Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy

Summary

Zgłaszamy znaczące ulepszenia w zakresie powtarzalnego pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy na potencjalne czynniki uszkadzające DNA.

Abstract

Możliwość pomiaru mutacji komórek macierzystych jest potężnym narzędziem do ilościowego określania w krytycznej populacji komórek, czy i w jakim stopniu, substancja chemiczna może wywołać mutacje, które potencjalnie prowadzą do raka. Wcześniej donoszono o zastosowaniu testu enzymatycznego do ilościowego określenia mutacji komórek macierzystych w genie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej sprzężonej z chromosomem X.¹ Metoda ta wymaga przygotowania zamrożonych skrawków i inkubacji wyciętej tkanki z mieszaniną reakcyjną, która daje niebieski kolor, jeśli komórki wytwarzają funkcjonalny enzym dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD). Jeśli nie, komórki wydają się białawe. Zmodyfikowaliśmy mieszaninę reakcyjną przy użyciu medium Optimum Cutting Temperature Compound (OCT) zamiast alkoholu poliwinylowego. Ułatwia to pomiar pH, zwiększa rozpuszczalność składników barwiących G6PD i ogranicza dyfuzję enzymu G6PD. Aby wykazać, że mutacja zaszła w komórce macierzystej, cała krypta musi być pozbawiona aktywności enzymatycznej G6PD. Tylko wtedy, gdy komórka macierzysta jest nosicielem fenotypowej mutacji G6PD, całe potomstwo w krypcie nie będzie miało aktywności enzymatycznej G6PD. Aby zidentyfikować krypty z mutacją komórek macierzystych, cztery kolejne sąsiadujące ze sobą zamrożone sekcje (poziom) zostały przecięte o grubości 7 μm. Takie podejście polegające na wykonywaniu sąsiednich cięć zapewnia potwierdzenie, że krypta była w pełni zmutowana, ponieważ ta sama zmutowana krypta będzie obserwowana w sąsiednich sekcjach. Preparaty z próbkami tkanek oddalonymi od siebie o ponad 50 μm zostały przygotowane w celu oceny łącznie >10⁴ krypt na mysz. Częstość mutacji to liczba obserwowanych zmutowanych (białych) krypt ÷ przez liczbę dzikich (niebieskich) krypt w grupie badanej.

Introduction

Uważa się, że rak jelita grubego wiąże się z narażeniem na czynniki środowiskowe i składniki diety, które mogą uszkadzać DNA i powodować aktywujące mutacje somatyczne w onkogenach (np. ß-katenina) lub inaktywujące mutacje w genach supresorowych nowotworów (np. APC). Zakłada się, że te krytyczne mutacje zachodzą w komórkach macierzystych okrężnicy. Ze względu na unikalną architekturę krypty nabłonka okrężnicy, możliwe jest zmierzenie mutacji komórek macierzystych w okrężnicy po wystawieniu zwierząt na działanie substancji chemicznych związanych z kancerogenezą jelita grubego. Kilka enzymów sprzężonych z chromosomem X może służyć jako wskaźniki mutacji....

Protocol

Procedury eksperymentalne i etyczne traktowanie zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu w Pittsburghu (protokół #1104674).

1. Przygotowanie mieszanki barwiącej G6PD

UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie każdego odczynnika jest następujące: 5 mM glukozo-6-fosforanu (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl₂, 0,35 mM siarczanu metylu 1-metoksy-5-metylofenazyny (MMPMS) i 0,8 mM NBT. ^1,8,9 Dla każdego odczynnika wyprowadzono początkowe stężenie dla końcowej objętości 40 ml. Roztwory były świeżo przygotowywane i używane każdego dnia.

1. Dodać 2 ml 200 mM buforu fosforanowego (PB) o pH 7,4 do 35 ml pożywk....

Results

Możliwość pomiaru mutacji komórek macierzystych okrężnicy u zwierząt dostarcza unikalnego sposobu na powiązanie mutacji z indukcją raka. Zwykle zakłada się, że krytyczny etap karcynogenezy obejmuje aktywację mutacji w onkogenach i/lub inaktywację mutacji w genach supresorowych nowotworu. Wstrzyknęliśmy myszom C57Bl / 6 200 μl PBS lub 10 mg / kg AOM w 200 μl PBS. OZUŚ jest znanym czynnikiem rakotwórczym jelita grubego. ^5-7 Po 90 dniach okrężnicy analizowano pod kątem mutacji komórek macierzystych. Czas ten jest.......

Discussion

Często o genotoksycznym działaniu związku decyduje jego zdolność do modyfikowania DNA. Zwykle odbywa się to poprzez izolację tkanki i pomiar globalnego poziomu adduktów DNA. W przypadku OZUŚ wiązałoby się to z ilościowym określeniem adduktów O-6-metyloguaniny w okrężnicy. Stosując to podejście, informacje o uszkodzeniach w określonych typach komórek, takich jak nisza komórek macierzystych, są tracone. Ponadto addukt DNA to nie to samo, co mutacja, ponieważ tylko niewielka podgrupa adduktów jest ostatecznie prz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
odczynniki
nitroniebieski tetrazolium
NADP
glukozo-6-fosforan
1-metoksy-5-metylofenazyny siarczan metylu bufor fosforanowy
dimetyloformamidu
(pH 7,4
Optymalna temperatura skrawania mieszanki (OCT)
Sprzęt
mikroskop świetlny wyposażony w kamerę
kriostat
ciepłe pomieszczenie