Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bariera nabłonkowa jest pierwszą wrodzoną obroną przewodu pokarmowego i selektywnie reguluje transport od światła do leżących poniżej przedziałów tkankowych, ograniczając transport mniejszych cząsteczek przez nabłonek i prawie całkowicie uniemożliwiając nabłonkowy transport makromolekularny. O tej selektywności decyduje śluzowa warstwa żelu, która ogranicza transport cząsteczek lipofilowych oraz zarówno receptorów wierzchołkowych, jak i ścisłych kompleksów białkowych nabłonka. Modele hodowli komórkowych nabłonka in vitro są wygodne, ale jako model brakuje im złożoności interakcji między mikrobiotą, żelem śluzowym, nabłonkiem i układem odpornościowym. Z drugiej strony, można przeprowadzić ocenę in vivo wchłaniania lub przepuszczalności jelitowej, ale testy te mierzą ogólne wchłanianie żołądkowo-jelitowe, bez wskazania swoistości miejsca. Testy przepuszczalności ex vivo z wykorzystaniem "worków jelitowych" są szybką i czułą metodą pomiaru ogólnej integralności jelit lub porównawczego transportu określonej cząsteczki, z dodatkową zaletą w postaci specyficzności miejsca jelitowego. W tym miejscu opisano przygotowanie worków jelitowych do badań przepuszczalności oraz obliczanie pozornej przepuszczalności (Papp) cząsteczki przez barierę jelitową. Technika ta może być stosowana jako metoda oceny wchłaniania leków lub do badania dysfunkcji regionalnej bariery nabłonkowej w zwierzęcych modelach chorób przewodu pokarmowego.
Wprowadzenie
Bariera nabłonkowa przewodu pokarmowego to powierzchnia błony śluzowej szacowana na 400m2 u dorosłego człowieka. W związku z tym jest stale narażony na wyzwania ze strony drobnoustrojów, spożywanych leków, składników odżywczych i toksyn bakteryjnych. Gospodarz musi nie tylko odróżniać tolerowane bakterie komensalne od potencjalnych patogenów, ale także zapobiegać przenikaniu tych gatunków i wydzielanych przez nie cząsteczek przez barierę nabłonkową, jednocześnie umożliwiając wchłanianie składników odżywczych. Tak więc rolą nabłonka jelitowego jest działanie jako selektywna bariera dla zawartości światła 1. Osiąga się to częściowo dzięki wrodzonemu nabłonkowi obronnemu błony śluzowej, który działa poprzez responsywny system biologiczny składający się z mechanizmów konstytutywnych i indukowalnych 2.
Utrata funkcji bariery nabłonkowej jest patologią charakterystyczną dla wielu chorób przewodu pokarmowego. Badanie in vivo funkcji bariery nabłonkowej można ocenić poprzez doustne zgłębnik cząsteczki znacznikowej, a następnie analizę surowicy 3. Jednak ta technika nie daje żadnych wskazówek co do miejsca dysfunkcji bariery. Ocena in vitro i ex vivo oporności przeznabłonkowej przy użyciu odpowiednio systemów Transwell3 i komór Ussinga 4,5 jest powszechnie stosowana jako zastępcze markery funkcji bariery nabłonkowej, ale brakuje fizjologii choroby przyczyniającej się do jej występowania w modelach zwierzęcych 6. W niniejszym protokole opisujemy model przygotowania tkanek ex vivo, który umożliwia bezpośrednią i miejscową ocenę integralności jelit i który może być wykorzystany do oceny funkcji bariery śluzówkowej na wielu poziomach. Co ważne, technika ta może być stosowana do zwierzęcych modeli choroby lub może być manipulowana farmakologicznie, aby umożliwić dogłębne badanie dysfunkcji bariery śluzówkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie prace nad zwierzętami w tym protokole są wykonywane zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Newcastle.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
- Wstępnie podgrzane podłoże 199 (TC199) lub zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do temperatury 37 °C. Wstępnie natlenić pożywkę przez bulgotanie 95% O2/5% CO2 . Sprawdzić, czy końcowe pH podłoża wynosi 7,3.
- Przygotuj szew, wycinając dwa odcinki po 5 cm dla każdego worka. Zapętl szwy w niezamknięty węzeł.
2. Rozwarstwienie i przygotowanie przewodu pokarmowego
- Odstaw pokarm stały na 12 godzin przed eutanazją. W razie potrzeby umieść w tym czasie zwierzęta na suplementach odżywczych w żelu.
- Poddaj myszy eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitonu sodu ([200 mg / kg], wstrzyknięcie dootrzewnowe), a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi protokołami etycznymi i spryskaj 70% etanolem brzuch i klatkę piersiową.
- Za pomocą nożyczek wykonaj poziome nacięcie na środku brzucha i odsłoń otrzewną.
- Przystąp do oddzielenia i usunięcia przewodu pokarmowego, przecinając górne jelito cienkie od żołądka przy zwieraczu odźwiernika i przecinając jelito grube na krawędzi odbytu. Użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć krezkę. Umieść przewód pokarmowy we wstępnie podgrzanym, natlenionym podłożu.
- Zidentyfikuj odcinek jelita, który ma być oceniany pod kątem przepuszczalności (ryc. 1) i odetnij ten odcinek od reszty przewodu pokarmowego.
