Zawał mięśnia sercowego (MI) nie tylko powoduje upośledzenie funkcji serca, ale także apoptozę w ciele migdałowatym, regionie mózgu zaangażowanym w behawioralne konsekwencje zawału mięśnia sercowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób indukować zawał mięśnia sercowego, pobierać tkankę ciała migdałowatego i mierzyć w niej aktywność kaspazy-3, markera apoptozy.
Artykuł metodologiczny
Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zawał mięśnia sercowego (MI) ma dramatyczne średnio- i długoterminowe konsekwencje na poziomie fizjologicznym i behawioralnym, ale mechanizmy z nim związane są nadal niejasne. Nasze laboratorium opracowało szczurzy model zespołu post-MIG, który objawia się upośledzonymi funkcjami serca, utratą neuronów w układzie limbicznym, deficytami poznawczymi i behawioralnymi objawami depresji. Na poziomie neuronalnym aktywacja kaspazy-3 pośredniczy w apoptozie po zawale mięśnia sercowego w różnych regionach limbicznych, takich jak ciało migdałowate – osiągając szczyt po 3 dniach po zawale mięśnia sercowego. Zaburzenia poznawcze i behawioralne pojawiają się 2-3 tygodnie po zawale mięśnia sercowego i są one statystycznie skorelowane z pomiarami aktywności kaspazy-3. Opisany tutaj protokół służy do indukcji zawału mięśnia sercowego, pobierania tkanki ciała migdałowatego i pomiaru aktywności kaspazy-3 za pomocą spektrofluorometrii. Aby wywołać zawał mięśnia, zstępująca tętnica wieńcowa jest zamykana na 40 minut. Protokół oceny aktywacji kaspazy-3 rozpoczyna się 3 dni po zawale mięśnia sercowego: szczury są uśmiercane, a ciało migdałowate szybko izolowane z mózgu. Próbki są szybko zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu właściwej analizy. Technika wykonywana w celu oceny aktywacji kaspazy-3 opiera się na rozszczepieniu substratu (DEVD-AMC) przez kaspazę-3, która uwalnia związek fluorogenny, który można zmierzyć za pomocą spektrofluorometrii. Metodologia jest ilościowa i odtwarzalna, ale wymagany sprzęt jest drogi, a procedura ilościowego oznaczania próbek jest czasochłonna. Technikę tę można zastosować do innych tkanek, takich jak serce i nerki. DEVD-AMC można zastąpić innymi substratami w celu pomiaru aktywności innych kaspaz.
Wprowadzenie
Kaspazy lub zależne od cysteiny proteazy kierowane asparaginianem to rodzina enzymów, które biorą udział w różnych procesach homeostazy1. Kaspazy można ogólnie sklasyfikować ze względu na ich rolę w apoptozie lub zapaleniu. Kaspaza-1, -4, -5 i -12 są zaangażowane w stan zapalny, podczas gdy te zaangażowane w apoptozę można podzielić na kaspazy inicjujące (kaspaza-8 i -9) i kaspazy katowskie (kaspaza-3, -6 i -7).
Kaspazy odgrywają znaczącą rolę w wielu patologiach, głównie w zaburzeniach, gdzie apoptoza może być nadmierna, co obserwuje się po zawale mięśnia sercowego (MI) lub niedokrwieniu mózgu.
W szczurzym modelu zespołu post-MI używanym w naszym laboratorium, ustalono, że kaspaza-3 jest aktywowana nie tylko w mięśniu sercowym2, ale także w układzie limbicznym, który jest zaangażowany w kontrolę nastroju i emocji3-6. Obserwuje się również, że kaspaza-3 jest aktywowana w różnych regionach układu limbicznego, takich jak ciało migdałowate i hipokamp, a aktywacja ta osiąga szczyt około 3 dni po urazie niedokrwiennym4. Co ciekawe, aktywność kaspazy-3 koreluje z zaburzeniami zachowania po zawale mięśnia sercowego, a jej tłumienie poprzez interwencje farmakologiczne i żywieniowe zmniejsza te urazy, co sugeruje możliwy związek między kaspazą-3 a depresją po zawale mięśnia sercowego7-12.
