Artykuł metodologiczny

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

DOI:

10.3791/53245

⸱

4 lipca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe pełnią ważne funkcje w komórkach, takie jak transport składników odżywczych, ruchliwość, sygnalizacja, przeżycie i zjadliwość, ale stanowią tylko ~1% procent znanych struktur. Istnieją dwa rodzaje białek błonowych, α-helisowe i β-beczkowe. Podczas gdy białka błonowe α-helisowe można znaleźć w prawie wszystkich błonach komórkowych, białka błonowe β beczkowe można znaleźć tylko w zewnętrznych błonach mitochondriów, chloroplastach i bakteriach Gram-ujemnych. Jednym z powszechnych wąskich gardeł w badaniach strukturalnych białek błonowych w ogóle jest uzyskanie wystarczającej ilości czystej próbki do analizy. W nadziei na pomoc osobom zainteresowanym w rozwiązaniu struktury ich ulubionego białka błony zewnętrznej β beczki (OMP), przedstawiono ogólne protokoły produkcji docelowych OMP z β beczkami na poziomach przydatnych do określania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej i / lub spektroskopii NMR. W tym miejscu przedstawiamy projekt konstrukcji zarówno dla ekspresji natywnej, jak i dla ekspresji w ciałach inkluzyjnych, oczyszczania za pomocą znacznika powinowactwa i krystalizacji przy użyciu technik przesiewania detergentów, bicelle i lipidowej fazy sześciennej. Protokoły te zostały przetestowane i stwierdzono, że działają w przypadku większości OMP z bakterii Gram-ujemnych; Istnieją jednak pewne cele, szczególnie dla mitochondriów i chloroplastów, które mogą wymagać innych metod ekspresji i oczyszczania. W związku z tym przedstawione metody powinny mieć zastosowanie do większości projektów, które obejmują OMP z bakterii Gram-ujemnych, jednak poziomy ekspresji i ilość oczyszczonej próbki będą się różnić w zależności od docelowego OMP.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-beczkowe OMP można znaleźć tylko w zewnętrznych błonach mitochondriów, chloroplastach i bakteriach Gram-ujemnych1-3. Chociaż pełnią podobne role jak białka α-helikalne, mają bardzo różne fałdy składające się z centralnej domeny β-beczkowej osadzonej w błonie centralnej, w zakresie od 8 do 26 antyrównoległych nici β, przy czym każda nić jest ściśle połączona z dwiema sąsiednimi niciami (ryc. 1 i 2). Pierwsza i ostatnia nić domeny β-barrel oddziałują następnie ze sobą, prawie wyłącznie w sposób antyrównoległy (z wyjątkiem mitochondrialnego VDAC), aby zamknąć i uszczelnić domenę β-barrel od otaczającej błony. Wszystkie β-beczkowe OMP mają pętle zewnątrzkomórkowe o różnej sekwencji i długości, które odgrywają ważną rolę w interakcjach ligandów i / lub kontaktach białko-białko, przy czym pętle te czasami mają rozmiar nawet 75 reszt, takich jak znalezione w białku wiążącym Neisserial transferynę A (TbpA)4. β-beczkowe OMP mogą również mieć N-końcowe lub C-końcowe rozszerzenia peryplazmatyczne, które służą jako dodatkowe domeny do funkcjonalnego celu białka (np. BamA5-7, FimD8,9, FadL10). Chociaż istnieje wiele typów β-lufowych OMP11, dwa z bardziej powszechnych typów opisano poniżej jako przykłady dla osób mniej zaznajomionych z tą dziedziną: (1) transportery zależne od tony i (2) autotransportery.

Transportery zależne od TonB (np. FepA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) są niezbędne do importu składników odżywczych i zawierają N-końcową domenę wtyczki składającą się z ~150 reszt, która znajduje się schowana w C-końcowej 22-niciowej domenie β-baryłkowej osadzonej w zewnętrznej membranie12 (Rysunek 3). Podczas gdy ta domena czopowa zapobiega swobodnemu przechodzeniu substratu przez domenę beczkowatą, wiązanie substratu indukuje zmianę konformacyjną w domenie czopowej, która prowadzi do tworzenia porów (albo przez przegrupowanie czopa, albo przez częściowe/pełne wyrzucenie czopa), co może następnie ułatwić transport substratu przez błonę zewnętrzną do peryplazmy. Transportery zależne od TonB są szczególnie ważne dla przetrwania niektórych patogennych szczepów bakterii Gram-ujemnych, takich jak Neisseria meningitidis, które wyewoluowały wyspecjalizowane transportery, które wychwytują składniki odżywcze, takie jak żelazo, bezpośrednio z ludzkich białek gospodarza4,13,14.

