Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Podsumowanie

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Streszczenie

Eksperymenty mające na celu zmierzenie właściwości przepuszczalności indywidualnie perfundowanych mikronaczyń stanowią pomost między badaniem molekularnych i komórkowych mechanizmów regulujących przepuszczalność naczyń krwionośnych w hodowanych monowarstwach komórek śródbłonka a funkcjonalnymi właściwościami wymiany całych łożysk mikronaczyniowych. Opisano metodę kanniulacji i perfuzji mikronaczyń komorowych krezki szczura oraz pomiaru przewodności hydraulicznej ścianki mikronaczynia. Głównym potrzebnym sprzętem jest mikroskop przyżyciowy z dużym zmodyfikowanym stolikiem, który obsługuje mikromanipulatory w ustawianiu trzech różnych mikronarzędzi: (1) mikropipety ze szkła ze skosem do kanniulacji i perfuzji mikronaczynia; (2) szklany mikrookluder do przejściowego blokowania perfuzji i umożliwiający pomiar ruchu przepływu wody przeznaczyniowej przy mierzonym ciśnieniu hydrostatycznym oraz (3) szklany pręt do stabilizacji tkanki krezkowej w miejscu kaniulacji. Zmodyfikowana technika mikrookluzji Landisa wykorzystuje czerwone krwinki zawieszone w sztucznym perfuzacie jako markery ruchu płynu transnaczyniowego, a także umożliwia wielokrotne pomiary tych przepływów w miarę zmiany warunków eksperymentalnych oraz dokładnej kontroli hydrostatycznej i koloidalnej różnicy ciśnień osmotycznych w mikronaczyniach. Pomiary przewodności hydraulicznej najpierw przy użyciu perfuzatu kontrolnego, a następnie po ponownym kaniulacji tego samego mikronaczynia za pomocą perfuzatów testowych umożliwiają sparowane porównania odpowiedzi mikronaczynia w tych dobrze kontrolowanych warunkach. Próby rozszerzenia metody na mikronaczynia w krezce myszy z modyfikacjami genetycznymi, które miały modyfikować przepuszczalność naczyń krwionośnych, były poważnie ograniczone ze względu na brak długich, prostych i nierozgałęzionych mikronaczyń w krezce myszy, ale oczekuje się, że niedawna dostępność szczurów z podobnymi modyfikacjami genetycznymi przy użyciu technologii CRISPR/Cas9 otworzy nowe obszary badań, w których można zastosować opisane tutaj metody.

Wprowadzenie

Mikroperfuzja w układzie naczyniowym polega na ustanowieniu kontrolowanego przepływu sztucznego perfuzatu o znanym składzie za pomocą mikropipety w naczyniu krwionośnym o średnicy zwykle mniejszej niż 40 μm. Perfundowane naczynie pozostaje w swoim normalnym środowisku tkankowym i jest perfundowane krwią zwierzęcia aż do momentu kannelacji. W połączeniu z szeregiem technik obrazowania wideo lub fluorometrycznych, mikroperfuzja in situ umożliwia pomiar przepływu wody i substancji rozpuszczonych przez ścianki mikronaczyń w warunkach, w których znane są siły napędowe tych przepływów, a właściwości przepuszczalności ściany naczyniowej można bezpośrednio ocenić. Po....

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Wstępna produkcja mikropipet, ograniczników i blokerów

1. Przeciągnij kilka czystych rurek kapilarnych ze szkła borokrzemianowego na pół za pomocą elektronicznego ściągacza wyregulowanego tak, aby po pociągnięciu rozciągnięta część rurki miała około 1 cm długości, a dwie połówki były nieco symetryczne. Upewnij się, że stożek jest zgodny z wymiarami na rysunku 1. Obu połówek należy używać do mikropipet, ograniczników i blokerów.
   1. Ukosuj mikropipety za pomocą napęd....

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia wyniki pomiaru przebiegu czasowego zmian L_p w żylnej mikrotniczce szczura, do której kolejno wprowadzono cztery perfuzaty.³³ Wartość L_p obliczona przy stałym ciśnieniu posłużyła jako miara zmian przepuszczalności ściany mikrotniczki, najpierw w stanie kontrolnym z perfuzatem zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej, a następnie po poddaniu naczynia działaniu czynnika zapalnego – bradykininy (Bk) przy użyciu drugiej mikropipety zawierającej 10 nM Bk.......

