Artykuł metodologiczny

Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

DOI:

10.3791/53261

⸱

16 października 2015

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy nową metodę badania przesiewowego leków do określania powinowactwa wiązania małych cząsteczek leku z docelowym białkiem poprzez tworzenie fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) w białku załadowanym lekiem, na podstawie różnicowego sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez Au NCs. Białka albuminowe, takie jak albumina surowicy ludzkiej (HSA) i albumina surowicy bydlęcej (BSA) są wybierane jako białka modelowe. Badane są cztery leki małocząsteczkowe (np. ibuprofen, warfaryna, fenytoina i sulfanilamid) o różnym powinowactwie wiązania do białek albuminy. Stwierdzono, że tempo tworzenia fluorescencyjnych Au NC wewnątrz białka albuminowego obciążonego lekiem w warunkach denaturacji (tj. 60 °C lub w obecności mocznika) jest wolniejsze niż w białku pierwotnym (bez leków). Co więcej, stwierdzono, że intensywność fluorescencji powstałych NC jest odwrotnie skorelowana z powinowactwem tych leków do białek albuminy. W szczególności, im wyższe powinowactwo wiązania lek-białko, tym wolniejsze tempo powstawania Au NCs, a tym samym obserwuje się mniejszą intensywność fluorescencji powstałych Au NCs. Intensywność fluorescencji otrzymanych Au NC stanowi zatem prostą miarę względnej siły wiązania różnych badanych leków. Metodę tę można również rozszerzyć w celu pomiaru swoistej stałej wiązania lek-białko (KD) poprzez prostą zmianę zawartości leku wstępnie załadowanego w białku przy ustalonym stężeniu białka. Zmierzone wyniki dobrze pokrywają się z wartościami uzyskanymi przy użyciu innych, prestiżowych, ale bardziej skomplikowanych metod.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Albuminy surowicy, takie jak albumina surowicy ludzkiej (HSA) i albumina surowicy bydlęcej (BSA) są najobficiej występującym białkiem w osoczu i odgrywają istotną rolę w utrzymaniu ciśnienia osmotycznego w kompartmencie krwi. Są również uznawane za białka nośnikowe dla małych cząsteczek o niskiej rozpuszczalności w wodzie, takich jak sterydy, kwasy tłuszczowe, hormony tarczycy i szeroka gama leków. Właściwości wiązania (np. miejsca wiązania, powinowactwo lub siła wiązania) tych cząsteczek z albuminami surowicy stanowią ważny temat w farmakokinetyce. 1-4 Opracowano kilka metod analitycznych w celu zbadania właściwości wiązania różnych leków z albuminami surowicy, takich jak krystalografia rentgenowska,5,6 magnetyczny rezonans jądrowy (NMR),7-11 i powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR),12,13 itp. Jednak metody te są ograniczone albo przez żmudny i czasochłonny proces analizy (np. wzrost monokryształu do krystalografii rentgenowskiej), wymóg specjalistycznego i drogiego sprzętu (SPR) lub konieczność kosztownego znakowania izotopów (NMR) w celu wykrywania. W związku z tym wysoce pożądane jest opracowanie alternatywnych metod badań przesiewowych leków małocząsteczkowych w szybki, prosty i opłacalny sposób.

Nanoklastry złota (Au NCs) to specjalny rodzaj nanomateriałów, które zawierają od kilku do kilkudziesięciu atomów metalu o rozmiarach mniejszych niż 2 nm. 14-17 Przyciągnęły one szerokie zainteresowania badawcze ze względu na ich dyskretną i zależną od wielkości strukturę elektronową,18,19 oraz absorpcje i emisje molekularne. 20-23 Tak unikalne właściwości materiałów, w szczególności silna fluorescencja, znalazły różnorodne zastosowania, takie jak wykrywanie i obrazowanie w systemach biologicznych. 24-32 Ultramałe fluorescencyjne Au NC mogą być syntetyzowane przy użyciu funkcjonalnych białek, takich jak albuminy surowicy, jako matrycy. 33 W typowej syntezie białkowej Au NC pewna ilość soli Au jest najpierw zamykana w białku, a następnie redukowana przez samo białko. Zdolność redukcyjną białka przypisuje się składowym funkcjonalnym resztom aminokwasowym (np. tyrozynie), które mogą być aktywowane przez zwiększenie pH roztworu do zasadowego. Rozwijanie struktury białka jest uważane za krytyczny etap tworzenia Au NC. Dzieje się tak, ponieważ w rozwiniętym białku więcej redukujących grup funkcyjnych może być narażonych na kapsułkowane sole Au. Rozwijanie białek można osiągnąć poprzez obróbkę cieplną lub wystawienie na działanie czynników denaturujących. Wprowadzenie leków małocząsteczkowych może również wpływać na proces rozwijania, czyli modyfikację temperatury denaturacji punktu środkowego oraz entalpii rozwijania. 34,35 Wpływ wszystkich tych czynników może być z kolei odzwierciedlony w kinetyce powstawania fluorescencyjnych Au NC i przejawiający się w intensywności fluorescencji wynikowych Au NC.36