Aktywacja kaspazy-3 może być mierzona różnymi technikami. Western blotting ustala właściwości enzymatyczne kaspaz i może wykryć aktywne enzymy, a także ich formy proenzymatyczne. Western blot jest jednak częściowo ilościowy, a niewielkie różnice mogą zostać utracone z powodu słabych stosunków sygnału do szumu13. Lepsza technika opiera się na rozszczepieniu substratu (DEVD-AMC) przez kaspazę-3, która uwalnia związek fluorogenny i może być mierzona za pomocą spektrofluorometrii. Aktywacja kaspazy-3 jest wiarygodnym markerem apoptozy. Pomiar apoptozy może być niestabilny, ponieważ okno czasowe występowania jest krótkie, a sąsiednie komórki mogą fagocytować ciała apoptotyczne lub komórki14. Apoptozę można dodatkowo potwierdzić za pomocą innych technik, takich jak test znakowania końca nicka końca deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), który wykrywa fragmentację DNA wynikającą z apoptotycznych kaskad sygnalizacyjnych6 lub stosunek białek pro-/antyapoptotycznych, takich jak Bax / Bcl26.
Protokół
Ze zwierzętami obchodzimy się zgodnie z przepisami lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Szczury są trzymane pojedynczo w stałych warunkach (temperatura 21-22 ºC i wilgotność 40-50%), w tym 12-godzinny cykl ciemnego światła, rozpoczynający się o godzinie 08:00. Granulki z chow i woda z kranu są dostępne ad libitum przez cały czas trwania badania. Przed eksperymentem dopuszczalny jest okres aklimatyzacji wynoszący 3 dni po dostawie przez dostawcę. Samce szczurów Sprague-Dawley o wadze od 300 do 800 g były rutynowo wykorzystywane z tym protokołem.
1. Chirurgia mięśnia sercowego
- Wywołać znieczulenie za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć ketaminy 60 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak odruchu, gdy łapy są ściśnięte.
- Ogolić miejsce operacji. Zaintubuj szczura rurką dotchawiczą: cewnik (16 G 1,77 cala) i umieść zwierzę w bocznej pozycji odleżynowa. Umieść zwierzęta na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę około 37 °C. Podłącz rurkę dotchawiczą do izofluranu 2%.
- Przygotować miejsce operacji za pomocą glukonianu chlorheksydyny i alkoholu izopropylowego. Podczas zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek i wysterylizowanych narzędzi. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Umieść sterylne pole na zwierzęciu, a narzędzia na innym sterylnym polu obok zwierzęcia.
- Naciąć skórę ostrzem skalpela #10. Oderwij tkankę mięśniową za pomocą zacisku hemostatycznego. Umieść zwierzę w brzusznej pozycji odleżynowej. Otwórz ścianę klatki piersiowej za pomocą hemostatycznego zacisku i pozycyjnego zwijacza klatki piersiowej. Otwórz osierdzie za pomocą zacisku hemostatycznego.
- Aby wywołać niedrożność naczyń wieńcowych, owiń jedwabny szew 4-0 o długości 360 mm wokół zstępującej tętnicy wieńcowej, przechodząc przez przylegającą tkankę mięśnia sercowego. Włóż oba końce jedwabnego szwu do plastikowej rurki o długości 14 g i 1,25 cm.
- Pociągnij oba końce jedwabnego szwu i dociśnij rurkę do tętnicy, aby ją zatkać, przez 40 minut. Zabezpiecz okluzję, zaciskając plastikową rurkę za pomocą hemostatycznego zacisku.
- Po 40 minutach zwolnij okluzję, zwalniając zacisk hemostatyczny, a następnie usuń elastyczną rurkę i szew jedwabny.
Uwaga: Szczury z grupy kontrolnej przechodzą ten sam zabieg chirurgiczny bez niedrożności tętnicy wieńcowej. - Przed zamknięciem ściany klatki piersiowej należy umieścić elastyczny cewnik (18 G, 4,5 cm) przez jamę klatki piersiowej, aby wyciągnąć powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, aby zapobiec odmie opłucnowej.
- Zamknij jamę klatki piersiowej szwem 2-0, zszyj mięsień szwem jedwabnym 4-0, a skórę szwem jedwabnym 3-0.
- Przed zamknięciem ostatniego punktu skórnego należy ponownie pobrać powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przez cewnik umieszczony wcześniej w jamie klatki piersiowej.
