Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Podsumowanie

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Streszczenie

Mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają szczególną rolę w wielu patologiach chorobowych. W związku z tym pomiar zużycia tlenu jako wskaźnika funkcji mitochondriów w tej tkance stał się bardziej powszechny. Chociaż istnieje wiele technologii i testów, które mierzą mitochondrialne szlaki oddechowe w różnych komórkach, tkankach i gatunkach, obecnie istnieje luka w literaturze dotyczącej kompilacji tych testów przy użyciu wyizolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do stosowania w technologiach opartych na mikropłytkach. Co ważne, stosowanie testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach rośnie wśród biologów mitochondrialnych, ponieważ pozwala to na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów. W związku z tym opracowano zbiór testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach, które są w stanie ocenić mechanistyczne zmiany/adaptacje w zużyciu tlenu w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym. Przedstawione w niniejszym dokumencie metody zawierają instrukcje krok po kroku, jak wykonać te testy z optymalną ilością białka mitochondrialnego i odczynników oraz z wysoką precyzją, o czym świadczy minimalna wariancja w zakresie dynamicznym każdego testu.

Wprowadzenie

Główną fizjologiczną rolą mitochondriów mięśni szkieletowych jest wytwarzanie ATP z fosforylacji oksydacyjnej¹. Co ważne, mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają szczególną rolę w zdolności wysiłkowej2, starzeniu^się3, chorobie zwyrodnieniowej4 i cukrzycy typu ^II5. W związku ze starzeniem się społeczeństwa, w którym cukrzyca typu II jest siódmą^{najczęstszą} przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych⁶, zapotrzebowanie na metody oceny funkcji mitochondriów staje się coraz bardziej powszechne w badaniach biomedycznych^7,8. W szczególności pomiar zużycia tlenu ma wyjątkową przydatność w ocenie funkcji mitochondriów, ponieważ reprezentuje skoordynowaną funkcję między genomami mitochondrialnymi i jądrowymi w celu ekspresji funkcjonalnych składników fosforylacji oksydacyjnej⁹.

Istnieje kilka technologii, które umożliwiają pomiar zużycia tlenu w nienaruszonych komórkach i izolowanych mitochondriach^7-10. Ponadto opracowano testy dla wielu typów komórek i tkanek oraz dla różnych gatunków, które pozwalają na pomiar szlaków mitochondrialnych i kontrolę oddechu^9,11,12. Jednak obecnie istnieje luka w literaturze w odniesieniu do kompilacji wszystkich tych testów z wykorzystaniem izolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do stosowania w technologiach zużycia tlenu opartych na mikropłytkach. Co ważne, stosowanie testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach jest coraz częstsze wśród biologów mitochondrialnych i pozwala na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów⁹. W związku z tym opracowano zbiór testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach, które pozwalają na określenie, gdzie w łańcuchu transportu elektronów (ETC) mogą występować nieprawidłowości i/lub adaptacje. Ponadto opracowano dwa dodatkowe testy respirometryczne oparte na mikropłytkach, które umożliwiają ocenę koordynacji między cyklem kwasu trikarboksylowego (TCA) a ETC oraz między ß-oksydacją a ETC. Co ważne, przedstawione metody zapewniają jasny i zwięzły sposób pomiaru mechanistycznych zmian funkcji mitochondriów w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym.

Protokół

UWAGA: Ten protokół rozpoczyna się po wyizolowaniu mitochondriów z czerwonych mięśni szkieletowych. Mitochondria wyizolowano, jak opisano wcześniej, z ~ 75 - 100 mg czerwonych mięśni szkieletowych¹³. Z tej ilości tkanki uzyska się od 5 do 10 μg / μl białka mitochondrialnego poprzez ponowne zawieszenie końcowego osadu mitochondrialnego w ≤50 μl buforu izolacyjnego dla mitochondriów (IBM) 2 (patrz Frisard i wsp. ¹³).

1. Konfiguracja

1. Przygotować robocze roztwory podstawowe (Tabela 1) i mieszaniny roztworów do oznaczania mitochondriów (MAS) (Tabela 2) do kolejnych testów.
   Uwaga: Większość przygotowań do testów można wykonać z wyprzedzeniem, ponieważ większość roztworów podstawowych i MAS można przechowywać.
2. Uwodnić wkład testu respirometrycznego w 1 ml roztworu kalibracyjnego w noc poprzedzającą eksperyment w inkubatorze innym niż CO₂ w temperaturze 37 °C.
3. W dniu doświadczenia wyjąć zamrożone wywary (substraty i modulatory mitochondrialne, mieszaninę MAS, MAS bez BSA, tabela 1) i rozmrozić w łaźni o temperaturze 37 °C lub w inkubatorze.
4. Przygotować wszystkie roztwory substratów (Tabela 3) i wstrzyknięcia (Tabela 4-5) i dostosować pH zgodnie z potrzebami (pH 7,4). Po dostosowaniu pH przechowywać na lodzie.
5. Zaprogramuj wielodołkową maszynę do pomiaru zużycia tlenu, aby prawidłowo mieszała, czekała i mierzyła parametry (patrz tabela 6) i oznacz tło oraz studzienki grupowe/kondycjonalne, najpierw wchodząc do oprogramowania analitycznego, a następnie w trybie "Standard".
   1. Wejdź na forum "Gość" i kliknij na "Kreator testów". W "Kreatorze testów" kliknij "Protokół", aby zmienić parametry mieszania, oczekiwania i pomiaru. Oznacz studzienki tła pod "Wstecz. Korekta" i pamiętaj, aby zaznaczyć opcję "Wykonaj korektę tła".
   2. Oznacz warunki, klikając najpierw zakładkę "Grupy i etykiety", a następnie zakładkę "Informacje o grupie". Po wprowadzeniu tych parametrów kliknij "Koniec", a następnie "Zapisz szablon".

