Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają szczególną rolę w wielu patologiach chorobowych. W związku z tym pomiar zużycia tlenu jako wskaźnika funkcji mitochondriów w tej tkance stał się bardziej powszechny. Chociaż istnieje wiele technologii i testów, które mierzą mitochondrialne szlaki oddechowe w różnych komórkach, tkankach i gatunkach, obecnie istnieje luka w literaturze dotyczącej kompilacji tych testów przy użyciu wyizolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do stosowania w technologiach opartych na mikropłytkach. Co ważne, stosowanie testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach rośnie wśród biologów mitochondrialnych, ponieważ pozwala to na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów. W związku z tym opracowano zbiór testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach, które są w stanie ocenić mechanistyczne zmiany/adaptacje w zużyciu tlenu w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym. Przedstawione w niniejszym dokumencie metody zawierają instrukcje krok po kroku, jak wykonać te testy z optymalną ilością białka mitochondrialnego i odczynników oraz z wysoką precyzją, o czym świadczy minimalna wariancja w zakresie dynamicznym każdego testu.
Wprowadzenie
Główną fizjologiczną rolą mitochondriów mięśni szkieletowych jest wytwarzanie ATP z fosforylacji oksydacyjnej1. Co ważne, mitochondria mięśni szkieletowych odgrywają szczególną rolę w zdolności wysiłkowej2, starzeniusię3, chorobie zwyrodnieniowej4 i cukrzycy typu II5. W związku ze starzeniem się społeczeństwa, w którym cukrzyca typu II jest siódmąnajczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych6, zapotrzebowanie na metody oceny funkcji mitochondriów staje się coraz bardziej powszechne w badaniach biomedycznych7,8. W szczególności pomiar zużycia tlenu ma wyjątkową przydatność w ocenie funkcji mitochondriów, ponieważ reprezentuje skoordynowaną funkcję między genomami mitochondrialnymi i jądrowymi w celu ekspresji funkcjonalnych składników fosforylacji oksydacyjnej9.
Istnieje kilka technologii, które umożliwiają pomiar zużycia tlenu w nienaruszonych komórkach i izolowanych mitochondriach7-10. Ponadto opracowano testy dla wielu typów komórek i tkanek oraz dla różnych gatunków, które pozwalają na pomiar szlaków mitochondrialnych i kontrolę oddechu9,11,12. Jednak obecnie istnieje luka w literaturze w odniesieniu do kompilacji wszystkich tych testów z wykorzystaniem izolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do stosowania w technologiach zużycia tlenu opartych na mikropłytkach. Co ważne, stosowanie testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach jest coraz częstsze wśród biologów mitochondrialnych i pozwala na pomiary o wysokiej przepustowości przy użyciu minimalnych ilości izolowanych mitochondriów9. W związku z tym opracowano zbiór testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach, które pozwalają na określenie, gdzie w łańcuchu transportu elektronów (ETC) mogą występować nieprawidłowości i/lub adaptacje. Ponadto opracowano dwa dodatkowe testy respirometryczne oparte na mikropłytkach, które umożliwiają ocenę koordynacji między cyklem kwasu trikarboksylowego (TCA) a ETC oraz między ß-oksydacją a ETC. Co ważne, przedstawione metody zapewniają jasny i zwięzły sposób pomiaru mechanistycznych zmian funkcji mitochondriów w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym.
Protokół
UWAGA: Ten protokół rozpoczyna się po wyizolowaniu mitochondriów z czerwonych mięśni szkieletowych. Mitochondria wyizolowano, jak opisano wcześniej, z ~ 75 - 100 mg czerwonych mięśni szkieletowych13. Z tej ilości tkanki uzyska się od 5 do 10 μg / μl białka mitochondrialnego poprzez ponowne zawieszenie końcowego osadu mitochondrialnego w ≤50 μl buforu izolacyjnego dla mitochondriów (IBM) 2 (patrz Frisard i wsp. 13).
1. Konfiguracja
- Przygotować robocze roztwory podstawowe (Tabela 1) i mieszaniny roztworów do oznaczania mitochondriów (MAS) (Tabela 2) do kolejnych testów.
Uwaga: Większość przygotowań do testów można wykonać z wyprzedzeniem, ponieważ większość roztworów podstawowych i MAS można przechowywać. - Uwodnić wkład testu respirometrycznego w 1 ml roztworu kalibracyjnego w noc poprzedzającą eksperyment w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C.
- W dniu doświadczenia wyjąć zamrożone wywary (substraty i modulatory mitochondrialne, mieszaninę MAS, MAS bez BSA, tabela 1) i rozmrozić w łaźni o temperaturze 37 °C lub w inkubatorze.
- Przygotować wszystkie roztwory substratów (Tabela 3) i wstrzyknięcia (Tabela 4-5) i dostosować pH zgodnie z potrzebami (pH 7,4). Po dostosowaniu pH przechowywać na lodzie.
- Zaprogramuj wielodołkową maszynę do pomiaru zużycia tlenu, aby prawidłowo mieszała, czekała i mierzyła parametry (patrz tabela 6) i oznacz tło oraz studzienki grupowe/kondycjonalne, najpierw wchodząc do oprogramowania analitycznego, a następnie w trybie "Standard".