- Zszyj ostatni punkt skóry. Zatrzymać wentylację izofluranem.
- Monitoruj budzenie się szczurów. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
- Szczura należy leczyć co 8 godzin przez 24 godziny lekiem przeciwbólowym (buprenorfina, 0,05 mg/kg i.p.) i antybiotykiem (pojedyncza dawka duplocyliny, 0,2 mg/kg i.p.).
- Po zabiegu szczury domowe są pojedynczo do czasu złożenia ofiary, tj. 3 dni po zawale mięśnia sercowego.
- Wielkość zawału, głównie martwicy, jest wyrażona jako odsetek tkanki zawału w obszarze zagrożonym lewą komorą. Można to zmierzyć za pomocą zabarwienia trifenylotetrazolium11.
2. Izolacja ciała migdałowatego
- Umieść głowę zwierzęcia najpierw w torbie w kształcie stożka, z nosem wystającym z wąskiego otworu końcowego. Zabezpiecz szczura, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu. Ustaw jego głowę odpowiednio na gilotynie, między ostrzami nożyczek. Odetnij głowę zwierzęcia.
- Umieść głowę szczura w naczyniu trzymanym na pokruszonym lodzie. Wszystkie procedury izolacji tkanek należy wykonać na kruszonym lodzie (4 °C).
- Rozetnij czaszkę nożyczkami, ostrożnie odłącz pochewki kostne za pomocą kostnych rongeurów, podciągając i unikając okaleczania tkanki pod spodem.
- Umieść płaskie ostrze szpatułki między dnem czaszki a tylną brzuszną powierzchnią mózgu i ostrożnie odłącz mózg od czaszki, delikatnie popychając ostrze do przodu wzdłuż dna czaszki, aż mózg będzie mógł być powoli wynoszony z czaszki. Wyrzuć czaszkę.
- Umieść mózg na jego grzbietowej powierzchni. Zidentyfikuj podwzgórze (strukturę przed móżdżkiem) i przetnij mózg koronalnie przed jego przednim końcem i za tylnym końcem; Wyrzuć przednią i tylną część mózgu, jeśli nie jest potrzebna do innych zastosowań.
- Wyobraź sobie ciało migdałowate jako małe kulki pod płatami skroniowymi, obustronnie, tuż obok podwzgórza.
- Odwróć mózg płasko na jego przednim końcu, na powierzchni grzbietowej od eksperymentatora.
- Zacznij od lewej lub prawej półkuli mózgu. Oddziel półkule, a następnie korę mózgową od przyległego ciała migdałowatego. Wytnij około 8 mm tej luźnej kory, aby umożliwić izolację ciała migdałowatego. Odetnij ciało migdałowate skalpelem.
- Odizoluj podstawno-boczną część ciała migdałowatego od jego części środkowo-przyśrodkowej, przecinając wzdłuż ciemnego szwu, który biegnie w poprzek, prawie pół na pół. Struktura ta nie zawsze jest łatwa do zidentyfikowania.
- Umieścić części ciała migdałowatego w oddzielnych zidentyfikowanych fiolkach i trzymać na rozdrobnionym lodzie.
- Powtórz procedurę preparacji z drugą półkulą.
- Zanurzyć fiolki w ciekłym azocie na 1 minutę. Fiolkę należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu, gdy będzie potrzebna.
3. Aktywność kaspazy-3
- Przygotować bufor do lizy z 0,32 M sacharozy, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, 2 mM ditiotreitolu, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μg/μl leupeptyny, 10 μg/μl pepstatyny A i 10 μg/μl aprotyniny.
- Do każdej próbki dodać 150 μl buforu do lizy (5-10 mg). Trzymaj na lodzie. Poddaj sonikę każdej próbce na lodzie przez 5 sekund z maksymalną intensywnością (40 W). Inkubować tkankę w buforze do lizy na lodzie przez 30 minut. Wirować każdą próbkę przez 5 minut.
- Wykonać 3 cykle zamrażania/rozmrażania, umieszczając próbki na przemian w ciekłym azocie i na termostatycznie sterowanej płycie grzewczej ustawionej na 37 °C. Odwirować tkankę w temperaturze 13 000 g (4 °C) przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i przechowywać w probówce na lodzie.