2. Przebieg testu

1. Załaduj roztwory iniekcyjne do kartridża testowego i rozpocznij kalibrację, najpierw wprowadzając oprogramowanie analityczne, a następnie przechodząc do trybu "Standardowego". Wejdź na forum "Gość". Otwórz szablon zapisany w kroku 1.5 pod dyskiem "XF", w zakładce "Szablony". Po otwarciu kliknij "Start", aby rozpocząć kalibrację.
   Uwaga: Kaseta z testem musi być wprowadzona do maszyny z naciętym rogiem w lewym dolnym rogu. Trwa to około 30 minut. Należy uważać, aby wstrzykiwać roztwory do odpowiednich portów. Iniekcje w tabeli 4-5 są wymienione w kolejności ładowania.
2. Delikatnie, ale dokładnie wymieszaj zapas mitochondriów, mieszając roztwór z końcówką do pipety o pojemności 200 μl, a następnie delikatnie rozcierając zapas końcówką do pipety o pojemności 200 μl, której otwór został poszerzony przez odcięcie nożyczkami ~ 3 mm od końca końcówki.
3. Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić stężenie białka w stadzie mitochondrialnym.
4. Korzystając ze stężenia podstawowego uzyskanego w kroku 2.3, ponownie zawiesić 10 μg białka mitochondrialnego/200 μl mieszaniny substratów bursztynian/rotenon (Tabela 3). Zawiesić ponownie 14 μg białka mitochondrialnego/200 μl pozostałych mieszanin substratów (należy to zrobić dla każdej mieszaniny substratów) (Tabela 3). Umieść wszystkie mieszanki białek mitochondrialnych z substratem na lodzie.
   Uwaga: Optymalna ilość białka mitochondrialnego na studzienkę dla każdego testu została określona zgodnie z wcześniejszym opisem⁹. Stwierdzono, że testy pirogronianu / jabłczanu, palmitoilokarnityny / jabłczanu, glutaminianu / jabłczanu i przepływu elektronów wykorzystują 3,5 μg białka mitochondrialnego, podczas gdy test bursztynianu / rotenonu wykorzystuje 2,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę. Dlatego badacz musi ponownie zawiesić wystarczającą ilość białka mitochondrialnego dla 4 powtórzeń na tym etapie, ponieważ na studzience ładowane jest 2,5 μg lub 3,5 μg na 50 μl (patrz krok 2.6).
5. Wymieszaj roztwory mitochondriów/substratów delikatnie, ale dokładnie, mieszając roztwór z końcówką pipety o pojemności 200 μl, a następnie delikatnie rozcierając bulion końcówką pipety o pojemności 200 μl, której koniec został odcięty ~ 3 mm.
6. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej na lodzie i w trzech egzemplarzach załadować 50 μl/studzienkę każdej z mieszanin mitochondriów/substratów. Twórcy testu respirometrycznego opartego na mikropłytkach zalecają pozostawienie co najmniej dwóch ślepych (bez mitochondriów) studzienek, najlepiej po obu stronach płytki do hodowli komórkowej.
7. Obracać płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 2 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania płytki rozgrzać roztwory podłoża w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
8. Po zakończeniu wirowania ostrożnie załaduj 450 μl każdego roztworu substratu na odpowiednie dołki (tj. załaduj substrat pirogronianowy/jabłczan do studzienek, w których mitochondria są początkowo ponownie zawieszone w tym roztworze substratu). Pamiętaj, aby załadować płytę w RT. Uwaga: Puste studzienki należy załadować 500 μl podłoża. Ślepe studzienki przeznaczone do oznaczania przepływu elektronów powinny być załadowane substratem przepływu elektronów (pirogronian/jabłczan + FCCP), podczas gdy sprzężone ślepe studzienki testowe mogą być załadowane dowolnym substratem do oznaczania sprzęgającego.
   Uwaga: W przypadku wykonywania testów sprzężonych i przepływu elektronów na tej samej płytce, badacz musi ponownie przypisać studzienki tła do odpowiednich testów po zakończeniu testu za pomocą platformy "XF Reader" za pośrednictwem zakładki "Instrument". Po przejściu do ustawień "Instrument" kliknij zakładkę "Administracja", a następnie "Korekta tła". Naciśnij "Zakończ tryb konfiguracji instrumentu" po zakończeniu. Dzieje się tak, ponieważ połączenie askorbinianu/TMPD może zużywać_O2, dlatego dla każdego typu testu potrzebna jest osobna korekta tła.
9. Po dodaniu 450 μl substratu do każdej studzienki, obejrzyj warstwę mitochondriów w studzience, aby upewnić się, że mitochondria są równomiernie rozproszone w jednej monowarstwie (20-krotne powiększenie [patrz Rogers⁹, ryc. 4]). Studnie, które nie wydają się mieć równomiernie rozłożonej monowarstwy, można usunąć post hoc.