- Wejdź na forum "Gość" i kliknij na "Kreator testów". W "Kreatorze testów" kliknij "Protokół", aby zmienić parametry mieszania, oczekiwania i pomiaru. Oznacz studzienki tła pod "Wstecz. Korekta" i pamiętaj, aby zaznaczyć opcję "Wykonaj korektę tła".
- Oznacz warunki, klikając najpierw zakładkę "Grupy i etykiety", a następnie zakładkę "Informacje o grupie". Po wprowadzeniu tych parametrów kliknij "Koniec", a następnie "Zapisz szablon".
2. Przebieg testu
- Załaduj roztwory iniekcyjne do kartridża testowego i rozpocznij kalibrację, najpierw wprowadzając oprogramowanie analityczne, a następnie przechodząc do trybu "Standardowego". Wejdź na forum "Gość". Otwórz szablon zapisany w kroku 1.5 pod dyskiem "XF", w zakładce "Szablony". Po otwarciu kliknij "Start", aby rozpocząć kalibrację.
Uwaga: Kaseta z testem musi być wprowadzona do maszyny z naciętym rogiem w lewym dolnym rogu. Trwa to około 30 minut. Należy uważać, aby wstrzykiwać roztwory do odpowiednich portów. Iniekcje w tabeli 4-5 są wymienione w kolejności ładowania. - Delikatnie, ale dokładnie wymieszaj zapas mitochondriów, mieszając roztwór z końcówką do pipety o pojemności 200 μl, a następnie delikatnie rozcierając zapas końcówką do pipety o pojemności 200 μl, której otwór został poszerzony przez odcięcie nożyczkami ~ 3 mm od końca końcówki.
- Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić stężenie białka w stadzie mitochondrialnym.
- Korzystając ze stężenia podstawowego uzyskanego w kroku 2.3, ponownie zawiesić 10 μg białka mitochondrialnego/200 μl mieszaniny substratów bursztynian/rotenon (Tabela 3). Zawiesić ponownie 14 μg białka mitochondrialnego/200 μl pozostałych mieszanin substratów (należy to zrobić dla każdej mieszaniny substratów) (Tabela 3). Umieść wszystkie mieszanki białek mitochondrialnych z substratem na lodzie.
Uwaga: Optymalna ilość białka mitochondrialnego na studzienkę dla każdego testu została określona zgodnie z wcześniejszym opisem9. Stwierdzono, że testy pirogronianu / jabłczanu, palmitoilokarnityny / jabłczanu, glutaminianu / jabłczanu i przepływu elektronów wykorzystują 3,5 μg białka mitochondrialnego, podczas gdy test bursztynianu / rotenonu wykorzystuje 2,5 μg białka mitochondrialnego na studzienkę. Dlatego badacz musi ponownie zawiesić wystarczającą ilość białka mitochondrialnego dla 4 powtórzeń na tym etapie, ponieważ na studzience ładowane jest 2,5 μg lub 3,5 μg na 50 μl (patrz krok 2.6). - Wymieszaj roztwory mitochondriów/substratów delikatnie, ale dokładnie, mieszając roztwór z końcówką pipety o pojemności 200 μl, a następnie delikatnie rozcierając bulion końcówką pipety o pojemności 200 μl, której koniec został odcięty ~ 3 mm.
- Umieścić płytkę do hodowli komórkowej na lodzie i w trzech egzemplarzach załadować 50 μl/studzienkę każdej z mieszanin mitochondriów/substratów. Twórcy testu respirometrycznego opartego na mikropłytkach zalecają pozostawienie co najmniej dwóch ślepych (bez mitochondriów) studzienek, najlepiej po obu stronach płytki do hodowli komórkowej.
- Obracać płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 2 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania płytki rozgrzać roztwory podłoża w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Po zakończeniu wirowania ostrożnie załaduj 450 μl każdego roztworu substratu na odpowiednie dołki (tj. załaduj substrat pirogronianowy/jabłczan do studzienek, w których mitochondria są początkowo ponownie zawieszone w tym roztworze substratu). Pamiętaj, aby załadować płytę w RT. Uwaga: Puste studzienki należy załadować 500 μl podłoża. Ślepe studzienki przeznaczone do oznaczania przepływu elektronów powinny być załadowane substratem przepływu elektronów (pirogronian/jabłczan + FCCP), podczas gdy sprzężone ślepe studzienki testowe mogą być załadowane dowolnym substratem do oznaczania sprzęgającego.
Uwaga: W przypadku wykonywania testów sprzężonych i przepływu elektronów na tej samej płytce, badacz musi ponownie przypisać studzienki tła do odpowiednich testów po zakończeniu testu za pomocą platformy "XF Reader" za pośrednictwem zakładki "Instrument". Po przejściu do ustawień "Instrument" kliknij zakładkę "Administracja", a następnie "Korekta tła". Naciśnij "Zakończ tryb konfiguracji instrumentu" po zakończeniu. Dzieje się tak, ponieważ połączenie askorbinianu/TMPD może zużywaćO2, dlatego dla każdego typu testu potrzebna jest osobna korekta tła. - Po dodaniu 450 μl substratu do każdej studzienki, obejrzyj warstwę mitochondriów w studzience, aby upewnić się, że mitochondria są równomiernie rozproszone w jednej monowarstwie (20-krotne powiększenie [patrz Rogers9, ryc. 4]). Studnie, które nie wydają się mieć równomiernie rozłożonej monowarstwy, można usunąć post hoc.
