Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Podsumowanie

Ostatnio dostępne techniki nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zarówno propagacji, jak i mieszania wzorców motoryki jelit. Celem tego protokołu jest wyjaśnienie generowania i analizy map STmap przy użyciu systemu monitorowania ruchliwości przewodu pokarmowego (GIMM).

Streszczenie

Do rejestracji i oceny motoryki przewodu pokarmowego użyto wielu podejść, w tym: rejestrowania zmian napięcia mięśniowego, ciśnienia śródświetlnego i potencjału błonowego. Wszystkie te podejścia opierają się na pomiarze aktywności w jednym lub wielu miejscach wzdłuż jelita jednocześnie, które są następnie interpretowane w celu zapewnienia poczucia ogólnych wzorców ruchliwości. Ostatnio rozwój technik nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwił obserwację i analizę złożonych wzorców w całych segmentach okrężnicy i jelita ex vivo. Po nagraniu i zdigitalizowaniu nagrania wideo można przekształcić w STmaps, w których średnica światła jest konwertowana na skalę szarości lub kolor [tzw. mapy średnic (Dmaps)]. STmaps mogą dostarczać danych na temat kierunku ruchliwości (tj. stacjonarny, perystaltyczny, antyperystaltyczny), prędkości, czasu trwania, częstotliwości i siły wzorców ruchliwości skurczu. Do zalet tego podejścia należą: analiza interakcji lub jednoczesnego rozwoju różnych wzorców ruchliwości w różnych regionach tego samego segmentu, wizualizacja zmian wzorca ruchliwości w czasie oraz analiza, w jaki sposób aktywność w jednym regionie wpływa na aktywność w innym regionie. Nagrania wideo mogą być odtwarzane z różnymi skalami czasowymi i parametrami analizy, dzięki czemu można bardziej szczegółowo analizować oddzielne mapy ST i wzorce ruchliwości. Protokół ten szczegółowo opisuje skutki rozdęcia płynu śródświetlnego i bodźców śródświetlnych, które wpływają na generowanie ruchliwości. Zastosowanie agonistów i antagonistów receptorów luminalnych dostarcza mechanistycznych informacji na temat tego, w jaki sposób inicjowane są określone wzorce i jak jeden wzór może zostać przekształcony w inny. Technika ta jest ograniczona przez możliwość pomiaru tylko ruchliwości, która powoduje zmiany średnicy światła, bez dostarczania danych na temat zmian ciśnienia śródświetlnego lub napięcia mięśni, a także przez generowanie artefaktów w oparciu o konfigurację eksperymentalną; Chociaż metody analizy mogą wyjaśnić te problemy. W porównaniu z poprzednimi technikami, nagrywanie wideo i podejście STmap zapewnia bardziej kompleksowe zrozumienie motoryki przewodu pokarmowego.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 150 lat rozwinęły się różne metody rejestrowania i analizowania motoryki jelit ¹. Obejmowały one zarówno początkowe obserwacje in vivo i opisy Williama Beaumonta i Waltera Cannona, jak i nowsze metody pomiaru i interpretacji wielomiejscowego zapisu napięcia mięśniowego, ciśnienia śródświetlnego i/lub potencjału błonowego (tj. potencjałów połączeniowych) ^2-6. Te ostatnie podejścia zapewniają migawkę ogólnych wzorców ruchliwości, ale są ograniczone przez liczbę miejsc rejestracji i ważność interpolacji danych do obszarów między miejscami rejestracji.

Niedawny rozwój technik nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwił obserwację i analizę złożonych wzorców ruchliwości w całych segmentach okrężnicy i jelita ex vivo. Początkowe podejścia, po raz pierwszy opisane dla segmentów jelitowych pod koniec lat 90. ^7,8, opierały się na oprogramowaniu zaprojektowanym przez badaczy do analizy nagrań wideo; Kilka grup stworzyło lub zmodyfikowało oprogramowanie do tego celu ^2,8-12. Podczas gdy wiele grup wygenerowało własne pakiety oprogramowania lub wtyczki, wszystkie analizują średnice segmentu tkanki i konwertują te różne średnice na reprezentację w skali szarości. Dostępny na rynku system rejestracji i analizy zwany systemem monitorowania motoryki przewodu pokarmowego (GIMM) zapewnia podejście "pod klucz", które pozwala na analizę zarówno motoryki układu napędowego poprzez określenie prędkości wypluwki kałowej w dystalnej okrężnicy świnki morskiej ¹³, jak i analizę wzorców motoryki napędowej i mieszającej się z bodźcem płynnym w nienaruszonych segmentach jelita ^4,5,14-19. To ostatnie podejście zależy od generowania i analizy STmap i jest opisane w tym artykule. Celem tej metody jest zwiększenie zdolności do jakościowej i ilościowej analizy różnych wzorców motoryki występujących w jelicie. Podczas gdy inne grupy używały STmap do analizy ruchliwości za pomocą własnego oprogramowania, jest to pierwszy opis tego, jak używać GIMM do analizy wzorców ruchliwości poprzez generowanie STmaps. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące: przygotowania tkanek jelitowych do rejestracji wideo, prawidłowego ustawienia parametrów zapisu wideo w celu maksymalizacji możliwości wykrywania zmian średnicy tkanki, tworzenia STmap, a także interpretacji i analizy STmap za pomocą systemu GIMM i oprogramowania ImageJ.

