Artykuł metodologiczny

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53210

⸱

12 września 2015

 ,  , 
1Department of Physiology & Membrane Biology, University of California Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Streszczenie

Eksperymenty mające na celu zmierzenie właściwości przepuszczalności indywidualnie perfundowanych mikronaczyń stanowią pomost między badaniem molekularnych i komórkowych mechanizmów regulujących przepuszczalność naczyń krwionośnych w hodowanych monowarstwach komórek śródbłonka a funkcjonalnymi właściwościami wymiany całych łożysk mikronaczyniowych. Opisano metodę kanniulacji i perfuzji mikronaczyń komorowych krezki szczura oraz pomiaru przewodności hydraulicznej ścianki mikronaczynia. Głównym potrzebnym sprzętem jest mikroskop przyżyciowy z dużym zmodyfikowanym stolikiem, który obsługuje mikromanipulatory w ustawianiu trzech różnych mikronarzędzi: (1) mikropipety ze szkła ze skosem do kanniulacji i perfuzji mikronaczynia; (2) szklany mikrookluder do przejściowego blokowania perfuzji i umożliwiający pomiar ruchu przepływu wody przeznaczyniowej przy mierzonym ciśnieniu hydrostatycznym oraz (3) szklany pręt do stabilizacji tkanki krezkowej w miejscu kaniulacji. Zmodyfikowana technika mikrookluzji Landisa wykorzystuje czerwone krwinki zawieszone w sztucznym perfuzacie jako markery ruchu płynu transnaczyniowego, a także umożliwia wielokrotne pomiary tych przepływów w miarę zmiany warunków eksperymentalnych oraz dokładnej kontroli hydrostatycznej i koloidalnej różnicy ciśnień osmotycznych w mikronaczyniach. Pomiary przewodności hydraulicznej najpierw przy użyciu perfuzatu kontrolnego, a następnie po ponownym kaniulacji tego samego mikronaczynia za pomocą perfuzatów testowych umożliwiają sparowane porównania odpowiedzi mikronaczynia w tych dobrze kontrolowanych warunkach. Próby rozszerzenia metody na mikronaczynia w krezce myszy z modyfikacjami genetycznymi, które miały modyfikować przepuszczalność naczyń krwionośnych, były poważnie ograniczone ze względu na brak długich, prostych i nierozgałęzionych mikronaczyń w krezce myszy, ale oczekuje się, że niedawna dostępność szczurów z podobnymi modyfikacjami genetycznymi przy użyciu technologii CRISPR/Cas9 otworzy nowe obszary badań, w których można zastosować opisane tutaj metody.

Wprowadzenie

Mikroperfuzja w układzie naczyniowym polega na ustanowieniu kontrolowanego przepływu sztucznego perfuzatu o znanym składzie za pomocą mikropipety w naczyniu krwionośnym o średnicy zwykle mniejszej niż 40 μm. Perfundowane naczynie pozostaje w swoim normalnym środowisku tkankowym i jest perfundowane krwią zwierzęcia aż do momentu kannelacji. W połączeniu z szeregiem technik obrazowania wideo lub fluorometrycznych, mikroperfuzja in situ umożliwia pomiar przepływu wody i substancji rozpuszczonych przez ścianki mikronaczyń w warunkach, w których znane są siły napędowe tych przepływów, a właściwości przepuszczalności ściany naczyniowej można bezpośrednio ocenić. Ponadto, kontrolując skład płynu otaczającego mikronaczynie w tkance (perfuzat i superfuzat), można badać regulację przepuszczalności i wymiany mikronaczyń, umożliwiając komórkom śródbłonka tworzącym ścianę mikronaczynia wystawienie na różne warunki eksperymentalne (agoniści, zmodyfikowane warunki perfuzji, wskaźniki fluorescencyjne do pomiaru składu wewnątrzkomórkowego i sygnalizacji) przez precyzyjnie mierzone okresy czasu (od sekund do godz.). Ponadto ultrastrukturalne lub cytochemiczne oceny kluczowych komórkowych struktur molekularnych regulujących barierę mogą być badane w tych samych mikronaczyniach, w których bezpośrednio mierzy się przepuszczalność. Podejście to stanowi zatem pomost między badaniem mechanizmów komórkowych i molekularnych modyfikacji funkcji bariery śródbłonkowej w monowarstwach hodowanych komórek śródbłonka a badaniem w nienaruszonych mikronaczyniach. Zapoznaj się z poniższymi recenzjami w celu dalszej oceny1-6.

