Artykuł metodologiczny

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

16.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53247

⸱

14 września 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEA DSV iRCM SCSR, Laboratoire de Radiopathologie, UMR 967, 2INSERM, UMR 967, 3Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, UMR 967, 4Université Paris Sud, UMR 967, 5CNRS, Université Paris Sud, UMR 9197, Neuroscience Paris-Saclay Institute, Molecules Circuits Department

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Streszczenie

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) w strefie podkomorowej komór bocznych (SVZ) podtrzymują neurogenezę węchową przez całe życie w mózgu ssaków. Kolejno generują komórki wzmacniające tranzyt (TAC) i neuroblasty, które różnicują się w neurony po zintegrowaniu opuszki węchowej. Pojawiające się techniki fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) umożliwiły izolację NSC, a także ich potomstwa i zaczęły rzucać światło na sieci regulacyjne genów w niszach neurogennych dorosłych. Przedstawiamy tutaj technikę sortowania komórek, która pozwala śledzić i odróżniać dynamikę cyklu komórkowego wyżej wymienionych populacji komórek od dorosłego SVZ z potrójnym barwieniem LeX/EGFR/CD24. Wyizolowane komórki są następnie platerowane jako komórki przylegające, aby szczegółowo zbadać progresję ich cyklu komórkowego za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. W tym celu używamy transgenicznego wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI), u których komórki są czerwono-fluorescencyjne podczas fazy G1 z powodu specyficznego dla G1 reportera czerwonego Cdt1. Metoda ta ujawniła niedawno, że proliferujące NSC stopniowo wydłużają swoją fazę G1 podczas starzenia, co prowadzi do upośledzenia neurogenezy. Metoda ta jest łatwa do przeniesienia do innych systemów i może być bardzo interesująca dla badania dynamiki cyklu komórkowego komórek mózgowych w kontekście patologii mózgu.

Wprowadzenie

Spoczynkowe nerwowe komórki macierzyste (NSC) są źródłem neurogenezy u dorosłych1i mogą przekształcić się w swoją proliferacyjną "aktywowaną" formę, wyrażając EGFR (aNSC) 2. Po aktywacji dają początek tranzytowym komórkom amplifikacyjnym (TAC) 3, a następnie neuroblastom, które migrują do opuszki węchowej (OB) przez rurkę astrocytów i ostatecznie różnicują się w neurony4,5. NSC i ich potomstwo są zorganizowane w wyspecjalizowane architektury "niszowe" wzdłuż komór bocznych, co implikuje niezliczone czynniki kontrolujące ich proliferację6. Izolacja i oczyszczenie komórek neurogennych SVZ jest konieczne, aby rzucić światło na złożoną molekularną regulację ich proliferacji, ale przez długi czas pozostawało wyzwaniem ze względu na brak specyficznych markerów i dostosowanych technik.

Nowe podejścia wykorzystujące cytometrię przepływową umożliwiły izolację NSC i ich potomstwa od dorosłego SVZ2,7-11. Używając markera komórek macierzystych LeX12 wraz z markerem neuroblastów CD2413 i fluorescencyjnym EGF do znakowania EGFR na proliferujących komórkach2, niedawno opracowaliśmy strategię FACS pozwalającą na oczyszczenie pięciu głównych populacji neurogennych SVZ: spoczynkowych i aktywowanych NSC, TAC, niedojrzałych i migrujących neuroblastów9. Tutaj szczegółowo opisujemy tę technikę sortowania komórek i sposób, w jaki potrójne barwienie LeX/EGFR/CD24 pozwoliło po raz pierwszy na izolację zarówno spoczynkowych, jak i aktywowanych NSC.

Chociaż neurogeneza utrzymuje się w wieku dorosłym, produkcja nowych neuronów jest drastycznie zmniejszona w starzejącym się mózgu14. Większość badań zgadza się co do postępującego zmniejszania się liczby proliferujących komórek progenitorowych w SGZ i SVZ15-20. Konsekwencje nie są nieszkodliwe, ponieważ związany z wiekiem spadek neurogenezy w SVZ powoduje zmniejszenie liczby nowonarodzonych neuronów w opuszkach węchowych starzejącego się mózgu, co ostatecznie prowadzi do upośledzenia dyskryminacji węchowej u starszych myszy18. Wyjaśnienie kinetyki cyklu komórkowego neuronalnych komórek progenitorowych jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw ewolucji neurogenezy u dorosłych podczas starzenia się. Ostatnie badania dotyczyły cyklu komórkowego i progresji linii dorosłych nerwowych komórek macierzystych in vitro21 i in vivo22, ale żadne z nich nie wykorzystywało technik sortowania komórek i genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond cyklu komórkowego w celu wizualizacji faz cyklu komórkowego izolowanych komórek na poziomie pojedynczej komórki.

Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje transgeniczne myszy FUCCI, w których komórki są fluorescencyjne podczas swojego cyklu komórkowego, co pozwala na rozróżnienie między fazami G1 i S-G2/M 23. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób prospektywna izolacja NSC i ich potomstwa od dorosłych myszy FUCCI w połączeniu z poklatkową mikroskopią wideo umożliwia badanie dynamiki cyklu komórkowego na poziomie pojedynczej komórki.

Protokół

Ten protokół został opracowany zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z 24 listopada 1986 roku (86/609/EWG) i został zatwierdzony przez nasz instytucjonalny komitet ds. dobrostanu zwierząt (CETEA-CEA DSV IdF).

1. Podstawowe ustawienia przed hodowlą i wideomikroskopią

  1. Użyj szklanych płytek hodowlanych lub płytek μ do konfokalnej mikroskopii wideo. W przypadku 1 - 5 x 103 komórek/dołka użyj płytek 96-dołkowych i płytek 24-dołkowych dla więcej niż 5 x 103 komórek/basenik.
  2. Co najmniej jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować sterylne płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL) do przylegających kultur jednowarstwowych. Dodać tyle PDL (10 μg/ml w dH2O), aby pokryć dno każdej studzienki i inkubować O/N w temperaturze 37 °C. Usunąć roztwór PDL i przepłukać trzykrotniedH2O, zanim pozostawić płytkę do wyschnięcia w kapturze przez co najmniej 2 godziny przy przepływie laminarnym. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyta, należy przechowywać powlekaną płytkę w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować pożywkę hodowlaną, mieszając pożywkę podstawową NSC i suplement proliferacyjny NSC w stosunku 9:1 (patrz tabela materiałów) wraz z 2 μg/ml heparyny, 20 ng/ml oczyszczonego ludzkiego rekombinowanego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 10 ng/ml ludzkiego rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2). Przed użyciem podgrzać pożywkę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  4. Do dysocjacji SVZ przygotuj roztwór papainy: 1 mg/ml papainy (15 UI/ml) w roztworze soli Earl's Balance (EBSS) zawierającym 0,2 mg/ml L-cysteiny, 0,2 mg/ml EDTA i 0,01 mg/ml DNazy I w PBS. Wysterylizuj roztwór, przechodząc przez filtr 0,2 μm. Przed użyciem wyrównać roztwór w temperaturze 37 °C.
  5. Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, należy przygotować roztwór inhibitora proteazy (Ovomucoid): DMEM:F12 pożywka zawierająca 0,7 mg/ml inhibitora trypsyny typu II. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm.
  6. Przygotować 0,6% roztwór glukozy PBS do zebrania mózgów i 0,15% roztwór BSA PBS do etapów mycia i barwienia przeciwciał.
  7. Przygotuj narzędzia preparacyjne: nożyczki, kleszcze preparujące i wiążące, skalpel. Namocz je w 70% etanolu.

2. Pobieranie mózgów dorosłych myszy i mikrodysekcje SVZ

  1. Uśmierc dorosłe myszy FUCCI23 (w wieku od 2 do 3 miesięcy i/lub 12-miesięczne do badań starzenia) wykonujące zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Spryskaj mysz 70% etanolem i odetnij głowę ostrymi nożyczkami.
  3. Wykonaj nacięcie wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
  4. Wykonaj podłużne cięcie linii środkowej, zaczynając od podstawy czaszki w kierunku opuszki węchowej za pomocą małych nożyczek. Upewnij się, że nie uszkodzisz leżącego pod spodem mózgu ostrzami nożyczek. Usuń górną otwartą część czaszki za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić mózg.
  5. Zbierz mózg na 15-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 0,6% glukozy w PBS.
  6. Wypreparuj opuszki węchowe. Umieść mózg na jego grzbietowej powierzchni i wykonaj przekrój koronalny przez skrzyżowanie wzrokowe za pomocą skalpela.
  7. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść rostralną część części mózgu tak, aby przecięta powierzchnia koronowa była skierowana do góry w kierunku eksperymentatora.
  8. Aby wypreparować SVZ, usuń przegrodę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków, a następnie włóż jedną końcówkę cienkich kleszczyków do prążkowia bezpośrednio przylegającego do komory i odłącz SVZ od otaczającej tkanki. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zapoznaj się z Azari i wsp.24. Umieść rozcięty SVZ na szalce Petriego zawierającej 1 ml PBS-0,6% glukozy.

3. Dysocjacja tkanek SVZ

  1. Zmiel rozcięty SVZ na szalce Petriego, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.
  2. Przenieś zmieloną tkankę wraz z PBS-0,6% glukozy do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 200 x g przez 5 minut.
  3. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej papainy (1 mg/ml, przygotowanej w kroku 1.4) uzupełnionej 0,01 mg/ml DNazy I. Inkubować przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Użyć 1 ml papainy na mysz.
  4. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  5. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego ovomucoidu (0,7 mg/ml, przygotowanego w kroku 1.5), aby zatrzymać aktywność papainy. Mechanicznie zdysocjuj zmieloną tkankę dalej w zawiesinę jednokomórkową, delikatnie pipetując 20 razy w górę i w dół przez końcówkę mikropipety p1000. Unikaj pęcherzyków powietrza.
  6. Przepuść zawiesinę komórkową przez sterylny filtr 20 μm w nowej probówce o pojemności 15 ml. Pamiętaj, aby umyć filtr komórkowy PBS 0.15% BSA, aby uniknąć utraty komórek.
  7. Wirować przy 200 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS zawierającego 0,15% BSA.

