Artykuł metodologiczny

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53211

⸱

23 listopada 2015

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Biochemistry, Chang Gung University College of Medicine, 3Molecular Medicine Research Center, Chang Gung University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

Streszczenie

Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) są potężnymi komórkami wytwarzającymi interferon typu I (IFN-I), które są aktywowane w odpowiedzi na infekcję lub podczas reakcji zapalnych. Niestety, badania funkcji pDC są utrudnione ze względu na ich niską częstotliwość w narządach limfatycznych, a istniejące metody wytwarzania prądu stałego in vitro w przeważającej mierze faworyzują produkcję cDC w stosunku do pDC. W tym miejscu przedstawiamy unikalne podejście do wydajnego generowania pDC z powszechnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP) in vitro. W szczególności protokół szczegółowo opisywał, w jaki sposób oczyszczać CLP ze szpiku kostnego i generować pDC poprzez kokulturację z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3. Unikalną cechą tego systemu hodowli jest to, że CLP migrują pod komórkami AC-6 i stają się komórkami tworzącymi obszar bruku, co jest krytycznym krokiem dla ekspansji pDC. Morfologicznie odrębne DC, a mianowicie pDC i cDC, zostały wygenerowane po około 2 tygodniach ze składem 70-90% pDC w optymalnych warunkach. Zazwyczaj liczba pDC generowanych tą metodą jest około 100-krotnie większa niż liczba zainicjowanych CLP. W związku z tym jest to nowatorski system, za pomocą którego można solidnie generować dużą liczbę pDC wymaganą do ułatwienia dalszych badań nad rozwojem i funkcjonowaniem tych komórek.

Wprowadzenie

Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki prezentujące antygen, które odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu odpowiedzi immunologicznej1. Chociaż DC są niejednorodne, można je ogólnie podzielić na dwie populacje, konwencjonalne DC (cDC) i plazmocytoidalne DC (pDCs)2,3. Oprócz narządów limfatycznych, cDC i pDC znajdują się również w tkankach, w tym w płucach, jelitach i skórze2. Morfologia cDC i pDC różni się, przy czym cDC wykazują dendrytowe projekcje, a kształt pDC jest bardziej podobny do komórek plazmatycznych. Ponadto powszechny mysi marker DC, CD11c, ulega wyższej ekspresji na cDC niż na pDC. Co więcej, cDC można dalej podzielić na cDC CD11b+CD24- cDC i cDC CD11b-CD24+, z których oba wyrażają wyższe poziomy MHC klasy II i cząsteczek kostymulujących niż pDC2. Z drugiej strony wykazano, że dojrzałe pDC selektywnie eksprymują Siglec-H i BST24. Funkcjonalnie cDC są lepszymi komórkami prezentującymi antygen niż pDC; jednak pDC mogą wytwarzać ogromne ilości interferonu typu I po zakażeniu wirusem lub stymulacji zapalnej5.

Zarówno cDCs, jak i pDC są krótkotrwałe, dlatego muszą być stale uzupełniane z komórek progenitorowych w szpiku kostnym (BM)6,7. Adoptywny transfer wspólnych komórek progenitorowych szpiku (CMP) i zwykłych komórek progenitorowych limfoidalnych (CLP) do myszy śmiertelnie napromieniowanych pokazuje, że cDC i pDC mogą być generowane z obu linii8-10. Istnieje jednak podzbiór pDC, które wyrażają RAG1 / 2 i mają przegrupowane segmenty D-J w locus IgH11,12. Komórki te mają również podobieństwa molekularne z limfocytami B, w tym ekspresję markera B220, receptory wyczuwające kwasy nukleinowe (TLR7 / TLR9) i czynniki transkrypcyjne (Spib i Bcl11a)13, cechy uważane za sygnatury linii limfoidalnej. W związku z tym CLP mogą być dobrym wyborem do generowania pDC in vitro ze względu na podobieństwo linii.

