Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy

Podsumowanie

Zgłaszamy znaczące ulepszenia w zakresie powtarzalnego pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy na potencjalne czynniki uszkadzające DNA.

Streszczenie

Możliwość pomiaru mutacji komórek macierzystych jest potężnym narzędziem do ilościowego określania w krytycznej populacji komórek, czy i w jakim stopniu, substancja chemiczna może wywołać mutacje, które potencjalnie prowadzą do raka. Wcześniej donoszono o zastosowaniu testu enzymatycznego do ilościowego określenia mutacji komórek macierzystych w genie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej sprzężonej z chromosomem X.¹ Metoda ta wymaga przygotowania zamrożonych skrawków i inkubacji wyciętej tkanki z mieszaniną reakcyjną, która daje niebieski kolor, jeśli komórki wytwarzają funkcjonalny enzym dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD). Jeśli nie, komórki wydają się białawe. Zmodyfikowaliśmy mieszaninę reakcyjną przy użyciu medium Optimum Cutting Temperature Compound (OCT) zamiast alkoholu poliwinylowego. Ułatwia to pomiar pH, zwiększa rozpuszczalność składników barwiących G6PD i ogranicza dyfuzję enzymu G6PD. Aby wykazać, że mutacja zaszła w komórce macierzystej, cała krypta musi być pozbawiona aktywności enzymatycznej G6PD. Tylko wtedy, gdy komórka macierzysta jest nosicielem fenotypowej mutacji G6PD, całe potomstwo w krypcie nie będzie miało aktywności enzymatycznej G6PD. Aby zidentyfikować krypty z mutacją komórek macierzystych, cztery kolejne sąsiadujące ze sobą zamrożone sekcje (poziom) zostały przecięte o grubości 7 μm. Takie podejście polegające na wykonywaniu sąsiednich cięć zapewnia potwierdzenie, że krypta była w pełni zmutowana, ponieważ ta sama zmutowana krypta będzie obserwowana w sąsiednich sekcjach. Preparaty z próbkami tkanek oddalonymi od siebie o ponad 50 μm zostały przygotowane w celu oceny łącznie >10⁴ krypt na mysz. Częstość mutacji to liczba obserwowanych zmutowanych (białych) krypt ÷ przez liczbę dzikich (niebieskich) krypt w grupie badanej.

Wprowadzenie

Uważa się, że rak jelita grubego wiąże się z narażeniem na czynniki środowiskowe i składniki diety, które mogą uszkadzać DNA i powodować aktywujące mutacje somatyczne w onkogenach (np. ß-katenina) lub inaktywujące mutacje w genach supresorowych nowotworów (np. APC). Zakłada się, że te krytyczne mutacje zachodzą w komórkach macierzystych okrężnicy. Ze względu na unikalną architekturę krypty nabłonka okrężnicy, możliwe jest zmierzenie mutacji komórek macierzystych w okrężnicy po wystawieniu zwierząt na działanie substancji chemicznych związanych z kancerogenezą jelita grubego. Kilka enzymów sprzężonych z chromosomem X może służyć jako wskaźniki mutacji zachodzących w komórkach macierzystych, ponieważ mutacje będą obecne we wszystkich komórkach w krypcie.

Poprzednio opublikowano procedurę pokazującą, że substancje chemiczne wywołujące nowotwory jelita grubego u myszy generują również mutacje somatycznych komórek macierzystych w okrężnicy poprzez analizę mutacji w genie dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD) sprzężonej z chromosomem X. ^1-3 Metoda określa ilościowo występowanie losowych mutacji somatycznych w komórkach macierzystych okrężnicy bez żadnej presji selekcyjnej. Procedura polega na wytworzeniu nieutrwalonych zamrożonych skrawków jelita grubego od myszy leczonych i kontrolnych oraz identyfikacji krypt pozbawionych komórek, które wytwarzają funkcjonalną aktywność G6PD. Te zmutowane krypty, które wydają się białe, wskazują, że mutacja wystąpiła w komórce macierzystej, która dała początek potomstwu również zawierającemu zmutowany gen G6PD. W teście enzymatycznym zmutowane krypty z niedoborem G6PD nie mogą utleniać glukozo-6-fosforanu, który jest wymagany do redukcji tetrazolu błękitu nitro (NBT). Gdy enzym G6PD jest funkcjonalny, NBT w mieszaninie barwiącej jest redukowany do nierozpuszczalnego formazanu i wytrąca się, gromadząc się w miejscu enzymu i "barwiąc" komórki na niebiesko. Komórki, które są mutantami G6PD, pozostają białawe w przeciwieństwie do zabarwionych na niebiesko krypt typu dzikiego. Ta metoda mierzy mutacje, które mają fenotyp "zerowy". Ponieważ enzymy, takie jak G6PD, mogą dyfundować z komórek na nieutrwalonym fragmencie tkanki, jeśli skrawki zostaną umieszczone w roztworze wodnym, konieczne jest ustabilizowanie enzymu w analizowanych skrawkach tkanki. ⁴ Stabilizacja enzymu w tkance nie może zakłócać dyfuzji małych cząsteczek odczynnika niezbędnych do reakcji enzymatycznej G6PD.