Autotransportery należą do systemu wydzielania bakterii Gram-ujemnych typu V i są β-beczkowymi OMP, które składają się z domeny β-beczkowej (zazwyczaj 12-niciowej jak w przypadku EstA i EspP) oraz domeny pasażerskiej, która jest albo wydzielana, albo prezentowana na powierzchni komórki15,16 (Rysunek 3). Te β-beczkowe OMP często odgrywają ważną rolę w przetrwaniu i zjadliwości komórek, a domena pasażera służy jako proteaza, adhezyna i / lub inny efektor, który pośredniczy w patogenezie.

Metody strukturalne, takie jak krystalografia rentgenowska, spektroskopia NMR i mikroskopia elektronowa (EM) pozwalają nam określić modele dla OMP w rozdzielczości atomowej, które z kolei mogą być wykorzystane do dokładnego rozszyfrowania, jak funkcjonują w zewnętrznej membranie. Te bezcenne informacje mogą być następnie wykorzystane do opracowania leków i szczepionek, jeśli ma to zastosowanie. Na przykład białko wiążące transferynę A (TbpA) znajduje się na powierzchni Neisseria i jest niezbędne do patogenezy, ponieważ bezpośrednio wiąże ludzką transferynę, a następnie ekstrahuje i importuje żelazo dla własnego przetrwania. Bez TbpA Neisseria nie może wymiatać żelaza z ludzkiego gospodarza i staje się niepatogenna. Po rozwiązaniu struktury krystalicznej ludzkiej transferyny związanej z TbpA4 stało się znacznie jaśniejsze, w jaki sposób te dwa białka łączą się, jakie regiony TbpA pośredniczą w interakcji, jakie reszty są ważne dla ekstrakcji żelaza przez TbpA i jak można opracować terapie przeciwko Neisseria ukierunkowanej na TbpA. W związku z tym, biorąc pod uwagę znaczenie β-baryłkowatych OMP w bakteriach Gram-ujemnych dla przeżycia i patogenezy, a także w funkcji mitochondriów i chloroplastów, a także potrzebę dodatkowych informacji strukturalnych na temat tej unikalnej klasy białek błonowych i systemów, w których funkcjonują, przedstawiono ogólne protokoły z ogólnym celem ekspresji i oczyszczania docelowych OMP na wysokich poziomach w celu scharakteryzowania metodami strukturalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie i wyrażenie

Uwaga: Aby umożliwić badania strukturalne, musi być przygotowana wystarczająca ilość wysoko oczyszczonego białka, a to zazwyczaj zaczyna się od klonowania i nadekspresji docelowego białka zewnętrznej błony β (OMP) w E. coli (Rysunek 4). Do tej pory wszystkie β-beczkowate struktury OMP, w tym struktury mitochondrialnego VDAC, pochodziły z białka11 ulegającego ekspresji bakteryjnej. W tym miejscu przedstawiono ogólne protokoły klonowania i ekspresji β-beczkowych OMP dla (1) natywnej ekspresji bezpośrednio do błon bakteryjnych i (2) ekspresji do ciał inkluzyjnych w celu ponownego fałdowania in vitro 17.