Podczas gdy częstość występowania zarówno cDC, jak i pDC u ludzi i myszy jestbardzo niska6, DCs, szczególnie cDCs, mogą być generowane in vitro z BM lub komórek progenitorowych w obecności cytokin, takich jak GM-CSF11,14 lub ligand Flt3 (FL) przy użyciu systemów bezzasilających 11,15,16. Niestety, nie jest możliwe wytworzenie dużej liczby pDC in vitro przy użyciu FL11,15,16. Wcześniej wykazaliśmy, że pDC mogą być efektywnie generowane in vitro z CLP przy użyciu systemu zasilania AC-617. Zaletą zastosowania linii komórek zrębu AC-6 w systemie hodowli jest to, że zapewnia ona kontakt komórka-komórka i wydzielanie cytokin, które wspierają wytwarzanie dużej liczby pDC z CLP. Chociaż produkcja z wykorzystaniem tego systemu jest dość solidna, konieczne jest staranne odtworzenie procedur opisanych poniżej, aby zapewnić wydajne wytwarzanie pDC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy C57BL/6 typu dzikiego zakupiono w National Laboratory Animal Center (NLAC) na Tajwanie. Wszystkie myszy zostały wyhodowane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Protokoły i procedury wykorzystania zwierząt zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt National Taiwan University College of Medicine (numer zezwolenia: 20120075). Ponadto naukowcy dołożyli wszelkich starań, aby zmniejszyć ryzyko bólu, cierpienia lub dystresu u zwierząt podczas przeprowadzania eksperymentów. Wszystkie opisane procedury zostały przeprowadzone w RT w rękawiczkach.

1. Przygotowanie ogniw zasilających AC-6

Uwaga: Linia komórek zrębu18 AC-6.21 (w skrócie AC-6) (dostarczona przez I. Weissmana, Uniwersytet Stanforda) powinna być utrzymywana w RPMI uzupełnionym 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Aby służyć jako komórki zasilające, komórki AC-6 są γ napromieniowywane 3,000 rad (30Gy) na dzień przed kokulturą, aby zapobiec ich proliferacji. Należy zauważyć, że komórki AC-6 mają tendencję do utraty zdolności do różnicowania, jeśli są przepełnione podczas konserwacji lub jeśli ich liczba przejścia przekracza 20.

  1. Umyj komórki AC-6 raz 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco i usuń DPBS przez aspirację. Traktować komórki AC-6 0,8 ml roztworu trypsyny (0,05% trypsyny i 0,5 mM EDTA w DPBS) przez 3-5 minut w temperaturze 37oC, 5% CO2 , a następnie zatrzymać reakcję, rozcieńczając ją 10 objętościami pożywki hodowlanej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
  2. Komórki AC-6 zasiać w 5,9x104 komórki/basenie na płytki 12-dołkowe i inkubować w temperaturze 37oC, 5% CO2 O/N.
    Uwaga: Gęstość ogniw AC-6 jest bardzo ważna, ponieważ niższa gęstość będzie sprzyjać wytwarzaniu prądu stałego. Wysiew o gęstości 5,9x104 komórek/studzienkę pozwoli AC-6 osiągnąć konfluencję do następnego dnia, co jest optymalne do wyprowadzenia pDC z CLP.
  3. Naświetlić ogniwa AC-6 o natężeniu 3,000 rad (30 Gy) za pomocą γ-naświetlacza.
    Uwaga: Dawka stosowana do napromieniania AC-6 jest zoptymalizowana tak, aby zapobiec proliferacji komórek, a jednocześnie utrzymać je przy życiu wystarczająco długo, aby zapewnić cytokiny i kontakt komórka-komórka wymagane do różnicowania DC od CLP.
  4. Odessać pożywkę i zastąpić 1 ml pełnego RPMI (RPMI 10 % inaktywowanego termicznie FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu).

2. Izolowanie komórek BM od myszy

  1. Ofiarować myszy przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Umieść myszy na tacy preparacyjnej i wysterylizuj 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w środkowej części brzucha i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą kończyny dolne.
  2. Wypreparuj myszy w półsterylnym kapturze. Aby uwolnić kość udową i piszczelową, przypnij kość udową powyżej, a piszczele poniżej stawu kolanowego. Odłącz mięśnie od kości za pomocą nożyczek i umieść kości na 6-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 5 ml pełnego RPMI.
  3. Przenieś się do sterylnego kaptura hodowlanego. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml podłączoną do igły 27G pełnym RPMI. Odetnij oba końce kości za pomocą nożyczek i włóż igłę 27G, aby wypłukać szpik z kości, delikatnie wstrzykując pełne RPMI raz z każdego końca.
  4. Przygotować zawiesinę pojedynczej komórki, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół 3-5 razy w naczyniu hodowlanym za pomocą strzykawki bez igły.
  5. Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g i zdekantować supernatant.
  6. Lizować krwinki czerwone za pomocą 1 ml buforu ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) inkubować przez 1 minutę i zatrzymać reakcję przez rozcieńczenie 10 objętościami pełnego RPMI. Pozostaw komórki na 5 minut, aby grawitacyjnie rozdrobnić martwe grudki komórek i resztki tkanek.
    Uwaga: Nie stój dłużej niż 5 minut, ponieważ spowoduje to utratę komórek z powodu osiadania żywych komórek.
  7. Powoli zdekantować supernatant zawierający komórki do nowej probówki, pozostawiając zanieczyszczenia w oryginalnej probówce.
  8. Wirować przez 5 minut przy 500 x g w celu osadzenia komórek, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  9. Ponownie zawiesić całkowitą liczbę komórek BM (zwykle 4-6 x 107 komórek BM uzyskuje się z jednej myszy) w buforze FACS o pojemności 100 μl (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).