Opisana tutaj metoda jest specyficzna dla analizy perfuzji świetlnej płynów lub półstałych zawierających związki, które wpływają na wzorce motoryki jelit. Metoda analizy napędu granulek kałowych została opisana w pracy Mawe i współpracowników ¹³. Opisana tutaj ogólna metoda może być zastosowana do innych rurkowatych narządów mięśni gładkich, takich jak: jelito cienkie, naczynia krwionośne, cewka moczowa, moczowody itp. Chociaż metoda ta sama w sobie nie dostarcza danych na temat zmian ciśnienia lub napięcia mięśniowego, można ją połączyć z użyciem przetworników ciśnienia, przetworników siły lub pomiarów elektrofizjologicznych, aby zapewnić pełniejszy obraz wzorców ruchliwości, jak wykazały niektóre inne grupy ^2,15,20,21.

Protokół

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Virginia Commonwealth zatwierdził wszystkie zwierzęta i procedury eutanazji stosowane w tym protokole.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotować 4 l buforu Krebsa (w składzie: [w mM]: 118 NaCl, 4,75 KCl, 1,19 KH₂PO₄, 1,2_MgSO4, 2,54 CaCl₂, 25_NaHCO3, 11 glukozy). Odważ odpowiednie ilości każdej stałej substancji chemicznej, umieść w odpowiedniej objętości wody dejonizowanej i mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.
2. Następnie napowietrzać roztwór karbtlenem (95%_O2, 5% CO₂) przez 30 minut, podgrzewając do temperatury 37 °C.
3. Oznaczyć pH roztworu w temperaturze 37 °C (tej samej temperatury co w łaźni organowej) i w razie potrzeby dostosować do pH 7,4 przy użyciu HCl. Utrzymywać bufor Krebsa w stanie ciągłego karbontowania i w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania doświadczenia.
4. Umieść rurki doprowadzające i odpływowe z pomp perystaltycznych do zbiornika buforowego i włącz pompy perystaltyczne, aby rozpocząć perfuzję buforu w całym systemie rurek i kąpieli narządowych.
   UWAGA: Bufor może być początkowo pompowany z powrotem do oryginalnego pojemnika do momentu dodania tkanki do kąpieli narządowej lub substancji chemicznych do buforu perfuzyjnego. Zmniejsza to całkowitą ilość bufora wymaganego do eksperymentowania. Następnie wychodzące linie perfuzyjne buforu należy umieścić w pustym pojemniku, tak aby przychodzące i wychodzące nie mieszały się.
5. Skalibrować temperaturę systemu grzewczego w cyrkulatorze kąpielowym tak, aby bufor w łaźni narządowej osiągnął i pozostał na poziomie 37,0 ± 0,5 °C przez cały czas trwania eksperymentu. Potwierdzić i w razie potrzeby zmodyfikować pH buforu Krebsa co najmniej jeszcze raz przed umieszczeniem segmentów tkanek w kąpieli w kroku 2.8.

2. Przygotowanie tkanek

1. Poddaj świnkę morską eutanazji poprzez wdychanie/uduszenie dwutlenkiem węgla w szczelnej komorze lub inną metodę eutanazji zatwierdzoną przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
2. Po potwierdzeniu eutanazji zwierzęcia należy rozciąć ścianę brzucha wzdłużnie nożyczkami preparacyjnymi i zlokalizować jelita. Przeciąć krezkę przyczepioną do jelita cienkiego, aby odsłonić jelito ślepe.
   UWAGA: Aby potwierdzić eutanazję, wykonaj wtórną procedurę, taką jak torakotomia obustronna, zatwierdzoną przez komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
3. Zlokalizuj dystalny koniec jelita ślepego i przetnij bliższą okrężnicę tuż dystalnie do jej połączenia z jelitem ślepym. Następnie ponownie przeciąć proksymalną okrężnicę ~ 8 cm dystalnie do pierwszego przecięcia.
4. Umieść tkankę jelita grubego w podgrzanym i nawęglanym roztworze Krebsa (opisanym w sekcji 1) w celu dalszej sekcji. Przypnij okrężnicę do wanny rozwarstwiającej i użyj mniejszego zestawu nożyczek, aby usunąć jak najwięcej krezki i tłuszczu.
5. Z podgrzewanej tacki preparacyjnej usuń całą zawartość śródświatełkową, delikatnie perfuzję buforu Krebsa przez światło za pomocą strzykawki połączonej z cewnikiem końcowym (aby zapobiec perforacji tkanki). Unikaj nadmiernego rozciągnięcia segmentu podczas tego procesu perfuzji.
6. Zaopatrzyć się w dwa cewniki szklane wypolerowane ogniowo (średnica 3 mm) i umieścić krótki kawałek rurki polietylenowej (o długości ~ 3 mm i średnicy ~ 3 mm) wokół części szklanej rurki wchodzącej w światło tkanki.
   UWAGA: Pozwoli to na umieszczenie szwu wokół tkanki, a szklana rurka pozostanie bezpieczna i nie ześlizgnie się podczas umieszczania preparatu w kąpieli narządowej oraz podczas zmian długości tkanki.
7. Wprowadzić jeden cewnik do ustnego końca preparatu tkankowego i zawiązać szew wokół małego kawałka rurki otaczającej cewnik za pomocą węzła chirurgicznego. Delikatnie spróbuj wyciągnąć cewnik z powrotem, aby upewnić się, że węzeł jest dobrze dopasowany. Następnie wykonaj tę samą czynność na drugim cewniku wchodzącym do brzusznego końca tkanki.
8. Po zabezpieczeniu cewników przenieś cały preparat (tkankę i cewniki) z tacki preparacyjnej do jednej z kąpieli narządowych. Umieścić preparat w kąpieli końcówką ustną skierowaną w stronę przeciwną do użytkownika.
9. Następnie zamontuj/przymocuj cewniki szklanej rurki do kąpieli narządowej za pomocą jednej z dwóch sugerowanych metod.
   UWAGA: Zabezpieczenie szklanych probówek zapobiega zmianie długości segmentu tkanki podczas eksperymentu lub wydostaniu się ponad poziom powierzchni buforu Krebsa w kąpieli.
   1. Opcja A: Przymocuj górną część szklanej rurki do górnej części boku plastikowej wanny organowej za pomocą glinki do formowania lub plastikowego klipsa.
   2. Opcja B: Przymocuj szklane rurki do metalowych słupków, które utrzymują kamery nad przygotowaniem do kąpieli organowej za pomocą plastikowych klipsów.
10. Po przymocowaniu cewników do wanny przymocuj 5-centymetrowy kawałek rurki do otwartego końca każdego cewnika. W przypadku cewnika doustnego podłącz tę rurkę do strzykawki o pojemności 10 ml, która będzie używana do wstrzykiwania buforu do światła bliższego odcinka okrężnicy. W przypadku cewnika aboralnego ten kawałek rurki pozwoli na skierowanie odpływu światła do pojemnika zbiorczego (zlewka 50 ml, zbiornik itp.).
11. Za pomocą strzykawki przymocowanej do końcówki ustnej powoli przepłucz podgrzany bufor Krebsa przez światło tkanki, aby upewnić się, że płyn może przepływać przez tkankę. Przepływ potwierdza płyn wychodzący z cewnika aborowego. Skalibrować system zapisu wideo (sekcja 3 protokołu), podczas gdy tkanka równoważy się przez 30 minut.