  1. Projektowanie konstrukcji wyrażenia
    1. Uzyskaj lub kup zoptymalizowany pod kątem kodonu docelowy gen OMP.
    2. Kup lub uzyskaj wektor ekspresyjny T7 (i) zawierający sekwencję sygnałową lokalizacji peryplazmatycznej, N-końcowy znacznik 6x-histydyny i miejsce proteazy TEV4,18,19 do ekspresji in vivo do błony lub (ii) bez sekwencji sygnałowej lokalizacji peryplazmatycznej do ekspresji do ciał inkluzyjnych w celu ponownego fałdowania in vitro.
      Uwaga: N-końcowy znacznik proteazy rozszczepialnej 6x lub 10x-histydyny zapewniłby łatwą metodę oczyszczania. Podobnie jak w przypadku białek rozpuszczalnych, różnią się wyborem znacznika powinowactwa (histydyna, paciorkowiec, GST itp.), Położenia znacznika powinowactwa i włączenia miejsca proteazy (TEV, enterokinaza, trombina itp.) w celu późniejszego usunięcia znacznika.
    3. PCR amplifikuje sekwencję docelową odpowiednimi starterami i subklonuje do wektora ekspresji. Do subklonowania należy stosować klonowanie niezależne od ligacji (LIC)20,21 lub konwencjonalne techniki klonowania (enzymy restrykcyjne/ligacja). Jednak LIC może zapewnić wysoką przepustowość, co pozwala na łatwiejsze klonowanie równoległe ogromnej liczby różnych konstrukcji (obcięć, różnorodności tagów, różnych promotorów).
  2. Ekspresja in vivo ukierunkowana na błonę
    1. Użyj analizy sekwencjonowania, aby sprawdzić, czy docelowy OMP z β-lufą jest sklonowany dalej i w ramce z sekwencją sygnałów (tj. pelB, OmpA) w konstrukcji wyrażenia.
      Uwaga: Sekwencja sygnałowa kieruje powstający łańcuch do translokonu Sec w celu wydzielenia do peryplazmy, a następnie złożenia w błonie zewnętrznej.
    2. Przekształć konstrukt w ekspresyjny szczep bakterii do ekspresji, pipetując 1,0 μl plazmidu do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3) i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
    3. Podgrzewaj impuls w temperaturze 42 ºC przez 30 sekund w łaźni wodnej, a następnie umieść z powrotem na lodzie na 1 minutę.
    4. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SOC i wstrząsać w temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę z prędkością 1 000 obr./min za pomocą inkubatora z wytrząsarką laboratoryjną.
    5. Umieścić 100 μl komórek na płytkach agarowych LB zawierających odpowiedni antybiotyk i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w pozycji odwróconej.
    6. Wykonaj testy ekspresji na małą skalę, zaszczepiając 5 ml kultury antybiotyku LB+ pojedynczą kolonią. Powtórz dla 5-10 kolonii.
      Uwaga: Ze względu na potencjalną toksyczność OMP w β beczkach i zależność od podstawowych poziomów ekspresji, czasami obserwuje się zmienność między koloniami. W związku z tym zaleca się badanie przesiewowe wielu kolonii dla każdego badanego konstruktu. W przypadku testów ekspresji na małą skalę, zamiast konwencjonalnych kultur 5 ml, sugeruje się hodowlę 25 ml kultur w 125 ml kolbach Erlenmeyera z przegrodami. Warunki te często lepiej odzwierciedlają to, co wydarzy się przy wzroście na dużą skalę. Dodatkowo dobrym pomysłem jest również badanie przesiewowe różnych rodzajów pożywek hodowlanych (TB, LB, 2xYT, M9 itp.), ponieważ odnotowano różne poziomy sukcesu w zależności od białka docelowego.
      1. Rosnąć w temperaturze 37 ºC z wytrząsaniem do OD600 ~0,6.
      2. Wywołać ekspresję docelowego OMP poprzez dodanie 5 μl 1 M izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do każdej probówki hodowlanej i pozostawić do wzrostu przez dodatkowe 1-2 godziny.