10. Po sprawdzeniu przylegania mitochondriów włóż mikropłytkę do przyrządu do testu respirometrycznego i rozpocznij test, klikając "OK".
    Uwaga: Kalibracja z kroku 2.1 musi zostać zakończona przed rozpoczęciem biegu. Gdy badacz kliknie "OK", urządzenie wysunie tabliczkę narzędziową, która została użyta do kalibracji.
    1. Wyjmij płytkę użytkową i umieść na tacy płytkę do hodowli komórkowej zawierającą mitochondria. Niebieskie nacięcie na płytce do hodowli komórkowej należy umieścić w lewym dolnym rogu tacy. Kliknij "kontynuuj", aby rozpocząć przebieg testu.
11. Po zakończeniu cyklu wysuń płytkę z kulturą komórkową i wkład, naciskając "Wysuń" na ekranie.
    1. Po wysunięciu płytki wyjmij i wyrzuć płytkę do hodowli komórkowej i wkład, a następnie kliknij "Kontynuuj" na ekranie. Przebieg zostanie automatycznie zapisany jako plik .xls w pliku "Dane".
12. Otwórz ten plik i zmień wyświetlanie z "O2" na "OCR", naciskając strzałkę w dół pod znacznikiem "Y1:".
    1. Następnie zmień "Punkt środkowy" na "Stawki punkt-punkt" w opcji "Dane stawki wyświetlane jako:". Kliknij "OK", aby zastosować te zmiany.
13. Kliknij zakładkę "Tryb grupowania studni" w lewym dolnym rogu ekranu, aby pogrupować ze sobą studnie o podobnych warunkach. Na koniec kliknij kartę "Przykładowa średnia/błąd standardowy" w kierunku środka ekranu, po lewej stronie. Alternatywnie te polecenia można skonfigurować przed rozpoczęciem testu w ustawieniu "Kreator testów".
    Uwaga: Każdy warunek będzie miał wyświetlaną średnią ± odchylenie standardowe dla każdej stawki i każdego warunku. Wykonywane są pomiary szybkości dla każdego stanu (oddychanie w stanie 2 [sprzężenie]/stanie 3u [przepływ elektronów], po którym następują cztery wstrzyknięcia). Użyć średniej szybkości stanu 2 z drugiego pomiaru, określić stan 4o w punkcie minimum po wstrzyknięciu oligomycyny, użyć punktu maksymalnego odpowiednio dla stanu 3 i stanu 3u po wstrzyknięciu ADP i FCCP oraz użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego antymycyną A dla testów sprzęgających. Użyć punktu maksymalnego dla oddychania indukowanego pirumianem/jabłczanem 3u, użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego rotenonem, użyć punktu maksymalnego dla oddychania indukowanego bursztynianem 3u i użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego antymycyną A dla testu przepływu elektronów. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono 3 razy, a przedstawione dane są wynikami reprezentatywnego śledzenia.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia wskaźniki zużycia tlenu (OCR) dla testów pirogronianu/jabłczanu, bursztynianu/rotenonu, palmitoilokarinityny/jabłczanu i glutaminianu/jabłczanu (Testy sprzęgające). Te ślady testowe są wyświetlane jako wskaźnik zużycia tlenu lub OCR w funkcji czasu, są skorelowane z tłem i są wyświetlane jako wskaźniki punkt-punkt. Każdy panel reprezentuje zużycie tlenu w różnych stanach mitochondrialnych, jak opisano przez Chance'a i Williamsa¹⁴. Pierwszy panel reprezentuje podstawowe zużycie tlenu lub stan 2. Drugi panel, po wstrzyknięciu ADP, reprezentuje maksymalne sprzężone oddychanie, czyli stan 3. Trzeci panel, po wstrzyknięciu oligomycyny A (inhibitora kompleksu V), reprezentuje oddychanie z powodu wycieku protonów lub stan 4o. Czwarty panel, po wstrzyknięciu FCCP, reprezentuje maksymalne oddychanie niesprzężone, czyli stan 3u. Wreszcie piąty panel, po wstrzyknięciu antymycyny A, reprezentuje hamowanie oddychania oksydacyjnego. Warto zauważyć, że wszystkie stany mitochondrialne mają minimalne odchylenie standardowe. Dzieje się tak dzięki dokładnemu wymieszaniu materiału mitochondrialnego i mieszanin mitochondriów/substratów oraz uzyskaniu pojedynczej monowarstwy mitochondriów po wirowaniu przylegania (krok 2.6). Z drugiej strony, ładowanie nierównych mitochondriów w każdym dołku i brak uzyskania pojedynczej monowarstwy mitochondriów w studzience mikropłytki prowadzi do zwiększonego odchylenia standardowego w każdym stanie, jak pokazano na rysunku 2.