3. Kalibracja systemu nagrywania wideo

1. Skalibruj ustawienie wysokości kamery, ustawienia wideo dotyczące jasności i kontrastu oraz odległości w poziomie za pomocą oprogramowania.
   UWAGA: Najlepsze ustawienia dla konfiguracji perfuzji śródświetlnej różnią się od ustawień używanych do określania prędkości napędu granulek ¹³.
2. Kliknij zakładkę eksperymentu, aby zainstalować kamerę, która ma zostać skalibrowana. Następnie w menu "Plik" kliknij "Kalibruj".
3. Gdy film pojawi się w oknie "kalibracja stacji roboczej", ustaw kamerę na wysokości, na której obraz obejmuje końce cewników wprowadzonych w światło okrężnicy.
4. Następnie skalibruj odległość poziomą wyświetlaną na obrazie za pomocą przezroczystej naklejki linijki dołączonej do każdej wanny.
   UWAGA: Ta kalibracja ma kluczowe znaczenie dla późniejszych obliczeń programowych średnicy światła i prędkości fal skurczowych.
5. W tym samym oknie "kalibracja stacji roboczej" ustaw czerwone pionowe linie pomocnicze tak, aby były oddalone od siebie o 10 mm zgodnie z linijką na obrazie z kamery. Następnie wpisz odpowiednią odległość (10 mm) w oknie "kursory odległości" i kliknij przycisk "CAL".
6. Następnie dostosuj suwaki wzmocnienia, jasności i migawki w oknie "kalibracja stacji roboczej", aby zmodyfikować obraz z kamery tak, aby segment tkanki wyglądał jak ciemna sylwetka na jasnym tle.
   UWAGA: Rysunek 4 przedstawia dobre i złe przykłady tej procedury kalibracji.
7. Aby prawidłowo wyregulować obraz, wyreguluj również pokrętła ostrości i przysłony na samym aparacie.
8. Kalibracja została zakończona. Kliknij "Zapisz", następnie kliknij "OK" w wyskakującym okienku, a na koniec kliknij przycisk "WYJDŹ".

