Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

DOI:

10.3791/53256

⸱

29 października 2015

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Laboratory for Molecular Immunology and Inflammation, Ghent University Hospital, 2VIB Inflammation Research Center, Ghent University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dostosowany protokół, który może być użyty do wygenerowania dużej liczby mysich niezmiennych limfocytów T NK z mysiej śledziony. W protokole przedstawiono podejście, dzięki któremu komórki iNKT śledziony mogą być wzbogacane, izolowane i namnażane in vitro przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt i odczynników.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do szybkiego wydzielania cytokin po stymulacji jest funkcjonalną cechą niezmiennej linii komórkowej T (iNKT). Komórki iNKT są zatem charakteryzowane jako wrodzona populacja limfocytów T zdolna do aktywacji i kierowania adaptacyjnymi odpowiedziami immunologicznymi. Opracowanie ulepszonych technik hodowli i namnażania mysich komórek iNKT ułatwia badanie biologii komórek iNKT w systemach modelowych in vitro i in vivo. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę izolacji i ekspansji mysich komórek iNKT śledziony.

Śledziony myszy C57Bl/6 są usuwane, preparowane i naprężane, a powstała zawiesina komórkowa jest nakładana na podłoże o gradiencie gęstości. Po odwirowaniu pobiera się jednojądrzaste komórki śledziony (MNC), a limfocyty CD5-dodatnie (CD5+) są wzbogacane do użycia kulek magnetycznych. Komórki iNKT we frakcji CD5+ są następnie barwione tetramerem CD1d załadowanym αGalCer i oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Komórki iNKT posortowane w FACS są następnie początkowo hodowane in vitro przy użyciu kombinacji rekombinowanych cytokin mysich i bodźców receptora komórek T związanych z płytką (TCR), a następnie są namnażane w obecności rekombinowanej myszy IL-7. Stosując tę technikę, w ciągu 18-20 dni hodowli można wygenerować około10-8 komórek iNKT, po czym można je wykorzystać do testów funkcjonalnych in vitro lub do eksperymentów transferowych in vivo u myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie niezmienne komórki T naturalnego killera (iNKT) są odrębną populacją wrodzonych limfocytów T wybranych w grasicy przez tymocyty korowe z ekspresją CD1d 1,2. Komórki iNKT wyrażają receptor limfocytów T (TCR) składający się z niezmiennego łańcucha TCR Vα14-Jα18 sparowanego z TCR Vβ8, Vβ7 lub Vβ2 3, który jest zdolny do rozpoznawania endogennych i obcych antygenów lipidowych w kontekście CD1d. Na przykład mysie komórki iNKT rozpoznają i są aktywowane przez endogenny antygen lipidowy zwany izoglobotriheksozyloceramidem (iGb3) 4, a także α-galaktozyloceramid (αGalCer) 5,6, glikolipid wyizolowany z gąbek morskich. Zależna od TCR aktywacja komórek iNKT sprzyja pobudzaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, w wyniku czego wykazano, że komórki iNKT są funkcjonalnie zaangażowane w poprawę lub rozwój szeregu patologii, w tym choroby reumatycznej 7 i raka 8. Obecnie syntetyczne ligandy komórek iNKT stanowią obiecujące nowe adiuwanty szczepionkowe, które mogą być zdolne do regulowania wielu schorzeń immunopatologicznych.

Wcześniej wykazano, że komórki iNKT mogą być generowane in vitro po izolacji z tkanki myszy; wiele z tych badań wykorzystuje pierwotne komórki prezentujące antygen (APC) i/lub linie komórkowe 9, myszy transgeniczne Vα14 TCR (Tg) 10, lub grasiczaki do generowania hybrydomów pochodzących z komórek iNKT 11,12. Co więcej, duża liczba myszy, duże ilości odczynników, takich jak dimery CD1d załadowane αGalCer, oraz długi czas hodowli sprawiają, że niektóre opublikowane protokoły są mniej atrakcyjne etycznie i ekonomicznie 9,13.