      3. Porównaj poziomy ekspresji dla wszystkich kolonii, odwirowując 1 ml każdej kultury (OD600 ~0,6) przez 1 minutę przy 15 000 x g za pomocą mikrowirówki.
      4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl 1x bufora ładującego SDS-PAGE. Ogrzewać w temperaturze 100 ºC przez 5 minut, a następnie ponownie odwirowywać w temperaturze 15 000 x g przez 5 minut.
      5. Analizować próbki za pomocą SDS-PAGE, pipetując 20 μl do każdego dołka 10% żelu. Uruchom żel przez 35 minut przy stałym napięciu 200 V.
        Uwaga: W tym momencie korzystne byłoby określenie, czy docelowe białko jest prawidłowo składane, czy nie. Często można to osiągnąć, wykonując oczyszczanie na małą skalę lub testując modyfikowalność cieplną.
    7. Wybierz kolonię wykazującą najlepszą ekspresję i wykonaj ekspresję na dużą skalę, używając 12-24 L medium.
      Uwaga: Konwencjonalne metody zazwyczaj polegają na wzroście kultur w temperaturze 37 ºC z wytrząsaniem do OD600 ~0,6, a następnie indukowaniu odpowiednim induktorem (tj. 0,1-1 mM dla IPTG lub ~0,2% dla arabinozy) przez dodatkowe 2-4 godziny. W razie potrzeby, przed indukcją, obniż temperaturę do zaledwie 20 °C i wydłuż czas indukcji.
      1. W przypadku metody nieszczelnej ekspresji, hodować 25 ml kultury inokulacyjnej w temperaturze 37 °C w pożywce LB zawierającej odpowiedni antybiotyk (antybiotyki), aż OD600 osiągnie ~0,6. Następnie dodać 1 ml inokulatu do dwunastu 1-litrowych kolb pożywki gruźliczej plus antybiotyk(i) i rosnąć w temperaturze 20 °C do nasycenia (~3 dni).
    8. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 6 000 x g przez 10 minut.
    9. Przejść do etapu oczyszczania opisanego w sekcji 2.1 lub zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.
  3. Ekspresja do inkluzji ciała do ponownego składania in vitro
    1. Użyj analizy sekwencjonowania, aby sprawdzić, czy konstrukcja wyrażenia nie zawiera sekwencji sygnału. Brak sekwencji sygnałowej skieruje białko docelowe do akumulacji w cytozolu w postaci ciał inkluzyjnych.
    2. Przekształć konstrukcję wyrażenia w szczep wyrażenia bakterii na potrzeby ekspresji. W celu inkluzji ekspresji ciała najlepiej jest kontrolować ekspresję przez indukcję (tj. IPTG, arabinozę itp.), aby zminimalizować możliwe skutki toksyczności.
    3. Umieścić 100 μl przekształconych komórek na płytkach agarowych LB zawierających odpowiedni antybiotyk i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w pozycji odwróconej.
    4. Wykonaj testy ekspresji na małą skalę, zaszczepiając 5 ml kultury antybiotyku LB+ pojedynczą kolonią.
    5. Powtórz krok 1.3.4 dla 2-4 dodatkowych kolonii.
    6. Rosnąć w temperaturze 37 ºC z wytrząsaniem do OD600 ~0,6.
    7. Indukować za pomocą odpowiedniego induktora przez 1-2 godziny.
    8. Porównaj poziomy ekspresji dla wszystkich kolonii poprzez analizę za pomocą SDS-PAGE (patrz krok 1.2.6). Wybierz kolonię wykazującą najlepszą ekspresję i wykonaj ekspresję na dużą skalę przy użyciu 12-24 l podłoża.
      1. Hodować komórki w temperaturze 37 °C do OD600 0,6-0,8 i indukować w temperaturze 37 °C przez 3-5 godzin. Podczas gdy ekspresja ciał inkluzyjnych jest bardziej odporna niż inne rodzaje ekspresji, podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów z ekspresją białek, ekspresję można poprawić poprzez zmianę pożywki wzrostowej, czasu indukcji, temperatury indukcji i stężenia czynnika indukującego.
    9. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 6 000 x g przez 10 minut.
    10. Przejść do etapu oczyszczania ppkt 2.2 lub zamrozić osad komórkowy w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.

