Zgłaszamy znaczące ulepszenia w zakresie powtarzalnego pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy na potencjalne czynniki uszkadzające DNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Możliwość pomiaru mutacji komórek macierzystych jest potężnym narzędziem do ilościowego określania w krytycznej populacji komórek, czy i w jakim stopniu, substancja chemiczna może wywołać mutacje, które potencjalnie prowadzą do raka. Wcześniej donoszono o zastosowaniu testu enzymatycznego do ilościowego określenia mutacji komórek macierzystych w genie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej sprzężonej z chromosomem X.1 Metoda ta wymaga przygotowania zamrożonych skrawków i inkubacji wyciętej tkanki z mieszaniną reakcyjną, która daje niebieski kolor, jeśli komórki wytwarzają funkcjonalny enzym dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD). Jeśli nie, komórki wydają się białawe. Zmodyfikowaliśmy mieszaninę reakcyjną przy użyciu medium Optimum Cutting Temperature Compound (OCT) zamiast alkoholu poliwinylowego. Ułatwia to pomiar pH, zwiększa rozpuszczalność składników barwiących G6PD i ogranicza dyfuzję enzymu G6PD. Aby wykazać, że mutacja zaszła w komórce macierzystej, cała krypta musi być pozbawiona aktywności enzymatycznej G6PD. Tylko wtedy, gdy komórka macierzysta jest nosicielem fenotypowej mutacji G6PD, całe potomstwo w krypcie nie będzie miało aktywności enzymatycznej G6PD. Aby zidentyfikować krypty z mutacją komórek macierzystych, cztery kolejne sąsiadujące ze sobą zamrożone sekcje (poziom) zostały przecięte o grubości 7 μm. Takie podejście polegające na wykonywaniu sąsiednich cięć zapewnia potwierdzenie, że krypta była w pełni zmutowana, ponieważ ta sama zmutowana krypta będzie obserwowana w sąsiednich sekcjach. Preparaty z próbkami tkanek oddalonymi od siebie o ponad 50 μm zostały przygotowane w celu oceny łącznie >104 krypt na mysz. Częstość mutacji to liczba obserwowanych zmutowanych (białych) krypt ÷ przez liczbę dzikich (niebieskich) krypt w grupie badanej.
Wprowadzenie
Uważa się, że rak jelita grubego wiąże się z narażeniem na czynniki środowiskowe i składniki diety, które mogą uszkadzać DNA i powodować aktywujące mutacje somatyczne w onkogenach (np. ß-katenina) lub inaktywujące mutacje w genach supresorowych nowotworów (np. APC). Zakłada się, że te krytyczne mutacje zachodzą w komórkach macierzystych okrężnicy. Ze względu na unikalną architekturę krypty nabłonka okrężnicy, możliwe jest zmierzenie mutacji komórek macierzystych w okrężnicy po wystawieniu zwierząt na działanie substancji chemicznych związanych z kancerogenezą jelita grubego. Kilka enzymów sprzężonych z chromosomem X może służyć jako wskaźniki mutacji....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury eksperymentalne i etyczne traktowanie zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu w Pittsburghu (protokół #1104674).
1. Przygotowanie mieszanki barwiącej G6PD
UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie każdego odczynnika jest następujące: 5 mM glukozo-6-fosforanu (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,35 mM siarczanu metylu 1-metoksy-5-metylofenazyny (MMPMS) i 0,8 mM NBT. 1,8,9 Dla każdego odczynnika wyprowadzono początkowe stężenie dla końcowej objętości 40 ml. Roztwory były świeżo przygotowywane i używane każdego dnia.
- Dodać 2 ml 200 mM buforu fosforanowego (PB) o pH 7,4 do 35 ml pożywk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zdolność do pomiaru mutacji komórek macierzystych okrężnicy u zwierząt zapewnia wyjątkową możliwość skorelowania mutacji z indukcją nowotworu. Zazwyczaj przyjmuje się, że krytyczny etap kancerogenezy obejmuje mutacje aktywujące w onkogenach i/lub mutacje inaktywujące w genach supresorowych. Wstrzyknęliśmy myszom szczepu C57Bl/6 200 µl PBS lub 10 mg/kg AOM w 200 µl PBS. AOM jest znanym kancerogenem okrężnicy.5-7 W 90. dniu przeprowadzono analizę kolonów pod kątem mutacji komórek macierzystych. Czas ten jest nie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Często o genotoksycznym działaniu związku decyduje jego zdolność do modyfikowania DNA. Zwykle odbywa się to poprzez izolację tkanki i pomiar globalnego poziomu adduktów DNA. W przypadku OZUŚ wiązałoby się to z ilościowym określeniem adduktów O-6-metyloguaniny w okrężnicy. Stosując to podejście, informacje o uszkodzeniach w określonych typach komórek, takich jak nisza komórek macierzystych, są tracone. Ponadto addukt DNA to nie to samo, co mutacja, ponieważ tylko niewielka podgrupa adduktów jest ostatecznie prz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczynniki | |||
| nitroniebieski tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glukozo-6-fosforan | |||
| 1-metoksy-5-metylofenazyny siarczan metylu bufor fosforanowy | |||
| dimetyloformamidu | |||
| (pH 7,4 | |||
| Optymalna temperatura skrawania mieszanki (OCT) | |||
| Sprzęt | |||
| mikroskop świetlny wyposażony w kamerę | |||
| kriostat | |||
| ciepłe pomieszczenie |
Bibliografia
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