- Po sprawdzeniu przylegania mitochondriów włóż mikropłytkę do przyrządu do testu respirometrycznego i rozpocznij test, klikając "OK".
Uwaga: Kalibracja z kroku 2.1 musi zostać zakończona przed rozpoczęciem biegu. Gdy badacz kliknie "OK", urządzenie wysunie tabliczkę narzędziową, która została użyta do kalibracji.- Wyjmij płytkę użytkową i umieść na tacy płytkę do hodowli komórkowej zawierającą mitochondria. Niebieskie nacięcie na płytce do hodowli komórkowej należy umieścić w lewym dolnym rogu tacy. Kliknij "kontynuuj", aby rozpocząć przebieg testu.
- Po zakończeniu cyklu wysuń płytkę z kulturą komórkową i wkład, naciskając "Wysuń" na ekranie.
- Po wysunięciu płytki wyjmij i wyrzuć płytkę do hodowli komórkowej i wkład, a następnie kliknij "Kontynuuj" na ekranie. Przebieg zostanie automatycznie zapisany jako plik .xls w pliku "Dane".
- Otwórz ten plik i zmień wyświetlanie z "O2" na "OCR", naciskając strzałkę w dół pod znacznikiem "Y1:".
- Następnie zmień "Punkt środkowy" na "Stawki punkt-punkt" w opcji "Dane stawki wyświetlane jako:". Kliknij "OK", aby zastosować te zmiany.
- Kliknij zakładkę "Tryb grupowania studni" w lewym dolnym rogu ekranu, aby pogrupować ze sobą studnie o podobnych warunkach. Na koniec kliknij kartę "Przykładowa średnia/błąd standardowy" w kierunku środka ekranu, po lewej stronie. Alternatywnie te polecenia można skonfigurować przed rozpoczęciem testu w ustawieniu "Kreator testów".
Uwaga: Każdy warunek będzie miał wyświetlaną średnią ± odchylenie standardowe dla każdej stawki i każdego warunku. Wykonywane są pomiary szybkości dla każdego stanu (oddychanie w stanie 2 [sprzężenie]/stanie 3u [przepływ elektronów], po którym następują cztery wstrzyknięcia). Użyć średniej szybkości stanu 2 z drugiego pomiaru, określić stan 4o w punkcie minimum po wstrzyknięciu oligomycyny, użyć punktu maksymalnego odpowiednio dla stanu 3 i stanu 3u po wstrzyknięciu ADP i FCCP oraz użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego antymycyną A dla testów sprzęgających. Użyć punktu maksymalnego dla oddychania indukowanego pirumianem/jabłczanem 3u, użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego rotenonem, użyć punktu maksymalnego dla oddychania indukowanego bursztynianem 3u i użyć punktu minimalnego dla oddychania indukowanego antymycyną A dla testu przepływu elektronów. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono 3 razy, a przedstawione dane są wynikami reprezentatywnego śledzenia.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia szybkości zużycia tlenu (OCR) dla testów z użyciem pirogronianu/malonianu, bursztynianu/rotenonu, palmitylo karnityny/malonianu oraz glutaminianu/malonianu (testy sprzężenia). Przebiegi tych testów są wyświetlane jako szybkość zużycia tlenu (OCR) w funkcji czasu, są skorygowane o tło i przedstawione jako szybkości punkt-do-punktu. Każdy panel reprezentuje zużycie tlenu w różnych stanach mitochondrialnych opisanych przez Chance'a i Williamsa14. Pierwszy panel reprezentuje podstawowe zużycie tlenu, czyli stan 2. Drugi panel, po wstrzyknięciu ADP, reprezentuje maksymalną respirację sprzężoną, czyli stan 3. Trzeci panel, po wstrzyknięciu oligomycyny A (inhibitora kompleksu V), reprezentuje respirację wynikającą z przecieku protonów, czyli stan 4o. Czwarty panel, po wstrzyknięciu FCCP, reprezentuje maksymalną respirację niesprzężoną, czyli stan 3u. Wreszcie piąty panel, po wstrzyknięciu antymycyny A, reprezentuje inhibicję respiracji oksydacyjnej. Co istotne, wszystkie stany mitochondrialne charakteryzują się minimalnym odchyleniem standardowym. Wynika to z dokładnego wymieszania zapasu mitochondriów i mieszanin mitochondriów z substratem oraz uzyskania pojedynczej warstwy mitochondriów po wirowaniu w celu adhezji (krok 2.6). Z drugiej strony, naniesienie nierównej ilości mitochondriów do każdego dołka i nieosiągnięcie pojedynczej warstwy mitochondriów w dołku mikropłytki prowadzi do zwiększenia odchylenia standardowego w każdym stanie, co pokazano na Rysunku 2.
Wykresy na Rysunku 1 przedstawiają plateau dla każdego stanu mitochondrialnego i dla każdego substratu. Osiągnięcie plateau po dwóch cyklach pomiarowych sugeruje wysoką jakość mitochondriów oraz to, że pozostają one przytwierdzone do dołka przez cały czas trwania analizy. Ponadto osiągnięcie plateau dla maksymalnych szybkości może być bardziej pożądane, ponieważ pozwala badaczowi na wyznaczenie średniej wartości OCR w tych stanach mitochondrialnych, co redukuje błąd, który mógłby wynikać z arbitralnego wyboru pojedynczego punktu.