4. Barwienie immunofluorescencyjne do sortowania komórek

Do sortowania komórek za pomocą myszy FUCCI-Red (Rysunek 2A), użyj następujących przeciwciał: CD24 koniugat fikoerytryny-cyjaniny [PC7] ; CD15/LeX sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny [FITC] i ligandem EGF sprzężonym z Ax647.

Uwaga: Komórki LeX+EGFR+ i komórki EGFR+ nie występują w obfitości u dorosłego SVZ: ≈ odpowiednio 600 i 1500 komórek/mysz9. Zalecamy łączenie komórek SVZ od 2 do 3 myszy, aby mieć wystarczającą ilość materiału. Nie pracuj z więcej niż 12 myszami tego samego dnia, aby czas sortowania komórek nie przekraczał 3 godzin. Należy pamiętać, że praca ze zbyt dużą liczbą myszy tego samego dnia doprowadzi do wydłużenia czasu sortowania komórek, co może skutkować zwiększoną śmiercią komórek i/lub różnicowaniem komórek.

  1. Wykonaj barwienie FACS w 100 μl PBS 0,15% BSA na mysz (lub w 200 μl dla grupy od 2 do 3 myszy w celu optymalnego barwienia).
  2. Przygotować probówki kontrolne. Użyj koralików kompensacyjnych, aby przygotować pojedyncze rurki kontrolne koloru zgodnie z protokołem producenta. Wybierz frakcję komórek (wystarczy 1/10 komórek wyekstrahowanych od jednej myszy) i rozdziel ją na 4 probówki, aby przygotować 1 probówkę kontroli ujemnej (nieoznaczone komórki) i 3 probówki kontrolne fluorescencyjne minus jedna (FMO). Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS 0,15% BSA na probówkę.
    Wskazówka: W przypadku kontroli LeX-FITC FMO oznacz komórki ligandem EGF sprzężonym z CD24-PC7 (1:50) i Ax647 (1:200); w przypadku kontroli FMO CD24-PC7 oznacz komórki ligandem EGF sprzężonym z CD15 / LeX-FITC (1:50) i Ax647 (1:200), a w przypadku kontroli FMO liganda EGF sprzężonego z Ax647 oznacz komórki CD15 / LeX-FITC (1:50) i CD24-PC7 (1:50).
  3. Do probówek używanych do sortowania komórek należy stosować następujące przeciwciała we wskazanym rozcieńczeniu w PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) i ligand EGF sprzężony z Ax647 (1:200).
  4. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przemyć 1 ml PBS 0,15% BSA i odwirować przy 200 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS 0,15% BSA na mózg. Trzymaj probówki do sortowania komórek na lodzie i natychmiast przystąp do sortowania komórek.
  5. W przypadku korzystania z myszy FUCCI-Green, oddziel frakcje LeX-dodatnie i LeX-ujemne za pomocą kolumn separacyjnych przed sortowaniem komórek, ponieważ przeciwciało LeX-FITC ma tę samą długość fali emisyjnej, co fluorescencja FUCCI-zielona (Figura 3A, B).
    1. Najpierw oznacz komórki mysim przeciwciałem anty-ludzkim LeX (1:50) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności w 100 μl PBS 0,15% BSA.
    2. Przemyć komórki 1 ml PBS 0,15% BSA i odwirować przy 200 x g przez 10 minut, a następnie oznaczyć komórki mikrogranulkami anty-mysim IgM (1:10) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    3. Umyć komórki 1 ml PBS 0,15% BSA i odwirować przy 200 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS 0,15% BSA i przelać komórki przez kolumnę separacyjną w polu magnetycznym, jak schematycznie pokazano na rysunku 3 C. Przemyć kolumnę 1 ml PBS 0,15% BSA w celu uzyskania frakcji ujemnej LeX.
    4. Aby uzyskać frakcję LeX-dodatnią, należy usunąć kolumnę separacyjną z pola magnetycznego i wymyć komórki za pomocą 2 ml PBS 0,15% BSA.
    5. Przejść do barwienia ligandów EGF sprzężonych z CD24-PC7 i Ax647, jak wskazano w 4.2.

5. Sortowanie komórek

Uwaga: Komórki zostały posortowane na sorterze FACS przy 40 Psi z makaronem 86 μm. Fluorescencję zebrano przy użyciu zestawu filtrów: 520/35nm (FITC), 575/26nm (PE), 670/20nm (Ax647) i 740LP (PC7). Kompensacja jest konieczna, aby zapobiec sygnałom fałszywie dodatnim, ponieważ widma emisyjne czerwonej fluorescencji FUCCI i barwnika PC7 nakładają się na siebie.

