Przeciwzjadliwe rozbijanie patogennych biofilmów za pomocą zaprojektowanych laktonaz gaszących kworum

Podsumowanie

Enzymy gaszące kworum są opcjami antyzjadliwymi i przeciwbakteryjnymi, które mogą łagodzić patogenezę bez ryzyka wystąpienia oporności, zapobiegając ekspresji czynników wirulencji i genów związanych z opornością na antybiotyki i tworzeniem biofilmu. W tym badaniu przedstawiamy metodę, która pokazuje skuteczność enzymów gaszących kworum w rozbijaniu biofilmu bakteryjnego.

Streszczenie

Szybkie pojawienie się bakterii opornych na wiele leków przyspieszyło potrzebę nowych podejść terapeutycznych do zwalczania zagrażających życiu infekcji. Utrzymywanie się infekcji bakteryjnej jest często związane z tworzeniem biofilmu za pośrednictwem quorum-sensing. Tak więc zakłócenie tego obwodu sygnalizacyjnego stanowi atrakcyjną strategię antywirulencyjną. Doniesiono, że laktonazy wygaszające kworum skutecznie zakłócają obwody wyczuwania kworum. Pojawiło się jednak bardzo niewiele doniesień o skutecznym wykorzystaniu tych enzymów w zakłócaniu tworzenia biofilmu bakteryjnego. Protokół ten opisuje metodę zakłócania tworzenia biofilmu w klinicznie istotnym szczepie A. baumannii S1 poprzez zastosowanie zmodyfikowanej laktonazy gaszącej kworum. Acinetobacter baumannii jest głównym ludzkim patogenem związanym z poważnymi zakażeniami szpitalnymi na całym świecie, a jego zjadliwość przypisuje się głównie trwałości biofilmu. Zabieg z użyciem laktonazy pozwolił na znaczne zmniejszenie biofilmu A. baumannii S1. Badanie to wykazało również możliwość wykorzystania zmodyfikowanych enzymów wygaszających kworum w przyszłym leczeniu chorób bakteryjnych wywoływanych przez biofilm. Wreszcie, metoda ta może być wykorzystana do oceny kompetencji obiecujących enzymów wygaszających kworum.

Wprowadzenie

Opcje leczenia chorób zakaźnych zostały skomplikowane przez szybki wzrost liczby bakterii wielolekoopornych, które są odporne na szeroki zakres antybiotyków¹. Ze względu na wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności z powodu zakażeń wywołanych przez oporne bakterie, istnieje potrzeba eskalacji procesów opracowywania leków i/lub zbadania lepszych alternatyw przeciwbakteryjnych w celu poprawy opcji terapeutycznych. Ostatnio podejście przeciwzjadliwe zyskuje na popularności ze względu na jego potencjał w zapobieganiu zjadliwości metodami niebakteriobójczymi, a tym samym ograniczaniu ryzyka mechanizmów oporności².

Quorum-sensing to 'główny przełącznik' w zjadliwości bakterii, a zakłócenie tego zjawiska sygnalizacji jest obiecującą metodą anty-wirulencyjną przeciwko patogenezie³. Początek zjadliwości wymaga akumulacji cząsteczek kworum w środowisku zewnątrzkomórkowym po osiągnięciu krytycznej gęstości populacji bakterii. Ponieważ cząsteczki kworum dyfundują z powrotem do macierzy wewnątrzkomórkowej, wiązanie się z pokrewnymi receptorami prowadzi do aktywacji czynników wirulencji, a także genów związanych z opornością na antybiotyki i tworzeniem biofilmu⁴. Ogólnie rzecz biorąc, zakłócenie quorum-sensing polega na hamowaniu interakcji cząsteczki kworum i receptora bez wpływu na pierwotne szlaki metaboliczne. W związku z tym nie ma to bezpośredniego wpływu na wzrost komórek. Ponieważ sprawność fizyczna nie jest zagrożona, istnieje minimalna presja selekcyjna, aby bakterie ewoluowały i uodparniały się na takie zabiegi⁵. Ponadto zakłócenie quorum-sensing może zakłócać wrodzone bakteryjne mechanizmy ochronne, jak w przypadku tworzenia biofilmu, który zapewnia ochronę przed środkami przeciwbakteryjnymi i odpowiedziami immunologicznymi gospodarza.

