Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Podsumowanie

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Streszczenie

Badanie interakcji gospodarz-patogen pozwala nam zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorobotwórczości podczas infekcji mikrobiologicznej. Rokowanie gospodarza zależy od udziału dostosowanej odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenowi¹. Odpowiedź immunologiczna jest złożona i wynika z interakcji patogenów i kilku immunologicznych lub nieimmunologicznych typów komórkowych². Badania in vitro nie są w stanie scharakteryzować tych interakcji i koncentrują się na interakcjach komórka-patogen. Ponadto w drogach oddechowych³, szczególnie u pacjentów z ropną przewlekłą chorobą płuc lub u pacjentów wentylowanych mechanicznie, obecne są zbiorowiska wielodrobnoustrojów, które komplikują interakcję gospodarz-patogen. Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans są problematycznymi patogenami⁴, często izolowanymi z próbek tchawicy i oskrzeli i związanymi z ciężkimi infekcjami, zwłaszcza na oddziale intensywnej terapii⁵. Interakcje mikrobiologiczne między tymi patogenami zgłaszano in vitro, ale wpływ kliniczny tych interakcji pozostaje niejasny⁶. Aby zbadać interakcje między C. albicans i P. aeruginosa, przeprowadzono mysi model kolonizacji dróg oddechowych C. albicans, a następnie ostrej infekcji płuc za pośrednictwem P. aeruginosa.

Wprowadzenie

Modele zwierzęce, zwłaszcza myszy, były szeroko wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom. Chociaż odporność wrodzona i nabyta różni się u gryzoni i ludzi⁷, łatwość rozmnażania i rozwój nokautów dla wielu genów sprawiają, że myszy są doskonałym modelem do badania odpowiedzi immunologicznych⁸. Odpowiedź immunologiczna jest złożona i wynika z interakcji patogenu, rezydentnej flory bakteryjnej i kilku immunologicznych (limfocyty, neutrofile, makrofagi) i nieimmunologicznych (komórki nabłonka, komórki śródbłonka) typów komórkowych². Badania in vitro nie pozwalają na obserwację tych złożonych interakcji i koncentrują się głównie na unikalnych interakcjach komórka-patogen. Podczas gdy modele zwierzęce muszą być używane z ostrożnością i ograniczone do bardzo szczegółowych i istotnych pytań, modele mysie zapewniają dobry wgląd w odpowiedź immunologiczną ssaków in vivo i mogą odpowiadać na części ważnych pytań klinicznych⁷.

W drogach oddechowych społeczność mikroorganizmów jest złożona, kojarząc dużą liczbę różnych mikroorganizmów⁶. Chociaż to, co stanowi "normalny" mikrobiom dróg oddechowych, nie zostało jeszcze ustalone, społeczności mieszkańców są często wielomikrobiologiczne i pochodzą z różnych źródeł ekologicznych. Pacjenci z ropną przewlekłą chorobą płuc (mukowiscydoza, oskrzela) lub pacjenci wentylowani mechanicznie wykazują szczególną florę spowodowaną kolonizacją dróg oddechowych przez mikroorganizmy nabyte w środowisku⁹. Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans są problematycznymi^patogenami5, często izolowanymi razem z próbek tchawicy i oskrzeli i odpowiedzialnymi za ciężkie zakażenie oportunistyczne u tych pacjentów, zwłaszcza na oddziale intensywnej terapii (OIOM)⁴.

Izolacja tych mikroorganizmów podczas ostrego zapalenia płuc na OIOM-ie skutkuje leczeniem przeciwbakteryjnym przeciwko P. aeruginosa, ale drożdże zwykle nie są uważane za chorobotwórcze w tym miejscu⁵. Interakcje in vitro między P. aeruginosa i C. albicans zostały szeroko opisane i wykazały, że mikroorganizmy te mogą wpływać na wzrost i przetrwanie siebie nawzajem, ale badania nie mogły stwierdzić, czy obecność C. albicans jest szkodliwa czy korzystna dla gospodarza¹⁰. Opracowano modele mysie, aby odpowiedzieć na to pytanie o znaczenie P. aeruginosa i C. albicans in vivo, ale interakcja między mikroorganizmami nie była kluczowa. Rzeczywiście, model został stworzony w celu oceny udziału C. albicans w odpowiedzi immunologicznej gospodarza i wynikach.