- Przygotować wzorcowe stężenia białka między 0 a 10 μg/ml z albuminą surowicy bydlęcej. Przygotować półfabrykaty tylko z buforem.
- Do każdego wzorca dodać 200 μl odczynnika Bradford. Odczyt standardowy przy długości fali 595 nm. Aby uzyskać poziom białka, dodaj 5 μl supernatantu próbki do 795 μl wody destylowanej i 200 μl odczynnika Bradford. Odczytać każdą próbkę przy długości fali 595 nm i określić ilościowo białko za pomocą krzywej wzorcowej.
- Przygotować bufor reakcyjny z 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl2, 1 mM glikolu etylenowego kwasu tetraoctowego, 0,1% 3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu i 1 mM ditiotreitolu.
- Dodać 25 μg białka do buforu reakcyjnego i substratów kaspazy-3, aby uzyskać dodatnie i ujemne próbki reaktywne. W przypadku próbek ujemnych dodać bufor reakcyjny, 25 μg białka, 0,4 μl Ac-DEVD-CHO 800 μM i 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM. W przypadku próbek dodatnich należy dodać 25 μg białka do buforu reakcyjnego i 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Wszystkie próbki ujemne i dodatnie należy przetworzyć trzykrotnie. Uzupełnić końcową objętość każdej próbki do 200 μl, dodając bufor reakcyjny.
- Uzyskać kontrole ujemne, dodając 188,7 μl buforu reakcyjnego do 0,5 μl Ac-DEVD-CHO 800 μM, 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM i 10 μl buforu do lizy. W przypadku kontroli dodatnich dodać 189,2 μl buforu reakcyjnego, 0,8 μl Ac-DEVD-AMC 10 mM i 10 μl buforu do lizy.
- Inkubować próbki i próby kontrolne w ciemności przez 3 godziny w temperaturze 37oC.
- Zatrzymać reakcję z 600 μl glicyny 0,4 M i NaOH 0,4 M (pH 10) w każdej próbce i kontroli.
- Określić ilościowo fluorescencję za pomocą spektrofluorometrii przy długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 465 nm. Dodaj 2 ml wody destylowanej do reakcji w szklanej kuwecie. Odczytywanie danych kontrolnych i próbek przez 10 sekund z 1 punktem na każdą sekundę.
- Określić ilościowo aktywność właściwą w każdej próbce: ((fluorescencja próbek ujemnych minus fluorescencja próbek dodatnich) x objętość 2,8 ml) podzielone przez (czas inkubacji 3 godziny x ilość białka 25 mg).
Wyniki
Ciało migdałowate wyizolowano od 8 szczurów w grupie pozorowanej (kontrolnej) oraz 8 szczurów z MI trzy dni po indukcji protokołu niedokrwienia/reperfuzji. Aktywność kaspazy-3 w tej tkance zmierzono przy użyciu fluorochromu, który może być rozszczepiany przez aktywną kaspazę-3 i wykrywany metodą spektrofluorometrii. Pomiary dodatnie i ujemne (patrz kroki 3.11, 3.12 i 3.16) przeprowadzono w trzech powtórzeniach i mierzono przez 10 s, rejestrując 1 punkt w każdej sekundzie. Obliczono różnice między kontrolami dodatnimi a ujemnymi, a średnią z różnic dla wszystkich tkanek z grupy pozorowanej uzyskanych w tym doświadczeniu przyjęto za 100%. Wyniki dla szczurów z MI przeskalowano zgodnie z tym punktem odniesienia, a Rysunek 1 przedstawia końcowe wyniki: wskazują one na istotnie wyższą aktywność u szczurów z MI w porównaniu do grupy pozorowanej (p <0.05).
Rycina 1. Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczurów po MI, wyrażona jako procent średniej aktywności w grupach kontrolnych Sham, przyjętej jako 100% (8 szczurów na grupę). *Oznacza istotną różnicę między grupami (p <0.05). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM.