4. Ogólne procedury eksperymentalne

1. Po zakończeniu procedur kalibracji kamery i 30 minutach równoważenia tkanek nazwij badania w każdym protokole eksperymentalnym. Nazwy badań mogą być oparte na nazwie i stężeniu związku oraz objętości płynu przenikającego śródświetlnie do segmentu tkanki podczas tej części eksperymentu.
2. Następnie należy zatkać rurkę wystającą z cewnika brzusznego za pomocą zacisku rurkowego.
   UWAGA: Zapobiega to wydostawaniu się cieczy luminalnej na zewnątrz końca przewodu pokarmowego podczas dalszych eksperymentów, umożliwiając użycie określonych objętości w świetle w celu wywołania różnych poziomów rozprężenia (ryc. 1).
3. Wstrzyknąć około 0,7 ml buforu Krebsa do bliższego światła okrężnicy, aby zapewnić wystarczające rozdęcie do zainicjowania skurczów napędowych w preparacie ex vivo świnki morskiej.
   UWAGA: Objętość ta może się nieznacznie różnić (0,1 - 0,2 ml) w zależności od całkowitej długości nienaruszonego segmentu i stopnia rozciągnięcia zastosowanego do segmentu w kąpieli narządowej.
4. Gdy segment zostanie rozdęty przez płyn świetlny, włącz kamerę, a następnie rejestruj ruchliwość przez określony czas (np. 10 minut).
   1. W szczególności kliknij dwukrotnie odpowiednio nazwaną próbę, aby otworzyć eksperymentalny widok kamery, a następnie kliknij przełącznik w pozycji "ON", aby wyświetlić pole kamery. Następnie kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie (przycisk nagrywania pozostanie czerwony, gdy kamera nagrywa) i ponownie kliknij przycisk nagrywania, aby zatrzymać nagrywanie.
5. Pod koniec tej wstępnej próby rozdęcia kontrolnego poluzuj/usuń zacisk zamykający cewnik brzuszny, aby umożliwić segmentowi tkanki wypchnięcie rozdętego płynu ze światła.
6. Po 10-minutowym okresie przywracania równowagi powtórzyć tę procedurę z dowolnym z różnych składników odżywczych, środków bioaktywnych, leków lub agonistów/antagonistów w płynie luminalnym w celu modyfikacji ruchliwości układu napędowego segmentu (np. krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe lub kwas dekanowy) ^10,18.
   1. Aby pomóc ocenić, kiedy nowy płyn eksperymentalny dostanie się do segmentu okrężnicy, pozostaw pęcherzyk powietrza w pobliżu portu strzykawki, tak aby po perfuzji nowego roztworu do światła okrężnicy postęp pęcherzyka pozwolił użytkownikowi wiedzieć, kiedy eksperymentalny płyn osiągnął światło.
   2. Kontynuować perfuzję śródświateł z otwartym cewnikiem aboralnym, aż pęcherzyk zostanie całkowicie przepchnięty przez system perfuzji światła (może wymagać 2-3 ml perfuzatu). Następnie pozwól segmentowi tkanki wydalić płyn przez otwarty cewnik brzuszny przez maksymalnie 5 minut.
      UWAGA: Po tej procedurze światło będzie zawierało znikomą objętość płynu, co pozwoli na perfuzję znanej objętości płynu do światła.
7. Ponownie zatkać rurkę cewnika światła jamy ustnej za pomocą zacisku rurkowego (jak w kroku 4.3), wstrzyknąć przez strzykawkę taką samą objętość płynu rozdętego, jak w stanie kontrolnym. Zapisz wzorce ruchliwości w okresie eksperymentalnym w celu późniejszej analizy i porównania z kontrolnym stanem Krebsa (jak w kroku 4.5).
8. Powtórzyć sekcje 4.4 - 4.7 protokołu z różnymi związkami luminalnymi lub różnymi stężeniami tego samego związku luminalnego.

5. Budowa map czasoprzestrzennych (STmaps)

1. Po zakończeniu nagrywania eksperymentu kliknij dwukrotnie nazwę konkretnego badania, aby otworzyć okno analizy do budowy STmap.
2. W obszarze odtwarzania wideo dostosuj suwaki kontrastu i jasności w oknie analizy, aby obraz był odpowiedni do analizy (sylwetka czarnej tkanki na jasnym tle; Rysunek 4).
   UWAGA: Jeśli kalibracja kamery nie została wykonana prawidłowo przed rozpoczęciem eksperymentu, obraz może być w tym momencie zmodyfikowany tylko w mniejszym stopniu.
3. Po prawidłowym skontrastowaniu obrazu ustaw poziome i pionowe czerwone linie pomocnicze w oknie obrazu wideo, aby wyizolować obszar tkanki do analizy i usunąć obszary zawierające artefakty. Należy również wybrać odpowiedni segment czasu z nagrania, określając punkty czasu rozpoczęcia i zakończenia analizy.
   1. W szczególności wybierz punkt początkowy i końcowy w filmie za pomocą zielonych przycisków "A" i żółtych "B" w oprogramowaniu do analizy. Ustaw suwak czasu na początku segmentu wideo do analizy, a następnie kliknij zielony przycisk "A". Następnie ustaw suwak na końcu segmentu do analizy i kliknij żółty przycisk "B".
4. Następnie kliknij zakładkę "analiza silnika", aby otworzyć okno STmap i kliknij przycisk "stoper". Po kliknięciu stopera, następnie kliknij kursor krzyżyka w czarnej sylwetce tkanki w nagranym filmie, aby rozpocząć generowanie STmap.
5. Po kliknięciu krzyża nitkowego w sylwetce tkanki, oprogramowanie generuje i wyświetla STmap dla tego regionu wideo.
   UWAGA: Może to potrwać kilka minut w zależności od długości filmu wybranego do analizy.
6. Kliknij "powiększenie", aby wyświetlić powiększony obraz STmap i elementy sterujące, aby dostosować obraz.
   1. Kliknij opcję "kolor" w nowo utworzonym oknie, aby wyświetlić STmap jako kolor, a nie w skali szarości. Kliknij także opcję "Włącz", aby móc umieścić kursor na określonych pikselach na mapie i wyświetlić śledzenie zmiany średnicy światła dla tego konkretnego obszaru tkanki. Kliknij "Wyjdź" po zakończeniu.
7. Wyeksportuj STmap do wykorzystania w artykułach lub prezentacjach lub do dalszej analizy w ImageJ, wybierając menu "Plik", a następnie wybierz "Eksportuj dane", a następnie "Meta File". Następnie nazwij STmap, który zostanie zapisany jako plik .emf i kliknij przycisk "Zapisz".
8. Alternatywnie zapisz obrazy STmap, przechwytując zrzut ekranu. Jest to konieczne, aby zapisać pseudo-kolorowe wersje STmap.