Ilość mitochondriów na dołek określono w drodze prób optymalizacyjnych. Optymalna ilość mitochondriów na dołek powinna zapewniać tempo State 2 w zakresie 100-200 pmol/min/well oraz tempo state 3 < 1 500 pmol/min/well, ponieważ wartości te mieszczą się w dynamicznym zakresie detekcji tlenu urządzenia do pomiaru zużycia tlenu w wielu dołkach. Zbyt duża ilość białka mitochondrialnego w jednym dołku może spowodować uzyskanie wartości OCR wykraczających poza zakres dynamiczny instrumentu (Rycina 3A). Rycina 3 przedstawia obciążenie 3,5 µg białka mitochondrialnego na dołek (krzywa niebieska) w porównaniu do obciążenia 2,5 µg białka mitochondrialnego na dołek (krzywa czerwona) dla testu z bursztynianem/rotenonem. Zbyt duża ilość białka mitochondrialnego na dołek może również prowadzić do wyczerpania tlenu w mikrokomorze dołka, co uniemożliwia dokładny pomiar OCR w każdym kolejnym etapie pomiaru9 (Rycina 3B). Point-to-point OCR to chwilowe tempo zmiany OCR. Jeśli linia jest płaska, OCR jest stały/stabilny, natomiast spadek może wskazywać na problem biologiczny lub techniczny. Gwałtowny spadek OCR w oddychaniu State 3 i State 3u (Rycina 3A) jest spowodowany wyczerpaniem zapasów tlenu przez mitochondria przed zakończeniem pomiaru (Rycina 3B).
Rysunek 4 przedstawia OCR w funkcji czasu dla testu przepływu elektronów. Wykres został skorygowany i wyświetlony zgodnie z opisem dla Rysunku 1. Pierwszy panel w tym teście reprezentuje oddychanie w stanie 3u na pirogronianie/malonie poprzez Kompleks I. Drugi panel, po wstrzyknięciu rotenonu, przedstawia inhibicję oddychania zapośredniczonego przez Kompleks I. Trzeci panel, po wstrzyknięciu bursztynianu, reprezentuje stymulowany substratem stan 3u z elektronami wchodzącymi do ETC w Kompleksie II (oddychanie zapośredniczone przez Kompleks II). Czwarty panel, po wstrzyknięciu Antomycyny A, przedstawia inhibicję Kompleksu III, a tym samym całkowite oddychanie. Na koniec piąty panel, po wstrzyknięciu askorbinianu/TMPD, reprezentuje oddychanie zapośredniczone przez Kompleks IV. Podobnie jak na wykresach na Rysunku 1, wszystkie stany mitochondrialne wykazują minimalne odchylenie standardowe, a każda szybkość osiągnęła lub prawie osiągnęła plateau.
Rycina 1. Testy sprzęgania. (A) 10 mM pirogronianu/ 5 mM malonianu, (B) 10 mM bursztynianu/ 2 µM rotenonu, (C) 40 µM palmitoilokarnityny/ 1 mM malonianu oraz (D) 10 mM glutaminianu/ 10 mM malonianu – przebiegi testów sprzęgania oddychania mitochondrialnego określone poprzez pomiar zużycia tlenu w wielu dołkach. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD. Ilość białka mitochondrialnego naniesiona na dołek wynosiła 3,5 µg dla wszystkich testów z wyjątkiem testu z bursztynianem/rotenonem, w którym wykorzystano 2,5 µg białka mitochondrialnego na dołek. Dane reprezentują n=3 sparowanych powtórzeń biologicznych. OCR = szybkość zużycia tlenu; ADP = adenozynodifosforan; Oligo = oligomycyna A; FCCP = karbonylocyjanid-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazona; Anti-A = antymycyna A; PYR = pirogronian; SUCC = bursztynian; ROT = rotenon; PAL-C = palmitoilokarnityna; GLUT = glutaminian. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2. Wysoce zmienny test z wykorzystaniem pirogronianu/malonianu. Wysoka zmienność testu z 10 mM pirogronianu/ 5 mM malonianu spowodowana niepełnym wymieszaniem mitochondriów z zapasu mitochondriów w mieszaninie substratu/MAS, co prowadzi do zmiennego obciążenia białkiem mitochondrialnym w każdej studzience. Ilość białka mitochondrialnego naniesiona na studzience wynosiła 3,5 µg. Dane reprezentują n=3 sparowanych powtórzeń biologicznych. OCR=Oxygen Consumption Rate; ADP= Adenozynodifosforan; Oligo= Oligomycyna A; FCCP= Karbonylocyjanid-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Anti-A= Antymycyna A; PYR= Pirogronian. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3. Przeładowanie białka mitochondrialnego w teście z bursztynianem/rotenonem. (A) Wskaźniki zużycia tlenu poza zakresem dynamicznym wielodołkowego urządzenia do pomiaru zużycia tlenu spowodowane nałożeniem 3,5 µg białka mitochondrialnego na dołek (linia niebieska) w porównaniu do nałożenia 2,5 µg białka mitochondrialnego na dołek (linia czerwona). (B) Napięcie tlenowe zbliżające się do zera po wstrzyknięciu ADP i FCCP spowodowane nałożeniem nadmiernej ilości białka mitochondrialnego (3,5 µg) na dołek (linia niebieska) w porównaniu do nałożenia optymalnej ilości (2,5 µg) białka mitochondrialnego na dołek (linia czerwona). Dane reprezentują n = 3 sparowane powtórzenia biologiczne dla każdej ilości białka mitochondrialnego. OCR = wskaźnik zużycia tlenu; ADP = adenozynodifosforan; Oligo = oligomycyna A; FCCP = cyjano-karbonyl-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Anti-A = antymycyna A; SUCC = bursztynian; ROT = rotenon; O2 = tlen; mm Hg = milimetry słupa rtęci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4. Analiza przepływu elektronów. 5 mM pirogronianu/ 1 mM jabłczanu+ 4 µM FCCP, zapis badania respiracji mitochondrialnej przepływu elektronów określony poprzez pomiar zużycia tlenu w wielu studzienkach. Wartości wyrażono jako średnia ± SD. Ilość białka mitochondrialnego naniesiona na studzienkę wynosiła 3,5 µg. Dane reprezentują n=3 sparowane powtórzenia biologiczne. OCR = Oxygen Consumption Rate (tempo zużycia tlenu); Anti-A = Antomycyna A; Asc = Askorbinian; TMPD = N,N,N′,N′-tetrametylo-p-fenylenodiamina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Odczynnik | Stężenie roztworu zapasu | MW | Objętość końcowa | Dodano masę | Komentarze/Opis |
| (M) | (g/mol) | (ml) | (g lub ml) | ||
| EGTA, pH 7,2 | 0.1 | 380.35 | 100 ml 1M Tris-base | 3,801 g | Przechowywać w temperaturze 4 °C |
| HEPES | 1 | 238.3 | 250 ml wody destylowanej (DiH)2O | 59,57 g | Przechowywać w 4 °C |
| MgCl₂2, heksahydrat | 1 | 203.31 | 250 ml wody dejonizowanej2O | 50,82 g | Przechowywać w temperaturze 4 °C |
| Pirogronian pH 7,4 | 0.1 | 88,06 (dostarczane jako roztwór 14,11 M) | 40 ml wodyy destylowanej (DiH)2O | 0,283 ml kwasu pirogronowego | Przygotować alikwoty o objętości 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °Cprzygotowywać na świeżo co dwa tygodnie |
| Bursztynian pH 7,4 | 0.5 | 118.09 | 100 ml wody dejonizowanej2O | 9,4 g kwasu bursztynowego | Przygotować alikwoty o objętości 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Malonian, pH 7,4 | 0.5 | 134.09 | 100 ml 95% etanolu | 6,7 g kwasu jabłkowego | Wykonaj 200 μl dzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| TMPD | 0.01 | 164.25 | 10 ml | 0,0164 g | Wykonaj 300 μl podzielić na aликwoty i przechowywać w temperaturze -20 °CWymieszać z ekimolarną ilością askorbinianu, aby utrzymać TMPD w formie zredukowanej |
| Chlorek palmitoilu L-karnityny | 0.01 | 436.07 | 1,14 ml 95% etanolu | 0,005 g | Wykonaj 40 μl podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Oligomycyna A | 0.006 | 791.06 | 0,987 ml 95% etanolu | 0,005 g | Wykonaj 20 μl podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| FCCP | 0.01 | 254.17 | 3,9 ml 95% etanolu | 0,01 g | Wykonaj 40 μl przelić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Rotenon | 0.001 | 394.4 | 10 ml 95% etanolu | 0,0039 g | Przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Antymycyna A | 0.005 | 548.63 | 9,12 ml 95% etanolu | 0,025 g | Przechowywać w temperaturze -20 °C |
| K+ ADP | 0.5 | 501.32 | 3,9 ml wodyy destylowanej (DiH)2O | 1,0 g | Przechowywać w temperaturze -20 °C |
| Kwas jabłkowy, pH 7,4 | 0.5 | 134.09 | 40 ml | 2,68 g | Wykonaj 200 μl podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C |
Tabela 1. Roztwory zapasowe
| Odczynnik | Stężenie zapasu | Dodana masa | Końcowa molarność/procent |
| (M) | (g lub ml) | ||
| Sacharoza | -- | 11.98 g | 70 mM |
| Mannitol | -- | 20.04 g | 220 mM |
| Fosforan potasu jednodstawny | -- | 0.34 g | 5 mM |
| MgCl2, sześcionawodniany | 1 | 2.5 ml | 5 mM |
| HEPES | 1 | 1.0 ml | 2 mM |
| EGTA | 0.1 | 5.0 ml | 1 mM |
| BSA wolna od kwasów tłuszczowych | -- | 1.0 g | 0.20% |
Tabela 2. Mieszanina MAS. pH 7.4, 500 ml: Odmierzyć 25 ml i przechowywać w -20 ºC *Uwaga: Pominąć BSA w przypadku mieszaniny MAS używanej do iniekcji w analizie.