Poprzedni model stworzony przez Roux et al już używał początkowej kolonizacji C. albicans, po której nastąpiła ostra infekcja płuc wywołana przez P. aeruginosa. Korzystając ze swojego modelu, autorzy odkryli szkodliwą rolę wcześniejszej kolonizacji C. albicans ¹¹. Jednak Roux i wsp. użyli dużego obciążenia C. albicans w swoim modelu z 2 x 10⁶ CFU/mysz przez 3 kolejne dni. Ustaliliśmy 4-dniowy model kolonizacji dróg oddechowych C. albicans lub przynajmniej trwałości bez uszkodzenia płuc, W tym modelu C. albicans został pobrany do 4 dni po pojedynczym wkropleniu 10⁵ CFU na mysz (Figura 2B) ^12,13. Po 4 dniach nie zaobserwowano śladów rekrutacji komórek zapalnych, produkcji cytokin zapalnych ani uszkodzenia nabłonka. Po 24 - 48 godzinach, przy szczytowej obecności C. albicans, mimo że zaobserwowano wrodzoną odpowiedź immunologiczną komórek i cytokin, nie stwierdzono dowodów na uszkodzenie płuc. Co zaskakujące, myszy skolonizowane w ten sposób C. albicans 48 godzin przed donosowym wkropleniem P. aeruginosa miały osłabioną infekcję w porównaniu z myszami z samą infekcją P. aeruginosa. Rzeczywiście, myszy wykazywały mniejsze uszkodzenie płuc i zmniejszone obciążenie bakteryjne^12,13.

Kilka hipotez mogłoby wyjaśnić ten korzystny wpływ wcześniejszej kolonizacji C. albicans na ostrą infekcję płuc wywołaną przez P. aeruginosa. W pierwszej kolejności oceniono wzajemne oddziaływanie międzygatunkowe obejmujące systemy quorum-sensing każdego mikroorganizmu, system P. aeruginosa oparty na homoserinelactonie i system C. albicans oparty na farnezolu. Po drugie, badano C. albicans działający jako "wabik" dla P. aeruginosa, odwracający patogen od komórek nabłonka płuc. Obie hipotezy zostały unieważnione (dane niepublikowane). Trzecią hipotezą było "pobudzenie" wrodzonego układu odpornościowego przez C. albicans odpowiedzialnego za wzmocnioną późniejszą wrodzoną odpowiedź przeciwko P. aeruginosa. Ta ostatnia hipoteza została potwierdzona. Rzeczywiście, kolonizacja C. albicans doprowadziła do pobudzenia wrodzonej odporności poprzez IL-22, głównie wydzielaną przez wrodzone komórki limfoidalne, co spowodowało zwiększony klirens bakteryjny i zmniejszone uszkodzenie płuc¹².

Podsumowując, gospodarz jest głównym aktorem w interakcji między mikroorganizmami modulującymi wrodzoną odpowiedź immunologiczną i obejmującymi różne typy komórek zapalnych. Podczas gdy te złożone interakcje immunologiczne można przeanalizować in vitro, wstępne hipotezy mogą być dostarczone tylko przez odpowiednie modele in vivo. Poniższy protokół zawiera przykład badania in vivo interakcji patogenu za pośrednictwem gospodarza, która może być dostosowana do innych mikroorganizmów.

Protokół

Regionalny komitet etyki regionalnej ds. doświadczeń na zwierzętach zatwierdził tę metodę, zgodnie z krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich stosowania w badaniach eksperymentalnych.

1. Pobieranie próbek

1. Przechowywanie próbek
   1. Zebrać wszystkie próbki i natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C lub na lodzie do czasu przechowywania w zamrażarce, aby uniknąć ich zepsucia. Umieść sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) na lodzie, aby poprawić wydajność płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL).
2. chirurgia
   1. Wysterylizuj cały sprzęt chirurgiczny za pomocą autoklawu.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, zaleca się używanie dwóch różnych zestawów narzędzi do kroków brzusznych i piersiowych, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Wymagany sprzęt preparacyjny jest szczegółowo opisany na rysunku 4A