Wprowadziliśmy kilka istotnych zmian do pierwotnej procedury. Pożywka do krytycznego barwienia enzymatycznego została zmieniona z alkoholu poliwinylowego na związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), co ułatwia kontrolę pH i solubilizację składników użytych w teście. Barwienie odbywa się za pomocą studzienek o pojemności 0,4 – 0,5 ml wykonanych z myjek stalowych tak, aby każdy wycinek tkanki otrzymał taką samą objętość mieszaniny reakcyjnej G6PD. Opracowano procedurę szacowania liczby krypt w zobrazowanej sekcji, która zapewnia dużą próbkę tkanki okrężnicy bez konieczności ręcznego liczenia >10⁵ krypt dla każdej okrężnicy. Analiza sąsiadujących ze sobą skrawków tkanek o wielkości 7 μm pozwala na wizualizację zmutowanej krypty na więcej niż jednym szkiełku, co zmniejsza potencjalne artefakty barwienia. Zmiany te sprawiają, że procedura jest bardziej wydajna i powtarzalna.

Korzystając z tego poprawionego protokołu, określiliśmy ilościowo częstotliwość mutacji w komórkach macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy C57Bl/6 na azoksymetan, dobrze znany czynnik rakotwórczy jelita grubego u gryzoni. ^5-7

Protokół

Procedury eksperymentalne i etyczne traktowanie zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu w Pittsburghu (protokół #1104674).

1. Przygotowanie mieszanki barwiącej G6PD

UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie każdego odczynnika jest następujące: 5 mM glukozo-6-fosforanu (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl₂, 0,35 mM siarczanu metylu 1-metoksy-5-metylofenazyny (MMPMS) i 0,8 mM NBT. ^1,8,9 Dla każdego odczynnika wyprowadzono początkowe stężenie dla końcowej objętości 40 ml. Roztwory były świeżo przygotowywane i używane każdego dnia.

1. Dodać 2 ml 200 mM buforu fosforanowego (PB) o pH 7,4 do 35 ml pożywki OCT w probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsnąć. Potwierdź za pomocą papieru pH, że roztwór ma pH ~ 7,4. Jeśli nie, wyrzuć roztwór.
2. Dodać 61 mg G6P rozpuszczonego w 0,94 ml 200 mM PB, 61 mg NADP rozpuszczonego w 0,94 ml 200 mM PB i 41 mg MgCl₂ rozpuszczonego w 0,96 ml 100 mM PB. Potwierdź, że pH wynosi ~ 7,4 za pomocą papieru pH. Jeśli nie ~7,4, wyrzuć roztwór.
3. Dodać 5 mg MMPMS rozpuszczonego w 0,25 ml 200 mM PB (pH 7,4). Energicznie wstrząsnąć powstałą mieszaniną reakcyjną, aby uzyskać klarowny ciemnoczerwony homogenat. Jeśli roztwór jest mętny, mieszaninę należy wyrzucić. Probówka zawierająca mieszaninę reakcyjną jest owinięta folią, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Mieszaninę reakcyjną należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu przygotowania końcowego składnika, NBT.
4. Przygotować oddzielnie 5 mM roztwór NBT, dodając 0,4 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) i 0,4 ml bezwodnego etanolu do 164 mg NBT w probówce o pojemności 2 ml z pokrywką typu O-ring. Zamknij luźno pokrywkę (nie jest szczelnie zamknięta) i doprowadź roztwór do energicznego wrzenia w łaźni olejowej, aż NBT znajdzie się w roztworze. ⁸
5. Pozostawić rozpuszczony NBT do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodać cały roztwór do mieszaniny reakcyjnej OCT i energicznie wstrząsnąć, aby uzyskać klarowny roztwór. Obserwuj, jak kolor roztworu zmienia się z początkowego pomarańczowo-czerwonego na ciemnoczerwony lub fioletowy kolor w czasie. To normalne.
6. Umieść ostateczną mieszaninę barwiącą G6PD w ciepłym pomieszczeniu o temperaturze 37 °C na 1 godzinę przed użyciem.