Ten film demonstruje metodę badań przesiewowych leków poprzez syntezę Au NCs w białkach albuminy obciążonych lekiem w wyższej temperaturze (60 °C) lub w obecności czynników denaturujących (np. mocznika). Intensywność fluorescencji wynikowych Au NC jest odczytem sygnału. Po pierwsze, Au NC są syntetyzowane w matrycach HSA i BSA poddanych działaniu substancji w temperaturze 60 °C lub w obecności mocznika, aby pokazać, w jaki sposób rozwijanie się białek (wywołane obróbką cieplną lub denaturantami) wpływa na kinetykę powstawania Au NC. Po drugie, Au NC są syntetyzowane w matrycach białkowych wstępnie załadowanych różnymi lekami, a następnie badany jest wpływ obciążenia leku na względną intensywność fluorescencji wynikowych Au NC, które stanowią miarę względnej siły wiązania. Wreszcie, protokół badań przesiewowych leków Au NC jest modyfikowany pod kątem ilościowego pomiaru stałej wiązanialek-białko (K D) poprzez zmianę zawartości leku wstępnie załadowanego w białku o ustalonym stężeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki (SDS) wszystkich zaangażowanych chemikaliów przed użyciem. Eksperyment z badaniami przesiewowymi leków obejmuje syntezę i obchodzenie się z nanomateriałami, które mogą wiązać się z dodatkowymi zagrożeniami w porównaniu z ich masowymi odpowiednikami. Należy zapewnić wszystkie niezbędne środki kontrolne, które należy stosować przez cały czas trwania eksperymentu, w tym stosowanie kontroli inżynieryjnych (dygestoria) i środków ochrony osobistej (środki ochrony indywidualnej, np. długie spodnie ochronne, buty z zakrytymi palcami, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne).

1. Przygotowanie odczynników chemicznych do badań przesiewowych leków

  1. Prekursory do syntezy Au NCs
    1. Rozpuścić 30 mg roztworu chlorku złota (III) (99,99% w przeliczeniu na metale śladowe, 30% wag. w rozcieńczonym HCl) w 6,9 ml ultraczystej wody, aby przygotować 15 mM roztworu chlorku złota (III). Uwaga: roztwór chlorku złota jest i drażniący. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z oczami i skórą.
    2. Rozpuścić 74 mg HSA lub BSA w 1 ml ultraczystej wody, aby przygotować 74 mg/ml roztworu białkowego.
  2. Rozwiązania lekowe
    1. Rozpuść żądaną ilość leku, np. 1,9 mg dla (a) ibuprofenu, 2,8 mg dla (b) warfaryny, 2,3 mg dla (c) fenytoiny i 1,5 mg dla (d) sulfanilamidu w 20 μl DMSO, aby przygotować 450 mM roztworów podstawowych leku.
      Uwaga: DMSO jest wybierany jako rozpuszczalnik, ponieważ leki te są hydrofobowe i mają słabą rozpuszczalność w wodzie.
  3. Inne odczynniki
    1. Rozpuść 600 mg granulek NaOH w 10 ml ultraczystej wody, aby przygotować 1,5 M roztworu NaOH. Rozpuścić 2,4 g mocznika w 2 ml ultraczystej wody, aby przygotować 20 M roztworu mocznika.