Ślady na rysunku 1 pokazują płaskowyże dla każdego stanu mitochondrialnego i dla każdego substratu. Plateau osiągnięte po dwóch cyklach pomiarowych sugeruje dobrą jakość mitochondriów i to, że mitochondria pozostają przylegające do studzienki przez cały czas trwania testu. Ponadto osiągnięcie maksymalnych wskaźników plateau może być bardziej pożądane, ponieważ pozwala to badaczowi na wykonanie średniego OCR w tych stanach mitochondrialnych, zmniejszając w ten sposób odchylenie, które może wystąpić w wyniku arbitralnego wyboru punktu.

Ilość mitochondriów na studnię została określona przez próby optymalizacyjne. Optymalna ilość mitochondriów na studzienkę powinna skutkować szybkościami stanu 2 między 100-200 pmol/min/studnię, a szybkością stanu 3 < 1,500 pmol/min/studnię, ponieważ wartości te mieszczą się w zakresie dynamicznego wykrywania tlenu wielostudziennej maszyny do pomiaru zużycia tlenu. Załadowanie zbyt dużej ilości białka mitochondrialnego na studzienkę może spowodować OCR wykraczające poza zakres dynamiczny instrumentu (ryc. 3A). Rysunek 3 przedstawia ładowanie 3,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę (niebieskie śledzenie) w porównaniu z ładowaniem 2,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę (czerwony ślad) dla testu bursztynianu/rotenonu. Ładowanie zbyt dużej ilości białka mitochondrialnego na studzienkę może również prowadzić do wyczerpania tlenu w mikrokomorze studzienki, uniemożliwiając w ten sposób dokładny pomiar OCR dla każdego kolejnego pomiaru⁹ (ryc. 3B). OCR punkt-punkt to chwilowa szybkość zmian OCR. Jeśli jest płaski, OCR jest stały/stabilny, ale jeśli maleje, może to oznaczać problem biologiczny lub techniczny. Gwałtowny spadek OCR w oddychaniu w stanie 3 i stanie 3u (ryc. 3A) jest spowodowany tym, że mitochondria wyczerpują zapas tlenu przed końcem pomiaru (ryc. 3B).

Rysunek 4 przedstawia OCR w funkcji czasu dla testu przepływu elektronów. Śledzenie jest korygowane i wyświetlane zgodnie z opisem na rysunku 1. Pierwszy panel w tym teście reprezentuje oddychanie stanu 3u na pirogronianie/jabłczanie za pośrednictwem kompleksu I. Drugi panel, po wstrzyknięciu rotenonu, reprezentuje hamowanie oddychania za pośrednictwem kompleksu I. Trzeci panel, po wstrzyknięciu bursztynianu, reprezentuje stan stymulowany substratem 3u z elektronami wchodzącymi do ETC w kompleksie II (oddychanie za pośrednictwem kompleksu II). Czwarty panel, po wstrzyknięciu antymycyny A, reprezentuje hamowanie kompleksu III, a tym samym całkowite oddychanie. Wreszcie piąty panel, po wstrzyknięciu askorbinianu / TMPD, reprezentuje oddychanie za pośrednictwem kompleksu IV. Podobnie jak w przypadku śladów na rysunku 1, wszystkie stany mitochondrialne mają minimalne odchylenie standardowe, a każda szybkość osiągnęła lub prawie osiągnęła plateau.

Rysunek 1. Testy sprzęgające. (A) 10 mM pirogronianu / 5 mM jabłczanu, (B) 10 mM bursztynian / 2 μM rotenon, (C) 40 μM palmitoilokarinityny / 1 mM jabłczan i (D) 10 mM glutaminian/ 10 mM jabłczan sprzężony z oddychaniem mitochondrialnym zgodnie z wielodołkowym pomiarem zużycia tlenu. Wartości są wyrażone jako średnia ± SD. Białko mitochondrialne załadowane na studzienkę wynosiło 3,5 μg dla wszystkich testów z wyjątkiem bursztynianu/rotenonu, który wykorzystuje 2,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę. Dane reprezentują n=3 sparowane kontrpróby biologiczne. OCR = wskaźnik zużycia tlenu; ADP = difosforan adenozyny; Oligo = Oligomycyna A; FCCP = cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Anty-A = Antymycyna A; PYR = pirogronian; SUCC = bursztynian; ROT = rotenon; PAL-C = palmitoilokarnityna; GLUT = glutaminian. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. 

