwując, jak światło rozproszone bocznie od światłowodu i wyłącza) lub podłączając światłowód do fotodiody, która jest przymocowana do oscyloskopu.
7. Rozetnij jeden koniec światłowodu i włóż go do adaptera z gołym światłowodem. Umieść ten koniec światłowodu w wejściu fotoodbiornika.
8. Światłowód łączy drugi koniec szpuli światłowodu z laserem za pomocą łącznika światłowodowego.
9. Umieść chip mikrotoroidowy na uchwycie próbki (stal nierdzewna, 37.8 mm x 6.4 mm x 3.2 mm) za pomocą taśmy epoksydowej lub dwustronnej.
10. Zamontuj uchwyt próbki na stoliku pozycjonującym, który składa się z 3-osiowego stolika do nanopozycjonowania (nanosześcianu) (patrz lista wyposażenia) na górze 3-osiowego mikrometru. Wykonuj wszystkie eksperymenty na pneumatycznie izolowanym stole optycznym, aby zminimalizować wibracje.
11. Zgrubnie ustawić chip próbki za pomocą mikrometru 3-osiowego.
12. Ustaw chip zawierający mikrotoroid równolegle do światłowodu za pomocą nanopozycjonera. Uwaga: Ustaw mikrotoroid w odległości jednej długości fali od światła wejściowego (~633 nm). Do wizualizacji tego procesu należy wykorzystać dwie kolumny obrazowania (tubus z soczewką obiektywu i kamerą, patrz lista wyposażenia) umieszczone na górze i z boku chipa.
13. Zoptymalizuj polaryzację światła laserowego kierowanego przez światłowód za pomocą wbudowanego kontrolera polaryzacji (patrz lista wyposażenia) z pokrętłem do regulacji polaryzacji. Uwaga: Optymalna polaryzacja jest osiągana, gdy zmierzone zanurzenie w transmisji światłowodu wydaje się najwęższe. Obserwuj ten spadek na oscyloskopie (więcej szczegółów w kroku 2.2).
14. Skonstruuj komorę na próbki, epoksydując szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku próbki, używając szklanego szkiełka mikroskopowego jako elementu dystansowego. Uwaga: Obudowa z pleksiglasu zakrywająca całą instalację może być przydatna do minimalizacji prądów powietrza. Należy pozostawić mały otwór, aby umożliwić wpompowanie roztworu za pomocą rurki.
15. Zrównoważyć termicznie zawiesiny cząstek lub jednocząsteczkowe roztwory wodne przez ≥ 1 godzinę w łaźni wodnej RT (~500 ml). Uwaga: Próbki rozcieńcza się do pożądanego stężenia w probówkach mikrowirówkowych przy użyciu odpowiednich określonych przez producenta, np. PBS lub HEPES. Jeżeli nie zostaną wykryte żadne zdarzenia wiązania, należy zwiększyć stężenie soli w buforze.
16. Wirować cząstki zawierające roztwory (1 ml) krótko przez ~2 sek.
17. Wstrzyknąć roztwory zawierające cząstki do komory na próbkę z prędkością 1 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej o pojemności 1 ml.
18. Po napełnieniu komory na próbkę wyłączyć pompę strzykawkową.
19. Odczekaj 30 sekund przed zapisaniem danych, aby zminimalizować skutki drgań mechanicznych wynikających z przepływu płynu, które mogą wpływać na pomiar.

2. Blokowanie częstotliwości

1. Ponownie sprzęgnij toroid ze światłowodem, przesuwając uchwyt próbki za pomocą nanopozycjonera, ponieważ sprzężenie zostanie zakłócone z powodu wtrysku płynu.
2. Zlokalizuj długość fali rezonansowej mikrotoroidu, skanując sterowany komputerowo laser wejściowy przez różne długości fal. Wykonaj ten krok, wysyłając trójkątny sygnał napięcia falowego do elementu piezoelektrycznego w sterowniku lasera, który reguluje długość fali lasera. Wykonuj eksperymenty w świetle widzialnym (635 nm ± 2,5 nm), ponieważ absorpcja światła w wodzie o tej długości fali jest niska.
3. Zmierz transmisję światła przez światłowód, podłączając wyjście światłowodu do automatycznie zbalansowanego fotoodbiornika. Podłącz wyjście fotoodbiornika do oscyloskopu za pomocą BNC. Obserwuj na oscyloskopie, że przy długości fali rezonansowej mikrotoroidu transmisja przez światłowód spada.
4. Podłącz wyjście fotoodbiornika do głównego wejścia sterownika sprzężenia zwrotnego z blokadą częstotliwości (patrz lista wyposażenia) za pomocą.
5. Uruchom regulator sprzężenia zwrotnego z blokadą częstotliwości w trybie automatycznej blokady, używając blokady górnej części szczytu z częstotliwością roztrząsania 2 kHz i amplitudą oscylacji długości fali 19 fm. Empirycznie ustaw ustawienia pochodnej proporcjonalnej całki w oknie oprogramowania, korzystając z reguł strojenia Zieglera-Nicholsa¹⁴. Uwaga: te wartości należy ustawić tylko raz na początku wszystkich eksperymentów.
6. Automatycznie blokuj długość fali lasera do długości fali rezonansowej mikrotoroidu. Wykonaj ten krok po napełnieniu komory na próbkę. Uwaga: Jeśli przesunięcie długości fali jest zbyt duże, kontroler sprzężenia zwrotnego straci blokadę i automatycznie przełączy się w tryb skanowania w celu zlokalizowania lokalizacji długości fali rezonansowej. Dzieje się tak w przypadku przesunięć długości fal większych niż około jednej szerokości linii (co najmniej 600 fm dla wszystkich badanych tutaj systemów).
7. Nagraj wyjście kontrolera sprzężenia zwrotnego przy 20 kHz za pomocą 24-bitowej karty akwizycji danych. Eksportuj dane jako plik tekstowy za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.