2. Synteza białkowych Au NCs

  1. Szablony HSA AU NC (HSA-AU NC)
    1. Umieścić dwie szklane fiolki, z których każda zawiera mieszadło mikromagnetyczne, na dwóch oddzielnych mieszadłach magnetycznych z kontrolowaną temperaturą.
    2. Ustawić temperaturę jednego mieszadła magnetycznego na 60 °C i oznaczyć szklaną fiolkę na wierzchu jako "60 °C"; podczas gdy drugie mieszadło magnetyczne jest przechowywane w temperaturze pokojowej (RT), gdzie szklana fiolka na górze jest oznaczona jako "RT".
    3. Dodać 200 μl roztworu HSA, 200 μl ultraczystej wody i 200 μl roztworu chlorku złota (III) do każdej fiolki przy ciągłym mieszaniu (ustawionym na 360 obr./min, chyba że określono inaczej), aby umożliwić enkapsulację jonów Au wewnątrz matrycy białkowej.
    4. 2 minuty później dodać 20 μl roztworu NaOH do każdej fiolki, aby aktywować zdolność redukcyjną HSA w tworzeniu Au NC i rozpocząć rejestrowanie czasu reakcji jako 0 min.
    5. Co 20 minut pobieraj 50 μl roztworów z każdej próbki na czarną płytkę z 384 dołkami i mierz widmo emisji za pomocą czytnika mikropłytek. Typowa konfiguracja skanowania: λex = 370 nm, λem = 410 – 850 nm.
    6. Zatrzymaj mieszadło magnetyczne po 100 minutach.
    7. Ostudzić szklane fiolki pod bieżącą wodą w zlewie. Uwaga: Szklane fiolki są gorące. Nosić rękawice żaroodporne, aby uniknąć poparzenia.
    8. Wykreślić widma fotoemisyjne przez cały czas dla każdej próbki, aby uzyskać kinetykę powstawania Au NC w różnych warunkach temperaturowych.
  2. Szablony BSA AU (BSA-AU NCs)
    1. Umieść szklaną fiolkę zawierającą mieszadło mikromagnetyczne na mieszadle magnetycznym. Pozostaw temperaturę jako temperaturę pokojową.
    2. Zmieszać 200 μl roztworu BSA, 200 μl mocznika i 200 μl roztworu chlorku złota (III) w szklanej fiolce pod ciągłym mieszaniem.
    3. 2 minuty później dodać 20 μl roztworu NaOH, aby aktywować zdolność redukcyjną BSA do tworzenia Au NC i rozpocząć rejestrowanie czasu reakcji jako 0 min. Zmierzyć widmo fotoemisyjne mieszaniny reakcyjnej co godzinę.
      Uwaga: Widmo fotoemisyjne BSA-Au NC jest mierzone rzadziej, ponieważ szybkość tworzenia BSA-Au NC jest wolniejsza niż HSA-Au w tej samej temperaturze ze względu na mniejszą skuteczność mocznika w rozwijaniu białka.
    4. Zatrzymaj mieszadło magnetyczne po 7 godzinach. Wykreśl widma fotoemisyjne przez cały czas, aby zobaczyć kinetykę powstawania Au NC przez denaturację mocznika.