Rysunek 2. Wysoce zmienny test pirogronianu/jabłczanu. Wysoce zmienny test pirogronianu 10 mM / jabłczanu 5 mM spowodowany niepełnym wymieszaniem mitochondriów z materiału mitochondrialnego w mieszaninie substrat/MAS, co prowadzi do zmiennego obciążenia białkami mitochondrialnymi w każdym dołku. Białko mitochondrialne załadowane na studzienkę wynosiło 3,5 μg. Dane reprezentują n=3 sparowane kontrpróby biologiczne. OCR = wskaźnik zużycia tlenu; ADP = difosforan adenozyny; Oligo= oligomycyna A; FCCP = cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Anty-A = antymycyna A; PYR=Pirogronian. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Przeciążenie białka mitochondrialnego w teście bursztynianu/rotenonu. (A) Wskaźniki zużycia tlenu poza zakresem dynamicznym wielostudziennej maszyny do pomiaru zużycia tlenu spowodowane obciążeniem 3,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę (niebieskie śledzenie) w porównaniu z obciążeniem 2,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę (czerwone śledzenie). (B) Ciśnienie tlenu zbliżające się do zera po wstrzyknięciach ADP i FCCP spowodowane ładowaniem nadmiernej ilości białka mitochondrialnego (3,5 μg) na studzienkę (niebieskie śledzenie) w porównaniu z obciążeniem optymalną ilością (2,5 μg) białka mitochondrialnego na studzienkę (czerwone śledzenie). Dane reprezentują n = 3 sparowane kontrpróby biologiczne na ilość białka mitochondrialnego. OCR = wskaźnik zużycia tlenu; ADP = difosforan adenozyny; Oligo = Oligomycyna A; FCCP = cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Anty-A = Antymycyna A; SUCC = bursztynian; ROT = rotenon; O₂ = tlen; mm Hg = milimetry słupa rtęci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Test przepływu elektronów. 5 mM pirogronian/1 mM jabłczan + 4 μM FCCP, śledzenie testu oddychania mitochondrialnego przepływu elektronów, jak określono za pomocą wielodołkowego pomiaru zużycia tlenu. Wartości są wyrażone jako średnia ± SD. Białko mitochondrialne załadowane na studzienkę wynosiło 3,5 μg. Dane reprezentują n=3 sparowane kontrpróby biologiczne. OCR = wskaźnik zużycia tlenu; Anty-A = Antymycyna A; Asc = askorbinian; TMPD = N,N,N′,N′-tetrametylo-p-fenylenodiamina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynnik Koncentracja zapasów Mw Ostatni tom Masa dodana Komentarze/Opis (M) (g/mol) Panie przewodniczący, panie i góra! (g lub ml) EGTA, pH 7,2 0,1 380,35 pkt. 100 ml 1M Tris Base 3.801 gr Przechowywać w temperaturze 4 °C HEPESY 1 238,3 pkt. 250 ml DiH₂O Waga 59. 57 gramów Przechowywać w temperaturze 4 °C MgCl₂, sześciowodny 1 203,31 pkt. 250 ml DiH₂O 50,82 gr Przechowywać w temperaturze 4 °C Pirogronian pH 7,4 0,1 88.06 (Występuje jako roztwór 14.11 M) 40 ml DiH₂O 0,283 ml kwasu pirogronowego Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C, przygotowywać świeże co dwa tygodnie Bursztynian pH 7,4 0,5 Godzina 118.09 100 ml DiH₂O 9,4 g kwasu bursztynowego Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C Jabłczan, pH 7,4 0,5 134.09 100 ml 95% etanolu 6,7 g kwasu jabłkowego Przygotować 200 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C TMPD (Protokół TMPD) 0,01 pkt. 164,25 pkt. Pojemność 10 ml 0,0164 grama Przygotować 300 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C; Wymieszaj z równomolową ilością askorbinianu, aby utrzymać TMPD na niskim poziomie Chlorek L-karnityny palmitoilu 0,01 pkt. Numer katalogowy: 436.07 1,14 ml 95% etanolu 0,005 grama Przygotować 40 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C Oligomycyna A 0,006 791.06 Rozdział 791.06 0,987 ml 95% etanolu 0,005 grama Przygotować 20 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C FCCP (Protokół FCCP) 0,01 pkt. Klasa 254,17 3,9 ml 95% etanolu 0,01 gr Przygotować 40 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C Rotenon 0,001 pkt. 394,4 pkt. 10 ml 95% etanolu 0,0039 gr Przechowywać w temperaturze -20 °C Antymycyna A 0,005 pkt. 548,63 pkt. 9,12 ml 95% etanolu 0,025 gr Przechowywać w temperaturze -20 °C K⁺ ADP 0,5 501.32 TGL 3,9 ml DiH₂O 1,0 gr Przechowywać w temperaturze -20 °C Kwas jabłkowy, pH 7,4 0,5 134.09 Pojemność 40 ml 2,68 gr Przygotować 200 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C

Tabela 1.Roztwory podstawowe

Odczynnik Koncentracja zapasów Masa dodana Końcowa molowość/Procent (M) (g lub ml) sacharoza -- 11,98 gr 70 mM Mannitol -- 20,04 gr 220 mM Fosforan potasu jednozasadowy -- 0,34 grama 5 mM MgCl₂, sześciowodny 1 Pojemność 2,5 ml 5 mM HEPESY 1 Pojemność 1,0 ml 2 mM EGTA (EGTA) 0,1 Pojemność 5,0 ml 1 mM Zasadniczo bez kwasów tłuszczowych - BSA -- 1,0 gr 0,20%

Tabela 2.MAS Mix. pH 7,4, 500 ml: Podwielokrotność 25 ml i przechowywać w temperaturze -20 ºC *Uwaga: Z wyłączeniem BSA dla mieszaniny MAS używanej do oznaczania iniekcji.