Ograniczeniem mikroperfuzji jest to, że może być stosowana tylko w łożyskach mikronaczyniowych, które są cienkie, przezroczyste i mają wystarczającą integralność strukturalną, aby umożliwić kaniulację za pomocą szklanej mikropipety. Podczas gdy we wczesnych badaniach wykorzystywano mikronaczynia żaby w krezce i cienkim mięśniu piersiowymskóry 7,8, zdecydowanie najczęściej stosowanym preparatem w modelach ssaków jest krezka szczura9-15. Większość badań koncentrowała się na ostrych zmianach przepuszczalności naczyń badanych w okresach 1-4 godzin, ale nowsze badania zostały rozszerzone na pomiary na poszczególnych naczyniach 24-72 godziny po początkowej perfuzji12,16. Niedawno opracowana technologia CRISPR, która daje nadzieję na udostępnienie większej liczby genetycznie zmodyfikowanych modeli szczurów do badania regulacji przepuszczalności naczyńkrwionośnych 17, powinna umożliwić zastosowanie metod opisanych w niniejszym komunikacie w mikronaczyniach komorowych krezki w tych ważnych nowych modelach szczurów.

Metoda wymaga odwróconego mikroskopu wyposażonego w specjalnie skonstruowany stolik mikroskopowy wystarczająco duży, aby pomieścić zarówno preparat dla zwierząt, jak i co najmniej trzy mikromanipulatory używane do umieszczania mikronarzędzi blisko naczynia perfuzyjnego i ustawiania mikropipety perfuzyjnej do światła naczynia. Na przykład niestandardowa platforma do stolika mikroskopowego x-y (około 90 × 60 cm) może być wykonana z blachy stalowej o grubości 1 cm z powłoką odporną na rdzę. Stolik jest przymocowany do inżynierskiego stołu indeksowego lub dwóch prowadnic typu jaskółczy ogon zamontowanych pod kątem prostym i wspartych na teflonowych filarach lub transferach kulkowych do ruchu w płaszczyźnie poziomej. Typowy aparat (patrz ryc. 2) ma wiele wspólnego z mikroskopem i sprzętem do mikropozycjonowania używanym do szeregu eksperymentów mikrokrążenia przyżyciowego, takich jak te do pomiaru przepływu krwi w pojedynczym naczyniu i hematokrytu, miejscowego dostarczania tlenu przez mikronaczynia perfundowane krwią, regulacji napięcia mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz miejscowej akumulacji mikronaczyniowej znaczników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do całego krążenia. 18-26

Podstawowym aspektem tej techniki jest pomiar przepływu objętościowego (Jv) przez określoną powierzchnię (S) ściany mikronaczynia. Aby osiągnąć to za pomocą zmodyfikowanej techniki Landisa opisanej w niniejszym dokumencie, wystarczy prosty mikroskop odwrócony. Na porcie obrazu montowana jest mała kamera wideo, a sygnał wideo, z dodaną podstawą czasu, jest wyświetlany na monitorze wideo i nagrywany w formie cyfrowej na komputerze lub jako sygnał cyfrowy lub analogowy na magnetowidzie. Po kaniulacji mikronaczynia część mikronaczynia widoczną dla kamery może być zmieniana poprzez przesuwanie stolika i manipulatorów jako jednostki bez przerywania kaniulacji.

Pomiar przepływów przeznaczyniowych może być również połączony z bardziej szczegółowymi badaniami przy użyciu zaawansowanego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami, takimi jak urządzenia używane do pomiarów przepuszczalności substancji rozpuszczonych, monitorowania proporcji fluorescencji cytoplazmatycznego wapnia lub innych mechanizmów komórkowych oraz obrazowania konfokalnego 6,12,13,27. Kluczową zaletą wszystkich metod mikroperfuzji jest możliwość wykonywania powtarzających się pomiarów na tym samym naczyniu pod kontrolowaną zmianą siły napędowej, takiej jak ciśnienie hydrostatyczne i onkotyczne lub indukowana zmiana odpowiedzi naczyń na stany zapalne. Najpowszechniejszym projektem jest sparowane porównanie zmierzonej przewodności hydraulicznej (Lp) w tym samym naczyniu, przy czym naczynie najpierw zostało przepłukane za pomocą mikropipety wypełnionej perfuzatem kontrolnym i zawiesiną krwinek czerwonych w celu ustalenia wyjściowego stanu przepuszczalności, a następnie drugą pipetą z badanym czynnikiem dodanym do perfuzatu. Możliwe są wielokrotne kaniulacje z cyklem powtórzonym po reperfuzji za pomocą pipety kontrolnej.