2. Myszy, szczepy bakterii i drożdży

1. Myszy trzymane w pomieszczeniach trzymanych w pomieszczeniach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 zgodnie z lokalnymi wytycznymi komitetu badawczego w wentylowanym stojaku nieprzekraczającym 5 myszy na klatkę, z jedzeniem i wodą ad lib, w pomieszczeniach inwentarskich o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 ze względu na stosowanie mikroorganizmów o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2: P. aeruginosa i C. albicans.
2. Szczepy bakterii należy przechowywać w temperaturze -80 °C w 40% pożywce glicerynowej .
   1. Dodać bakterie bezpośrednio z zamrożonego bulionu do probówki hodowlanej zawierającej 3 ml sterylnego bulionu Luria-Bertani za pomocą pętli inokulacyjnej o objętości 10 μl. Pozostawić O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym (400 obr./min) dzień przed wkropleniem.
   2. Zbieraj bakterie przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 5 minut.
   3. Odessać supernatant do odpowiedniego zamkniętego miejsca unieszkodliwiania odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Obserwuj biały, przylegający osad na dnie probówki hodowlanej.
   4. Przemyć i zawiesić osad przy użyciu 5 ml PBS.
   5. Powtórz kroki od 2.2.2 do 2.2.3 po raz drugi, aby wykonać drugie pranie.
   6. Zawiesić granulowane bakterie za pomocą 1 ml PBS i krótko wirować.
   7. Określić gęstość inokulum za pomocą densytometru optycznego przy 600 nm za pomocą gęstościomierza optycznego. Gęstość 0,9 odpowiada 10⁹ jtk/ml dla PAO1, rozcieńczyć odpowiednio.
      UWAGA: Wynik ten należy uzyskać dla każdego użytego szczepu poprzez określenie gęstości kolejnych rozcieńczeń skalibrowanego inokulum.
   8. Sprawdzić inokulum przez seryjne rozcieńczenia logarytmiczne i płytkę 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach z bromokrezolowym agarem purpurowym (BCP) i kulturze O/N. Każdej myszy podać donosowo 50 μl roztworu zawierającego 1 x 10⁸ do 2 x 10⁸ CFU na ml (5 x 10⁶ do 1 x10⁷ CFU na mysz).
3. Użyj C. albicans SC5314 jako szczepu referencyjnego. Szczep należy konserwować w 40% pożywce glicerolowej w temperaturze -80°C.
   1. Uzupełnij bulion drożdżowo-peptonowo-dekstrozowy 0,015% amikacyny, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego i ułatwić dalsze liczenie.
   2. Dodać drożdże za pomocą 10 μl pętli inokulacyjnej do przygotowanego bulionu YPD uzupełnionego amikacyną O/N w temperaturze 37°C.
   3. Drożdże zbierać przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 5 minut.
   4. Usunąć sklarowany osad do odpowiedniego miejsca do utylizacji odpadów bioharzardowych. Na dnie probówki hodowlanej należy obserwować biały przylegający osad
   .
   5. Umyć i zawiesić granulowane bakterie za pomocą 5 ml PBS i krótko wirować.
   6. Powtórz kroki od 2.2.2 do 2.2.3 po raz drugi, aby wykonać drugie pranie.
   7. Zawiesić osad przy użyciu 1 ml PBS i krótko wirować.
   8. Określ rozmiar inokulum, licząc na hematocytometrze Mallasseza przy użyciu standardowego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: Stężenie (w jtk/ml) uzyskuje się za pomocą następującego wzoru: (liczba drożdży x 10⁵)/(liczba zliczonych prostokątów siatki na hematocytometrze Mallasseza).
   9. Sprawdzić przez szeregowe rozcieńczenie logarytmiczne do ^10-5 i ^10-6 w celu potwierdzenia, że roztwór zawiera 2 x 10⁶ jtk/ml.
   10. Płytka na płytkach agarowych YPD uzupełniona 0,015% amikacyną.

3. Kolonizacja dróg oddechowych przez C. albicans

UWAGA: Po adaptacji do warunków środowiskowych, myszy są ważone dwa razy dziennie.