Szacuje się, że 99% mikrobów na Ziemi występuje w skomplikowanych matrycach przypominających biofilm, co daje kluczowe korzyści w przetrwaniu mikroorganizmom żyjącym w tych strukturach⁶. Co ważniejsze, powstawanie tych domen siedzących jest przyczyną większości uporczywych i przewlekłych zakażeń szpitalnych⁷. Acinetobacter baumannii jest jednym z głównych ludzkich patogenów, który jest związany z globalnymi zakażeniami szpitalnymi, a jego zjadliwość jest w dużej mierze przypisywana^{tworzeniu się} biofilmu za pośrednictwem quorum-sensing8. Enzymy wygaszające kworum zostały z powodzeniem wykorzystane do zakłócania transdukcji sygnału za pośrednictwem kworum poprzez celowanie w grupę związków znanych jako laktony N-acylhomoseryny (AHL), które są wytwarzane przez bakterie Gram-ujemne⁹. W kilku badaniach rozszerzono również zastosowanie tych enzymów do blokowania patogenezy bakterii poprzez zmniejszenie ekspresji czynnika wirulencji i liczby komórek w biofilmach^10,11. Niestety, nadal brakuje namacalnych dowodów na skuteczne stosowanie enzymów wygaszających kworum przeciwko tworzeniu się biofilmu przez patogeny bakteryjne. Podjęto próby użycia inhibitorów kworum (analogów AHL) zamiast enzymów wygaszających kworum, aby zakłócić tworzenie biofilmu A. baumannii ¹². Chociaż ta metoda stosowania inhibitorów małych cząsteczek jest słusznym podejściem, utrzymanie jej biodostępności w zastosowaniach translacyjnych może być wyzwaniem. Wręcz przeciwnie, zastosowanie katalitycznych enzymów wygaszających kworum może obejść problem biodostępności, ponieważ enzymy są bardziej podatne na unieruchomienie na powierzchniach urządzeń biomedycznych w celu uzyskania efektów terapeutycznych.

Tutaj opisujemy ocenę wpływu inżynieryjnych laktonaz gaszących kworum z Geobacillus kaustophilus (GKL)¹³ na tworzenie biofilmu bakteryjnego, przy użyciu barwienia fioletem krystalicznym i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Badanie to jest pierwszą udaną demonstracją przerwania biofilmu w klinicznie istotnym szczepie A. baumannii S1 przy użyciu enzymów gaszących kworum. Metody opisane w tym badaniu są przydatne do oceny skuteczności innych enzymów wygaszających kworum w późniejszych wysiłkach terapeutycznych przeciwko patogennym bakteriom Gram-ujemnym.

Protokół

1. Kwantyfikacja powstawania biofilmu w fiolecie krystalicznym u A. baumannii S1

1. Hodować 5 ml kultury A. baumannii S1 w bulionie lizogennym (LB) (trypton 10 g/l, ekstrakt drożdżowy 5 g/l) w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) przez 16 godzin.
2. Dostosuj kulturę A. baumannii S1 do pożądanego OD₆₀₀ 0,8. Używając płytki 96-dołkowej, zaszczepić kulturę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do świeżego LB zawierającego 10 μl oczyszczonego enzymu GKL (40 mg/ml); Ostateczna objętość nowej kultury wynosi 100 μl.
3. Przygotuj również kulturę kontrolną, która nie będzie zawierała żadnego enzymu. Powtórz podobne warunki, aby uzyskać żądaną liczbę powtórzeń.
4. Przykryj talerz pokrywką i umieść go w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 3 godziny przed delikatnym usunięciem pożywki.
5. Dodać kolejne 100 μl świeżej pożywki LB do dołka i inkubować płytkę przez 21 godzin w temperaturze 30 °C.
6. Po drugim okresie inkubacji delikatnie usuń wszystkie podłoża. Umyj komórkę bakterii planktonowej 200 μl sterylnej wody. Upewnij się, że podczas prania komórki są tylko minimalnie zakłócane.
7. Dodać 100 μl 1% roztworu fioletu krystalicznego do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór fioletu krystalicznego, przemywając studzienkę 200 μl sterylnej wody. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
8. Dodać 100 μl 33% kwasu octowego do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut, delikatnie wstrząsając, co spowoduje rozpuszczenie barwnika.
9. Określić ilościowo ilość utworzonego biofilmu, mierząc absorbancję fioletu krystalicznego przy długości fali 600 nm. Ilość fioletu krystalicznego jest proporcjonalna do ilości powstałego biofilmu.