Obecny protokół demonstruje kaniulację i mikroperfuzję naczynia komorowego w krezce szczura, aby rejestrować przepływy wody przez ścianę mikronaczynia i mierzyć Lp ściany naczynia, użyteczny wskaźnik przepuszczalności wspólnej drogi dla wody i substancji rozpuszczonych przez nienaruszoną barierę śródbłonkową. Procedura ta jest nazywana zmodyfikowaną techniką Landisa, ponieważ oryginalna zasada Landisa polegająca na wykorzystaniu względnego ruchu krwinek czerwonych jako miary wymiany płynu transnaczyniowego po zablokowaniu perfuzji jest zachowana28, ale zakres warunków eksperymentalnych (np. różnice ciśnienia hydrostatycznego i onkotycznego albuminy na ścianie mikronaczynia) dostępnych po mikroperfuzji jest znacznie większy niż w mikronaczyniach perfuzji krwi niekaniulowanej8,29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Wstępna produkcja mikropipet, ograniczników i blokerów

  1. Przeciągnij kilka czystych rurek kapilarnych ze szkła borokrzemianowego na pół za pomocą elektronicznego ściągacza wyregulowanego tak, aby po pociągnięciu rozciągnięta część rurki miała około 1 cm długości, a dwie połówki były nieco symetryczne. Upewnij się, że stożek jest zgodny z wymiarami na rysunku 1. Obu połówek należy używać do mikropipet, ograniczników i blokerów.
    1. Ukosuj mikropipety za pomocą napędzanej powietrzem ściernicy30 z papierem ściernym 0,5 μm skąpanym w wodzie. Ustaw kąt uchwytu mikropipety tak, aby znajdował się około 30 stopni od poziomu.
    2. Dokładnie umyj i osusz mikropipety, używając ssania, aby przeciągnąć czysty aceton przez końcówkę i w górę trzonu. Sprawdzić mikropipety (Rysunek 1A) za pomocą małego mikroskopu pionowego z obiektywami 4× i 40×, wyposażonego w zacisk krokodylkowy, uchwyt do mikropipet i siatkę okularową.
    3. Wybierz mikropipety z otworem końcówki o długości około 50 μm, ze skosem, którego stosunek długości do szerokości wynosi od 3,1 do 3,5 i z ostro zwężającym się końcem, który pomaga penetrować twarde włókna kolagenowe w krezce.
    4. Przechowuj 15-20 mikropipet o nieco różnych rozmiarach w pudełku bezpyłowym.
  2. Wykonaj krępujące za pomocą ciągniętych rurek kapilarnych przygotowanych w kroku 1.1). Przytrzymaj przez chwilę wyciągniętą szklaną rurkę kapilarną w pobliżu mikropłomienia, aby utworzyć koniec (Rysunek 1B). Przechowuj kilka w bezpyłowym pudełku.
  3. Wykonaj mikrookludery za pomocą ciągniętych kapilar przygotowanych w kroku 1.1). Przytrzymaj wyciągniętą rurkę kapilarną pod mikropłomieniem i delikatnie zegnij (za pomocą adaptera do rurki, np. 23G) cienką końcówkę (około 4 mm od końcówki), aby uzyskać kąt zbliżony do 120 stopni do wału (Rysunek 1C). Zrób i przechowuj kilka.

2. Przygotowanie i chirurgia zwierząt

  1. Samce (350-450 g) lub samice szczurów Sprague-Dawley (200-300 g) znieczulić pentobarbitalem sodu (80-100 mg/kg, Sigma-Aldrich, P3761) poprzez wstrzyknięcie podskórne; chroń krezkę, nie stosując iniekcji dootrzewnowej.
  2. Podczas zabiegów chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych należy utrzymywać znieczulenie przez dodatkowe zastrzyki (30 mg/kg) w razie potrzeby. Określ głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi lub odruch rogówkowy. Po zakończeniu procedury eksperymentalnej należy poddać szczura eutanazji poprzez przedawkowanie pentobarbitalu lub wstrzyknięcie dosercowe nasyconego chlorku potasu w znieczuleniu.