2. Oczyszczanie

  1. Izolacja od frakcji membranowych
    Uwaga: W przeciwieństwie do białek rozpuszczalnych, integralne białka błonowe są osadzone w dwuwarstwie lipidowej i dlatego wymagają detergentów do ich ekstrakcji w celu dalszego oczyszczania i analizy (ryc. 5). Po ekspresji, pierwszym etapem oczyszczania OMP z β beczki jest ekstrakcja z frakcji membranowej.
    1. Ponownie zawiesić komórki w buforze do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 μg/ml AEBSF, 5 μg/ml DNazy I) w stosunku 5 ml/g pasty komórkowej.
    2. Lizować komórki za pomocą prasy francuskiej lub homogenizatora komórkowego. Wirować lizowane komórki w temperaturze 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 ºC, aby usunąć niezlizowane komórki i resztki komórek.
    3. Przenieść supernatant do czystej probówki i ponownie odwirować z dużą prędkością (200 000 x g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Powstały osad jest frakcją błonową, która zawiera interesujące białko.
    4. Za pomocą homogenizatora odbitkowego ponownie zawiesić frakcję membranową, najpierw przenosząc membrany, a następnie dodając bufor solubilizacyjny (50 mM KH2PO4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) (50 ml na komórki 20 g) w stężeniu 2x, bez detergentu.
    5. Wlać zawieszone membrany do małej zlewki i powoli dodawać detergent (tj. n-dodecylo-β-D-maltozyd (DDM), N-tlenek laurylodimetyloaminy (LDAO), n-oktylo-β-D-glukopiranozyd (OG), Triton X-100 itp.) do końcowego stężenia ~10x krytycznego stężenia miceli (CMC).
    6. Napełnij wodą aż do końcowego stężenia 1x bufor do rozpuszczania. Mieszać przez 0,5-16 godzin w temperaturze 4 ºC, w zależności od tego, jak łatwo docelowe białko jest ekstrahowane z błon.
      Uwaga: Detergent służy do powolnego rozpuszczania błon w celu ekstrakcji białka docelowego. Istnieją 3 rodzaje detergentów, które można tutaj stosować: jonowe (SDS, kwas dezoksycholowy), niejonowe (Elugent, TWEEN, Triton X-100, OG, DDM) i opuchnieornojonowe (LDAO, CHAPS). Kompleks białkowo-detergentowy, który jest stabilny i monodyspersyjny na etapie oczyszczania, znacznie pomoże w powodzeniu krystalizacji białek błonowych. Więcej informacji na temat detergentów, ich właściwości, informacji o CMC i ich zastosowaniu w oczyszczaniu białek błonowych i innych zastosowaniach można znaleźć na stronach internetowych dostawców komercyjnych.
    7. Rozpuszczoną próbkę odwirować w temperaturze 300 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Supernatant zawiera teraz rozpuszczony w detergentach OMP z β cylindrycznej tarczy.
    8. Postępuj zgodnie z sekcją 2.3 zgodnie z poniższym opisem.
  2. Składanie z organów inkluzyjnych
    Uwaga: W przypadku ponownego składania in vitro, OMP z β lufy docelowej jest wyrażany bezpośrednio w ciałach inkluzyjnych. Jedną z zalet jest to, że białka te mogą być wytwarzane na wysokich poziomach. Wadą jest jednak to, że ponowne składanie jest często nieefektywne i różni się w zależności od eksperymentu z ponownym składaniem. Mimo to istnieje wiele przykładów białek, które zostały z powodzeniem ponownie sfałdowane do badań strukturalnych. Po wyrażeniu w ciałach inkluzyjnych, należy teraz wyizolować ciała inkluzji w celu eksperymentów z ponownym fałdowaniem.
    1. Zawieś komórki w buforze do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 μg/ml AEBSF, 5 μg/ml DNazy I, 4 mM 2-merkaptoetanolu (BME)) (5 ml na g pasty komórkowej). Lizować za pomocą prasy francuskiej, sonikacji lub homogenizatora komórkowego.
    2. Osadzać korpusy wtrąceń przez wirowanie z małą prędkością przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ºC.
    3. Przemyć inkluzje przez ponowne wymieszanie w 25 ml 1,0 M mocznika za pomocą homogenizatora z beczki. Ponownie granulować przez wirowanie z małą prędkością przy 6.000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ºC.
    4. W razie potrzeby powtórz krok 2.2.3.
    5. Zawiesić przemyte ciała inkluzyjne do końcowego stężenia 10 mg/ml przy użyciu buforu zawierającego 8,0 M mocznika (lub 6,0 M chlorowodorku guanidyny (GdCl)) plus detergent (tj. DDM lub LDAO) przy 2x CMC lub więcej.
      Uwaga: W razie potrzeby, w przypadku docelowych białek błonowych zawierających znacznik histydyny, oczyszczanie metodą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metali (IMAC) można przeprowadzić przy użyciu warunków denaturacji (w 8,0 M moczniku lub 6,0 M GdCl) jako wstępny etap podobny do opisanego poniżej w sekcji 2.3.
    6. Przeprowadzić reakcję ponownego fałdowania, powoli (przez noc) usuwając denaturant za pomocą dializy w buforze bez denaturantu.
      Uwaga: W tym celu może być konieczne kilka zmian bufora dializacyjnego. Alternatywnie, jeśli ciała inkluzji są najpierw powiązane z kolumną IMAC, można przeprowadzić reakcję ponownego składania, nadal będąc związanym z kolumną, powoli wymieniając w celu usunięcia denaturantu. W obu przypadkach należy pamiętać, że jest to białko błonowe, dlatego detergent musi być obecny, aby ustabilizować cel. Ponadto, jeśli używany detergent nadaje się do dializacji, należy go również dodać do buforu () do dializy.
    7. Ponownie złożone próbki należy obracać w temperaturze 200 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 ºC. Supernatant zawiera ponownie złożoną, rozpuszczoną w β cylindryczną tarczę OMP.