3. Badania przesiewowe leków małocząsteczkowych

  1. Badanie przesiewowe względnego powinowactwa wiązania różnych leków małocząsteczkowych do HSA
    1. Umieść pięć szklanych fiolek, z których każda zawiera mieszadło magnetyczne, na wielopunktowym mieszadle magnetycznym z kontrolowaną temperaturą. Oznacz te fiolki odpowiednio jako a, b, c i d odpowiednio dla każdego leku, a mianowicie ibuprofenu, warfaryny, fenytoiny i sulfanilamidu. Oznacz ten z czystym HSA jako kontrolę.
    2. Dodać 200 μl HSA do każdej fiolki. Dodać 1 μl roztworu leku do czterech odpowiednich fiolek. Dodać 1 μl DMSO do kontroli. Włączyć mieszadło i ustawić prędkość wirowania na 360 obr./min i inkubować przez 1 godzinę, aby umożliwić zakończenie wiązania leku z HSA.
    3. 1 godzinę później dodać 200 μl wody Milli-Q i 200 μl roztworu chlorku złota (III) do każdej fiolki, ciągle mieszając. Ustawić temperaturę na 60 °C przy ciągłym mieszaniu przez 10 minut. Dodać 20 μl 1,5 M NaOH do każdej fiolki i zacząć zapisywać czas reakcji jako 0 min.
    4. Szybko pobrać 50 μl roztworu z każdej fiolki na czarną płytkę z 384 dołkami i zmierzyć widmo emisyjne (wyniki oznaczone jako 0 min). Rejestrować widma emisyjne każdej próbki co 10 minut. Zbierz co najmniej cztery widma w czterech różnych momentach, tj. 0, 10, 20 i 30 minut.
    5. Powtórz kroki 3.1.1 - 3.1.4 kilka razy, aby uzyskać wyniki ze spójnym trendem. Zatrzymaj mieszadło magnetyczne.
    6. Wykreślić czasowo rozdzielcze widma fotoemisyjne dla każdej próbki (a-d i kontrola). Zidentyfikuj szczytową intensywność wszystkich próbek i wykreśl w zależności od czasu, aby porównać kinetykę powstawania Au NC w różnych matrycach białkowych obciążonych lekiem.
  2. Pomiar stałej wiązania określonego leku z HSA
    1. Powtórz kroki 3.1.1 – 3.1.4. Zastąp roztwór leku roztworami ibuprofenu o czterech różnych stężeniach (w tym próbce kontrolnej przy użyciu HSA tylko bez ładowania leku). Oznaczyć szklaną fiolkę zgodnie ze stężeniem leku.
    2. 10 minut później schłodzić szklane fiolki pod bieżącą wodą w zlewie. Uwaga: Szklane fiolki są gorące. Nosić rękawice żaroodporne, aby uniknąć poparzenia.
    3. Pobrać 50 μl powyższych roztworów z każdej fiolki na czarną płytkę z 384 dołkami i zmierzyć widmo emisyjne.
    4. Powtórz kroki 3.2.1 – 3.2.3 jeszcze dwukrotnie, aby uzyskać kolejne dwa zestawy wyników przy różnych stężeniach leku.
    5. Zatrzymaj mieszadło magnetyczne. Wykreśl widma fotoemisyjne i przeanalizuj wyniki.
      1. Dla surowych danych uzyskanych w każdej pojedynczej partii, należy wykreślić widma fotoemisyjne każdej próbki w oprogramowaniu, takim jak oprogramowanie OriginPro, i określić intensywność piku.
      2. Obliczyć i wykreślić względną intensywność fluorescencji [(I0 - I) /I0] w stosunku do stężenia leku, gdzie I i I0 odnoszą się do intensywności fluorescencji Au NC utworzonych odpowiednio w HSA obciążonym lekiem i czystym HSA.
      3. Oblicz stałą wiązania, dopasowując dane do modelu wiązania pojedynczego miejsca za pomocą równania Michaelisa-Mentena: Y = Rmax × C/(KD + C), gdzie Rmax oznacza maksymalny sygnał odpowiedzi, C jest stężeniem liganda, a KD jest stałą wiązania. Zrób to w oprogramowaniu takim jak OriginPro. Wybierz menu Dopasowanie analizy Dopasowanie krzywej nieliniowej, a następnie wybierz funkcję Hilla z kategorii Wzrost/Sigmoidalny. Na stronie Ustawienia: Wybór funkcji kliknij przycisk Dopasuj, aby wyświetlić dopasowane wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwijanie białek jest ważną procedurą dla tworzenia białkowych szablonowych Au NCs, ponieważ bardziej reaktywne grupy funkcyjne (np. reszty tyrozyny) białka mogą być eksponowane w celu zmniejszenia zamkniętych jonów Au i tym samym przyspieszenia tempa tworzenia Au NCs. Ogrzewanie i zewnętrzne czynniki denaturujące to dwa powszechne sposoby promowania procesu rozwijania białek. Rysunek 1 przedstawia wpływ ogrzewania i dodawania zewnętrznych środków denaturujących na kinetykę powstawania Au NC, w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka krytycznych kroków, które należy podkreślić w tej metodzie. W protokole badania przesiewowego względnego powinowactwa do wiązania różnych leków małocząsteczkowych, kroki 3.1.2, 3.1.3 i 3.1.4 mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników pokazujących spójny trend względnej siły wiązania. Na tych etapach działania polegające na dodawaniu substancji chemicznych i pobieraniu roztworów reakcyjnych do pomiaru powinny być wykonywane tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować efekt opóźnienia, a w celu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.N.T. pragnie podziękować Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR), Singapur za wsparcie finansowe w ramach grantu JCO CDA 13302FG063.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór chlorku złota (III), 30%Sigma-Aldrich484385, drażniące
Albumina surowicy ludzkiej, 96%Sigma-AldrichA1887
Albumina surowicy bydlęcej, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofen, 98%Sigma-AldrichI4883 
warfaryna, 98%Sigma-AldrichA2250
fenytoinaSigma-AldrichPHR1139
sulfanilamid, 99%Sigma-AldrichS9251
dimetylosulfotlenekSigma-AldrichD8418
mocznikSigma-AldrichU5128
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich
Mieszadło magnetyczneIKART5
Czytnik mikropłytekTecanInfinite M200
384-dołkowa Corning
5 ml pipeta wyporowaEppendorf
1,000 μ l pipeta wyporowaEppendorf
100 μ l pipeta wyporowaEppendorf
5,000 μ l Końcówki
1,000 μ l Końcówki
100 i #956; l Końcówki
Mikroprobówka 1,5 mlEppendorf
20 ml szklana fiolka z zakrętką
ml szklana fiolka z zakrętką
221465EppendorfEppendorfEppendorf 4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103(2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescent Gold NanoclustersProtein Targeting Drug ScreeningBinding Affinity MeasurementHuman Serum AlbuminFluorescence Intensity AnalysisGold Nanocluster FormationDrug Protein Binding ConstantMicroplate Reader EmissionTemperature Denaturing ConditionsUrea Denaturation Method

Powiązane artykuły