Podłoże podłoża Stężenie końcowe Ilość zapasów (μl) Ilość MAS* (ml) Pirogronian/Jabłczan 10 mM/5 mM Pirogronian: 1,000 9 Jabłczan: 100 Sukcycynat/Rotenon 10 mM/2 μM Bursztynian: 200 10 Rotenon 20 *Pirogronian/Jabłczan + FCCP 5 mM/1 mM/4 μM Pirogronian: 500 10 FCCP: 4 Jabłczeń: 20 Palmitoyl L-karnityna/jabłczan 40 μM/1 mM Palmitoylkarnityna: 40 Jabłczan: 20 10 Glutaminian/Jabłczan 10 mM/10 mM Glutaminian: 400 10 Jabłczan: 200

Tabela 3.Roztwory substratów pH 7,4: Świeżość w dniu eksperymentu. *Roztwór do oznaczania przepływu elektronów.

Medium iniekcyjne koncentracja Ilość zapasów (μl) Ilość MAS (ml) Ilość wstrzyknięta do wkładu Stężenie końcowe (Po wstrzyknięciu do płytki) Adp 50 mM 300 μl 3 50 μl 5,0 mln Oligomycyna A 20 μM 10 μl 3 55 μl 2,0 μM FCCP (Protokół FCCP) 40 μM 12 μl 3 60 μl 4,0 μM Antymycyna A 40 μM 24 μl 3 65 μl 4,0 μM

Tabela 4. Iniekcje do testów sprzężonych. pH 7,4: Świeżość w dniu eksperymentu. *Testy sprzęgające obejmują (między innymi) pirogronian/jabłczan, bursztynian/rotenon, palmitoilokarnitynę/jabłczan i glutaminian/jabłczan.

Medium iniekcyjne koncentracja Ilość zapasów (g lub ul) Ilość MAS (ml) Ilość wstrzyknięta do wkładu Stężenie końcowe (po wstrzyknięciu do płytki) Rotenon 20 μM 60 μl 3 50 μl 2,0 μM Bursztynian 50 mM 300 μl 3 55 μl 5,0 mln Antymycyna A 40 μM 24 μl 3 60 μl 4,0 μM TMPD/Ascorabte 1 mM, 100 mM TMPD : 300 μl 3 65 μl 100 μM, 10 mM Askorbinian: 0,059 g

Tabela 5. Iniekcje do testu przepływu elektronów. pH 7,4: Świeżość w dniu eksperymentu

polecenie Czas (min) # cykli kalibrować czekać 10 min (aby płyta mogła się rozgrzać od etapu przylegania) mieszać 1 min 2 miara Czas trwania: 2 min Wstrzyknięcie A mieszać 1 min 2 miara Czas trwania: 2 min Wstrzyknięcie B mieszać 1 min 2 miara Czas trwania: 2 min Wstrzyknięcie C mieszać 1 min 2 miara Czas trwania: 2 min Wstrzyknięcie D mieszać 1 min 2 miara Czas trwania: 2 min

Tabela 6. Protokół uruchamiania instrumentu.

Dyskusja

Metody przedstawione w tym artykule zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu mitochondriów wyizolowanych z 75 - 100 mg mięśni szkieletowych myszy. Testy te można wykonywać z dużą precyzją, o czym świadczy ścisłe odchylenie standardowe między trzema dołkami. Co ważne, te testy respirometryczne pozwalają na określenie, gdzie mogą wystąpić nieprawidłowości i/lub adaptacje w ETC, cyklu TCA, szlaku β-utleniania, transporterach substratów itp. w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym.