6. Analiza prędkości fali skurczowej w STmaps

1. Aby przeanalizować prędkość propagacji skurczu lub czas trwania skurczu, najpierw przekonwertuj plik STmap .emf na formaty .tiff, .gif, .jpg lub .bmp, które są akceptowane przez ImageJ za pomocą wybranego programu do konwersji plików.
   UWAGA: ImageJ nie otwiera wyjścia w formacie .emf STmaps z oprogramowania.
   1. Alternatywnie użyj oprogramowania do przechwytywania zrzutów ekranu, aby zrobić zdjęcie STmap na ekranie i zapisać je w odpowiednim formacie pliku.
2. Następnie otwórz ponownie sformatowaną mapę STmap w ImageJ, a następnie otwórz wtyczkę GIMMProcessor, otwierając menu "Wtyczki" i wybierając "GIMMProcessor". Spowoduje to otwarcie okien "GIMMProcessor" i "Tabela pomiarów".
3. Kliknij "prostokątne narzędzie do zaznaczania" w oknie ImageJ, a następnie użyj go do obrysowania, klikając i przeciągając cały obszar paska skali w prawym górnym rogu STmap. Po wybraniu tego regionu kliknij przycisk "ustaw kalibrację" we wtyczce. Na koniec włóż odpowiednią odległość (mm) i czas (s) do pola kalibracji zgodnie z wartościami na pasku skali i kliknij "Gotowe".
4. Następnie kliknij narzędzie do rysowania linii w oknie ImageJ. Narysuj linię na STmap przechodzącą przez środek propagacji skurczu wzdłuż kąta nachylenia, klikając i przeciągając obraz STmap. Alternatywnie narysuj pionową linię przechodzącą przez pasmo nierozprzestrzeniającego się skurczu, aby określić czas trwania skurczu.
5. Po odpowiednim narysowaniu linii (w danym momencie może być narysowana tylko jedna linia), kliknij przycisk "wykonaj pomiar" we wtyczce, aby wygenerować odczyt odległości poziomej, odległości pionowej i nachylenia linii, które odpowiadają odpowiednio długości (mm), czasowi (s) i prędkości (mm/s). Dane te są wyświetlane w oknie 'Tabela pomiarów'.
6. Powtórz kroki rysowania linii i analizy wiele razy w ramach danej mapy STmap i zapisz dane jako plik .gmd. Kliknij przycisk "Zapisz" we wtyczce i nazwij plik. Następnie ponownie kliknij "Zapisz", aby zakończyć proces. Dane te można później porównać z innymi danymi z badania lub wykorzystać do ponownego narysowania linii na mapie STmap.

Wyniki

Rozumienie map czasoprzestrzennych (STmaps) jako map średnicy (Dmaps)

Podczas gdy mapy generowane tą techniką są czasoprzestrzenne, zmiana średnicy światła tkanki jest parametrem specjalnie wizualizowanym zarówno pod względem odległości, jak i czasu. STmap przedstawia odległość poziomą wzdłuż segmentu tkanki na osi x (w mm) i czas na osi y (w sekundach) z czasem początkowym na górze i czasem końcowym na dole. W prawym górnym rogu znajduje się legenda, która wyświetla minimalne i maksymalne średnice światła, a także skalowanie dla osi x i y (rysunki 1-4). W związku z tym różne odcienie pikseli na obrazie w skali szarości odpowiadają różnym średnicom światła. Ciemniejsze piksele odpowiadają szerszym średnicom, a jaśniejsze piksele odpowiadają mniejszym średnicom. W ten sposób fale skurczowe mięśnia okrężnego pojawią się jako obszary jaśniejszej pikselizacji z powodu zmniejszenia średnicy światła (ryc. 1 czarne strzałki). W przeciwieństwie do tego, rozdęcie światła spowodowane rozluźnieniem mięśni okrężnych lub dużym bolusem płynu spowoduje wzrost średnicy światła i ciemniejsze piksele w STmap/Dmap (Rysunek 1C, białe strzałki). Dalsza dyskusja na temat powstawania i znaczenia STmap znajduje się w artykule Lammersa grupy¹¹.

Skurcze propagacyjne wywołane rozdęciem światła

Na rysunku 1, proksymalna okrężnica świnki morskiej była rozdęta 0,5, 1,0, 1,5 i 2,0 ml buforu Krebsa przez 5 minut przy każdej objętości. Rozprzestrzeniające się skurcze zostały wywołane przez wszystkie objętości ≥1,0 ml i pojawiają się jako cienkie białe pasma na STmap (ryc. 1). Rozdęcie światła jelita powoduje inicjację skurczów rozchodzących się. Jak pokazano na rysunku 1, średnica światła zwiększa się wraz ze wzrostem objętości wewnątrzświetlnej, a piksele w STmap odpowiadające tej średnicy stają się ciemniejsze, tworząc ogólnie ciemniejsze tło. Przy pewnym poziomie rozdęcia aktywowany jest odruch perystaltyczny (1,0 ml; Ryc. 1), który inicjuje fale napędowe skurczu na końcu jamy ustnej, które zmniejszają średnicę światła i przesuwają się w kierunku odbytowego końca segmentu (pokazanego jako białe paski na rysunkach 1 i 4). Biały pas reprezentujący skurcz jest często poprzedzony ciemnym paskiem, który reprezentuje aboral relaksację przed falą perystaltyczną (ryc. 1C, białe strzałki). Te białe i ciemne piksele odpowiadają odpowiednio rosnącym składowym skurczu i opadającej relaksacji odruchu perystaltycznego ^22,23. Na STmapie na rysunku 1 panel A znajduje się 0 fal napędowych przy 0,0 ml, 0 fal napędowych przy rozprężeniu 0,5 ml, 3 fale napędowe przy rozprężeniu 1,0 ml, 6 fal napędowych przy rozprężeniu 1,5 ml i 5 fal napędowych przy rozprężeniu 2,0 ml.