3. Przygotuj roztwory i erytrocyty do użycia jako markery przepływu

  1. Przygotować roztwór Ringera dla ssaków jako roztwór superfuzatu i kontrolny roztwór perfuzatu (zazwyczaj roztwór Ringera dla ssaków zawierający 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych, BSA).
    1. Przefiltruj perfuzat przez filtry strzykawkowe 0,2 μm, aby usunąć drobne cząsteczki, które mogą zablokować końcówkę mikropipety; przefiltruj do małego, czystego pojemnika.
  2. Przygotować erytrocyty, pobierając około 0,2 ml krwi z żyły ogonowej znieczulonego szczura do igły 20G na małej strzykawce zawierającej 0,05 ml heparyny (1000 U/ml) i przenieść do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej około 14 ml roztworu Ringera u ssaków.
    1. Odwirować, aby delikatnie upakować czerwone krwinki (około 200 × g przez 7 minut). Odciągnąć supernatant i ponownie zawiesić krwinki czerwone w roztworze Ringera.
    2. Po trzykrotnym odwirowaniu i usunięciu supernatantu należy pozostawić upakowane krwinki czerwone na dnie probówki do późniejszego wykorzystania. Należy pamiętać, że ta procedura zmniejsza liczbę płytek krwi w końcowych perfuzatach do mniej niż 0,1% normalnego poziomu31.

4. Ułóż chusteczkę na tacy dla zwierząt

  1. Ogolić brzuch znieczulonego szczura od dołu pępka do wyrostka mieczykowatego. Upewnij się, że ogolony obszar rozciąga się wokół prawej strony (w przypadku szczura umieszczonego po prawej stronie), tak aby włosy nie tworzyły, aby dobrze wyciągnąć superfuzat. Usuń ścięte włosy za pomocą zwilżonej gazy lub chusteczki.
    1. Przytrzymaj skórę ząbkowanymi kleszczami i wykonaj środkowe nacięcie (o długości 2-3 cm) przez skórę za pomocą mocnych nożyczek. Za pomocą cienkich nożyczek (tęczówki) wykonaj podobne nacięcie przez linea alba, podnosząc ścianę brzucha ząbkowanymi kleszczami, aby uniknąć uszkodzenia jelita.
    2. Trzymając zwierzę na boku na tacy dla zwierząt, delikatnie wyciągnij jelito z jamy brzusznej za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką (drewniany patyczek) nasączonych roztworem Ringera i ząbkowanych kleszczy. Ułóż jelito w tkance tak, aby krezka była udrapowana na filarze do oglądania przez mikroskop, uważając, aby nie dotykać krezki (potencjalnie uszkadzając mikronaczynia) ani kleszczami, ani bawełną.
      Uwaga: Taca dla zwierząt (Rysunek 2A) może być wykonana z pleksiglasu i wymaga studzienki na chusteczki (o głębokości około 3 mm), optycznie przezroczystego słupka (np. polerowanego kwarcu o średnicy około 2 cm i wysokości 5 mm) oraz podkładki grzewczej dostosowanej do utrzymania temperatury zwierzęcia. Grubość słupka nie może przekraczać odległości roboczej obiektywu.
  2. Umieść tacę na zwierzęta na stoliku mikroskopu tak, aby krezka była widoczna przez okulary.
  3. Ustawić grawitacyjną linię kroplową, aby w sposób ciągły przelać krezkę z roztworem Ringera ssaków utrzymywanym w temperaturze 35–37 °C. Użyj gazików, aby utrzymać jelito na miejscu, pomóc zatrzymać wilgoć i usunąć nadmiar roztworu Ringera z powierzchni. Dostosuj przepływ i zasysaj ścieki, aby utrzymać stałą grubość superfuzatu.
  4. Zidentyfikuj docelowe mikronaczynia komorowe, które są nierozgałęzionymi segmentami poniżej przepływu zbieżnego, jedną lub dwiema gałęziami dystalnymi do prawdziwych naczyń włosowatych. Znajdź nierozgałęzione naczynie (najlepiej o długości od 600 do 1000 μm) o szybkim przepływie krwi i wolne od białych krwinek przyklejających się do ściany naczynia.
  5. Umieść mikronaczynie testowe w środku pola mikroskopu i przesuń ogranicznik na miejsce w pobliżu wybranego miejsca kaniulacji.