1. Pod wyciągiem nanieść 500 μl sewofluranu na gazę o wymiarach 4 cm x 4 cm (technika otwartego kropli)¹⁴.
   1. Natychmiast umieść gazę na podłodze komory indukcyjnej o pojemności około 750 ml. Natychmiast umieść podniesioną siatkę platformę nad gazą, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu zwierzęcia z gazą.
   2. Zamknij hermetyczną pokrywę i odczekaj 1 do 2 minut, aby umożliwić dyfuzję Sevofluranu w komorze.
   3. Przenieś mysz z klatki na platformę siatkową i zamknij pokrywę. Lekkie znieczulenie z zachowanym oddechem spontanicznym powinno być osiągnięte w ciągu 30 do 45 sekund.
   4. Monitoruj hipotonię, obserwując utratę odruchu prostowania, w którym to momencie mysz można wyjąć z pudełka i zakroplić.
2. Wkraplanie donosowe (może być wykonane w ciągu 10 sekund przez przeszkolonego operatora).
   1. Trzymaj mysz jedną ręką osadzoną na plecach trzymaną pionowo (Rysunek 4B).
   2. Palcem wskazującym podeprzyj głowę i kciukiem trzymaj szczękę zamkniętą, aby uniknąć odkrztuszania (Rysunek 4C).
   3. Jak opisano w kroku 2.3.8, upewnić się, że przygotowany roztwór C. albicans zawiera 2 x10⁶ jtk na ml na 50 μl wkroplonej objętości.
      UWAGA: Drugim punktem krytycznym jest wkroplona objętość. Objętość mniejsza niż 50 μl może spowodować niedostateczną kolonizację lub niejednorodne wkroplenie dróg oddechowych, większa objętość może spowodować utonięcie/uduszenie i śmierć.
   4. Wlej mysz donosowo, zbliżając pipetę do nozdrzy.
   5. Odpipetować kroplę o objętości 50 μl, tworząc bańkę zawierającą roztwór w nozdrzach, a następnie wdychać ją przez spontanicznie oddychającą mysz.
   6. Umieść mysz w miejscu odzyskiwania (np. w dużej, dobrze napowietrzonej, gołej klatce z górną lampą grzewczą). Myszy muszą być monitorowane aż do całkowitego przebudzenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżenie mostka i odruch prostowania. W tym momencie mysz można wrócić do normalnej klatki mieszkaniowej.

4. Ostra infekcja płuc wywołana przez P. aeruginosa

UWAGA: Myszy są ważone przez cztery kolejne dni. Zwykle myszy przybierają na wadze podczas kolonizacji dróg oddechowych za pośrednictwem C. albicans (Figura 2A).

1. Przygotować zawiesinę zawierającą P. aeruginosa w dniu wkroplenia po wzroście O/N (sekcja 2.2).
2. Znieczulenie należy przeprowadzić krótko, stosując wziewny sewofluran, jak opisano powyżej (punkt 3.1).
   UWAGA: Aby przeprowadzić ostre zakażenie płuc, zalecane obciążenie bakteryjne jest sugerowane w Tabeli 1.
3. Wlać mysz w sposób opisany powyżej (sekcja 3.2), zwracając szczególną uwagę na powrót do zdrowia po zakropleniu.