  1. Bezpośrednio przed sortowaniem komórek dodaj niezbędny barwnik, aby odróżnić żywe komórki od martwych. Użyliśmy HO (patrz tabela materiałów) w stężeniu końcowym 2 μg/ml. Przeprowadź probówkę kontroli ujemnej (nieoznaczone komórki) przez sorter FACS i wybierz komórki za pomocą parametrów rozpraszania bocznego (SSC) i rozpraszania do przodu (FSC) (Rysunek 1A).
    UWAGA: Martwe komórki zostały wykluczone przez bramkowanie tylko frakcji ujemnej HO (Rysunek 1A'), a następnie dublety zostały wykluczone, wybierając frakcję ujemną szerokości impulsu (Rysunek 1A'').
  2. Uruchom pojedyncze kontrolki kolorów przygotowane w kroku 4.2 i w razie potrzeby dostosuj napięcia lampy fotopowielacza (PMT) (np. zbyt wysoka populacja ujemna i/lub dodatnie ogniwa poza skalą). Wykonaj kompensację kolorów w oknie kompensacji oprogramowania.
  3. Uruchom kontrolki FMO przygotowane w kroku 4.2 (sterowanie LeX-FITC FMO, sterowanie FMO CD24-PC7 i sterowanie FMO liganda EGF sprzężone z Ax647) i narysuj bramki sortujące (rysunek 1). Posortuj komórki bezpośrednio do 100 μl pożywki hodowlanej w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml.

6. Przygotowanie komórek do mikroskopii

  1. Świeżo posortowane komórki należy poszczepić w gęstości 1-3 x 103 komórki/basenik na 96-dołkowej płytce μ pokrytej poli-D-lizyną z 300 μl pożywki hodowlanej.
  2. Przed badaniem wideomikroskopii należy inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić adhezję komórek.

7. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu

  1. Wykonuj obrazowanie na żywo za pomocą obiektywu Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) na systemie konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego podłączonego do odwróconej komory termostatycznej w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% atmosfery CO2 .
  2. Umieść 96-dołkową płytkę μ we wstępnie ogrzanej i zrównoważonej komorze termostatycznej i załóż pokrywę na termostatowaną pokrywę.
  3. Otwórz oprogramowanie NIS-Elements i kliknij na pasku menu "Przejęcie/Kontrola akwizycji/Akwizycja ND", aby wybrać opcje filmu poklatkowego (długość, pozycje etapu, konfokalne sekcje z,...), "Przejęcie/Kontrola akwizycji/Ti Pad", aby wybrać cele i "Przejęcie/Kontrola akwizycji/Ustawienia A1plus", aby wybrać poziom PMT dla każdej fluorescencji na pasku menu. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych.
  4. Korzystając z okna akwizycji ND, ustaw środek każdej studzienki jako pozycję stolika i wybierz opcję dużego obrazu na 7 x 7 mm². Spowoduje to utworzenie mozaiki wokół środka każdej studni. Ustaw nakładanie się dużego obrazu mozaiki na 5%. Rób zdjęcia co 20 minut przez 24 godziny. Wybierz obiektyw Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) w oknie Ti Pad.
  5. W oknie Ustawienia A1plus pobierz obrazy za pomocą szybkiego skanera rezonansowego w formacie 512 x 512 pikseli o rozdzielczości 1,26 μm/piksel. Użyj jasnego pola, aby zwizualizować kształty komórek. W przypadku myszy FUCCI-Red wzbudzić czerwoną fluorescencję przy 561 nm i zebrać za pomocą filtra 595/50 nm. W przypadku myszy FUCCI-Green wzbudzić zieloną fluorescencję przy 488 nm i zebrać za pomocą filtra 530/40 nm. Określ optymalny poziom PMT, offset i moc lasera dla każdej długości fali.
    UWAGA: Zalecamy korzystanie z funkcji autofokusa dla kanału jasnego pola, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne ustawianie ostrości w każdej pozycji stage przed każdym akwizycją. Wskazówka: Obiektyw Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) został użyty ze względu na doskonałą rozdzielczość bez konieczności stosowania oleju. W zależności od pożądanej rozdzielczości optycznej można zastosować inne obiektywy.
  6. Wybierz przycisk "Uruchom teraz" w oknie pobierania ND, aby rozpocząć pobieranie.
    Wskazówka: Postępuj zgodnie z pracą komputera przez 1 pętlę, aby upewnić się, że wszystko działa poprawnie.

8. Przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Analizuj dane bezpośrednio w oprogramowaniu NIS-Elements, śledząc poszczególne ogniwa. Wskazówka: Aby zyskać na czasie, zapisz każdą pozycję w .avi formacie za pomocą oprogramowania NIS-Elements i przeanalizuj filmy za pomocą ImageJ.
  2. W oprogramowaniu ImageJ śledź poszczególne komórki przechodzące co najmniej 2 podziały (tj. od jednej komórki do czterokomórkowej kolonii). Przytnij mały obszar wokół komórki i wybierz "Obraz/Duplikat".
  3. Wybierz "Obraz/Stosy/Wykonaj montaż" na pasku menu, aby wykonać montaż. Określ klatki, które mają zostać dołączone, rozmiar obrazów i zapisz montaż jako plik .tif, aby uzyskać optymalną rozdzielczość.
  4. Aby obliczyć długość pierwszej fazy SG2/M (rysunek 2C,D), wybierz pojedynczą czerwoną komórkę fluorescencyjną (w G1), a następnie ustaw t = 0 (faza S rozpocznie się, gdy wyłączy się czerwona fluorescencja). Policz liczbę ramek, po których komórka się podzieli, aby oszacować długość S-G2/M.
    UWAGA: Obliczony czas zależy od odstępu czasu między każdą klatką.
  5. Aby obliczyć następną fazę G1 (rysunek 2C,D), kontynuuj śledzenie komórki, która właśnie się podzieliła. Jeśli podzielona komórka wejdzie w fazę G1, nastąpi akumulacja białka czerwonej fluorescencji cdt1. Oblicz liczbę klatek do ponownego wyłączenia czerwonej fluorescencji dla każdej komórki.
    Wskazówka: Na początku G1 czerwona fluorescencja może być słaba, więc wybierz początek fazy G1 na ramce, w której komórka się podzieliła, aby uniknąć przybliżeń.

Wyniki

Zdolność do niezawodnego rozróżniania poszczególnych populacji komórek linii komórek macierzystych strefy podkomorowej (SVZ) dorosłej myszy jest kluczowa dla zbadania ich właściwości funkcjonalnych. W tym celu opracowaliśmy strategię potrójnego znakowania LeX/EGFR/CD24, która umożliwia oczyszczanie specyficznych populacji komórek z dorosłej SVZ: spoczywających NSCs (LeXbright), aktywowanych NSCs (LeX+EGFR+), komórek TAC (EGFR+), niedojrzałych i migrujących neuroblastów (odpowiednio CD24+EGFR+ i CD24+) 9 (Ryc. 1). Zastosowanie techniki sortowania komórek u myszy transgenicznych FUCCI pozwala na obrazowanie na żywo faz cyklu komórkowego różnych populacji neurogennych na poziomie pojedynczych komórek25. Myszy FUCCI-Red zostały wykorzystane do śledzenia fazy G1 za pomocą czerwonej fluorescencji w mikroskopii wideo time-lapse (Ryc. 2A). Komórki FUCCI-Redneg reprezentują komórki w fazach S-G2/M cyklu komórkowego, komórki FUCCI-Redpos to komórki w fazie G1, a komórki FUCCI-Redbright to komórki opuszczające cykl komórkowy lub znajdujące się poza nim (Ryc. 2B) 23,26. Komórki LeX+EGFR+ i EGFR+ od młodych dorosłych myszy (Ryc. 2C) oraz myszy w średnim wieku (Ryc. 2D) wysiano jako komórki adherentne na płytkach hodowlanych powlekanych poli-D-lizyną. Pierwszą fazę S-G2/M w pojedynczych komórkach identyfikowano od momentu wygaszenia czerwonej fluorescencji aż do podziału komórki. Jak zaobserwowano wcześniej, długość fazy S-G2/M nie wykazała różnic między komórkami LeX+EGFR+ a EGFR+, zarówno u młodych, jak i u myszy w średnim wieku. Następnie obliczono długość kolejnej fazy G1 od pierwszego podziału do momentu wygaszenia czerwonej fluorescencji. Co ciekawe, wraz z wiekiem stwierdzono wydłużenie fazy G1 w komórkach LeX+EGFR+, ale nie w komórkach EGFR+25 (Ryc. 2C,D). W konsekwencji neurosfery uzyskane 5 dni po wysianiu są mniejsze w przypadku komórek LeX+EGFR+ pochodzących od myszy w starszym wieku, co przedstawiono na Ryc. 2E.

Myszy FUCCI-Green mogą być również wykorzystane do wizualizacji fazy S-G2/M za pomocą zielonej fluorescencji (Rycina 3A,B), jednak komórki muszą zostać uprzednio wyselekcjonowane przy użyciu kolumn separacyjnych, ponieważ przeciwciało LeX-FITC posiada tę samą długość fali emisji co fluorescencja FUCCI-green (Rycina 3C). Przykład fluorescencji FUCCI-green dla pierwszej fazy S-G2/M młodych dorosłych komórek LeX+EGFR+ oraz EGFR+ przedstawiono na Rycini 3D.