5. Napełnij mikropipetę i zamontuj w uchwycie

  1. Tuż przed kaniulacją zawieś krwinki czerwone w perfuzacie. Dodać 7 μl upakowanych krwinek czerwonych do 0,5 ml perfuzatu w czystej probówce borokrzemianowej. Uwaga: Można stosować hematokryty 1-3%, ale konsekwentny hematokryt doprowadzi do stałych stężeń perfuzatu wszelkich substancji uwalnianych z krwinek czerwonych.
  2. Założyć strzykawkę o pojemności 1 ml z adapterem rurki 23 G i rurką PE 50 (długość 5-15 cm). Pobrać mieszaninę perfuzatu i krwinek czerwonych do strzykawki. Odwrócić strzykawkę, aby wymieszać i usunąć wszystkie pęcherzyki z rurki i adaptera. Aby zwiększyć wydajność, przed rozpoczęciem eksperymentu dopasuj rurki do kilku strzykawek i przechowuj je w bezpyłowym pudełku lub plastikowej torbie.
  3. Napełnij mikropipetę, wsuwając rurkę w duży koniec mikropipety, aż będzie przylegać do stożkowego obszaru. Delikatnie i szybko nacisnąć tłok strzykawki, aby napełnić końcówkę mikropipety. Uwaga: Na końcówce powinien być widoczny mały strumień lub kropelka, aby udowodnić całkowite wypełnienie.
  4. Wyjmij rurkę, delikatnie naciskając tłok, aby napełnić szerszą część trzonu mikropipety. Usuń małe pęcherzyki z szerokiego trzonka, ostrożnie potrząsając trzonkiem mikropipety. Uwaga: Podobna procedura została zilustrowana32.
  5. Umieść mikropipetę w uchwycie na pipety z bocznym portem, który umożliwia ciągłe podłączenie płynu do manometru wodnego. Upewnij się, że uchwyt, który jest przymocowany do napędu hydraulicznego używanego do sterowania bardzo precyzyjnym przesuwaniem mikropipety, jest ustawiony pod niewielkim kątem (15-25°) do poziomu, tak aby krawędź stożka mikropipety nie dotykała jelita lub tacki.
  6. Zamontuj napęd hydrauliczny na ruchomym mikromanipulatorze, który ma napędy x, y i z, aby umożliwić ścisłe wyrównanie z naczyniem testowym (rysunek 2).
  7. Wyregulować ciśnienie hydrostatyczne przyłożone do płynu w mikropipecie za pomocą strzykawki lub gumowej gruszki wypełnionej wodą, aby zmienić wysokość płynu w słupie wody manometru na około 40cmH2O powyżej krezki.
  8. Kankaniulować mikronaczynie tak szybko, jak to możliwe po napełnieniu pipety; czerwone krwinki osiadają na dnie pipety, tak że po około 40 minutach bardzo niewiele czerwonych krwinek wpłynie do naczynia.

6. Mikrokaniulacja i pomiar ciśnienia mikronaczyniowego

  1. Przed umieszczeniem napełnionej mikropipety pod mikroskopem, delikatnie dociśnij ogranicznik do tkanki w pobliżu mikronaczynia, przykładając wystarczającą siłę, aby chwycić tkankę. Odciągnij krępujący kręp, lekko rozciągając tkankę w linii z mikronaczyniem, tak aby naprężenia we włóknach kolagenowych krezki były wyrównane z naczyniem.
    1. Wyrównaj mikropipetę z naczyniem i opuść ją w pole widzenia przez okulary. Umieść końcówkę tuż przed wybranym miejscem kaniulacji i opuść ją na tkankę tak, aby częściowo utrudniała przepływ w naczyniu, ale go nie zamykała.
  2. Unieruchomij naczynie, powoli wprowadzając końcówkę pipety w światło naczynia za pomocą napędu hydraulicznego. Uważaj, aby nie przepchnąć się przez dolną część naczynia.
    Uwaga: Gdy mikropipeta wchodzi do światła, perfuzat szybko wypłukuje krew w naczyniu ze światła, a perfuzat swobodnie przepływa do krążenia zwierzęcia dystalnie do badanego mikronaczynia, wypierając część normalnej perfuzji krwi w naczyniach znajdujących się za nim.
  3. Obniż ciśnienie perfuzji, regulując manometr, aż krew (zgodnie z czerwonymi krwinkami zwierzęcia) zostanie wciągnięta z powrotem do perfundowanego segmentu; określa to ciśnienie równowagi, w którym krwinki czerwone delikatnie oscylują w świetle naczynia i mierzy ciśnienie hydrostatyczne w mikronaczyniach (Pc) na dystalnym końcu segmentu mikronaczynia. Utrzymuj perfuzję naczynia przy wszystkich ciśnieniach powyżej tego ciśnienia równoważącego.