Stacjonarne/Mieszające Skurcze Wywołane Składnikami Odżywczymi

Fale rozprzestrzeniającego się skurczu nie są jedynym wzorcem ruchliwości, który może być zwizualizowany przez STmaps. Mieszające się wzorce ruchliwości, takie jak segmentacja, można również zobaczyć w STmaps i odpowiadającym im obrazie (ryc. 2A). Ten wzorzec różni się od rozprzestrzeniania się skurczów. Podczas mieszania wzorów wiele małych, stacjonarnych skurczów występuje w różnych obszarach w tym samym czasie (wizualizowanych jako wiele małych białych kwadratów w tej samej linii poziomej, ale nie stykających się ze sobą). Podczas gdy każdy skurcz segmentowy jest nieruchomy i nie porusza się w sposób oralny do odbytu, jak opisano dla skurczów propagacyjnych, zdolność STmap do ilustrowania złożonych wzorców skurczu w długich okresach czasu pozwala na wizualizację powolnego postępu skurczów odbytu w czasie (Figura 2A strzałka). Czas trwania każdego pojedynczego skurczu można również określić, rysując pionową linię przez biały kwadrat skurczu za pomocą ImageJ i powiązanej wtyczki (Rysunek 2A). W tym konkretnym STmap wygenerowanym z wewnątrzokrężniczej perfuzji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych średni czas trwania skurczu stacjonarnego wynosi ~ 2 sekundy (zakres: 1,9 do 2,1 sekundy). Podczas gdy krezka pozostająca na segmencie tkanki może powodować artefakty w analizie, artefakty linii pionowej generowane przez krezkę (ryc. 1B, 2B) można wykorzystać do określenia podłużnych ruchów mięśni. Na rysunkach 1B i 2B ruch poziomy czarnej pionowej linii jest spowodowany skurczem i rozluźnieniem mięśnia podłużnego. Ten boczny ruch mięśni podłużnych można zobrazować na mapach STmap jako poziome ruchy pionowych pasm generowane przez artefakty krezki (ryc. 1B, 2B).

ImageJ i analiza wtyczek STmaps

Zarówno prędkość rozchodzącej się fali (Rysunek 3), jak i czas trwania skurczu (Rysunek 2) można określić za pomocą ImageJ i wtyczki GIMMProcessor. Na rysunku 3 prędkość rozchodzenia się zarówno fal ortogradyjnych, jak i wstecznych wynosiła ~ 0,25 mm/s (zakres: od 0,21 do 0,35 mm/s). Jak widać na obrazie wideo nad mapą ST, linie analizy (czerwone linie tworzące ramkę na obrazie wideo) zostały ustawione dokładnie wokół jednej krawędzi segmentu tkanki, a nie wokół całego segmentu. Jest to ważne zastosowanie wytycznych zawartych w oprogramowaniu. Precyzyjne ustawienie tych wytycznych jest kluczowe dla właściwej analizy filmu, która jest dalej analizowana w sekcji dyskusji. Pozwala to na wygenerowanie STmap, który wizualizuje miogenne skurcze falowania ²⁴. Skurcze te są pochodzenia miogennego i nie zmieniają znacząco średnicy światła. Za pomocą tej techniki można również analizować różne kierunki propagacji (ortograd lub wstecz), które są wspólne dla zmarszczek, (ryc. 3). Jak pokazano na rycinie 2, czas trwania skurczu może się różnić w różnych regionach segmentu tkanki.

Właściwa analiza map STmaps

Jednym z potencjalnych problemów z tworzeniem STmaps jest możliwe generowanie artefaktów ze względu na metodologię eksperymentalną. Na przykład krezka pozostawiona na zewnątrz tkanki zwiększy odczyt średnicy tego segmentu tkanki, tworząc pionową czarną linię na STmap (ryc. 1, 2B). Obecność krezki powoduje również sztuczne poszerzenie mapy skali szarości poprzez zwiększenie najszerszego pomiaru światła, co skutkuje stępieniem pomiarów kontrastu skali. Z tego powodu najlepiej jest usunąć krezkę tak całkowicie, jak to możliwe z segmentu, bez perforacji tkanki. Innym możliwym artefaktem STmap jest biała pionowa linia spowodowana pęcherzykami w płynie świetlnym, której nie można skontrastować z czernią (Rysunek 4B). Bąbelki te mogą sprawić, że średnica światła będzie wydawać się mniejsza dla oprogramowania analitycznego lub nałożą się na białe/jasne obszary na wzorce ruchliwości w STmap. W związku z tym ustawienie segmentu tkanki i odpowiednie kontrastowanie nagrania wideo przed analizą są absolutnie kluczowe dla powodzenia w konstruowaniu STmap (ryc. 4). Prawidłowe i niewłaściwe ustawienia kontrastu pokazano na rysunku 4. Ważne jest, aby pamiętać, że regulacja wideo zarówno w oknie kalibracji kamery przed eksperymentem, jak i w oknie analizy po eksperymencie ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego generowania i analizy STmap. Niewłaściwa kalibracja obrazu może prowadzić do tego, że STmaps będą zawierały bezużyteczne dane (Rysunek 4A).