    8. Postępuj zgodnie z sekcją 2.3 zgodnie z poniższym opisem.
  3. Oczyszczanie za pomocą IMAC, wymiany jonowej i filtracji żelowej
    Uwaga: Zakładając, że białko zostało zmodyfikowane ze znacznikiem histydyny, niezależnie od tego, czy jest natywnie wyrażane, czy ponownie fałdowane przy użyciu metod in vitro, przeprowadza się immobilizowaną chromatografię powinowactwa do metalu (IMAC) w celu oczyszczenia, podobnie jak w przypadku rozpuszczalnych białek znakowanych histydyną, z wyjątkiem tego, że detergent musi być przechowywany we wszystkich kolejnych, aby utrzymać rozpuszczony i stabilny OMP w β-beczkowej.
    1. Przygotuj kolumnę IMAC o pojemności 1-5 ml lub użyj wstępnie zapakowanej kolumny. Wykonać kolejne etapy chromatografii w temperaturze 4 °C. Przepłukać wodą w celu usunięcia wszelkich śladów środków konserwujących. Jeśli korzystasz z automatycznego systemu oczyszczania, zainstaluj kolumnę zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przygotuj 500 ml buforu IMAC A (50 mM K2HPO4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) i 250 ml buforu IMAC B (50 mM K2HPO4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM i 1,0 M imidazolu).
      Uwaga: Inne detergenty, które mogą być używane, to Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%) i LDAO (0,05%).
    3. Zrównoważ kolumnę IMAC przy użyciu 10 woluminów kolumn buforu A IMAC.
    4. Dodać imidazol do próbki białka do końcowego stężenia 25 mM i wymieszać. Załadować próbkę do zrównoważonej kolumny IMAC z prędkością 2 ml/min. Zbierz przepływ.
    5. Przemyć kolumnę IMAC 5 objętościami kolumny, z których każda ma rosnące stężenie imidazolu, używając buforu B (tj. 25 mM, 50 mM, 100 mM). Zebrać popłuczyny we frakcjach o pojemności 2 ml.
    6. Eluować próbkę o końcowym stężeniu 250 mM dla 5 objętości kolumny. Zebrać eluowaną próbkę we frakcjach o objętości 2 ml.
    7. Przeanalizować przepływ, frakcje płuczące i frakcje elucyjne za pomocą analizy SDS-PAGE (patrz etap 1.2.6) w oparciu o ich absorbancję przy 280 nm. Zbierz frakcje zawierające docelowy OMP β-barrel, zweryfikowane za pomocą analizy SDS-PAGE.
    8. Usunąć znacznik 6x-histydyna, dodając proteazę TEV do próbki zbiorczej (zgodnie z protokołem producenta) i inkubując przez noc w temperaturze 4 ºC z delikatnym kołysaniem.
    9. Załaduj próbkę/roztwór proteazy ponownie do kolumny IMAC, aby oddzielić docelowy OMP (przepływ) z β beczki od rozszczepionych znaczników i wszelkich nieutwardzonych próbek. Przepływ będzie zawierał rozszczepioną próbkę bez znacznika.
      Uwaga: Usunęłoby to również wszelkie proteazy, takie jak TEV-His, która sama w sobie ma nierozszczepialny znacznik 6x-histydyny. W przeciwnym razie potrzebne będą inne metody, aby usunąć proteazę po trawieniu.
    10. Opcjonalnie należy przeprowadzić chromatografię jonowymienną w celu dalszego oczyszczenia próbki. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla kolumny, która ma być używana, pamiętając o dołączeniu detergentu do wszystkich.
    11. Aby przygotować się do krystalizacji, należy załadować próbkę do żelowej kolumny filtracyjnej do buforu zawierającego detergent, który ma być użyty do krystalizacji, takiego jak 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
    12. Zebrać frakcje o wielkości 1 ml i przeanalizować za pomocą analizy SDS-PAGE (patrz krok 1.2.6) w oparciu o ich absorbancję przy 280 nm. Frakcje pulowe o absorbancji przy 280 nm, ponieważ zawierają białko docelowe. Koncentrat do ~10 mg/ml.
      Uwaga: W razie potrzeby prawidłowe składanie można ocenić za pomocą testu modyfikowalności cieplnej, jak opisano poniżej.
  4. Test modyfikacji cieplnej
    Uwaga: Jedną z metod monitorowania prawidłowego składania oczyszczonych OMP z β luf jest przeprowadzenie testów modyfikowalności cieplnej przy użyciu półnatywnej karty SDS-PAGE22. W tym przypadku nieogrzewane próbki, które są prawidłowo złożone, zazwyczaj migrują inaczej niż te, które są denaturowane termicznie. Ta właściwość jest unikalna dla OMP z β lufami i jest szeroko stosowana do badania tej rodziny białek błonowych.
    1. Przed przygotowaniem próbek należy zmontować aparat żelowy. Na początek umieść zbiornik buforowy w pojemniku na lód i całkowicie otocz lodem. Włóż własny odlew lub komercyjny natywny żel gradientowy do uchwytu i umieść w zbiorniku. Napełnij zbiornik całkowicie zimnym 1x buforem do biegania MES (50 mM kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy, 50 mM zasada Tris, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
    2. Odpipetować 0,25 μl próbki (10 mg/ml) do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Oznacz jeden jako "Gotowany", a drugi jako "RT".
    3. Do każdego z nich dodać 9,75 μl buforu do próbki i wymieszać pipetując. Do obu próbek dodać 10 μl buforu ładującego 2x SDS (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% błękitu bromofenolowego i 20% glicerolu) i delikatnie wymieszać pipetując.
    4. Gotować "ugotowaną" próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut, pozostawiając próbkę "RT" w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować "ugotowaną" próbkę.
    5. Załadować 20 μl obu próbek na wstępnie zmontowany żel natywny. Uruchom przez 60 minut przy stałym napięciu 150 V. Usuń żel i zanurz go w roztworze barwiącym, aby zobrazować wyniki.