| Pożywka z substratem | Stężenie końcowe | Ilość roztworu zapasowego (µl) | Ilość MAS* (ml) |
| Pirowinian/Bursztynian | 10 mM/5 mM | Pirowinian: 1,000 | 9 |
| Bursztynian: 100 | |||
| Bursztynian/Rotenon | 10 mM/2 µM | Bursztynian: 200 | 10 |
| Rotenon 20 | |||
| *Pirowinian/Bursztynian + FCCP | 5 mM/1 mM/4 µM | Pirowinian: 500 | 10 |
| FCCP: 4 | |||
| Bursztynian: 20 | |||
| L-karnitynowy palmitoil/Bursztynian | 40 µM/1 mM | Palmitoylkarnityna: 40 Bursztynian: 20 | 10 |
| Glutaminian/Bursztynian | 10 mM/10 mM | Glutaminian: 400 | 10 |
| Bursztynian: 200 |
Tabela 3. Roztwory substratów pH 7.4: Przygotować na świeżo w dniu eksperymentu. *Roztwór do testu przepływu elektronów.
| Medium do wtryskiwania | Stężenie | Ilość roztworu macierzystego (µl) | Ilość MAS (ml) | Ilość wstrzyknięta do wkładu | Stężenie końcowe |
| (Po wstrzyknięciu na płytkę) | |||||
| ADP | 50 mM | 300 µl | 3 | 50 µl | 5.0 mM |
| Oligomycyna A | 20 µM | 10 µl | 3 | 55 µl | 2.0 µM |
| FCCP | 40 µM | 12 µl | 3 | 60 µl | 4.0 µM |
| Antymycyna A | 40 µM | 24 µl | 3 | 65 µl | 4.0 µM |
Tabela 4. Iniekcje do testów sprzężonych. pH 7.4: Przygotować na świeżo w dniu eksperymentu. *Testy sprzężone obejmują (ale nie ograniczają się do) pirogronian/jabłczan, bursztynian/rotenon, palmitoylo karnitynę/jabłczan oraz glutaminian/jabłczan.
| Pożywka do iniekcji | Stężenie | Ilość roztworu zapasowego (g lub µl) | Ilość MAS (ml) | Ilość wstrzyknięta do kartridża | Stężenie końcowe (po naniesieniu na płytkę) |
| Rotenon | 20 µM | 60 µl | 3 | 50 µl | 2.0 µM |
| Bursztynian | 50 mM | 300 µl | 3 | 55 µl | 5,0 mM |
| Antymycyna A | 40 µM | 24 µl | 3 | 60 µl | 4.0 µM |
| TMPD/askorbinian | 1 mM, 100 mM | TMPD : 300 µl | 3 | 65 µl | 100 µM, 10 mM |
| Askorbinian: 0,059 g |
Tabela 5. Iniekcje do analizy przepływu elektronów. pH 7.4: Przygotować na świeżo w dniu eksperymentu
| Polecenie | Czas (min) | liczba cykli |
| Kalibruj | ||
| Czekaj | 10 min (aby płytka ogrzała się po etapie adhezji) | |
| Wymieszać | 1 min | 2 |
| Pomiar | 2 min | |
| Wstrzyknąć A | ||
| Wymieszać | 1 min | 2 |
| Pomiar | 2 min | |
| Wstrzyknąć B | ||
| Wymieszać | 1 min | 2 |
| Pomiar | 2 min | |
| Wstrzyknij C | ||
| Wymieszać | 1 min | 2 |
| Pomiar | 2 min | |
| Wstrzyknij D | ||
| Wymieszaj | 1 min | 2 |
| Pomiar | 2 min |
Tabela 6. Protokół uruchamiania instrumentu.
Dyskusja
Metody przedstawione w tym artykule zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu mitochondriów wyizolowanych z 75 - 100 mg mięśni szkieletowych myszy. Testy te można wykonywać z dużą precyzją, o czym świadczy ścisłe odchylenie standardowe między trzema dołkami. Co ważne, te testy respirometryczne pozwalają na określenie, gdzie mogą wystąpić nieprawidłowości i/lub adaptacje w ETC, cyklu TCA, szlaku β-utleniania, transporterach substratów itp. w powszechnie stosowanym modelu zwierzęcym.
Ważne jest, aby podkreślić uzasadnienie stosowania różnych paliw i inhibitorów stosowanych w tym protokole. Testy respirometryczne pirogronianu/jabłczanu i glutaminianu/jabłczanu pozwalają na ocenę oddychania za pośrednictwem kompleksu I, a także ocenę ich odpowiednich transporterów, a w przypadku glutaminianu deaminazy15. Alternatywnie, połączenie bursztynianu / rotenonu pozwala na ocenę mitochondrialnego strumienia oddechowego przez kompleks II ETC, ponieważ rotenon hamuje kompleks I, a bursztynian dostarcza elektrony do kompleksu II poprzez redukcję dinukleotydu flawinoadeninowego (FADH2)15. Testy te dostarczają specyficznych dla substratu informacji na temat skuteczności sprzężenia i maksymalnego oddychania. Test przepływu elektronów jest wyjątkowy, ponieważ połączenie substratów i inhibitorów pozwala na ocenę wielu kompleksów podczas mitochondrialnego przepływu oddechowego9. Początkowa mieszanina substratów pirogronian/jabłczan + FCCP pozwala na ocenę maksymalnego oddychania napędzanego przez kompleks I, podczas gdy wstrzyknięcie rotenonu, a następnie bursztynianu pozwala na ocenę maksymalnego oddychania napędzanego przez kompleks II. Wstrzyknięcie antymycyny A, inhibitora kompleksu III, a następnie wstrzyknięcie askorbinianu/TMPD pozwala na ocenę oddychania napędzanego przez kompleks IV, ponieważ askorbinian / TMPD jest donorem elektronów cytochromu C / kompleksu IV. Chociaż nie uzyskuje się żadnych informacji na temat wydajności sprzężenia, metoda ta jest idealna dla bardzo małych próbek, które wykluczają niezależne uruchamianie wielu substratów. Wreszcie, zastosowanie palmitoilokarnityny/jabłczanu palmitoilu pozwala na ocenę koordynacji między utlenianiem β a ETC, ponieważ równoważnik redukujący powstały w wyniku utleniania kwasu palmitynowego (β-oksydacji) jest wprowadzany do ETC przez flawoproteinę15 przenoszącą elektrony. Należy zauważyć, że testy sprzężenia i przepływu elektronów mogą być również stosowane w połączeniu do identyfikacji zmian w funkcji mitochondriów spowodowanych pewną interwencją (leczenie farmakologiczne, manipulacje genetyczne).