3. Analiza FACS i sortowanie CLP

  1. Dodaj anty-CD16/32 (klon hybrydoma supernant 2,4G2, 50 μl/reakcję lub 1-2 μg/reakcję) do komórek w buforze FACS (krok 2.9) na 1-2 minuty w celu zablokowania receptorów Fc.
    Uwaga: Anty-CD16 / 32 jest również nazywany blokiem Fc, który jest dodawany, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z komórkami eksprymującymi receptory Fc, w tym granulocytami, monocytami i limfocytami B.
  2. Jednocześnie barwić komórki następującymi przeciwciałami znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym (dla komórek 4x107) przez 15 minut na lodzie, unikając światła otoczenia. Przeciwciała: markery linii sprzężone z PE (po 0,2 μg), w tym anty-CD3 (17A2), anty-CD8 (53-6.). 7), anty-B220 (RA3-6B2), anty-CD19 (eBio1D3), anty-CD11b (M1/70), anty-Gr-1 (RB6-8C5), anty-Thy1.1 (HIS51), anty-NK1.1 (PK136), anty-TER119 (TER-119) i anty-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg anty-c-Kit-PerCP-Cy5,5 (2B8), 1 μg anty-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg anty-M-CSFR-APC (AFS98) i 0,2 μg anty-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Przemyć komórki 3 ml buforu FACS i odwirować przez 5 minut przy 500 x g.
  4. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 300 μl i przefiltrować komórki przez sitko o pojemności 40 μM.
  5. Przemyć probówkę dodatkowym buforem FACS o pojemności 100 μl w celu odzyskania pozostałych komórek i przefiltrować do sterylnej probówki sortującej FACS przy użyciu tego samego sitka do komórek.
  6. Analizę cytometryczną przepływową należy przeprowadzić natychmiast po barwieniu, używając odpowiednich filtrów i napięć do wykrywania sygnału. Użyj lasera 488 nm do wykrywania przeciwciał znakowanych FITC, PerCP-Cy5.5, lasera 561 nm do wykrywania przeciwciał znakowanych PE i PE-Cy7 oraz lasera 633 nm do wykrywania przeciwciał znakowanych APC.
  7. Sortuj CLP według następujących znaczników: lin-c-kit,int, Sca-1,int, M-CSFR-IL-7Rα+ (zgodnie z zabarwieniem w kroku 3.2), używając sortera komórek. Zebrać posortowane komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml pełnego RPMI jako poduszkę.
  8. Zapisz bezwzględną liczbę posortowanych komórek, jak pokazano przez sortownik komórek na końcu przebiegu. Zazwyczaj 5x104 CLP można uzyskać z BM jednej myszy.