Dyskusja

Szczegóły obliczeń L_p . Chociaż ruch płynu przeznaczyniowego zachodzi, gdy naczynie jest swobodnie ukrwione, taka wymiana jest zbyt mała, aby można ją było zmierzyć podczas swobodnej perfuzji, ponieważ zwykle jest to mniej niż 0,01% szybkości perfuzji naczynia. Jednakże, gdy perfuzja jest przejściowo zatrzymywana przez zamknięcie mikronaczynia, przepływ przeznaczyniowy (tj. filtracja) jest mierzony na podstawie ruchu markerowych krwinek czerwonych w świetle, gdy kolumna płyn.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MIKROSKOP, STÓŁ I STOLIK Mikroskop
odwrócony (typ metalurgiczny) z głowicą trójokularową do wideo: przykład	Olympus	CK-40	spróbuj umieścić okulary wyżej w stosunku do stolika - musisz patrzeć przez okulary, sięgając do górnej części stolika nad interweniującymi mikromanipulatorami
odwrócony (typ metalurgiczny) z głowicą trójokularową do wideo: przykład	Leica	DMIL	spróbuj umieścić okulary wyżej w stosunku do sceny - musisz patrzeć przez okulary, sięgając do góry stolika nad interweniującymi mikromanipulatorami
o wąskiej średnicy, dużej odległości roboczej obiektyw: przykład	Nikon	Nikon E Plan 10 & razy;/0,25 LWD
platforma sceniczna - spawalnia blachy stalowej 1/2 cala lub 1 cm	, powinna być ciężka, aby zmniejszyć wibracje
Stół Unislide x-y: prowadnice z gołębim ogonem Kamera	CCD Velmex	AXY4006W1
VIDEO
: przykład	Pulnix	TM-7CN (już niedostępna)	nie wymaga koloru
System przechwytywania wideo z dźwiękiem - ogólny
system odtwarzania wideo (całkowicie nieruchoma klatka, ruch pojedynczej klatki)
mały
MIKROMANIPULATORY, UCHWYTY
mikromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (już niedostępny)		szukaj drobnego Z i większego zakresu ruchu w napędach zgrubnych dla łatwości pozycjonowania
napęd sondy hydraulicznej, jednokierunkowy	FHC	50-12-1C	należy dokupić napęd ręczny lub elektroniczny
ręczny napęd bębna	FHC	50-12-9-02
lub napęd hydrauliczny, 3-drożny	Siskiyou Corporation	MX610 (1-drożny) lub MX630 (3-drogowy)	doskonały do krótkich ramion, wypełniony wodą i musi być odsyłany do uzupełnienia ~ co 2 lata
łączniki / pręty / uchwyty	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB itp.
imadło szpilkowe	Starrett	162C	do trzymania
uchwytu na pipetę	World Prescision Instruments	Manometr wodny MPH3
~120 cm
TACA
przezroczysta pleksi do tacki mikroskopowej dla zwierząt
/4 cala polerowana tarcza kwarcowa ~1/4 cala wysokości	Quartz Scientific Inc.	niestandardowe	( lub plexi polerowana, szkło); upewnij się, że wysokość jest mniejsza niż odległość robocza obiektywu
Klej do plexi (Weld-on 4: UWAGA RAKOTWÓRCZY)
klej medyczny do dołka tkankowego	NuSil	MED-1037
Uniwersalna mata grzewcza z gumy silikonowej, 5 "L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	grzałka do tacy mikroskopu - potrzebuje przewodu i kontrolera - dostępna
wersja 240 VAdapter przewodu zasilającego do grzałek i zestawów kaptonowych, 6 stóp, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Regulator stałonapięciowy, 10 A; 120 V wejście, 0-140 V wyjście	Cole Parmer	EW-01575-00
PRODUKCJA
pionowy ściągacz do pipet	Sutter Instrument Company	P-30 z cienkościenną
mm	Sutter Instrument Company	B150-110-10
młynek do pipet mikroskop powietrzny i preparacyjny - zobacz odniesienie w tekście			lub kup pakiet od Sutter Instruments lub World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Maszyna	alternatywna dla kamienia napowietrzającego, do użytku z mikroskopem preparacyjnym zamontowanym pod kątem
z ceramiczną tarczą ostrzącą	RX Honing Machine Corporation		użyj "tak jak jest" lub dołącz
arkusze folii docierającej, 0,3 lub 0,5 um	3M	nr części 051144 80827	268X Imperial arkusze folii docierającej z samoprzylepnym tyłem - można kupić w Amazon

mikroskop wideo mikrofon z ogranicznikiem NA MIKROSKOP 3PIPET rurką kapilarną o średnicy zewnętrznej 1,5