3. Przetwarzanie i analiza danych

1. Fourier przekształca dane w MATLAB.
2. Dolnoprzepustowość danych za pomocą filtra "brick-wall" z odcięciem przy 1 kHz, aby usunąć narzuconą częstotliwość ditheru 2 kHz (patrz zrzut ekranu 1 pliku kodu uzupełniającego).
3. Obliczeniowo filtruj dane z wycięciem przy użyciu okna o rozmiarze 16 Hz. Uwaga: Ma to na celu usunięcie znanych źródeł szumów, w tym przypadku szumu linii elektronicznej 60 Hz i jego harmonicznych, a także 100 Hz (pochodzących ze sterownika lasera) i jego harmonicznych (patrz zrzut ekranu 1 pliku kodu uzupełniającego).
4. Odwrotność Fouriera przekształca dane z powrotem w dziedzinę czasu.
5. Mediana filtruje dane przy użyciu rozmiaru okna 1 001 próbek (patrz zrzut ekranu pliku kodu uzupełniającego 2).
6. Zlokalizuj skokowe zmiany długości fali rezonansowej za pomocą algorytmu znajdowania kroku Kerssemakersa i wsp.^{Rozdział 15}.
7. Wygeneruj histogramy amplitudy każdego kroku wiązania.
8. Oblicz wielkość cząstek za pomocą równania (1) (patrz Dyskusja).

Results

Zdarzenia wiązania cząstek są wyraźnie widoczne jako skokowe zmiany długości fali rezonansowej mikrotoroidu w czasie (Rysunek 2A). Wysokości tych stopni są pokazane jako histogram na rysunku 2B. Ryciny 2-4 pokazują reprezentatywne ślady wiązania egzosomów (nanopęcherzyków), kulek krzemionki 5 nm i pojedynczych cząsteczek ludzkiej interleukiny-2. Fakt, że zdarzenia przypominające krok skalują się wraz z wielkością cząstek, pokazuje, że technika została wykonana prawidłowo...

Discussion

Gdy cząstka się wiąże, długość fali rezonansowej (λ) toroidu wzrasta. Jeśli cząstka się odczepi, długość fali rezonansowej odpowiednio się zmniejsza (zdarzenie obniżające). Średnicę cząstki (d) można określić za pomocą histogramów amplitudy każdego kroku długości fali. Wysokość każdego kroku długości fali zmienia się ze względu na zmiany wielkości związanej cząstki oraz ze względu na miejsce na mikrotoroidzie, w którym cząstka się wiąże. Maksymalna zmiana długości fali rezonansowej (wysokości kroku) wys...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przestrajalny laser diodowy	Newport	TLB-6300
Kontroler lasera	Newport	TLB-6300-LN
Kontroler sprzężenia zwrotnego z blokadą częstotliwości	Toptica Photonics	Digilock 110
Automatycznie zbalansowany fotoodbiornik	Newport	Model 2007
Kontroler polaryzacji in-line	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bitowa karta akwizycji danych	National Instruments	NI-PCI-4461
Rekombinowana ludzka interleukina-2	Pierce Biotechnology	R201520
Koraliki polistyrenowe 20 nm	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Stół optyczny	Newport	VH3660W-OPT
Soczewka obiektywu do kolumny obrazowej	Navitar Machine Vision	1-60228
Kolumna obrazowania (tubus adaptera)	Navitar Machine Vision	1-60228
Kamera CCD o wysokiej rozdzielczości do kolumny obrazowania	Edmund Industrial Optics	NT39244