2. Leczenie zwierząt i pobieranie tkanek

1. Potraktuj 6-tygodniowe samce myszy C57Bl/6 środkiem uszkadzającym DNA, np. 10 mg/kg azoksymetanu (AOM) w objętości 200 μl PBS przez wstrzyknięcie dożylnie. Potraktuj myszy kontrolne 200 μl PBS przez wstrzyknięcie dożylne.
2. Po 90 dniach należy poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z protokołem IACUC.
3. Chirurgicznie otwórz jamę brzuszną od tuż nad odbytem do podstawy mostka. Wyjmij jelito cienkie z jamy ciała, ale nie wycinaj go. Wyciąć dolne jelito tuż poniżej jelita ślepego do odbytnicy. ¹⁰
4. Ostrożnie przekrój wzdłuż jednej strony okrężnicy za pomocą nożyczek do mikropreparowania i usuń kał z otwartej okrężnicy, przemywając czystym sterylnym PBS. Swiss zwiń wyciętą okrężnicę stroną luminalną skierowaną na zewnątrz i umieść w formie tkankowej. ¹⁰
5. Całkowicie zanurz okrężnicę w pożywce OCT i umieść formę w płynie Dewara zawierającym N₂. Trzymaj formę tak, aby plastikowa podstawa stykała się z cieczą_N2, aż podłoże OCT zamarznie w stanie stałym.
6. Przechowuj zamrożony blok tkanki w temperaturze -80 do momentu przecięcia zamrożonych odcinków. Nie należy stosować żadnych utrwalaczy, ponieważ mogłoby to spowodować inaktywację enzymu G6PD.

3. Przygotowanie zamrożonych sekcji

1. Wyciąć zamrożone skrawki tkanek o grubości 7 μm za pomocą kriostatu w temperaturze -25 °C. Wyciąć 4 kolejne odcinki o grubości 7 μm i umieścić dwie z nich na tym samym szkiełku (ryc. 1). Przygotuj 2 szkiełka lub cztery kolejne sekcje o wielkości 7 μm, aby przedstawić jeden poziom okrężnicy (ryc. 1).
2. Powtórz dla następnego poziomu z zachowaniem minimalnej odległości >50 μm od ostatniej sekcji poprzedniego poziomu. Odległość ta zapewniała, że krypty oceniane dla każdego poziomu nie powielały się nawzajem.
3. Często przecieraj ostrze kriostatu 100% etanolem, aby usunąć pozostałości OCT, które gromadzą się podczas cięcia. Przed wznowieniem cięcia suche ostrze przeciera się antystatycznym arkuszem suszarki, aby rozproszyć nagromadzony ładunek elektrostatyczny. Szkiełka z zamrożonymi sekcjami przechowywać w temperaturze -80 ^oC.

4. Barwienie zamrożonej tkanki skrawka

1. Przeprowadzić enzymatyczną reakcję histochemiczną w ciepłym pomieszczeniu o wysokiej wilgotności w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Próba reakcji enzymatycznej w piecu inkubacyjnym lub na podgrzewaczu do szkiełek doprowadziła do słabego i niespójnego barwienia G6PD.
2. Zbuduj studzienki do barwienia tkanek za pomocą dwóch stalowych podkładek o wymiarach 1,5 cm x 0,15 cm (średnica wewnętrzna x wysokość), które są połączone ze sobą za pomocą smaru silikonowego (rysunek 1). Wytnij parafilm tak, aby pasował do podstawy studzienki z wyciętym środkiem i studzienką umieszczoną nad sekcją tkanki na szkiełku.
   UWAGA: Parafilm na spodzie podkładki tworzy uszczelnienie między szkiełkiem a podkładką, które utrzymuje lepką mieszaninę barwiącą G6PD na przekroju tkanki. Konstrukt ten daje studzienkę o objętości 0,4 - 0,5 ml, dzięki czemu każda sekcja tkanki w badaniu otrzymuje taką samą objętość mieszaniny barwiącej reakcję G6PD.
3. Zamrożone szkiełka tkankowe inkubować w temperaturze 37 ^oC w ciepłym pomieszczeniu przez 10 minut. W temperaturze 37 °C dodać mieszaninę reakcji barwienia G6PD do każdego wycinka tkanki (2 sekcje na szkiełku) przez 45-50 min. Wyjmij szkiełka z ciepłego pomieszczenia i ostrożnie zdejmij ze szkiełek ze stali nierdzewnej.
4. Ustaw szkiełka na ich dłuższej krawędzi, aby umożliwić spłynięcie medium reakcyjnego. Umieść szkiełka w 100 mM PB (pH 7,4) na 30-60 minut, aby usunąć mieszaninę reakcji barwienia G6PD z tkanki bez naruszania barwienia tkanek. Zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na 5-10 minut, aby usunąć sole PB
5. Uszczelnij tkankę, dodając fluorożel z zakraplacza na tkankę i czekając ~ 30 minut, aż wyschnie. Unikaj bąbelków, które mogą zmylić identyfikację zmutowanych krypt.
   UWAGA: Jeśli tworzą się bąbelki, procedurę można powtórzyć po usunięciu fluorożelu poprzez namoczenie w wodzie destylowanej. Nie należy używać szkiełek nakrywkowych, ponieważ mają one tendencję do zatrzymywania pęcherzyków powietrza.