W tym raporcie opisujemy dostosowaną metodę izolacji i ekspansji in vitro komórek iNKT z śledziony myszy. Dokładniej rzecz ujmując, protokół opisuje metodę wzbogacania komórek iNKT ze śledziony myszy, która zmniejsza liczbę myszy, odczynników i czasu potrzebnego do sortowania komórek FACS, a także proponuje zoptymalizowane podejście do namnażania posortowanych komórek iNKT śledziony in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wykorzystano dorosłe (6-8 tygodni) samice myszy C57Bl/6. Myszy były trzymane i hodowane zgodnie z wytycznymi wiwarium Uniwersytetu w Gandawie. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki.

1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych (MNC) ze śledziony myszy

  1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Umieść mysz z powrotem na desce sekcyjnej i przymocuj tylne i przednie nogi za pomocą szpilek.
  3. Wysterylizować powierzchnię skóry 70% (obj./obj.) etanolem/H2O.
  4. Przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha do klatki piersiowej i odsłonić śledzionę za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych.
  5. Po przycięciu otaczających tkanek tłuszczowych umieścić śledzionę w 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej.
  6. Wyciąć śledzionę za pomocą sterylnego skalpela i przenieść kawałki do nylonowego filtra o wielkości 70 μm umieszczonego w probówce o pojemności 50 ml.
  7. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml delikatnie rozgnieć kawałki śledziony przez sitko do komórek i przemyć 5 ml 1x PBS.
  8. Dodać 3 ml Ficoll-Paque do probówki o pojemności 15 ml i nałożyć pożywkę o gradiencie gęstości na 5 ml zawiesiny komórkowej.
  9. Wirować przy 400 x g przez 20 minut przy RT bez hamulca.
  10. Przenieść interfazę do świeżej probówki o pojemności 15 ml, dodać 10 ml zimnego 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Zawiesić komórki w 2 ml 1x PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor FACS). Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do małej probówki, wymieszać z 10 μl 0,4%