Analiza danych z cytometrii przepływowej; bramkowanie CD24/EGFR. Schematy przedstawiają morfologię, martwe komórki, wykluczanie dubletów.
Rycina 1: Strategia selekcji komórek metodą FACS. (A) Komórki zostały najpierw wyselekcjonowane pod kątem morfologii z wykorzystaniem parametrów Side scatter (SSC) vs Forward scatter (FSC). Szczegółowe informacje na temat wyboru bramki morfologii znajdują się w pracy Daynac et al. 9 (A’) Martwe komórki zostały oznakowane markerem HO i wykluczone z selekcji. (A’’) Dublety zostały wykluczone przy użyciu parametru szerokości impulsu (pulse width). W celu ustawienia bramek sortowania wykorzystano kontrole Fluorescence minus one (FMO) dla CD24-PC7 (oznakowanie LeX-FITC/FUCCI-Red/EGF-Ax647; B) oraz LeX-FITC (oznakowanie FUCCI-Red/EGF-Ax647/CD24-PC7; B’). (C,C’) Następnie bramki sortowania określono w próbkach oznakowanych LeX-FITC/FUCCI-Red/EGF-Ax647/CD24-PC7 wraz z kontrolami FMO. Średnie wartości procentowe całkowitej liczby komórek są przedstawione wewnątrz bramek. Przy wyborze komórek CD24+ (neuroblastów) należy uważać, aby wykluczyć z bramki komórki wykazujące silną ekspresję CD24bright. Rzeczywiście, CD24bright odpowiadają komórkom oponowym2,9. C’ przedstawia komórki CD24-ujemne (czarny kwadrat w C). W niniejszym badaniu wykorzystano jedynie bramki sortowania LeX+EGFR+ oraz EGFR+ (C’).

Analiza cyklu komórkowego z użyciem FUCCI; system czerwony, schematy, cytometria przepływowa, obrazy time-lapse.
Rycina 2: Analizy na żywo cyklu komórkowego z wykorzystaniem myszy FUCCI-Red. (A) Schematyczne przedstawienie cyklu komórkowego FUCCI-Red, w którym komórki wykazują czerwoną fluorescencję w fazie G1 i są bezbarwne w fazach S-G2/M23. (B) Przedstawienie FACS fluorescencji FUCCI-Red w komórkach SVZ. (C,D) Mikroskopia wideo komórek LeX+EGFR+ oraz EGFR+ posortowanych od młodych (C) i w średnim wieku (D) myszy FUCCI-Red umożliwia śledzenie fazy G1 za pomocą czerwonej fluorescencji, podczas gdy fazy S-G2/M można wywnioskować w momencie wygaśnięcia czerwonej fluorescencji. Kolejne obrazy są przedstawione z skalą czasową podaną w punkcie D. (E) Reprezentatywne obrazy kolonii (neurosfer) uzyskanych 5 dni po wysianiu. Pasek skali: 10 µm (C, D), 30µm (E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cyklu komórkowego z wykorzystaniem systemu FUCCI, wyniki cytometrii przepływowej oraz schemat kolumny MACS.
Rysunek 3: Strategia analiz żywych komórek w cyklu komórkowym z wykorzystaniem myszy FUCCI-Green. (A) Schematyczny przebieg cyklu komórkowego FUCCI-Green, w którym komórki są zielone podczas fazy S-G2/M i bezbarwne podczas fazy G123. (B) Przedstawienie fluorescencji FUCCI-Green w metodzie FACS: komórki FUCCI-Greenneg reprezentują komórki w fazie G1 cyklu komórkowego, natomiast komórki FUCCI-Greenpos to komórki w fazie S-G2/M23. (C) Aby śledzić zieloną fluorescencję faz S-G2/M komórek LeX+EGFR+ oraz EGFR+ , komórki SVZ musiały zostać wstępnie wyselekcjonowane za pomocą kolumn separacyjnych. Komórki znakowano przeciwciałem anty-mysim przeciwko LeX, a frakcję LeX+ zatrzymano na kolumnie przy użyciu mikrokulek anty-mysich (patrz protokół 4.). Następnie frakcje LeX+ i LeX- wymyto i znakowano przeciwciałami EGF-Ax647 oraz CD24-PC7 do sortowania metodą FACS. (D) Mikroskopia wideo komórek LeX+EGFR+ i EGFR+ wyselekcjonowanych z młodych myszy FUCCI-Green umożliwia śledzenie faz S-G2/M za pomocą zielonej fluorescencji. Kolejne obrazy są przedstawione wraz ze skalą czasową widoczną w części D. Pasek skali: 10 µm (D).

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie technika sortowania komórek pozwala na wiarygodne rozróżnienie między NSC w stanie spoczynku, aktywowanymi NSC i ich potomstwem, umożliwiając badanie ich właściwości i dynamiki w dorosłym mózgu9. W połączeniu z technologią FUCCI, która umożliwia wizualizację progresji cyklu komórkowego w żywych komórkach23, opracowaliśmy szybką i skuteczną technikę śledzenia faz G1 i S-G2/M cyklu komórkowego z komórek mózgowych młodych dorosłych i starszych myszy.