Dyskusja
Nasze doświadczenia z tym protokołem w ciągu ostatnich 10 lat doprowadziły do zidentyfikowania krytycznych problemów metodologicznych. Po pierwsze, szybka sekcja mózgu na szalce Petriego na kruszonym lodzie jest ważna dla utrzymania jakości przygotowania. Po drugie, należy zdać sobie sprawę, że sonikacja tkanek jest krótsza w przypadku ciała migdałowatego mózgu w porównaniu z innymi typami tkanek, takimi jak serce (10 sekund) lub nerki (20 sekund). Po trzecie, należy zachować szczególną ostrożność, aby dokładnie wymieszać podłoże przed dodaniem go do próbek. Napotkaliśmy zmienne sygnały, gdy sekwencja mieszania była nieodpowiednia. Po czwarte, podczas odczytu próbek w komórce kwarcowej nie powinno być żadnych pęcherzyków. W przeciwnym razie sygnał może zostać zmieniony.
W ciągu ostatnich kilku lat wprowadziliśmy zmianę, aby zwiększyć powtarzalność wyników: zwiększyliśmy objętość substratu, aby uniknąć objętości mniejszej niż 1 μl. Mimo to mogą wystąpić niewielkie różnice między kolejnymi testami, a do kontroli zmian należy użyć co najmniej 3 próbek kontrolnych. Pomiary fluorescencji tych kontroli są uśredniane, a średnia jest ustalana na 100%. Pomiary fluorescencji w próbkach eksperymentalnych są przekształcane w procentach próbek kontrolnych.
Innym ograniczeniem tej techniki jest to, że wykorzystywana jest tylko część tkanki, a zatem aktywność kaspazy-3 może być niedoszacowana. Rzeczywiście, okno czasowe apoptozy jest krótkie w każdej komórce i może zostać pominięte, nawet jeśli występuje w sąsiednich obszarach w momencie pobieraniapróbek 1,4,15. Możliwa jest również sytuacja odwrotna: apoptoza może być szczególnie intensywna w częściach tkanki, powodując przeszacowanie aktywności kaspazy-3. Zalecamy wykorzystanie pozostałych tkanek (ciała migdałowatego) do technik uzupełniających, takich jak testy TUNEL lub stosunek Bax/Bcl2 (patrz Wprowadzenie).
Spektrofluorometria ma co najmniej dwie zalety w porównaniu z Western blot. Po pierwsze, bezpośrednio generuje dane ilościowe. Po drugie, mierzy samą aktywność enzymatyczną, a nie ekspresję białka lub RNA, które mogą być niepowiązane, i wiadomo, że ekspresja białka może być zwiększona bez żadnych zmian w aktywności enzymatycznej. Co więcej, spektrofluorometria może być wykonywana na innych tkankach lub na różnych gatunkach zwierząt i może być dostosowana do innych podtypów kaspazy, z różnymi substratami, dzięki czemu można dokonać bezpiecznych porównań.
Podsumowując, dokument ten demonstruje zastosowanie spektrofluorometrii do pomiaru aktywności kaspazy-3 w ciele migdałowatym, dostarczając dowodów na to, że apoptoza występuje w tym regionie układu limbicznego 3 dni po zawale mięśnia sercowego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z Kanadyjskiej Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych. Kim Gilbert jest stypendystką Fonds de la recherche du Québec - Santé.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Spektroflurometr | Instrument do technologii fotonowej (obecnie Horiba) | Ratiomaster M-40 | z DeltaRAM Monochromator o dostępie swobodnym |
| Respirator | Aparat Harvard | 683 | wentylacja małych zwierząt |
| Kuweta szklana | Precyzyjne ogniwa NSG | 3G10 | Szkło optyczne (340-2,500 nm) Ścieżka 10 mm |
| Sonikator | Cole Parmer | Spektrometr serii | |
| Varian | Cary 50 Bio |
Bibliografia
- Denault, J. B., Salvesen, G. S. Caspases: keys in the ignition of cell death. Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).
- Boucher, M., et al. Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).
- Kaloustian, S., et al. Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala. Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).
- Kaloustian, S., et al. Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat. Brain Research. 1216, 87-91 (2008).
- Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).
- Wann, B. P., et al. Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat. Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).
- Arseneault-Breard, J., et al. Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model. British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).
- Bah, T. M., et al. Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression. Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).
- Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction. Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).
- Gilbert, K., et al. Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion. British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).
- Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression. Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).
- Wann, B. P., et al. Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline. Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).
- Gorr, T. A., Vogel, J. Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues. Proteomics: Clinical Applications. , (2015).
- McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. 'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response. Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell. 102, 1-4 (2000).
Przedruki i uprawnienia