5. Określanie zmutowanych krypt G6PD i częstość mutacji

1. Analizuj szkiełka pod kątem zmutowanych krypt G6PD pod mikroskopem świetlnym.
   UWAGA: Kryteria użyte do identyfikacji w pełni zmutowanej krypty były następujące: (i) cała krypta była pozbawiona niebieskiego koloru; (ii) zewnętrzna struktura krypty była nienaruszona, (iii) zmutowana krypta była obserwowana na sąsiednich odcinkach o długości 7 μm i (iv) dwóch obserwatorów musiało zidentyfikować tę samą kryptę jako mutanta. Mutanty zaobserwowane na sąsiednich odcinkach o wielkości 7 μm są liczone jako jeden mutant.
2. Sfotografuj każdą kryptę mutantów G6PD w 40-krotnym powiększeniu i skataloguj obrazy za pomocą kamery o rozdzielczości 5,0 megapikseli z oprogramowaniem do obrazowania.
3. Określ ilościowo całkowitą liczbę krypt badanych za pomocą myszy, wybierając reprezentatywną sekcję dla każdej myszy z poziomu o najmniejszej powierzchni i zobrazuj ją w 10-krotnym powiększeniu (Rysunek 1C).
   UWAGA: Poziom reprezentuje cztery kolejne sekcje o wielkości 7 μm (Rysunek 1D), które ze względu na swoją bliskość często pokazują zmutowane krypty na więcej niż jednej sekcji. Poziomy są oddzielone od siebie o >50 μm, aby uwidocznić krypty z różnych obszarów okrężnicy.
4. Otwórz każdy plik obrazu i wizualnie policz liczbę krypt na poziomie, analizując pliki (pokazane jako pola na rysunku 1C). Pliki z obrazami będą się różnić liczbą obserwowanych krypt od zaledwie 20 do > 300 krypt w jednym pliku.
5. Pomnóż łączną liczbę krypt z wybranego poziomu (Rysunek 1C) dla każdej myszy przez liczbę poziomów przebadanych pod kątem zmutowanych krypt G6PD dla każdego dwukropka. Na przykład łączna liczba 1 250 krypt na wybrany poziom pomnożona przez 8 poziomów przebadanych pod kątem zmutowanych krypt równa się całkowitej liczbie 10 000 krypt. Oceń co najmniej 10 000 krypt dla każdego dwukropka do analizy statystycznej.
6. Połączyć liczbę mutantów zaobserwowanych u wszystkich zwierząt przez całkowitą liczbę krypt poddanych badaniom przesiewowym, aby obliczyć MF dla każdego leczenia. Poziom MF komórek macierzystych w tle u myszy nieleczonych wynosi < 0,1x10-4 (Tabela 1), co jest zbliżone do wcześniej zgłaszanego u myszy C57Bl/6. ¹¹

Wyniki

Możliwość pomiaru mutacji komórek macierzystych okrężnicy u zwierząt dostarcza unikalnego sposobu na powiązanie mutacji z indukcją raka. Zwykle zakłada się, że krytyczny etap karcynogenezy obejmuje aktywację mutacji w onkogenach i/lub inaktywację mutacji w genach supresorowych nowotworu. Wstrzyknęliśmy myszom C57Bl / 6 200 μl PBS lub 10 mg / kg AOM w 200 μl PBS. OZUŚ jest znanym czynnikiem rakotwórczym jelita grubego. ^5-7 Po 90 dniach okrężnicy analizowano pod kątem mutacji komórek macierzystych. Czas ten jest...

Dyskusja

Często o genotoksycznym działaniu związku decyduje jego zdolność do modyfikowania DNA. Zwykle odbywa się to poprzez izolację tkanki i pomiar globalnego poziomu adduktów DNA. W przypadku OZUŚ wiązałoby się to z ilościowym określeniem adduktów O-6-metyloguaniny w okrężnicy. Stosując to podejście, informacje o uszkodzeniach w określonych typach komórek, takich jak nisza komórek macierzystych, są tracone. Ponadto addukt DNA to nie to samo, co mutacja, ponieważ tylko niewielka podgrupa adduktów jest ostatecznie prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynniki
nitroniebieski tetrazolium
NADP
glukozo-6-fosforan
1-metoksy-5-metylofenazyny siarczan metylu bufor fosforanowy
dimetyloformamidu
(pH 7,4
Optymalna temperatura skrawania mieszanki (OCT)
Sprzęt
mikroskop świetlny wyposażony w kamerę
kriostat
ciepłe pomieszczenie