5. Miara wskaźnika uszkodzenia płuc

1. Przygotować roztwór zawierający albuminę znakowaną FITC. Roztwór należy wstrzykiwać na 2 godziny przed eutanazją zwierząt.
   1. Odważyć 0,2 mg albuminy-FITC przy użyciu odpowiedniego sprzętu.
   2. Dodać 0,2 mg do 1 ml PBS. Krótko wir. Jeśli roztwór nie zostanie natychmiast zużyty, umieść go w folii, aby uniknąć ekspozycji na światło otoczenia.
   3. Wstrzyknąć dootrzewnowo 200 μl roztworu albuminy znakowanego FITC każdej myszy.
2. eutanazja
   1. Zważ myszy, aby uzyskać ostatnie dane dotyczące wagi.
   2. Poddaj eutanazji pojedynczą mysz zgodnie z lokalnymi stosunkami zwierząt w wytycznych komitetu badawczego przy użyciu jednego wstrzyknięcia dootrzewnowego śmiertelnego przedawkowania pentobarbitalu: 300 μl 5,47% pentobarbitalu.
   3. Wyjmij mysz z klatki i otrzymaj śmiertelny zastrzyk od operatora.
   4. Po wstrzyknięciu należy przenieść samą mysz do innej klatki, ukrytej przed innymi zwierzętami. Obserwuj mysz aż do momentu braku ruchu. Potwierdza się śmierć z powodu braku ruchu, szczególnie ruchów oddechowych, braku pulsu.
   5. Chirurgiczne pobieranie próbek na martwych zwierzętach odbywa się bez stosowania środków znieczulających i przeciwbólowych.
3. Pobieranie próbek chirurgicznych: Etap klatki piersiowej.
   UWAGA: Aby utrzymać sterylne warunki, wszystkie operacje są wykonywane przy użyciu sterylnego sprzętu w środowisku o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
   1. Nałóż etanol na skórę. Wykonaj nożyczkami nacięcie skóry w linii środkowej od mostka do połowy brzucha. Od linii środkowej naciąć wzdłuż klatki piersiowej po obu stronach. Odchyl skórę po obu stronach klatki piersiowej, aby uwidocznić klatkę piersiową.
   2. Wykonaj pionowe nacięcie klatki piersiowej po obu stronach, idąc w górę w kierunku obojczyków, aby móc odchylić całą przednią ścianę klatki piersiowej z mostkiem, umożliwiając doskonałą wizualizację serca i płuc (ryc. 5A, 5B).
   3. Pobrać krew za pomocą strzykawki z heparyną, nakłuwając serce obok tętnicy międzykomorowej. Pobrać co najmniej 500 μl, aby uzyskać co najmniej 100 μl osocza. Umieść próbkę krwi na lodzie.
   4. Wykonaj nacięcie szyjki macicy w linii środkowej, aby uwidocznić tchawicę (ryc. 5B i 5C). Ostrożnie rozetnij powięź wokół tchawicy. Umieść szew za tchawicą (ryc. 5C i 5D). Następnie szew zostanie zamknięty wokół igły kaniulującej w celu zapewnienia prawidłowego płukania.
   5. Cewnikować tchawicę za pomocą zmodyfikowanej igły do zgłębnika 20-G (ryc. 5D i 4A). Zawiąż węzeł chirurgiczny wokół kaniulowanej tchawicy z wcześniej założonym szwem.
   6. Aby wykonać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL), delikatnie i stopniowo wstrzyknąć i pobrać 500 μl lodowatego PBS do/z płuc. Umieść próbkę na lodzie, aby uniknąć lizy komórkowej.
   7. Powtórzyć krok 5.3.6 3 razy, aby uzyskać łącznie 1 500 μl płynu BAL i próbek płukania w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml (rysunek 5E).
   8. Usuń płuca z klatki piersiowej. Umieścić segment płuca (rozmiar powinien odpowiadać połowie jednego płuca lub płata) w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i szybko przechowywać w temperaturze -80°C.
   9. Umieść segment płuca w wstępnie zważonej probówce do hemolizy zawierającej PBS, aby określić obciążenie bakteryjne i umieść go na lodzie.
4. Pobranie próbki chirurgicznej: stadium brzuszne.
   1. Wykonaj kolejne nacięcie po lewej stronie brzucha. Obserwuj śledzionę przez otrzewną.
   2. Usunąć śledzionę i umieścić w drugiej probówce do hemolizy zawierającej 1 ml PBS i umieścić na lodzie.
5. Wskaźnik uszkodzenia płuc
   UWAGA: Przepuszczalność błony pęcherzykowo-kapilarnej ocenia się, mierząc przeciek albuminy znakowanej FITC z przedziału naczyniowego do przedziału pęcherzykowo-śródmiąższowego.
   1. Odwirować próbkę krwi i płyn BAL przez 10 minut przy 1 500 x g. Zebrać supernatanty do nowych probówek wirówkowych. Granulki odpowiadają rekrutowanemu osocza lub komórkom BAL i powinny być umieszczone na lodzie.
   2. Dodać 100 μl każdego supernatantu krwi (osocza, kolor żółty) lub supernatantu BAL do 96-dołkowej przezroczystej płytki (300 μl dołków). Umieść folię na talerzu, jeśli nie zostanie natychmiast użyta.
   3. Pomiar poziomów fluorescencji w supernatantach plazmy i BAL za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych (wzbudzenie, 487 nm; emisja, 520 nm).
   4. Określ wskaźnik uszkodzenia płuc, obliczając współczynnik fluorescencji [(supernatant BAL/supernatant krwi) x 100].
6. Różnicowa liczba komórek w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL).
   UWAGA: Użyj osadu komórkowego otrzymanego z odwirowania płynu BAL w kroku 5.5.1.
   1. W razie potrzeby użyj buforu do lizy krwinek czerwonych. Dodać 500 μl buforu do lizy krwinek czerwonych do probówki wirówkowej zawierającej osad komórkowy. Krótko zwiruj i pozostaw 10 minut na lodzie. Dodaj 500 μl PBS, aby zatrzymać lizę krwinek czerwonych.
   2. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut przy 1 500 x g. Usunąć supernatant i zawiesić osad komórek w 1 ml sterylnego PBS. Wylicz komórki na hematocytometrze Mallasseza. Używanie hemekytometru do liczenia komórek. Skoncentruj komórki na szkiełku za pomocą cytospiny.
   3. Wybarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia umożliwiającego identyfikację i zliczenie komórek (makrofagi, limfocyty, neutrofile).
7. Obciążenie bakteryjne płuc i rozprzestrzenianie się bakterii
   UWAGA: Aby ocenić obciążenie bakteryjne płuc i rozprzestrzenianie się bakterii, płuca i śledziona zostały odpowiednio pobrane i przechowywane w wstępnie zważonych probówkach do hemolizy zawierających 1 ml PBS (krok 5.3.9).
   1. Zważyć probówki do hemolizy zawierające 1 ml PBS i płuca lub śledzionę. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora tkankowego w celu uzyskania homogenatów płuc i śledziony.
   2. Umieścić 100 μl homogenatów tkankowych w probówkach wirówkowych zawierających 900 μl sterylnego PBS w celu uzyskania szeregowych rozcieńczeń logarytmicznych.
   3. Dwie ostatnie odpowiednie rozcieńczone próbki (^10-3 i ^10-2) umieścić na agarze BCP dla P. aeruginosa lub agarze z dodatkiem YPD-amikacyny w celu określenia obciążenia płuc i śledziony C. albicans.
   4. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wylicz kolonie na tabliczkach.
   5. Indeksuj wynik do masy płuc, aby uzyskać jtk na gram płuca. Rozmiary próbek płuc nie są takie same, wyniki powinny być wyrażone w jtkówce na gram płuc.
      Wzór na indeks to: [CFU] x [waga rurki do hemolizy i płuc] - [waga rurki do hemolizy].