7. Mikrookluzja i zbieranie danych

  1. Opcjonalny krok: Przed użyciem mikrookludera do zablokowania naczynia, wciśnij go w tkankę w nieużywanym obszarze krezki z dala od jakiegokolwiek naczynia, tak aby końcówka gromadziła cienką podkładkę tkanki, która chroni naczynie eksperymentalne podczas powtarzających się mikrookluzji.
  2. Umieść bloker nad perfundowanym naczyniem w pobliżu dolnej krawędzi pola mikroskopu.
  3. Nagraj następujące elementy z obrazem i dźwiękiem.
    1. Zapisz ustnie lokalizację miejsca bloku i dolną krawędź ekranu, jak widać na siatce okularu.
    2. Trzymając końcówkę blokera umieszczoną tuż nad mikronaczyniem, użyj precyzyjnego regulatora z mikromanipulatora, aby delikatnie opuścić bloker, aż przepływ w naczyniu zostanie zablokowany. Zwróć uwagę na ciśnienie manometru (Pc) w dźwięku. Zastosuj okluzję zwykle na 3-10 sekund, a następnie zwolnij, przywracając swobodną perfuzję. Przesuwaj miejsce bloku w górę naczynia w kierunku końcówki pipety w krokach co 5-10 μm w zależności od czasu (>5 minuty po początkowym zablokowaniu w miejscu), liczby okluzji (3-5), aby zapobiec uszkodzeniu ścianki naczynia w miejscu bloku.