2. Wzbogacanie, wykrywanie i oczyszczanie mysich komórek iNKT

  1. Wzbogacenie mysich limfocytów CD5dodatnich (CD5+) śledziony.
    1. (Opcjonalnie) Zabarwić 105 komórek anty-CD5 sprzężonym z FITC (4 μl rozcieńczenia 1:30 / 106 komórek) przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności, przemyć 200 μl buforu FACS i ponownie zawiesić w 500 μl buforu FACS. Przygotować 20 μM roztwór roboczy 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x PBS, dodać 1 μl do 105 komórek w buforze FACS i inkubować w temperaturze RT przez 5 minut. Zdobądź 104 wstępnie wzbogaconych komórek na cytometrze przepływowym.
      1. Korzystając z FCS-H i FCS-W, elektronicznie bramkuj ogniwalo FSC-W, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek (rysunek 1A). Następnie elektronicznie wyłącz DAPI+ (martwe) komórki w populacjilo FSC-W (Figura 1B) i użyj SSC-A i FCS-A do elektronicznego wyboru populacji limfocytów według wielkości (Figura 1C).
      2. Wykorzystując komórki w bramce limfocytów, wykreśl SSC-A w porównaniu z CD5 i elektronicznie bramkuj limfocyty CD5 +, jak pokazano na rysunku 1D. Pozostałą część wstępnie wzbogaconej próbki pobrać na cytometr przepływowy.
    2. Dostosuj liczbę komórek do 107 komórek na 90 μl w buforze FACS i dodaj 10 μl mikrogranulek anty-CD5.
    3. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut, przemyć raz 4 ml buforu FACS i ponownie zawiesić w 500 μl zimnego buforu FACS. Wzbogacić na limfocyty CD5+ za pomocą kolumn do magnetycznej separacji komórek (MACS) zgodnie z zaleceniami producenta.
    4. Opcjonalnie) Zabarwić 105 komórek anty-CD5 sprzężonym z FITC (4 μl rozcieńczenia 1:30 / 106 komórek) i DAPI jak w 2.1.1. Pobrać 104 wzbogacone limfocyty na cytometrze przepływowym i sprawdzić, czy bramki elektroniczne utworzone w 2.1.1. wybierz limfocyty CD5 + we wzbogaconej frakcji komórkowej. Zdobądź 105 komórek na cytometrze przepływowym i przeanalizuj procent limfocytów CD5 + obecnych we wzbogaconej frakcji, jak pokazano na rysunku 1E-H.
  2. Wykrywanie i izolacja mysich komórek iNKT za pomocą FACS.
    1. Zawiesić wzbogacone limfocyty CD5 + w stężeniu około 106 komórek na 20 μl w buforze FACS zawierającym anty-CD16 / CD32 (4 μl rozcieńczenia 1:50 / 106 komórek) i tetramer αGalCer / CD1d sprzężony z PE (1 μg / 106 komórek).
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Rozcieńczyć mysie przeciwciała (mAb) anty-CD3ε V500 (4 μl o rozcieńczeniu 1:20 / 106 komórek), anty-CD19 e450 (4 μl o rozcieńczeniu 1:50 / 106 komórek) i anty-CD8α e450 (4 μl rozcieńczenia 1:50 / 106 komórek) w buforze FACS, dodać do limfocytów CD5 + i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    4. Przemyć komórki 1 ml buforu FACS przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 4 ml buforu FACS do końcowego stężenia10-7 komórek/ml.
    5. Przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 30 μm i umieść komórki na lodzie.
    6. Skalibrować cytometr przepływowy do sortowania komórek zgodnie z zaleceniami producenta 14,15.
      Uwaga: Kalibracja cytometru przepływowego do sortowania komórek wymaga przeszkolenia i może być wykonana przez doświadczonego operatora lub przeszkolonego technika.
    7. Dodać 10 μl 20 μM roztworu roboczego DAPI na 10-6 komórek i inkubować w temperaturze RT przez 5 minut. Uzyskać około 104 wzbogaconych limfocytów CD5 + na cytometrze przepływowym. Elektroniczna bramka na ogniwachlo FSC-W w celu wykluczenia dubletów i agregacji komórek (rysunek 2A). Następnie elektronicznie wyklucz komórki DAPI+ CD8+CD19+ (kanał zrzutu) w populacjilo FSC-W (Figura 2B) i użyj SSC-A i FCS-A do elektronicznej selekcji limfocytów (Figura 2C), jak opisano w 2.1.1.1.
      1. Wykreślić tetramer αGalCer/CD1d za pomocą CD3ε i elektronicznie bramkować komórki αGalCer/CD1d tetramer + CD3ε+ iNKT, jak pokazano na rysunku 2D. Pozyskaj nie więcej niż 2 x 105 limfocytów wzbogaconych w CD5 +, aby określić procent komórek αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT obecnych we wzbogaconej frakcji komórkowej.
    8. Korzystając z bramek elektronicznych utworzonych w 2.2.7., FACS sortuje komórki αGalCer/CD1d tetramer+CD3ε+ iNKT na cytometrze przepływowym przy ciśnieniu 70 psi za pomocą dyszy 70 μm przy natężeniu przepływu "1,5". Zebrać posortowane komórki iNKT w probówce FACS zawierającej 1 ml 100% FCS. Następnie przepłukać posortowane komórki iNKT od strony probówki FACS za pomocą 10 ml pożywki RMPI 1640 i odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Ponownie zawiesić posortowane komórki iNKT w 1 ml pożywki RPMI 1640 i pobrać z nich 40 μl na cytometrze przepływowym w celu oceny czystości posortowanych komórek iNKT. Wybrać limfocyty FSC-Wlo DAPI- zgodnie z opisem w 2.2.7. (Rysunek 2E-G) i elektronicznie bramkować komórki αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT, jak pokazano na rysunku 2H.