3. Krystalizacja

Uwaga: Dla krystalizacji zarówno rozpuszczalnych, jak i błonowych celów białkowych, standardowym protokołem maksymalizującym czystość i stabilność próbki (tj. najlepszy detergent, ligandy, kofaktory, itp.). Obecna metodologia krystalizacji celów białkowych błonowych ogólnie obejmuje trzy główne podejścia, które spełniają wymagania amfifilowe białek osadzonych w dwóch warstwach: (1) detergent, (2) bicelle i (3) lipidowa faza sześcienna (LCP) (Figura 6)23. Zdecydowanie zaleca się użycie robota krystalizującego o pojemności nanolitrów, jeśli to możliwe, w celu zwiększenia liczby warunków, które można przebadać dla danej objętości próbki, a także w celu wykorzystania najnowszych osiągnięć w narzędziach wspomagających określanie struktury (ryc. 7).

  1. Krystalizacja przy użyciu detergentów
    1. Otrzymać próbkę białka rozpuszczoną w detergentie o stężeniu ~10 mg/ml. Opcjonalnie dodać dodatek 1,2,3-heptanetriol bezpośrednio do próbki do końcowego stężenia 3%, aby zmniejszyć rozmiar miceli detergentu.
    2. Przefiltrować próbkę za pomocą filtra odśrodkowego 0,22 μm w celu usunięcia cząstek stałych i opadów.
    3. Za pomocą robota krystalizacyjnego wykonaj badanie przesiewowe krystalizacji na szerokiej matrycy przy użyciu dostępnych na rynku 96 sit dołkowych metodą parowania w pozycji wiszącej lub siedzącej z kroplami składającymi się z próbki białka ~200 nl i buforu krystalizacyjnego ~200 nl.
    4. Inkubować płytki krystaliczne w temperaturze ~21 °C. Co tydzień sprawdzać płytki pod kątem wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    5. Zoptymalizuj czynniki krystalizacji poprzez systematyczne zmienianie składników warunków krystalizacji (zwiększanie/zmniejszanie stężeń soli lub środków strącających, pH buforu, temperatura inkubacji i/lub stężenie białka).
  2. Krystalizacja za pomocą Bicelles
    Uwaga: Bardziej szczegółowa demonstracja technik bicelle została wcześniej opisana przez Ujwala i Abramsona24.
    1. Przygotuj lub kup 35% mieszaninę bicelle składającą się z DMPC:CHAPSO w stosunku 2,8:1 zgodnie z opublikowanymi protokołami25. W razie potrzeby można również oznaczyć inne stężenia, a także inne lipidy i detergenty.
    2. Otrzymać próbkę białka rozpuszczoną w detergentie o stężeniu ~10 mg/ml.
    3. Dodać mieszaninę bicelle na lodzie w stosunku wyjściowym 4:1 v/v (białko:bicelle) (np. dodać 10 μl mieszanki bicelle do 40 μl białka i szybko wymieszać pipetując).
    4. Inkubować na lodzie 30-60 min.
      Uwaga: Roztwór białkowo-bicellowy powinien pozostać w większości klarowny, ale często może stać się lekko nieprzezroczysty. Jeśli jednak roztwór białkowo-bikielowy zmieni kolor na mlecznobiały, wskazując na wytrącanie się, należy oznaczyć inne zmienne (tj. detergent, bufor itp.). W przypadku nowych próbek zaleca się wykonanie testów na małą skalę (8 μl białka i 2 μl bicele) w celu sprawdzenia stabilności przed zwiększeniem skali, aby zapobiec niepotrzebnej utracie próbki.
    5. Za pomocą robota krystalizacyjnego wykonaj badanie przesiewowe krystalizacji na szerokiej matrycy przy użyciu dostępnych na rynku 96 sit dołkowych metodą parowania w pozycji wiszącej lub siedzącej z kroplami składającymi się z próbki białka ~200 nl i buforu krystalizacyjnego ~200 nl.
    6. Inkubować płytki krystaliczne w temperaturze ~21 °C. Co tydzień sprawdzać płytki pod kątem wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    7. Zoptymalizuj czynniki krystalizacji poprzez systematyczne zmienianie składników warunków krystalizacji (zwiększanie/zmniejszanie stężeń soli lub środków strącających, pH buforu, temperatura inkubacji i/lub stężenie białka).
  3. Krystalizacja przy użyciu lipidowej fazy sześciennej (LCP)
    Uwaga: Bardziej szczegółowa demonstracja technik LCP została wcześniej opisana przez Liu i Cherezov26,27.
    1. Otrzymać próbkę białka rozpuszczoną w detergentie o stężeniu ~20 mg/ml.
    2. Podgrzej monooleinę do temperatury ~40 ºC. Załaduj 60 μl monooleiny do jednej gazoszczelnej strzykawki o pojemności 100 μl i 40 μl próbki białka do drugiej.
    3. Za pomocą łącznika do mieszania połączyć strzykawki, uważając, aby nie wprowadzić powietrza.
    4. Delikatnie wymieszać, wywierając naprzemienny nacisk na tłoki strzykawki, przepychając mieszaninę z jednej strzykawki do drugiej, aż próbka stanie się półprzezroczysta i jednorodna.