4. Coculture CLP i AC-6

  1. Odwirować posortowane komórki z kroku 3.7 przez 10 minut przy 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z wystarczającą ilością pełnego RPMI, aby uzyskać gęstość komórek około 5x104 komórek/ml. Wysiać 500 komórek/basenik na 12-dołkową płytkę zawierającą komórki zasilające przygotowane w kroku 1.4.
  2. Dodać 100 ng/ml FL19 (hu-Flt3L-Ig wytworzony we własnym zakresie przy użyciu systemu ekspresji dostarczonego przez M. Manz, Szpital Uniwersytecki w Zurychu, Szwajcaria) i inkubować w temperaturze 37oC, 5% CO2 z okresowym wizualnym monitorowaniem rozwoju prądu stałego pod mikroskopem.
    Uwaga: Dostępny na rynku rekombinowany ludzki FL lub mysi FL może być stosowany jako substytut hu-Flt3L-Ig w celu wsparcia rozwoju prądu stałego.
  3. Zebrać komórki w supernatance w dniu 12 i przemyć studzienki raz 0,5 ml kompletnej pożywki RPMI, łączącej otrzymane supernatanty. Dodać 0,5 ml świeżej pożywki i zeskrobać przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek.
  4. Połączyć pożywkę zawierającą komórki z obu części i wirować przez 5 minut przy 500 x g.
  5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 50 μl. Dodać 50 μl supernatantu hybrydoma anty-CD16/32 i inkubować przez 1-2 minuty w celu zablokowania receptorów Fc.
  6. Wylicz i wybarwij wszystkie komórki następującymi przeciwciałami (po 0,05 μg każda): anty-CD11c-APC (N418), anty-CD11b-FITC i anty-B220-PE.
  7. Umyć i odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 3.3.
  8. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS 100 μl, zabramkować na CD11c+ i przeanalizować pod kątem cDC (CD11c+CD11b+B220-) i pDC (CD11c+CD11b-B220+)17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z kości udowych i piszczeli jednej myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego w wieku 6-8 tygodni zazwyczaj izoluje się łącznie 4-6x107 komórek szpiku kostnego (BM). W celu wyizolowania CLP, całkowitą populację komórek BM barwi się przeciwciałami sprzężonymi z PE przeciwko markerom linii (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 oraz MHC-II), przeciwciałem anti-c-Kit-PerCP/Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC oraz anti-IL-7Rα-PE/Cy7, a następnie analizuje się i sortuje za pomocą sortera komórek. St...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy system hodowli in vitro dla solidnego wytwarzania DC, a w szczególności pDC, z niewielkiej liczby CLP. Wyjątkowość tego systemu hodowli wynika z zastosowania komórek AC-6, linii komórek zrębu, jako karmników. Wykazano, że takie podejście dostarcza nie tylko cytokin, takich jak IL-7, SCF, M-CSF i FL20, ale także kontakt komórka-komórka21 niezbędny do wspierania rozwoju prądu stałego. Komórki AC-6 były już wcześniej wykorzystywane do ułatwienia badań nad rozwojem D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni doktorom Markusowi Manzowi i Irvingowi Weissmanowi za dostarczenie odczynników. Doceniamy również usługi świadczone przez Główny Zakład Analizy Cytometrii Przepływowej i Sortowania Komórek w Pierwszym i Drugim Laboratorium Podstawowym odpowiednio w National Taiwan University College of Medicine i szpitalu NTU. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) oraz Narodowe Instytuty Badawcze Zdrowia na Tajwanie (NHRI-EX102-10256SI i NHRI-EX103-10256SI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-mysz Ly6g/Ly6c (PE), klon RB6-8C5Biolegend108408marker linii
Anty-mysz NK1.1 (PE), klon PK136Biolegend108708marker linii
Anti-mysz  CD11b (PE), klonM1/70Biolegend101208marker liniowy
Anty-mysz CD19 (PE), klon eBio1D3Biolegend115508marker liniowy
Anty-mysz B220 (PE), klon RA3-6B2Biolegend103208marker linii/FACS
Anty-mysz CD3 (PE), klon 17A2Biolegend100308marker linii
Anty-mysz CD8a (PE), klon 53-6.7Biolegend100707marker liniowy
Anty-mysz MHC-II (PE), klon NIMR-4Biolegend107608marker linii
Anty-mysz Ter119 (PE), klon TER-119Biolegend116208marker linii
Anti-mouse Thy1.1 (PE), klon HIS51eBioscience12-0900-83marker linii
Anti-mouse M-CSFR (APC), klon AFS98Biolegend135510FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), klon 2B8Biolegend105824FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), klon D7Biolegend108106FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), klon A7R34Biolegend135014FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), klon N418Biolegend117328FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), klon M1/70Biolegend101206FACS
FACSAria IIIBD BiosciencesSortownik komórek
Rurka sortująca FACS BD Biosciences352054
FlowJo FlowJo LLCOprogramowanie do analizy przepływu

Bibliografia

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowaligand Flt3kom rki tworz ce obszary brukowaneizolacja szpiku kostnegohodowla kom rkowana wietlanie gammasortowanie kom rek

Powiązane artykuły