Wyniki

Jak widać wcześniej w opisie protokołu, eksperyment potrzebuje 5 dni na ukończenie (Rysunek 1: harmonogram eksperymentu). Jeden operator jest proszony o udział w całym eksperymencie i może obsłużyć procesy do maksymalnie 10 myszy. Jeśli potrzeba więcej zwierząt, potrzebne są dwie osoby, szczególnie do chirurgicznego pobrania próbki. Rzeczywiście, wszystkie próbki muszą zostać pobrane w czasie krótszym niż 2 godziny, aby uniknąć zwiększonego biernego wycieku pęcherzykowo-kapilarnego albuminy znakowanej FI...

Dyskusja

Modele zwierzęce, w szczególności ssaki, są przydatne do wyjaśnienia złożonych mechanizmów interakcji gospodarz-patogen w dziedzinie odporności. Oczywiście, zasadnicze znaczenie musi mieć informacja, które można uzyskać tylko z modeli zwierzęcych; W przeciwnym razie wykorzystanie zwierząt musi zostać zastąpione modelami in vitro . Ten model zwierzęcy ilustruje wgląd, który może zapewnić tylko model zwierzęcy, ponieważ interakcja między patogenami odbywa się za pośrednictwem wieloskładnikowej odpowiedzi gospodarz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastikowa butelka
Czytnik fluorescencyjny Mithras  LB940	Berthold Technologies	odniesienie w pierwszej kolumnie	brak komentarza
Bromo-krezolowy fioletowy agar	Biomerieux	43021	20x na jednostkę
Pentobarbital sodowy 5,47%	CEVA	6742145	100 ml plastikowa butelka
2-głowicowy	Distrimed	92831	bez komentarza
Sterylna pętla inokulacyjna 10 µ l	Dutscher	10175	x1,000 kondycjonowanie
Strzykawki insulinowe 1 ml	Dutscher	30003	na 100 kondycjonowania
2 pozycje Probówka hodowlana 8 ml	Dutscher	64300	brak komentarza
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	bez komentarza
Rurki do hemolizy 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	na 100
PBS - Technologie Saline Life buforowane fosforanami		10010023	pakowane w 500 ml
amikacyny 1 g	Mylan	62516778	na 10
Heparyna 10 000 UI w 2 ml	Pan pharma	9128701	10x na jednostkę
Zestaw do koloryzacji RAL 555	Diagnostyka RAL	361550	3 flakony po 100 ml
1,5 ml probówka do mikrowirówek	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Przezroczysta 300 &mikro; l Płytka 96-dołkowa	Sarstedt	82 1581500	bez komentarza
Rosół Yest-pepton-dekstroza	Sigma	95763	w proszku
FITC-albumina	Sigma	A9771	w proszku
Luria Bertani Bulion	Sigma	L3022	w proszku
Igła o rozmiarze 25	Terumo lub unisharp	A231	x 100 kondycjonowanie
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	bez komentarza