3. Hodowla i ekspansja mysich komórek iNKT

Dzień 0

  1. Pokryj płaskodenną 96-dołkową płytkę oczyszczonym anty-CD3ε (3 μg/ml) na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć dwukrotnie 200 μl 1x PBS i raz 200 μl pełnej pożywki RPMI 1640 (10% obj./obj. FCS, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 5,5 μM β-merkaptoetanolu).
  2. Policz liczbę żywotnych posortowanych komórek iNKT (krok 2.2.8) za pomocą 0,4% hemocytometru, jak w 1.11, odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawieś przy 5 x 105 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI 1640 zawierającej rekombinowaną mysią IL-2 (10 ng/ml), rekombinowaną mysią IL-12 (1 ng/ml) i rozpuszczalną anty-mysią CD28 (5 μg/ml). Komórki iNKT posortowane płytkowo w 10-5 komórkach/basenie na płytkach pokrytych anty-CD3ε i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 dni.

Dzień 2

  1. Przenieść komórki na świeżą, niepowlekaną, płaskodenną 96-dołkową płytkę i hodować komórki w warunkach spoczynku w kompletnym podłożu RPMI 1640 w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 dni.

Dzień 4

    Usunąć
  1. komórki z płytki za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść komórki do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w temperaturze 5 x 105 komórek/ml w kompletnej pożywce RPMI 1640 zawierającej rekombinowaną mysią IL-7 (5 ng/ml) i płytkę 105 komórek/basenik w płaskodennej 96-dołkowej płytce przez 4 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .

Dzień 8

  1. Zebrać komórki do świeżej probówki, odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić przy 5 x 105 komórek/ml w kompletnej pożywce RPMI 1640 zawierającej rozpuszczalny anty-CD28 (5 μg/ml).
  2. Pokryć płaskodenną płytkę 96-dołkową oczyszczonym anty-CD3ε (3 μg/ml) na studzienkę i umyć jak w 3.1. Płytkę 105 komórek/basenik na płytkach pokrytych anty-CD3ε i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 do dnia 11.

Dzień 11 – 18

  1. Powtórz kroki od 3.4 do 3.6.

Dzień 19-20

  1. Przenieść komórki do świeżej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 300 x g i ponownie zawiesić przy 5 x 105 komórek/ml w pełnej pożywce RPMI 1640.
  2. Umieścić komórki w 10-5 komórkach/baseniku na płaskodennej płytce 96-dołkowej i pozostawić komórki na 2 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przed użyciem w doświadczeniu.