Rysunek 1. Rozchodzące się fale w bliższej okrężnicy. (A) Krzywa dystencjonalijno-zwrotna (wykonana w proksymalnej okrężnicy świnki morskiej) została wykorzystana do określenia odpowiedniej objętości płynu śródświetlnego do zainicjowania fal rozchodzących się w tym segmencie (białe pasma poziome). Czarne strzałki ilustrują przykłady rozchodzących się fal na całej długości. Białe strzałki ilustrują artefakt linii spowodowany niekompletnym usunięciem krezki. (B) Bliższe spojrzenie na propagację skurczów osiągniętych przez generowanie STmap z eksperymentu podobnego do Panelu A, ale film o krótszym czasie trwania. Łatwiej jest zauważyć, że skurcze postępują w kierunku oralnym do odbytu i zidentyfikować poprzedzające rozluźnienie aboralne reprezentowane jako ciemny obszar przed białym paskiem w porównaniu z panelem A. Ta mapa zapewnia również inny widok artefaktów krezki. Czerwona ramka identyfikuje obszar tej STmapy rozwinięty w Panelu C. (C) Ten panel ilustruje jeszcze dokładniejszy widok tego samego filmu i mapy, co w panelu B. Białe strzałki oznaczone jako "Płynne rozciągnięcie" wskazują na ciemne piksele, które są spowodowane rozciągnięciem światła przez płyn aboralny do rozchodzącej się fali. Są to obszary, w których następuje rozluźnienie mięśni okrężnych od abralnego do okrężnego. Zauważ, że rozchodzące się skurcze wyglądają jak całkowicie poziome linie w panelu A ze względu na długą skalę czasową mapy. W panelach B i C skale czasowe są stopniowo skracane, tak że fala skurczowa ma nachylenie, które można zmierzyć i podać jako prędkość ruchu fali. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Określanie czasu trwania skurczu za pomocą STmap. (A) Okrężnica proksymalna świnki morskiej wykazuje wzorzec ruchliwości mieszanej/segmentowej w odpowiedzi na wewnątrzświetlną perfuzję krótkołańcuchowego kwasu tłuszczowego (maślanu). Pionowe czerwone linie zostały narysowane przez okresy skurczu, aby określić czas trwania skurczu za pomocą Image J i wtyczki GIMMProcessor. strzałka pokazuje aboral kierunek rozchodzenia się stacjonarnych skurczów. (B) Rozprzestrzeniające się skurcze w jelicie krętym myszy często wykazują obszary trwałego skurczu. Pionowe strzałki narysowane na tej mapie pokazują, że więcej obszarów jamy ustnej pozostawało skurczonych przez dłuższy czas. W tym preparacie końcówka analna preparatu została zamknięta, aby zapobiec wydostawaniu się płynu z zamkniętego układu podczas skurczów tkanek. Obraz w górnej części panelu pokazuje czas, w którym cały koniec jamy ustnej tkanki jest skurczony (biały na STmap), podczas gdy cały koniec odbytu jest rozszerzony przez płyn (na STmap). Poziomy/boczny ruch pionowej czerni w środku panelu B STmap pokazuje ruch podłużnej warstwy mięśniowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Dwukierunkowe wzorce ruchliwości. Fale rozchodzące się mogą poruszać się zarówno w kierunku ortogradycznym (oralnym do odbytalnym), jak i wstecznym (analnym do oralnego). Ciągłe czarne strzałki pokazują normalną propagację ortogonalną, a przerywane czarne strzałki pokazują propagację wsteczną. Prędkość propagacji zarówno skurczów ortogonalnych, jak i wstecznych w tej STmap została określona przez analizę ImageJ i wynosiła ~ 0,25 mm/sek. Linie analizy obrazu (czerwone linie tworzące ramkę na obrazie wideo nad STmap) zostały ustawione blisko jednej krawędzi tkanki, aby uwidocznić miogenne skurcze falowe, które mają niską amplitudę, płytkie skurcze często zorientowane w ortogradii, wstecznej lub w obu kierunkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Znaczenie odpowiedniego kontrastu obrazu dla generowania STmap. (A) pokazuje obraz o niewłaściwym kontraście i STmap, podczas gdy panel B pokazuje obraz o odpowiednim kontraście i STmap. W (A) poziome białe pasma wygenerowane z odpowiednio skontrastowanego obrazu (B) nie są tak oczywiste i występuje wiele artefaktów (białe cieniowanie) ze względu na to, że początkowy obraz jest w skali szarości. W STmapie wygenerowanej z odpowiednio skontrastowanego obrazu (B) znikają artefakty białego cieniowania skali szarości, a rozchodzące się fale są bardziej wyraźne. Również czarne cieniowanie reprezentujące relaksację przed rozchodzącą się falą skurczową można zobaczyć na końcu odbytu STmap przy każdej fali skurczu. W panelu B białe strzałki ilustrują artefakt STmap wygenerowany przez obszar obrazu, którego nie można było odpowiednio skontrastować. Ten rodzaj artefaktu jest głównie spowodowany pęcherzykami śródświetlnymi, które czasami pojawiają się w preparacie w trakcie trwania protokołu eksperymentalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Motoryka jelit została obejrzana i opisana z wielu perspektyw w oparciu o charakter rejestrowanych parametrów. Nagrywanie wideo i mapowanie czasoprzestrzenne okazały się cennym narzędziem, które umożliwia analizę ogólnego ruchu i/lub napędu na długich odcinkach jelita, a także analizę aktywności w określonych punktach wzdłuż tego segmentu. Podejście przyjęte do rejestracji wideo i mapowania czasoprzestrzennego może być dwojakie i odzwierciedla badany obszar oraz charakter zawartości światła. W odcinkach jelita, w których treść światła jest bardziej płynna, oraz w bliższej części jelita grubego, gdzie treść jest bardziej półstała, aktywność jest indukowana przez doświetlne wprowadzenie płynu za pomocą bolusa lub wlewu. Mapy czasoprzestrzenne wykonane z tych nagrań wideo są zaprojektowane tak, aby przedstawiać ruch całego segmentu, jak opisano powyżej. W przeciwieństwie do tego, w środkowej i dalszej części okrężnicy, gdzie zawartość jest bardziej stała, aktywność jest inicjowana przez wprowadzenie osadu kałowego (naturalnego granulatu pokrytego żywicą epoksydową lub sztucznego osadu), a mapy czasoprzestrzenne są zaprojektowane tak, aby odzwierciedlić ruch osadu przez okrężnicę, jak pokazano w artykule JOVE Hoffmana i wsp. ¹³. W związku z tym przygotowanie eksperymentu i analiza są kluczowe i zależą od rodzaju bodźca i badanego regionu. W związku z tym kluczowymi etapami generowania i analizy czasoprzestrzennych map ruchliwości jelit indukowanej płynem są: 1) prawidłowe usunięcie krezki z wypreparowanej tkanki; 2) prawidłowa kalibracja obrazu przed nagraniem; 3) prawidłowe usuwanie artefaktów podczas generowania i analizy STmap; 4) prawidłowe ustawienie systemu analizy; oraz 5) uzyskanie sprawności manualnej w zakresie cewnikowania i zszywania segmentów bez ich uszkadzania.