Wysoka precyzja osiągnięta w tych testach wynika przede wszystkim z dokładnego wymieszania mitochondriów, czy to przed oznaczeniem białka, czy z roztworami substratów. W związku z tym, gdy mitochondria zostaną ponownie zawieszone w roztworach substratów, ważne jest, aby dokładnie wymieszać ten roztwór przed załadowaniem płytki do hodowli komórkowej, jak opisano w kroku 2.2, z poszerzoną kryzą końcówki pipety. Brak dokładnego wymieszania mitochondriów doprowadzi do dużej zmienności w teście. Ponadto użycie końcówki pipety z wąskim otworem spowoduje powstanie sił ścinających podczas mieszania mitochondriów i zwiększy potencjał uszkodzenia błon mitochondrialnych i uwolnienia cytochromu C. Etap przestrzegania zaleceń lekarskich (2.7) jest również kluczowym krokiem w tym protokole. Nieobracanie załadowanej płytki hodowli komórkowej wystarczająco długo/szybko spowoduje niepełne przyleganie mitochondriów do dołka, prowadząc w ten sposób do zwiększonej zmienności między studzienkami a pomiarami.
Opisany protokół został zoptymalizowany tak, aby obejmował: ładowanie optymalnej ilości białka mitochondrialnego na studzienkę, stosowanie odpowiednich stężeń/metod przygotowania do sporządzania roztworów podstawowych i substratowych, zmianę przebiegu testu w celu zapewnienia plateau stanu mitochondrialnego oraz odpowiednie mieszanie zapasów mitochondrialnych i mieszanin mitochondrial/substrat. Przed tymi działaniami optymalizacyjnymi autorzy napotkali pułapki w przebiegu testu. Poniżej omówiono metody/modyfikacje rozwiązywania problemów, które były pomocne w optymalizacji tego protokołu. Jeśli chodzi o optymalne obciążenie, obciążenie zbyt małej ilości mitochondriów nie wywoła silnej odpowiedzi, podczas gdy obciążenie zbyt dużej ilości mitochondriów wyczerpie tlen w mikrokomorze i doprowadzi do niedokładnych pomiarów. Rogers i wsp.9 podają przykłady określania optymalnych ilości obciążenia mitochondriów na studzienkę dla testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Częściej zbyt dużo mitochondriów jest załadowanych na studnię, o czym świadczą wskaźniki stanu 2 powyżej 100-200 pmol/min/studnię i wskaźniki stanu 3 >1500 pmol/min/studnia. Jeśli dojdzie do przeciążenia, należy przeprowadzić eksperyment z różnym stężeniem białka mitochondrialnego (np. między 1 a 10 μg), aby wywołać OCR w zakresie dynamicznym maszyny do pomiaru zużycia tlenu. Przygotowanie i stosowanie odpowiednich stężeń substratów i materiałów ma ogromne znaczenie. Zawsze używaj kwaśnej postaci substratów/iniekcji i dostosuj pH za pomocą wodorotlenku potasu lub HCl; Nie zaleca się stosowania/roztworów sodu. Ponadto ponowne zawieszenie substratów/zapasów w DMSO lub 100% etanolu spowoduje niepowodzenie lub błąd pomiaru. Pamiętaj, aby użyć 95% etanolu tam, gdzie jest to zaznaczone. Często zdarza się, że palmitoilokarinityna wytrąca się z 95% etanolu po rozmrożeniu zamrożonego bulionu, powodując w ten sposób dużą zmienność. Pamiętaj, aby dobrze rozgrzać bulion i wir palmitoilokarnityny przed użyciem. Ponadto bardzo zmienny wynik testu pirogronianu/jabłczanu może wynikać z faktu, że materiał pirogroniany ma >2 tygodnie. Pamiętaj, aby co 2 tygodnie przerabiać zamrożone porcje pirogronianu. Test został zmodyfikowany do 2-minutowych pomiarów, aby zapewnić plateau stanu mitochondriów. Jeśli pożądana jest obserwacja wyczerpania ADP, badacz może wydłużyć czas pomiaru w zakładce "Protokół" na forum "Kreator testów". Wreszcie, duża zmienność występuje, gdy zapas mitochondriów i mitochondria oraz roztwory substratów nie są w pełni homogenizowane przed załadowaniem. Jeśli zmienność między studzienkami jest duża po przebiegu testu, należy upewnić się, że roztwór substratu został w pełni wymieszany przed następnym eksperymentem. Nigdy nie mieszaj roztworów mitochondriów/substratów, a raczej mieszaj, rozcieraj i delikatnie rozcieraj końcówką pipety z poszerzonym otworem.