Ważne jest, aby podkreślić uzasadnienie stosowania różnych paliw i inhibitorów stosowanych w tym protokole. Testy respirometryczne pirogronianu/jabłczanu i glutaminianu/jabłczanu pozwalają na ocenę oddychania za pośrednictwem kompleksu I, a także ocenę ich odpowiednich transporterów, a w przypadku glutaminianu deaminazy¹⁵. Alternatywnie, połączenie bursztynianu / rotenonu pozwala na ocenę mitochondrialnego strumienia oddechowego przez kompleks II ETC, ponieważ rotenon hamuje kompleks I, a bursztynian dostarcza elektrony do kompleksu II poprzez redukcję dinukleotydu flawinoadeninowego (FADH₂)¹⁵. Testy te dostarczają specyficznych dla substratu informacji na temat skuteczności sprzężenia i maksymalnego oddychania. Test przepływu elektronów jest wyjątkowy, ponieważ połączenie substratów i inhibitorów pozwala na ocenę wielu kompleksów podczas mitochondrialnego przepływu oddechowego⁹. Początkowa mieszanina substratów pirogronian/jabłczan + FCCP pozwala na ocenę maksymalnego oddychania napędzanego przez kompleks I, podczas gdy wstrzyknięcie rotenonu, a następnie bursztynianu pozwala na ocenę maksymalnego oddychania napędzanego przez kompleks II. Wstrzyknięcie antymycyny A, inhibitora kompleksu III, a następnie wstrzyknięcie askorbinianu/TMPD pozwala na ocenę oddychania napędzanego przez kompleks IV, ponieważ askorbinian / TMPD jest donorem elektronów cytochromu C / kompleksu IV. Chociaż nie uzyskuje się żadnych informacji na temat wydajności sprzężenia, metoda ta jest idealna dla bardzo małych próbek, które wykluczają niezależne uruchamianie wielu substratów. Wreszcie, zastosowanie palmitoilokarnityny/jabłczanu palmitoilu pozwala na ocenę koordynacji między utlenianiem β a ETC, ponieważ równoważnik redukujący powstały w wyniku utleniania kwasu palmitynowego (β-oksydacji) jest wprowadzany do ETC przez flawoproteinę¹⁵ przenoszącą elektrony. Należy zauważyć, że testy sprzężenia i przepływu elektronów mogą być również stosowane w połączeniu do identyfikacji zmian w funkcji mitochondriów spowodowanych pewną interwencją (leczenie farmakologiczne, manipulacje genetyczne).

Wysoka precyzja osiągnięta w tych testach wynika przede wszystkim z dokładnego wymieszania mitochondriów, czy to przed oznaczeniem białka, czy z roztworami substratów. W związku z tym, gdy mitochondria zostaną ponownie zawieszone w roztworach substratów, ważne jest, aby dokładnie wymieszać ten roztwór przed załadowaniem płytki do hodowli komórkowej, jak opisano w kroku 2.2, z poszerzoną kryzą końcówki pipety. Brak dokładnego wymieszania mitochondriów doprowadzi do dużej zmienności w teście. Ponadto użycie końcówki pipety z wąskim otworem spowoduje powstanie sił ścinających podczas mieszania mitochondriów i zwiększy potencjał uszkodzenia błon mitochondrialnych i uwolnienia cytochromu C. Etap przestrzegania zaleceń lekarskich (2.7) jest również kluczowym krokiem w tym protokole. Nieobracanie załadowanej płytki hodowli komórkowej wystarczająco długo/szybko spowoduje niepełne przyleganie mitochondriów do dołka, prowadząc w ten sposób do zwiększonej zmienności między studzienkami a pomiarami.

Opisany protokół został zoptymalizowany tak, aby obejmował: ładowanie optymalnej ilości białka mitochondrialnego na studzienkę, stosowanie odpowiednich stężeń/metod przygotowania do sporządzania roztworów podstawowych i substratowych, zmianę przebiegu testu w celu zapewnienia plateau stanu mitochondrialnego oraz odpowiednie mieszanie zapasów mitochondrialnych i mieszanin mitochondrial/substrat. Przed tymi działaniami optymalizacyjnymi autorzy napotkali pułapki w przebiegu testu. Poniżej omówiono metody/modyfikacje rozwiązywania problemów, które były pomocne w optymalizacji tego protokołu. Jeśli chodzi o optymalne obciążenie, obciążenie zbyt małej ilości mitochondriów nie wywoła silnej odpowiedzi, podczas gdy obciążenie zbyt dużej ilości mitochondriów wyczerpie tlen w mikrokomorze i doprowadzi do niedokładnych pomiarów. Rogers i wsp.9 podają przykłady określania optymalnych ilości obciążenia mitochondriów na studzienkę dla testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Częściej zbyt dużo mitochondriów jest załadowanych na studnię, o czym świadczą wskaźniki stanu 2 powyżej 100-200 pmol/min/studnię i wskaźniki stanu 3 >1500 pmol/min/studnia. Jeśli dojdzie do przeciążenia, należy przeprowadzić eksperyment z różnym stężeniem białka mitochondrialnego (np. między 1 a 10 μg), aby wywołać OCR w zakresie dynamicznym maszyny do pomiaru zużycia tlenu. Przygotowanie i stosowanie odpowiednich stężeń substratów i materiałów ma ogromne znaczenie. Zawsze używaj kwaśnej postaci substratów/iniekcji i dostosuj pH za pomocą wodorotlenku potasu lub HCl; Nie zaleca się stosowania/roztworów sodu. Ponadto ponowne zawieszenie substratów/zapasów w DMSO lub 100% etanolu spowoduje niepowodzenie lub błąd pomiaru. Pamiętaj, aby użyć 95% etanolu tam, gdzie jest to zaznaczone. Często zdarza się, że palmitoilokarinityna wytrąca się z 95% etanolu po rozmrożeniu zamrożonego bulionu, powodując w ten sposób dużą zmienność. Pamiętaj, aby dobrze rozgrzać bulion i wir palmitoilokarnityny przed użyciem. Ponadto bardzo zmienny wynik testu pirogronianu/jabłczanu może wynikać z faktu, że materiał pirogroniany ma >2 tygodnie. Pamiętaj, aby co 2 tygodnie przerabiać zamrożone porcje pirogronianu. Test został zmodyfikowany do 2-minutowych pomiarów, aby zapewnić plateau stanu mitochondriów. Jeśli pożądana jest obserwacja wyczerpania ADP, badacz może wydłużyć czas pomiaru w zakładce "Protokół" na forum "Kreator testów". Wreszcie, duża zmienność występuje, gdy zapas mitochondriów i mitochondria oraz roztwory substratów nie są w pełni homogenizowane przed załadowaniem. Jeśli zmienność między studzienkami jest duża po przebiegu testu, należy upewnić się, że roztwór substratu został w pełni wymieszany przed następnym eksperymentem. Nigdy nie mieszaj roztworów mitochondriów/substratów, a raczej mieszaj, rozcieraj i delikatnie rozcieraj końcówką pipety z poszerzonym otworem.