4. Produkcja cytokin przez mysie komórki iNKT przy użyciu testu CD1d na płytce

  1. Pokryć płaskodenną 96-dołkową płytkę 100 μl rekombinowanego mysiego CD1d (10 μg/ml w 1x PBS) na basenik i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Przemyć czterokrotnie 200 μl 1x PBS, dodać 200 μl 2% FCS do 1x PBS (roztwór blokujący) na studzienkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Usunąć roztwór blokujący, dodać 200 μl αGalCer (5 ng/μl) do dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. [W celu przygotowania roztworu αGalCer dodać 1,085 μ 1x PBS do 55 μg αGalCer rozpuszczonego w nośniku zawierającym 96 mg/ml sacharozy, 10 mg/ml deoksycholanu sodu i 5 mg/ml tween 20].
  4. Po inkubacji odrzucić roztwór αGalCer i dwukrotnie przemyć studzienkę 200 μl 1x PBS, a następnie 200 μl pełnej pożywki RPMI 1640.
  5. Zebrać ekspandowane komórki iNKT in vitro w 21 dniu, odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w pełnej pożywce RPMI 1640 o stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml.
  6. Dodać 200 μl zawiesiny komórek iNKT do dołka i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
  7. Zebrać supernatant i zmierzyć interesujące go cytokiny za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja jednojądrzastych komórek śledziony za pomocą gradientu gęstości trwa około 1 godziny i eliminuje użycie odczynników niezbędnych do lizy czerwonych krwinek (RBC). Za pomocą tej metody uzyskuje się wysoki plon żywotnych komórek, a zanieczyszczenia powstałe podczas obciążania narządu są usuwane. Zazwyczaj częstość występowania komórek iNKT w puli limfocytów śledziony waha się od 1 do 5% wszystkich limfocytów T, jednak może się to różnić w zależności od wieku, płci i stanu zdrowia wykorzystanych zwierząt. Około 10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy obecnego protokołu obejmują izolację, a następnie wzbogacenie limfocytów CD5+ (sekcja 1 i 2), sortowanie FACS (sekcja 3) i wstępne posiewanie komórek iNKT (sekcja 4). Spośród kroków wykonanych w sekcji 1 należy pamiętać o ostrożnym nałożeniu zawiesiny komórkowej śledziony na podłoże o gradiencie gęstości, tak aby po odwirowaniu powstała wyraźna interfaza komórkowa. Późniejsze wzbogacenie limfocytów CD5 + przez magnetyczną separację komórek (sekcja 2) minimalizuje odczynniki i czas pot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.E. i M.B.D. są członkami multidyscyplinarnej platformy badawczej (MRP) Uniwersytetu w Gandawie oraz konsorcjum Badaczy z Gandawy ds. Rozwiniętych Białek w Chorobach Zapalnych (GROUP-ID).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
rekombinowana mysia IL-2eBiosciences14-8021
rekombinowana mysia IL-12eBiosciences39-8122-65
rekombinowana mysia IL-7eBiosciences14-8071
oczyszczona anty-mysia CD3e (145-2C11)eBiosciences16-0032-86
oczyszczona anty-mysie CD28 (37.51)eBiosciences16-0281-85
e450-sprzężony anty-mysz CD19 (eBio1D3)eBiosciences48-0193-82
e450-sprzężony anty-mysz CD8&alfa; (53-6,7)eBiosciences48-0081-82
Anty-mysie CD5 (53-7.3) SprzężoneFITC11-0051-81
V500 Anty-mysie CD3 i epsilon ze sprzężeniem FITC; (500A2)BD biosciences560771
mikrokulki anty-mysie CD5 (Ly-1)Macs Miltenyi Biotec130-049-301
oczyszczony anty-mysz CD16/32 (2.4G2)Macs Miltenyi Biotec130-092-575
MACS MS Kolumny MacsMiltenyi Biotec130-042-201
Błękit trypanowy, 0,4% (wt/vol)Gibco15250-061
RPMI 1640 mediumGibco12633-020
1x PBSGibco10010-056[Ca2+/Mg2+ - wolne]
Surowica cielęca płoduGibco10270
L-glutaminaGibco25030-123
Penicylina-streptomycynaSigma-AldrichP4458-100ML
Albuminasurowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906-100MG
β-MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sigma-AldrichEDS-1KG
Ficoll-Paque plusGE Healthcare71-7167-00 AF
Equipment Płytka
96-dołkowa F-bottomGreiner-bio one657-160
Płytka 24-dołkowaGreiner-bio one665-180
Płytka 6-dołkowaGreiner-bio one655-180
15 ml falcon tubkaGreiner-bio one188-271
50 ml tubka sokołaGreiner-bio one227-261
70 µ m filtrGreiner-bio one542-070
30 µ m filtrSeparator MilliporeSVGP01050
MiniMACSMacs Miltenyi Biotec130-042-102
MS ColumnsMacs Miltenyi Biotec130-042-201
Inkubator CO2 z płaszczem wodnymHemocytometr VWR
Zestaw do rozwarstwianiaVWR
BD FACSAria IIIBD Nauki biologiczne
z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
  2. Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
  3. Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
  4. Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
  5. Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
  6. Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
  7. Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
  8. Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
  9. Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
  11. Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
  12. Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
  13. Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
  14. Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
  15. Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
  16. Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek iNKTmagnetyczna separacja kom reksortowanie kom rek aktywowane fluorescencjbarwienie tetramerem CD1dmononuklearne kom rki ledzionyprotok ekspansji cytokinowejanaliza cytometrycznahodowla in vitrotransfer in vivo

Powiązane artykuły