Technika sortowania komórek zastosowana w tym protokole była pierwszą zwalidowaną kombinacją markerów pozwalającą na oczyszczenie pięciu głównych populacji neurogennych z SVZ9. Była to również pierwsza zwalidowana technika umożliwiająca rozróżnienie NSC w stanie spoczynku i aktywowanego. Warto zauważyć, że technika ta nie wymaga użycia myszy transgenicznych per se, co jest konieczne, gdy jest przystosowane do transgenicznych modeli myszy, takich jak FUCCI. Od tego czasu Codega i wsp.10 z nich użyło kombinacji potrójnego znakowania GFAP-GFP/CD133/EGFR w celu odróżnienia spoczynkowych NSC od ich aktywowanego odpowiednika, ale nie można jej dostosować do technologii FUCCI, ponieważ wymaga to użycia myszy transgenicznych GFAP-GFP. Mich i wsp.11 z nich opracowało strategię potrójnego znakowania Glast/EGFR/CD24, która ma wspólne wyniki z techniką zastosowaną w tym badaniu9. Rzeczywiście, wysoką korelację między markerami LeX i Glast NSCs zaobserwowano już w badaniuDaynac i wsp. 9. Jednak przeciwciało Glast użyte w technice Mich i wsp. jest sprzężone z fikoerytryną i dlatego nie może być przystosowane przy użyciu myszy FUCCI-Red.

Istnieje kilka ważnych punktów technicznych, które wymagają uwagi przed sortowaniem komórek SVZ. Po pierwsze, etap dysocjacji jest bardzo ważny, ponieważ tkanka mózgowa musi zostać zdysocjowana na pojedyncze komórki, przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej białek wykorzystywanych w strategii znakowania przeciwciał. Wykazano, że 0,05% trypsyna-EDTA jest bardzo skuteczna w dysocjacji tkanki SVZ27 , ale stwierdzono, że antygen LeX jest bardzo wrażliwy, ponieważ prawie cała immunofluorescencja LeX-FITC została utracona (dane nie pokazane). W związku z tym zastosowano papainę, ponieważ była bardziej wydajna i mniej destrukcyjna niż inne proteazy działające na tkankę mózgową. Co więcej, leczenie papainą nie miało wpływu ani na LeX, ani na EGFR, ani na CD24. Należy zauważyć, że znakowanie przeciwciałami ulegało zmianie, jeśli leczenie papainą trwało dłużej niż 15 minut. Optymalne efekty uzyskaliśmy przy 10-minutowym zabiegu papainy połączonym z dysocjacją mechaniczną (pipeta w górę i w dół 20 razy).

Powłoka z poli-D-lizyny umożliwia hodowlę przylegających komórek i tworzenie kolonii po kilku dniach w hodowli. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że testy in vitro mają swoje ograniczenia28,29. Zalecamy określenie tylko pierwszego cyklu komórkowego dla komórek przechodzących co najmniej jeden kolejny podział, aby pozostać jak najbardziej zbliżonym do fenotypu komórki in vivo .

Warto wspomnieć, że białka Geminin (zielona fluorescencja) i Cdt1 (czerwona fluorescencja) użyte do zaprojektowania systemu FUCCI23 wykazały wcześniej, że są obficie wyrażane przez progenitory nerwowe podczas wczesnej neurogenezy u myszy30 i w tkankach mózgowych dorosłych9,25. Chociaż konstrukt mKO2-hCdt1(30/120) został wykorzystany głównie w niniejszym badaniu do śledzenia fazy G1 z czerwoną fluorescencją, można przewidzieć zastosowanie obu konstruktów [mKO2-hCdt1(30/120) i mAG-hGem(1/110)], aby umożliwić wizualizację głównych faz cyklu komórkowego (G1 i S-G2 / M), a także przejścia G1 / S23. Główną wadą obrazowania dwukolorowego jest ograniczona liczba kompatybilnych zestawów fluorescencji, które nadal mogą być używane do znakowania komórek. Jednym z rozwiązań jest zastosowanie kolumn separacyjnych. Na przykład udało nam się usunąć frakcję CD24-dodatnią z komórek za pomocą kolumn separacyjnych przed sortowaniem komórek i obrazowaniem na żywo, ponieważ użyliśmy przeciwciała CD24-PE, które miało tę samą długość fali emisyjnej co fluorescencja FUCCI-Red25.

Niewiele badań dotyczyło długości cyklu komórkowego w populacjach SVZ dorosłych myszy. Całkowita długość cyklu komórkowego uzyskana za pomocą naszej techniki jest zbliżona do tej oszacowanej in vitro przez Costa i wsp.21, ale po raz pierwszy udało nam się rozróżnić różne fazy cyklu komórkowego. W badaniu in vivo Ponti i wsp.W badaniu 22 wykorzystano inkorporację analogów tymidyny w celu określenia dynamiki proliferacji różnych populacji komórek SVZ. Nie byli jednak w stanie prowadzić ciągłego monitorowania cyklu komórkowego ani śledzić komórek na poziomie pojedynczej komórki. Może to stanowić problem, ponieważ wykazano, że w danej populacji komórek SVZ istnieje silna heterogeniczność22,25. Opisujemy tutaj alternatywną technikę in vitro , łatwą do skonfigurowania, która umożliwia obrazowanie na żywo faz cyklu komórkowego różnych dorosłych populacji neurogennych na poziomie pojedynczej komórki.

Zrozumienie regulacji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych pozostaje wyzwaniem dla opracowania nowych podejść terapeutycznych w kontekście starzenia się lub patologii mózgu. Dzięki temu nasz protokół może mieć szeroki zakres zastosowań. W kontekście starzenia się technika ta może również okazać się przydatna w zrozumieniu wpływu starzenia się na różnicowanie NSC. Rzeczywiście, możliwe jest zidentyfikowanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych wchodzących w różnicowanie, ponieważ ich intensywność czerwonej fluorescencji jest wyraźnie wyższa26. Wreszcie, interesujące może być również wykorzystanie ciągłego obrazowania na żywo na poziomie pojedynczej komórki w celu zbadania wewnętrznych i zewnętrznych procesów komórkowych odpowiedzialnych za progresję linii dorosłych NSC.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni C. Joubertowi, V. Neuville'owi, V. Barroca, J. Tillietowi i całemu personelowi obiektów dla zwierząt; J. Baijerowi i N. Dechampsowi za sortowanie komórek; O. Etienne'owi za pomoc techniczną i A. Gouretowi za pomoc administracyjną. Cytometria przepływowa i sortowanie komórek zostały przeprowadzone w iRCM Flow Cytometry Shared Resource, utworzonym dzięki dotacjom na sprzęt od DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC i CEA. Prace te były wspierane przez granty Electricité de France (EDF). Stypendysta La Ligue Contre le Cancer oraz L.M. z Région Ile-de-France (DIM Biothérapies). Marc-André Mouthon i François D. Boussin są współautorami składu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe niepowlekane płytki hodowlane ze szkła dolnego MatTek Corp.P96G-1.5-5-5-F
µ-Płytki 96-dołkoweIbidi89626
Poli-D-LizynaMiliporowaA003E
NeuroCult NSC Basal MediumSTEMCELL Technologies5700
NeuroCult NSC Suplement proliferacyjny STEMCELL Technologies5701
HeparynaSTEMCELL Technologies7980
EGFMilliporeGF144
FGF-2MiliporaGF003
PapainaWorthingtonLS003119
EBSSInvitrogen24010-043
L-cysteinaSigmaC-7352
0,5 M EDTA, pH 8,0PromegaV4231
DNaza ISigmaD5025-15KU
Inhibitor trypsyny typu IISigmaT9128Ovomucoid
DMEM: F12 średniLife Technologies31330-038
20 µ Filtr M BD Medimachine Filcon340622
mikroprobówki Eppendorf 3810XSigmaZ606340-1000EA
BSASigmaA1595Roztwór albuminy surowicy bydlęcej
CD24 koniugat fikoerytryny-cyjaniny 7 [PC7]Life TechnologiesA14776Mysia IgM; klon MMA. 1:50
CD15/LeX izotiocyjanian fluoresceiny [FITC] - sprzężonyBD Biosciences332778Szczur IgG2b; klon M1/69.  1:50
Mysie przeciwciało anty-ludzkie LeXBD Pharmingen559045IgM myszy; klon MAM.  1:50
Alexa647 - sprzężony ligand EGFLife TechnologiesE353511:200; Ligand EGF sprzężony z Ax647 w tekście
CompBeadsBD Biosciences644204
MACS LS Miltenyi Biotec130-042-401(w manuskrypcie)
Mikrogranulki anty-mysie IgM Miltenyi Biotec130-047-301
Hoechst 33258Sigma861405HO (w rękopisie)
Sortownik komórek INFLUXSortownik BD BiosciencesFACS (w tekście)
System konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Nikon A1R podłączony do odwróconego ECLIPSE TiNikon Corp.konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (w manuskrypcie)
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bitowe oprogramowanieNikon Corp.Oprogramowanie NIS-Elements (w rękopisie)
Obiektyw Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75)Nikon Corp.
Komora termostatyczna ECLIPSE TiNikon Corp.komora termostatyczna (w rękopisie)
ImageJRBS
FlowJoTree Star, Ashland, OR
FUCCI myszyRIKEN BioResource Center, JAPONIASakaue-Sawano i in. 2008
Kolumny separacyjne Kolumny separacyjne

Bibliografia

  1. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  2. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
  3. Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
  4. Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  5. Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  6. Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
  7. Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
  8. Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
  9. Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
  10. Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
  11. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669(2014).
  12. Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
  13. Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
  14. Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
  15. Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
  16. Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
  17. Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
  18. Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
  19. Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
  20. Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
  21. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
  22. Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
  23. Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  24. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  25. Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
  26. Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
  27. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225(2014).
  28. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  29. Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  30. Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuralne kom rki macierzystetechnika FACSmyszy FUCCImikroskopia time lapsedysocjacja papainpoli D lizynasortowanie kom rek aktywowane fluorescencj

Powiązane artykuły