Istnieją pewne ograniczenia tej techniki, na które warto zwrócić uwagę. Po pierwsze, liczba studzienek na płytce do hodowli komórkowej używanej do tych testów jest stosunkowo niska (tj. 24 studzienki i co najmniej 2 przeznaczone dla studzienek ślepych). Jeśli pożądane jest wykonanie wszystkich 5 tych testów na jednej płytce, badacz jest w stanie zbadać odpowiedzi tylko jednej myszy na raz. Należy jednak zauważyć, że dostępnych jest 96 instrumentów wiertniczych o większej przepustowości. Po drugie, istnieją nieodłączne mocne i słabe strony w ocenie dysfunkcji mitochondriów w izolowanych mitochondriach w porównaniu z nienaruszonymi komórkami¹. Niektóre słabości obejmują mniejsze znaczenie fizjologiczne w porównaniu z nienaruszonymi komórkami i wywoływanie artefaktów w procesie izolacji. Wreszcie, sukces tej metody zależy od jakości procesu izolacji mitochondriów.

Chociaż niektóre z tych testów zostały albo opracowane w różnych systemach, albo zostały zwalidowane w innych modelach zwierzęcych, metody przedstawione w niniejszym dokumencie są pierwszymi, które zsyntetyzowały wszystkie wyżej wymienione testy w celu optymalnego wykorzystania w wielostudziennej maszynie do pomiaru zużycia tlenu przy użyciu mięśni szkieletowych myszy. Co ważne, wszystkie 5 z tych testów można wykonać z ilością mitochondriów wyizolowanych z ~75 - 100 mg mięśni szkieletowych myszy, zapewniając w ten sposób wysoką przepustowość przy minimalnym materiale. Ogromne znaczenie ma zdolność technologii wielodołkowego zużycia tlenu do wykonywania testów z minimalną ilością mitochondriów, w połączeniu ze zoptymalizowaną metodą izolacji, pozwala badaczowi na wykonanie wielu innych eksperymentów na pozostałej tkance mięśni szkieletowych (np. zachodnie plamy, RT-PCR, testy enzymatyczne itp.), co często stanowi wyzwanie dla tego modelu zwierzęcego.

Podsumowując, przedstawione w niniejszym dokumencie metody zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Co ważne, przedstawione metody wymagają minimalnej ilości tkanek i mitochondriów. Po opanowaniu, opisane tutaj techniki pozwolą naukowcom określić potencjalny mechanizm wpływu związku lub produktu genu na mitochondrialne zużycie tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sacharoza	Sigma Aldrich	S7903	Przechowywać w RT
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	Przechowywać w RT
Fosforan potasu jednozasadowy, minimum 99,0%	Sigma Aldrich	P5379	Przechowywać w RT
Sześciowodny chlorek magnezu, odczynnik ACS, 99,0-102,0%	Sigma Aldrich	M9272	Przechowywać w RT
HEPES minimum 99,5% miareczkowania	Sigma Aldrich	H3375	Sklep w RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	Sklep w RT
Zasadniczo tłusty	Sigma Aldrich	A6003	Sklep pod adresem 4 & deg; Bez kwasu C
BSA
, 98%	Sigma Aldrich	107360	Przechowywać w 4 & stopni; C
Kwas bursztynowy	Sigma Aldrich	S9512	Przechowywać w RT
L(-) Kwas jabłkowy, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Sklep w RT
Kwas L-glutaminowy	Sigma Aldrich	G1251	Sklep w RT
N,N,N′,N′,N&-Tetramethyl-p-phenylenodiamine	Sigma Aldrich	T7394	Przechowywać w RT
99%, proszek [TMPD]
Chlorek palmitylo-L-karnityny	Sigma Aldrich	P1645	Przechowywać w -20 ° C
Oligomycyna A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)	Sigma Aldrich	C2920	Przechowywać w temperaturze 2 - 8 stopni; C
fenylohydrazon
≥ 98% (TLC), proszek [FCCP]
Antymycyna A z Streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Sklep pod adresem -20 ° C
Sól monopotasowa adenozyno-5′-difosforanu odwadniająca [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Sklep w RT
Pierce™ Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Scientific	23225	Nie dotyczy