2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa biofilmu A. baumannii S1

1. Hodować 5 ml kultury A. baumannii S1 w LB w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) przez 16 godzin.
2. Dostosuj kulturę A. baumannii S1 do pożądanego OD₆₀₀ 0,8. Używając 35-milimetrowej płytki do μ ze szklanym dnem, zaszczepić kulturę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do świeżego LB zawierającego 30 μl oczyszczonego enzymu GKL (40 mg/ml); Ostateczna objętość nowej kultury wynosi 1 ml.
3. Przykryj μ-Dish pokrywką i umieść je w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku o pojemności 10 l. Inkubować półmiskę μ w temperaturze 30 °C przez 3 godziny, a następnie delikatnie wyjąć podłoże. Dodać 30 μl oczyszczonego enzymu GKL i świeżej pożywki, uzyskując całkowitą objętość 1 ml. Inkubować przez kolejne 21 godzin w temperaturze 30 °C.
4. Powtórzyć krok 2.3 i inkubować półmisek μ przez kolejne 24 godziny w temperaturze 30 °C. Następnie delikatnie wyjmij nośnik.
5. Dodać 500 μl 5 μg/ml aglutyniny (WGA) z kiełków pszenicy Alex Fluo 488 rozpuszczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) do naczynia μ i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut; spowoduje to zabarwienie utworzonego biofilmu. Usuń roztwór barwiący i umyj naczynie μ 2 ml HBSS. Powtórz krok prania jeszcze raz.
6. Dodać 500 μl 3,7 % formaldehydu rozpuszczonego w HBSS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut; w ten sposób utrwalony zostanie biofilm na szalce μ. Umyj naczynie μ raz 2 ml HBSS, a następnie całkowicie usuń roztwór. Naczynie μ-Time z utrwalonym biofilmem może być przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem CLSM.
7. W przypadku obrazowania i analizy CLSM użyj 63-krotnego powiększenia, aby wygenerować 97 stosów na obraz w odstępie 0,21 μm na stos.

Wyniki

W eksperymencie z kwantyfikacją fioletu krystalicznego użyto dwóch enzymów gaszących kworum, aby wykazać możliwość zakłócenia tworzenia biofilmu: dzikiego typu GKL i ulepszonego podwójnego mutanta GKL (E101G/R230C). Wykazano, że oba enzymy wykazują aktywność laktonazy wobec laktonu 3-hydroksy-dekanoilo-L-homoseryny (3-OH-C_10-HSL), głównej cząsteczki kworum używanej przez A. baumannii S1¹⁴. W celu prawidłowej oceny rozerwania biofilmu, ich odpowiednie katalit...

Dyskusja

W obu zestawach eksperymentów A. baumannii S1 hodowano w pożywkach LB bez NaCl, ponieważ wysokie stężenie soli może zmniejszyć ilość biofilmu utworzonego przez bakterie¹⁵. Obecność takiego artefaktu może zaniżać ilość powstałego biofilmu, a także wpływ enzymów gaszących kworum w różnych warunkach leczenia. Zastosowanie katalitycznie nieaktywnego enzymu jest ważne jako kontrola negatywna w celu wyeliminowania możliwych skutków sekwestracji enzymów. Rysunek 1 pokazuje, że nawet jeśli ni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trypton	BD	211705
Ekstrakt drożdżowy	BD	212750
96-dołkowa płytka	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
			Uwaga: Łatwopalny
μ-Naczynie	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-sprzężony WGA	Invitrogen	W11261
Hank' s Zrównoważony roztwór soli	Invitrogen	141475095
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775	Uwaga:
Synergy HT Czytnik mikropłytek	BioTek
1X-81 Mikroskop odwróconej fluorescencji	Olympus