8. Analiza danych i pomiar przepuszczalności wody (Lp)

  1. Podczas odtwarzania wideo określ początkową odległość (l0) od czerwonej krwinki markera do miejsca okluzji, korzystając z obrazu mikrometru stage i znanych pozycji na obrazach. Określ prędkość początkową (dl/dt) komórki znacznika na podstawie jej położenia w kilku klatkach w ciągu 3-10 sekund zarejestrowanych obrazów. Określ promień naczynia (r) na podstawie zdjęć wykonanych podczas okluzji (ryc. 3).
  2. Oblicz Jv/S dla każdej okluzji jako (dl/dt)×(1/l0)× (r/2). Obliczyć Lp przy stałym ciśnieniu jako (Jv/S) podzielone przez ciśnienie napędowe (ciśnienie w mikronaczyniu – efektywne koloidalne ciśnienie osmotyczne; patrz Dyskusja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia wyniki pomiaru przebiegu czasowego zmian Lp w żylnej mikrotniczce szczura, do której kolejno wprowadzono cztery perfuzaty.33 Wartość Lp obliczona przy stałym ciśnieniu posłużyła jako miara zmian przepuszczalności ściany mikrotniczki, najpierw w stanie kontrolnym z perfuzatem zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej, a następnie po poddaniu naczynia działaniu czynnika zapalnego – bradykininy (Bk) przy użyciu drugiej mikropipety zawierającej 10 nM Bk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczegóły obliczeń Lp . Chociaż ruch płynu przeznaczyniowego zachodzi, gdy naczynie jest swobodnie ukrwione, taka wymiana jest zbyt mała, aby można ją było zmierzyć podczas swobodnej perfuzji, ponieważ zwykle jest to mniej niż 0,01% szybkości perfuzji naczynia. Jednakże, gdy perfuzja jest przejściowo zatrzymywana przez zamknięcie mikronaczynia, przepływ przeznaczyniowy (tj. filtracja) jest mierzony na podstawie ruchu markerowych krwinek czerwonych w świetle, gdy kolumna płyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health HL44485 i HL28607.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MIKROSKOP, STÓŁ I STOLIK Mikroskop
odwrócony (typ metalurgiczny) z głowicą trójokularową do wideo: przykładOlympusCK-40spróbuj umieścić okulary wyżej w stosunku do stolika - musisz patrzeć przez okulary, sięgając do górnej części stolika nad interweniującymi mikromanipulatorami
odwrócony (typ metalurgiczny) z głowicą trójokularową do wideo: przykładLeicaDMILspróbuj umieścić okulary wyżej w stosunku do sceny - musisz patrzeć przez okulary, sięgając do góry stolika nad interweniującymi mikromanipulatorami
o wąskiej średnicy, dużej odległości roboczej obiektyw: przykładNikonNikon E Plan 10 & razy;/0,25 LWD
platforma sceniczna - spawalnia blachy stalowej 1/2 cala lub 1 cm, powinna być ciężka, aby zmniejszyć wibracje
Stół Unislide x-y: prowadnice z gołębim ogonem KameraCCD VelmexAXY4006W1
VIDEO
: przykładPulnixTM-7CN (już niedostępna)nie wymaga koloru
System przechwytywania wideo z dźwiękiem - ogólny
system odtwarzania wideo (całkowicie nieruchoma klatka, ruch pojedynczej klatki)
mały
MIKROMANIPULATORY, UCHWYTY
mikromanipulator, XYZ (3)Prior/Stoelting (już niedostępny)szukaj drobnego Z i większego zakresu ruchu w napędach zgrubnych dla łatwości pozycjonowania
napęd sondy hydraulicznej, jednokierunkowyFHC50-12-1Cnależy dokupić napęd ręczny lub elektroniczny
ręczny napęd bębna FHC50-12-9-02
lub napęd hydrauliczny, 3-drożnySiskiyou CorporationMX610 (1-drożny) lub MX630 (3-drogowy)doskonały do krótkich ramion, wypełniony wodą i musi być odsyłany do uzupełnienia ~ co 2 lata
łączniki / pręty / uchwytySiskiyou CorporationMXC-2.5, MXB itp.
imadło szpilkoweStarrett162Cdo trzymania
uchwytu na pipetęWorld Prescision InstrumentsManometr wodny MPH3
~120 cm
TACA
przezroczysta pleksi do tacki mikroskopowej dla zwierząt
/4 cala polerowana tarcza kwarcowa ~1/4 cala wysokościQuartz Scientific Inc.niestandardowe ( lub plexi polerowana, szkło); upewnij się, że wysokość jest mniejsza niż odległość robocza obiektywu
Klej do plexi (Weld-on 4: UWAGA RAKOTWÓRCZY)
klej medyczny do dołka tkankowegoNuSilMED-1037
Uniwersalna mata grzewcza z gumy silikonowej, 5 "L x 2" WCole ParmerEW-03125-20grzałka do tacy mikroskopu - potrzebuje przewodu i kontrolera - dostępna
wersja 240 VAdapter przewodu zasilającego do grzałek i zestawów kaptonowych, 6 stóp, 120 VACCole ParmerEW-03122-75
STACO 3PN1010B Regulator stałonapięciowy, 10 A; 120 V wejście, 0-140 V wyjścieCole ParmerEW-01575-00
PRODUKCJA
pionowy ściągacz do pipetSutter Instrument CompanyP-30 z cienkościenną
mmSutter Instrument CompanyB150-110-10
młynek do pipet mikroskop powietrzny i preparacyjny - zobacz odniesienie w tekścielub kup pakiet od Sutter Instruments lub World Precision Instruments
RX Honing Machine, System IIRX Honing Machine CorporationMAC-10700 Rx System II Maszynaalternatywna dla kamienia napowietrzającego, do użytku z mikroskopem preparacyjnym zamontowanym pod kątem
    z ceramiczną tarczą ostrzącąRX Honing Machine Corporationużyj "tak jak jest" lub dołącz
arkusze folii docierającej, 0,3 lub 0,5 um3Mnr części 051144 80827268X Imperial arkusze folii docierającej z samoprzylepnym tyłem - można kupić w Amazon
mikroskop wideo mikrofon z ogranicznikiem NA MIKROSKOP 3PIPET rurką kapilarną o średnicy zewnętrznej 1,5

Bibliografia

  1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
  2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
  4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
  5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
  6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
  7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
  8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
  9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
  10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
  11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
  12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
  14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
  15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
  16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
  17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
  18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
  19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
  20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
  21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
  22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
  23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
  24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
  25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
  26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
  27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
  28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
  29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
  30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
  31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
  32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
  34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
  35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
  36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
  37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
  38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
  39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
  40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
  41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
  42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
  43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

przewodno hydraulicznamikroskopia intravitalnametoda mikrookluzjitransvaskularna wymiana p yn wkontrola sk adu perfuzatuhydrauliczny system nap dowyszczury modyfikowane genetycznie

Powiązane artykuły