- Aby zachować spójność między zwierzętami, zmierz odcinki dwunastnicy i jelita czczego w stosunku do żołądka oraz zmierz odcinki okrężnicy i jelita krętego w stosunku do jelita ślepego.
- Wybierając segmenty tkanki, zwróć uwagę na obecność tkanek limfatycznych związanych z błoną śluzową, takich jak łaty Peyera. Można je zidentyfikować jako małe guzki po surowiczej stronie światła.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml delikatnie przepłukać zawartość świetlną odcinka jelitowego na szalkę Petriego z podgrzanym PBS (37 °C). Zawartość kału może być usunięta lub przechowywana w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy, zgodnie z życzeniem.
3. Przygotowanie worków jelitowych
- Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z objętością 300 μl badanego związku lub cząsteczki. W celu zapewnienia integralności błony śluzowej można użyć roztworu FITC-Dextran M.Wt. 4 400 o stężeniu 1 mg/ml. W celu zwiększenia czułości można zastosować sondy o wielkości od 4 400 do 70 000 Da. Bezpiecznie zamocuj cewnik naczyniowy dla małych zwierząt na strzykawce.
- Odmierz 5 cm od ujścia odcinka jelitowego i w tym miejscu zawiąż segment bezpiecznie zamknięty pętlą do szwów. Delikatnie umieść wstępnie zawiązaną pętlę szwów wokół otworu jelita i wprowadź stępiony cewnik. Pociągnąć pętlę tak, aby zabezpieczyć odcinek jelita i uwolnić objętość 300 μl ze strzykawki do jelita, upewniając się, że cały roztwór został wstrzyknięty.
- Delikatnie wyjmij cewnik, jednocześnie pociągając za pętlę szwową, aby zabezpieczyć zamknięcie worka jelitowego. Odciąć worek jelitowy od jelita i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml natlenionej pożywki, podgrzanej do temperatury 37 °C.
4. Pomiar przepuszczalności
- Umieścić stożkowe rurki zawierające worki jelitowe w podgrzewanej łaźni wodnej nastawionej na 37 °C. W punktach czasowych 0, 30, 60, 90 i 120 min pobrać próbkę o objętości 100 μl z probówki stożkowej i przenieść na płytkę 96-dołkową, zastępując objętość 100 μl świeżej pożywki w każdym przypadku.
- Po pobraniu próbki końcowej należy rozciąć worki w miejscu szwu i na całej długości segmentu, odsłaniając powierzchnię błony śluzowej.
- Zmierz długość i szerokość każdego segmentu jelita. W razie potrzeby należy zamrozić segmenty i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy białkowej lub biochemicznej lub alternatywnie przechowywać w roztworze stabilizującym RNA do testów molekularnych.
- Skonstruuj standardową krzywą rozcieńczeń logarytmicznych dla cząsteczek oznaczonych FITC w zakresie od 1 do 1 x 10-6.
- Pomiar próbek i wzorców dla FITC na czytniku płytek fluorescencyjnych, wzbudzenie/emisja FITC: 495 nm/519 nm.
5. Obliczanie pozornej przepuszczalności dla każdego pojedynczego worka jelitowego
- Zamień jednostki czasu na sekundy
- Dla każdego punktu czasowego obliczyć skumulowane stężenie, Q
Qt = (Ct*Vr) + (Qt sum* Vs), gdzie:
Qt = skumulowane stężenie w czasie t
Ct = stężenie w czasie t
Vr = Głośność po stronie odbiornika
Qt sum = Suma wszystkich poprzednich Qt
Vs = objętość próbkowanej próbki
- Wykreślić Q w funkcji czasu (T) i obliczyć nachylenie: δQ/δt
- Obliczać przepuszczalność pozorną (Papp)
Papp = (δQ/δt)/(A*Co), gdzie:
A = Powierzchnia tkanki
C0 = Stężenie początkowe
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół może być wykorzystany do badania regionalnych zmian w funkcji bariery jelitowej w modelach zwierzęcych chorób przewodu pokarmowego. Poprzez pomiar przepływu sondy parakomórkowej przez powierzchnię śluzówkową w różnych obszarach przewodu pokarmowego7, można ocenić szczelność połączeń ścisłych nabłonka. Ponadto, poprzez zmianę charakterystyki sondy parakomórkowej pod względem wielkości (Rycina 2) lub hydrofobowości (Rycina 3), ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy izolację i przygotowanie worków jelitowych w celu oceny funkcji bariery śluzówkowej ex vivo. Preparaty na woreczek jelitowy były przede wszystkim wykorzystywane w badaniach farmaceutycznych, badając wchłanianie potencjalnych leków przez jelito. Jednak ten test równie dobrze nadaje się do badania chorób jelit. Przepuszczalność jelit może się znacznie różnić w zależności od regionu i miejsca, ocena przepuszczalności pozwala lepiej zrozumieć regionalne znaczenie integralności bł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 oraz grant Hunter Medical Research Institute sponsorowany przez Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dekantel Niewchłanialny szew jedwabny | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | Brak czerwieni fenolowej, ponieważ zakłóca ona fluorescencję |
| Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco) | Life Technologies | 21063-045 | Brak czerwieni fenolowej, ponieważ zakłóca ona fluorescencję |
| N-acetylocysteiny | Sigma Aldrich | Stosowanie przy 10 mM w pożywce | |
| Cewnik naczyniowy dla małych zwierząt: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dekstran 4 400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dekstran 20 000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dekstran 70 000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
Bibliografia
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272(2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