Istnieją pewne ograniczenia tej techniki, na które warto zwrócić uwagę. Po pierwsze, liczba studzienek na płytce do hodowli komórkowej używanej do tych testów jest stosunkowo niska (tj. 24 studzienki i co najmniej 2 przeznaczone dla studzienek ślepych). Jeśli pożądane jest wykonanie wszystkich 5 tych testów na jednej płytce, badacz jest w stanie zbadać odpowiedzi tylko jednej myszy na raz. Należy jednak zauważyć, że dostępnych jest 96 instrumentów wiertniczych o większej przepustowości. Po drugie, istnieją nieodłączne mocne i słabe strony w ocenie dysfunkcji mitochondriów w izolowanych mitochondriach w porównaniu z nienaruszonymi komórkami1. Niektóre słabości obejmują mniejsze znaczenie fizjologiczne w porównaniu z nienaruszonymi komórkami i wywoływanie artefaktów w procesie izolacji. Wreszcie, sukces tej metody zależy od jakości procesu izolacji mitochondriów.
Chociaż niektóre z tych testów zostały albo opracowane w różnych systemach, albo zostały zwalidowane w innych modelach zwierzęcych, metody przedstawione w niniejszym dokumencie są pierwszymi, które zsyntetyzowały wszystkie wyżej wymienione testy w celu optymalnego wykorzystania w wielostudziennej maszynie do pomiaru zużycia tlenu przy użyciu mięśni szkieletowych myszy. Co ważne, wszystkie 5 z tych testów można wykonać z ilością mitochondriów wyizolowanych z ~75 - 100 mg mięśni szkieletowych myszy, zapewniając w ten sposób wysoką przepustowość przy minimalnym materiale. Ogromne znaczenie ma zdolność technologii wielodołkowego zużycia tlenu do wykonywania testów z minimalną ilością mitochondriów, w połączeniu ze zoptymalizowaną metodą izolacji, pozwala badaczowi na wykonanie wielu innych eksperymentów na pozostałej tkance mięśni szkieletowych (np. zachodnie plamy, RT-PCR, testy enzymatyczne itp.), co często stanowi wyzwanie dla tego modelu zwierzęcego.
Podsumowując, przedstawione w niniejszym dokumencie metody zawierają instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Co ważne, przedstawione metody wymagają minimalnej ilości tkanek i mitochondriów. Po opanowaniu, opisane tutaj techniki pozwolą naukowcom określić potencjalny mechanizm wpływu związku lub produktu genu na mitochondrialne zużycie tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.
Oświadczenia
George W. Rogers jest pracownikiem firmy Seahorse Bioscience, która produkuje instrument, dla którego opracowano te testy. Opłaty za otwarty dostęp zostały zapewnione przez firmę Seahorse Bioscience, będącą częścią Agilent Technologies.
Podziękowania
Instytut Badawczy Nauk Przyrodniczych Fralin oraz Rdzeń Fenotypowania Metabolicznego w Virginia Tech wsparły tę pracę.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sacharoza | Sigma Aldrich | S7903 | Przechowywać w RT |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Przechowywać w RT |
| Fosforan potasu jednozasadowy, minimum 99,0% | Sigma Aldrich | P5379 | Przechowywać w RT |
| Sześciowodny chlorek magnezu, odczynnik ACS, 99,0-102,0% | Sigma Aldrich | M9272 | Przechowywać w RT |
| HEPES minimum 99,5% miareczkowania | Sigma Aldrich | H3375 | Sklep w RT |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Sklep w RT |
| Zasadniczo tłusty | Sigma Aldrich | A6003 | Sklep pod adresem 4 & deg; Bez kwasu C |
| BSA | |||
| , 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Przechowywać w 4 & stopni; C |
| Kwas bursztynowy | Sigma Aldrich | S9512 | Przechowywać w RT |
| L(-) Kwas jabłkowy, BioXtra, ≥ 95% | Sigma Aldrich | M6413 | Sklep w RT |
| Kwas L-glutaminowy | Sigma Aldrich | G1251 | Sklep w RT |
| N,N,N′,N′,N&-Tetramethyl-p-phenylenodiamine | Sigma Aldrich | T7394 | Przechowywać w RT |
| 99%, proszek [TMPD] | |||
| Chlorek palmitylo-L-karnityny | Sigma Aldrich | P1645 | Przechowywać w -20 ° C |
| Oligomycyna A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Przechowywać w temperaturze -20 ° C |
| Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy) | Sigma Aldrich | C2920 | Przechowywać w temperaturze 2 - 8 stopni; C |
| fenylohydrazon | |||
| ≥ 98% (TLC), proszek [FCCP] | |||
| Antymycyna A z Streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Sklep pod adresem -20 ° C |
| Sól monopotasowa adenozyno-5′-difosforanu odwadniająca [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Przechowywać w temperaturze -20 ° C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Sklep w RT |
| Pierce™ Zestaw do oznaczania białek BCA | Thermo Scientific | 23225 | Nie dotyczy |
Bibliografia
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746(2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie