Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siatkówka jest dobrym modelem dla rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego. Duży rozmiar oka, a co najważniejsze, dostępność do eksperymentalnych manipulacji in vo/in vivo sprawia, że siatkówka embrionalna kurczaka jest wszechstronnym i bardzo wydajnym modelem eksperymentalnym. Chociaż siatkówka kurczaka jest łatwa do namierzenia in ovo za pomocą wstrzyknięć wewnątrzgałkowych lub elektroporacji, skuteczne i dokładne stężenie odczynników w siatkówce może być trudne do pełnego kontrolowania. Może to być spowodowane zmianami w dokładnym miejscu wstrzyknięcia, wyciekiem z oka lub nierównomierną dyfuzją substancji. Co więcej, częstość wad rozwojowych i śmiertelności po inwazyjnych manipulacjach, takich jak elektroporacja, jest dość wysoka.
Ten protokół opisuje technikę ex ovo hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka i dostarcza metodę kontrolowanej ekspozycji siatkówki na odczynniki. Protokół opisuje, jak preparować, eksperymentalnie manipulować i hodować całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka. Eksplantaty można hodować przez około 24 godziny i poddawać różnym manipulacjom, takim jak elektroporacja. Główną zaletą jest to, że eksperyment nie jest zależny od przeżycia zarodka oraz że stężenie wprowadzonego odczynnika może być zmieniane i kontrolowane w celu określenia i optymalizacji skutecznego stężenia. Co więcej, technika ta jest szybka, tania, a w połączeniu z wysokim wskaźnikiem sukcesu eksperymentalnego zapewnia powtarzalne wyniki. Należy podkreślić, że stanowi ona doskonałe uzupełnienie eksperymentów przeprowadzanych in ovo.
Wprowadzenie
Siatkówka jest częścią ośrodkowego układu nerwowego i jest, dzięki swojej względnej prostocie i dobrze scharakteryzowanej architekturze komórkowej, popularnym modelem do badania rozwoju ośrodkowego układu nerwowego. Oko zarodka kurczaka jest stosunkowo duże w porównaniu z resztą zarodka. Dzięki temu jest łatwo dostępny in ovo do manipulacji eksperymentalnych, takich jak zastrzyki lub elektroporacja, i służy jako doskonałe narzędzie do zdobywania wiedzy na temat komórek siatkówki i biologii rozwoju in vivo. Pomimo tych głównych zalet, przeżywalność zarodków może być niska, gdy eksperymenty są inwazyjne, takie jak elektroporacja, wielokrotne wstrzyknięcia lub połączone manipulacje eksperymentalne.
Elektroporacja plazmidów DNA do zarodka kurczaka in ovo jest ważną i dobrze znaną techniką1. Pozwala na znakowanie neuronów, śledzenie losów komórek, a także dróg neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym i pozwala na ektopową ekspresję genów w celu analizy funkcji białek in vivo. Technika ta została wykorzystana do badań cewy nerwowej2, tyłomózgowia3 i siatkówki4. Elektroporacja siatkówki zarodkowej in ovo wiąże się z pewnymi trudnościami eksperymentalnymi, które są związane z sytuacją in vivo. Położenie oka, ze względu na fałdowanie czaszki zarodka, jest stosunkowo blisko serca. Ta bliskość zwiększa ryzyko zatrzymania krążenia po elektroporacji, a ryzyko to wzrasta wraz z wiekiem zarodka. Ponadto, aby uzyskać dostęp do oka, konieczne jest otwarcie błon embrionalnych, zwiększając w ten sposób ryzyko krwawienia, wad rozwojowych i późniejszego zmniejszenia żywotności. Podczas testowania i optymalizacji nowego plazmidu DNA, często bez znanego wyniku fenotypowego, ograniczenia te mogą zmniejszyć skuteczność i moc metody nawet dla doświadczonego eksperymentatora. Jak przedstawiono w niniejszym protokole, hodowla całego eksplantatu siatkówki, zdefiniowanego jako cała siatkówka nerwowa z usuniętym nabłonkiem barwnikowym, jest skuteczną metodą, która uzupełnia podejście in ovo.
Wewnątrzgałkowe wstrzyknięcia odczynników chemicznych są stosunkowo łatwe do wykonania w ovo. Jednak skuteczne i dokładne stężenie wstrzykiwanych odczynników w siatkówce nerwowej może być trudne do pełnej kontroli. Objętość wstrzykniętego odczynnika może się różnić ze względu na nieszczelność, a dokładne miejsce wstrzyknięcia może wpływać zarówno na rozprowadzanie odczynnika w oku, jak i na dyfuzję przez ciało szkliste. Zmienność będzie miała poważne implikacje dla interpretacji wyników, gdy np. zostanie określona krzywa dawka-odpowiedź dla inhibitora enzymu; Zwłaszcza, jeśli efekt jest niewielki, a okno czasowe efektu jest wąskie. Co więcej, podczas przeprowadzania eksperymentów in ovo można użyć tylko jednego oka z każdego zarodka ze względu na potencjalne skutki ogólnoustrojowe poprzez przepływ krwi na oko przeciwległe. Dopasowanie wieku jest ważne podczas badania rozwoju, a indywidualna zmienność między zarodkami poddanymi działaniu substancji i kontrolnych może prowadzić do dodatkowej zmienności eksperymentalnej.
Z tych powodów opracowano metodę ex ovo opartą na eksplantatach siatkówki z zarodków kurczaka, w której siatkówka nerwowa może być wystawiona na działanie jednolitych i kontrolowanych warunków eksperymentalnych in vitro. Niniejszy protokół został opracowany w oparciu o poprzednie protokoły5-9. Eksplantaty siatkówki od stadium (st) 20 (dni embrionalne [E] 3) do st31 (E7) zarodki kurczaków wypreparowano, wyhodowano i elektroporowano z określonym stężeniem plazmidu DNA lub wystawiono na działanie pożywki zawierającej określone stężenie odczynnika chemicznego. Przedstawiony tutaj protokół został z powodzeniem wdrożony w ostatnich publikacjach, przy użyciu kilku różnych odczynników chemicznych, w tym regulatorów szlaku uszkodzenia DNA, takich jak KU55933, SB 218078 i NSC 109555 ditosylat, oraz cyklu komórkowego, takiego jak inhibitor Cdk1/2 III10,11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest wykonywany zgodnie z zaleceniami zawartymi w "Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych Stowarzyszenia do badań nad wzrokiem i okulistyką".
1. Obchodzenie się z jajami i zbieranie oczu
- Białe jaja Leghorn należy przechowywać w temperaturze 12-14 °C nie dłużej niż 1 tydzień. Jeśli to możliwe, użyj chłodzonej chłodziarki do wina do przechowywania zapłodnionych jaj.
Uwaga: Wyższe temperatury przechowywania prowadzą do nieprawidłowego rozwoju zarodków, podczas gdy niższe temperatury zwiększają śmiertelność. Wydłużony czas przechowywania zwiększa zarówno śmiertelność, jak i nieprawidłowy rozwój. - Jaja należy inkubować w inkubatorze o temperaturze 37,5 °C i wilgotności 60% z delikatnym kołysaniem z częstotliwością 5 razy na 24 godziny.
- Wyjąć inkubowane jaja z inkubatora jaj w pożądanym wieku embrionalnym.
Uwaga: Wiek zarodka kurcząt określa się jako czas inkubacji i oznacza się go jako dni embrionalne (E) lub jako stadia (st), zgodnie z serią stadiów rozwojowych opisanych przez Hamburgera i Hamiltona12. - Umieść wybrane jaja w okapie z przepływem laminarnym. Przetrzyj skorupkę jajka 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia zarodka.
Uwaga: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych, używając sterylnych roztworów https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory" i narzędzi. - Mocno uderz bokiem jajka o twardą powierzchnię, aby je rozłupać. Umieść zawartość na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą małej łyżeczki przenieś zarodek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą wstępnie podgrzany (37 °C) 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.
- Umieścić szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą tkankę zarodkową na dwuokularowym mikroskopie stereowizyjnym w kapturze z przepływem laminarnym. Odetnij głowę zarodkowi, ściskając szyję cienkimi kleszczami i wyrzuć ciało.
- Użyj cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie przez usta, brzusznie do oka. Zaczynając od miejsca nacięcia, rozerwij tkankę otaczającą całe oko. Uszczypnij nerw wzrokowy i usuń nienaruszone oko z oczodołu. Należy pobrać zarówno lewe, jak i prawe oko z tego samego zarodka do wykorzystania jako oko kontrolne lub leczone.
- Za pomocą małej łyżeczki przenieś oczy na nową szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą wstępnie podgrzaną (37 °C) 1x PBS.
2. Przygotowanie całych eksplantatów siatkówki
- Użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć całą tkankę wokół oka, w tym anlagę twardówki.
Uwaga: Tkanka łatwo się odkleja, pozostawiając siatkówkę na ciele szklistym i soczewce z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym (ryc. 1A-B). - Użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć małe nacięcie w nabłonku barwnikowym w grzbietowej części oka, nie uszkadzając siatkówki nerwowej (ryc. 1C).
- Użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie rozerwać nabłonek barwnikowy, zaczynając od miejsca nacięcia, pozostawiając soczewkę i całą siatkówkę przyczepioną do ciała szklistego (ryc. 1D). Utrzymuj oko w cieple (37 °C) 1x PBS, aby ułatwić usunięcie nabłonka barwnikowego.
Uwaga: Nabłonek barwnikowy może być trudny do usunięcia, w szczególności wzdłuż ciała rzęskowego wokół źrenicy, w przedniej części oka i wzdłuż szczeliny naczyniówki. W związku z tym część nabłonka barwnikowego może pozostać na siatkówce nerwowej (ryc. 1E-F).
3. Leczenie całych eksplantatów siatkówki
- Elektroporacja całych eksplantatów siatkówki
Uwaga: Elektroporację całych eksplantatów siatkówki można wykonać bezpośrednio po kroku 2.- Przygotuj pożywkę zawierającą mieszankę składników odżywczych 1:1 DMEM:F12, 10% FBS, 10 U/ml penicyliny streptomycyny, 5 μg/ml insuliny i 2 mM L-glutaminy.
- Odetnij jednorazową plastikową kuwetę o pojemności 1,5 ml (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (lub dowolny mały pojemnik mogący pomieścić 300-400 μl roztworu) około 8 mm od dna za pomocą piły o cienkim ostrzu.
- Rozcieńczyć wybrany plazmid DNA w 1xDPBS do końcowego stężenia 0,1 μg/μl.
- Włącz elektroporator i ustaw parametry na 15 V dla siatkówki st20 – st25 (E3-E4) i 20 V dla siatkówki st26 – st27 (E5). Ustaw powtórzenia impulsów na 5 impulsów o długości impulsu 50 ms w odstępach 1 sekundy. Użyj generatora impulsów, który można sterować za pomocą pedału nożnego na podłodze, ponieważ do utrzymania elektrod na miejscu potrzebne będą obie ręce.
- Podłącz dwie platynowe elektrody w kształcie łopatek (płaskie, okrągłe o średnicy 4 mm) (Rysunek 2A) do gniazda wyjściowego w generatorze impulsów.
Uwaga: Elektrody platynowe użyte w tym protokole zostały wykonane przez warsztat uniwersytecki. Elektrody wykonano z platynowej płytki o grubości 0,1 mm "rondelles" (klasa platyny: 950 Pt/5 Cu). Przewód łączący 0,8 mm został zaizolowany za pomocą rurki z tworzywa sztucznego. - Ostrożnie przenieś cały eksplant siatkówki z kroku 2.3 do kuwety (lub równoważnego małego pojemnika) za pomocą polietylenowej pipety Pasteura z odciętą końcówką, aby uzyskać odpowiedni rozmiar otworu końcówki dla eksplantatu siatkówki. Unikaj używania końcówek do pipet, ponieważ siatkówka ma tendencję do przyczepiania się do plastiku i rozrywania się.
- Użyj pipety o pojemności 100 μl, aby delikatnie usunąć cały 1x PBS otaczający eksplant siatkówki, uważając, aby nie dotknąć siatkówki, aby uniknąć rozerwania.
- Dodaj 100 μl roztworu plazmidu do kuwety, aby pokryć cały eksplant siatkówki. Delikatnie dociśnij eksplant siatkówki kleszczami, jeśli unosi się do góry. Użyj kleszczyków lub elektrod, aby ustawić soczewkę tak, aby była skierowana w stronę dowolnej strony kuwety, a nerw wzrokowy do dna kuwety.
- Umieść elektrodę dodatnią przed soczewką, a elektrodę ujemną za siatkówką (rysunek 2A), nie dotykając tkanki.
- Zastosuj prąd, naciskając pedał nożny. Sprawdź, czy na elektrodach nie ma pęcherzyków wskazujących na pomyślne rozładowanie.
- Użyj pipety o pojemności 100 μl, aby usunąć całą mieszaninę plazmidu z kuwety bez uszkadzania siatkówki. Mieszanina plazmidów może być ponownie użyta od trzech do pięciu razy.
- Napełnij kuwetę wstępnie podgrzanym (37 °C) 1x PBS. Użyj kleszczyków, aby delikatnie odłączyć eksplant siatkówki od ścianki kuwety. Po elektroporacji siatkówka bywa pokryta pęcherzykami, co sprawia, że przylega do ścianki kuwety.
- Za pomocą pipety Pasteura z polietylenu przenieść cały eksplant siatkówki do 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować jeden eksplant siatkówki na studzienkę.
- Inkubować eksplant siatkówki w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotatorowej, ze stałą prędkością 50 obr./min, w inkubatorze komórkowym z 5% CO2 przez 24 godziny. Rotacja ma na celu zapewnienie maksymalnej ekspozycji na podłoże i zapobieżenie przyleganiu siatkówki do dna płytki 24-dołkowej.
- Przejdź do kroku 4.
- Traktowanie całych eksplantatów siatkówki odczynnikami chemicznymi
Uwaga: Obróbkę chemiczną całych eksplantatów siatkówki można przeprowadzić bezpośrednio po kroku 2.- Przygotuj pożywkę zawierającą mieszankę składników odżywczych 1:1 DMEM:F12, 10% FBS, 10 U/ml penicyliny streptomycyny, 5 μg/ml insuliny i 2 mM L-glutaminy.
- Za pomocą małej łyżki przenieś eksplant siatkówki z kroku 2.3 do 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować jeden eksplant siatkówki na studzienkę.
- Inkubować cały eksplant siatkówki przez 60 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotatorowej, ze stałą prędkością 50 obr./min, w inkubatorze komórkowym z 5% stężeniem CO2 przed dodaniem odczynnika chemicznego lub nośnika.
- Przygotować roztwór chemiczny, na przykład Cdk1/2 inhibitor III, inhibitor progresji M-fazy13, o końcowym stężeniu 30 μM w DMSO.
- Wyjąć 24-dołkową płytkę zawierającą cały eksplant siatkówki z inkubatora komórkowego. Dodać 10 μl odczynnika chemicznego lub nośnika (DMSO) bezpośrednio do podłoża siatkówkowego, uzyskując końcowe stężenie 300 nM inhibitora Cdk1/2 III w 0,01% DMSO. Ręcznie obróć płytkę 24-dołkową, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie odczynnika chemicznego lub nośnika w roztworze.
- Inkubować eksplantaty siatkówki w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotatorowej, ze stałą prędkością 50 obr./min, w inkubatorze z 5% CO2 przez żądany czas (do 24 godzin).
- Przejdź do kroku 4.
4. Utrwalanie i zamrażanie całych eksplantatów siatkówki
- Wyjąć z inkubatora komórkowego 24-dołkową płytkę zawierającą cały eksplant siatkówki poddany działaniu środka.
- Użyj małej łyżeczki, aby przenieść eksplant siatkówki na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml / studzienkę lodowato zimnego 4% paraformaldehydu w 1xPBS. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
- Użyj małej łyżeczki, aby przenieść cały eksplant siatkówki na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml / studzienkę lodowato 1xPBS w celu umycia siatkówki. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
- Użyj małej łyżeczki, aby przenieść cały eksplant siatkówki na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml / studzienkę lodowato 30% sacharozy w 1xPBS. Inkubować na lodzie przez 1-3 godziny w zależności od dnia embrionalnego siatkówki. W przypadku siatkówek st20 – st25 (E3) inkubować przez 1 godzinę, starsze siatkówki wymagają dłuższego czasu inkubacji w sacharozy.
- Za pomocą małej łyżki przenieś cały eksplant siatkówki na folię parafinową zawierającą około 500 μl kriostatu do zamrażania. Usuń jak najwięcej sacharozy, delikatnie przesuwając eksplant siatkówki w pożywce zamrażającej za pomocą małej łyżki.
- Przenieś eksplant siatkówki do formy do zatapiania zawierającej medium zamrażające. Ustaw oko, aby ułatwić przyszłe sekcje. Umieść formę do osadzania zawierającą cały eksplant siatkówki na suchym lodzie, aż podłoże zamarznie w stanie stałym. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje przygotowanie (Rycina 1A-F) oraz hodowlę całych eksplantów siatkówki z embrionów kurczaka. Protokół ten został z sukcesem zastosowany w przypadku całych eksplantów siatkówki z embrionów od stadiów st20 (E3) do st31 (E7).
Elektroporacja plazmidów DNA do całych eksplantów siatkówki umożliwia znakowanie i śledzenie komórek progenitorowych siatkówki lub nadekspresję różnych produktów genowych. W eksperymentach z elektroporacją nabłonek pigmentowy został ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy przedstawiono szczegółowy protokół preparacji, elektroporacji lub obróbki chemicznej oraz hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaków. Protokół ten jest łatwy, szybki i pozwala zarówno na wysoki wskaźnik sukcesu, jak i powtarzalne wyniki.
Elektroporacja całych eksplantatów siatkówki wytwarza duże obszary komórek, które wyrażają interesujący nas konstrukt genu. Łatwo jest prawidłowo ustawić elektrody i wystawić określoną część siatkówki na działanie okreś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Praca była wspierana przez Barncancerfonden (PR2013-0104), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond i St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm szalka Petriego | VWR | 734-0006 | |
| 100 μ l końcówki do pipet | VWR | 613-0798 | |
| 1,5 ml jednorazowa plastikowa kuweta | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-dołkowa płytka | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm szalka Petriego | VWR | 391-1998 | |
| 70% etanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM w 0,01% DMSO |
| Inkubator do hodowli komórkowych | Mikroskop | ||
| Leica | |||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Elektrody | Platina, wykonane na zamówienie | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Mieszanka składników odżywczych | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Kleszcze | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Medium zamrażające NEG50 | Cellab, Szwecja | 6502 | |
| GFP z ekspresją plazmidu DNA (pZG) | |||
| Nawilżany inkubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Niemcy | 8204 | |
| Insulina | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030024 | |
| Medium montażowe ProLong Gold z DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Folia parafinowa | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyd | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Forma do zatapiania Peel-A-Way | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicylina streptomycyna | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fosfohiston 3 (PH3) | Milipore | 06-570 | Rozcieńczenie 1/4 000 |
| Elektrody platynowe (wykonane na zamówienie z "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Średnica: 4 mm, grubość 0,1 mm |
| Elektrody Platimun | Sonidel | CUY700P4L | Średnica: 4 mm |
| Pipeta pasteura z polietylenu | VWR | 612-2853 | |
| Wytrząsarka rotatorowa | VWR | 444-2900 | |
| Mała łyżka | VWR | 231-2151 | |
| Sacharoza | VWR | 443815S | |
| Białe jaja | Lokalny dostawca | ||
| Chłodziarka do wina | WineMaster 24, Caso, Berlin, Niemcy |
Bibliografia
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