    5. Korzystając z robota krystalizacyjnego zaprojektowanego do metod LCP, należy przeprowadzić przesiewanie krystalizacji na szerokiej matrycy przy użyciu dostępnych na rynku 96-dołkowych ekranów z płytkami krystalizacyjnymi typu sandwich (grubość dołka 0,1 mm) z kroplami złożonymi z próbki białka 100 nl i buforu krystalizacyjnego 750 nl.
      Uwaga: Współczynniki upuszczania można dostosować w razie potrzeby. Zalecane są również solidne pokrywy (tj. Szkło lub gruby plastik), które ładnie podtrzymują krople, a nie cienkie folie, które mają tendencję do umożliwiania kroplom poruszania się po studni podczas obchodzenia się z płytkami.
    6. Inkubować płytki krystaliczne w temperaturze ~21 °C. Co tydzień sprawdzać płytki pod kątem wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    7. Zoptymalizuj czynniki krystalizacji poprzez systematyczne zmienianie składników warunków krystalizacji (zwiększanie/zmniejszanie stężeń soli lub środków strącających, pH buforu, temperatura inkubacji i/lub stężenie białka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YiuR to transporter żelaza zależny od TonB, który jest przypuszczalnym celem szczepionki przeciwko Yersinia pestis. Pierwotnie został zidentyfikowany za pomocą testu mikromacierzy. W tym miejscu przedstawiono kroki, które zostały podjęte w celu określenia struktury YiuR za pomocą krystalografii rentgenowskiej (ryc. 9). W przypadku klonowania, sekwencja DNA YiuR (bez N-końcowej sekwencji sygnałowej) została amplifikowana PCR z genomowego DNA i subklonowana do wekt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-beczkowe OMP odgrywają istotną rolę w bakteriach Gram-ujemnych, mitochondriach i chloroplastach i są ważnymi celami analizy strukturalnej, która oferuje bogactwo informacji na temat podstawowych mechanizmów molekularnych w zewnętrznych błonach tych odpowiednich organelli. Jednak wyprodukowanie wystarczającej ilości próbki do analizy strukturalnej nie zawsze jest proste, dlatego przedstawiono ogólny rurociąg produkcji wystarczającej ilości docelowych β-beczkowych OMP do określenia struktury, szczegółowo wyjaśniając proc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Herve Celii z CNRS za dostarczenie zdjęć UV oraz Chrisowi Dettmarowi i Garthowi Simpsonowi z Wydziału Chemii Uniwersytetu Purdue za dostarczenie obrazów SONICC. Chcielibyśmy podziękować za dofinansowanie z Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowego i Nerek oraz Programu Badań Wewnętrznych w Narodowych Instytutach Zdrowia. Ponadto chcielibyśmy podziękować za dodatkowe fundusze z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (A.M.S. i C.J.), Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (N.N. 1K22AI113078-01) oraz Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue (N.N.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Robot krystalizacyjnyTTP Labtech, Art Robbins-Anypowinien tu pracować, z wyjątkiem termocyklera do krystalizacji LCP
PCREppendorf,BioRad-Media
ShakerNew Brunswick,HT-UV-vis
aparatu Eppendorf-SDS-PAGE
BioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE i natywne żeleBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGEHealthcare-AkTA
PurifierGEHealthcare-Mikrowirówka
Eppendorf
Wirówka (niska-średnia prędkość)Beckman-Coulter-Ultrawirówka
(wysoka prędkość) WirnikBeckman-Coulter-SS34
Wirnik Sorvall-Type
45 Ti WirnikBeckman-Coulter-Type
70 Ti HomogenizatorBeckman-Coulter-Dounce
Fisher Scientific06 435C
Emulsiflex
Narzędzia LCP SigmaD9652
Hamilton, TTPLabtech-VDX
24-dołkowe płytkiHampton ResearchHR3-172
Płytki warstwoweHampton Research, Wymiary molekularneHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Arkusze krystalizacjiGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HRkolumna GE Healthcare17-1167-01
Kolumna Q-SepharoseGE Healthcare17-0510-01
Ekrany krystalizacjiHampton Research, Qiagen, Wymiary molekularne-Strzykawka
gazoszczelna (100 ml)Hamilton 
spektrometru Infors Avestin-Dialysis

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383(2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000(2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377(2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510(2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Beta barrel Outer Membrane ProteinsOMP Expression PurificationT7 Expression VectorBL21 DE3 TransformationIPTG InductionSDS PAGE AnalysisIMAC PurificationTEV Protease CleavageGel Filtration ChromatographyCrystallization Trials

Powiązane artykuły