Podczas gdy zastosowanie STmap średnicy światła poprawiło zdolność do wizualizacji i analizy wzorców pełnej ruchliwości w regionie jelita, technika ta najlepiej sprawdza się w połączeniu z funkcjonalnymi pomiarami ciśnienia lub skurczu mięśni ^2,15,20. Na przykład, podczas gdy niektóre skurcze mięśni mogą nieznacznie zmieniać średnicę światła i być widoczne na niektórych STmapach (tj. zmarszczkach miogennych), mogą w rzeczywistości nie powodować żadnego napędu ani mieszania treści jelitowej ²⁵. Nie można tego stwierdzić bez sprzężenia tej techniki z innymi pomiarami funkcjonalnymi. Również charakter wielu preparatów tkankowych w tego typu systemie (tj. zamknięty układ luminalny lub stała perfuzja światła przez system pompy) prowadzi do artefaktów w STmaps. W związku z tym użytkownik musi być świadomy tego, w jaki sposób jego specyficzne przygotowanie narządu i eksperyment może prowadzić do artefaktów w danych oraz sposobów uniknięcia lub wykluczenia tych artefaktów w analizie danych (np. pionowe linie wywołane krezką lub ciemna pikselizacja spowodowana niezdolnością tkanki do wydalenia płynu z systemu w zamkniętym preparacie świetlnym). Istnieje wiele metod perfuzji światła nienaruszonego odcinka jelita oprócz systemu zamkniętego. Jedną z metod jest zamiast tego użycie systemu otwartego, który utrzymuje stałe ciśnienie śródświetlne/zwrotne dzięki zastosowaniu podniesionej rurki i/lub zaworu jednokierunkowego na końcu odbytu preparatu ^8-10,30. Pozwala to płynowi na wydostanie się z preparatu podczas skurczów napędowych.

Ponieważ system jest skonfigurowany głównie do wykrywania zmian średnicy światła, te skurcze lub wzorce ruchliwości, które nie wpływają znacząco na średnicę światła, są często trudne do zobrazowania za pomocą tego protokołu. Ponieważ zmiany w cieniowaniu pikseli w STmap opierają się na zmianach średnicy światła, wzorce ruchliwości, które nie powodują dużych zmian średnicy, nie będą dobrze wizualizowane w tej metodzie, jeśli silne skurcze są również obecne w tym samym nagraniu. Jak opisano w przypadku wizualizacji i analizy skurczu typu tętnienia (ryc. 3), ustawienie linii analizy w nagraniu wideo bliżej ściany tkanki może zapobiec temu problemowi. Ta metoda zmniejsza maksymalną średnicę wyświetlaną w STmap, dzięki czemu można zobrazować skurcze, które tylko minimalnie zmieniają średnicę tkanki. Inną opcją rozwiązania tego problemu jest zmiana czasu trwania analizowanego segmentu wideo, aby wykluczyć skurcze, które w dużym stopniu wpływają na średnicę światła, dzięki czemu mniejsze skurcze są łatwiej uwidocznione. Prowadzi to do potencjalnego problemu ruchliwości, który minimalnie zmienia średnicę światła, co wygląda podobnie do oddzielnej STmap, gdzie skurcze znacznie zmieniły średnicę światła. Dzieje się tak dlatego, że określenie białych pikseli na mapie opiera się na najmniejszej średnicy w danym filmie. Jeśli na filmie nie ma dużej zmienności średnicy (niewielki skurcz mięśnia okrężnego lub jego brak), bardzo małe skurcze, które nie zmieniają znacznie średnicy preparatu, mogą wyglądać podobnie do skurczów perystaltycznych z innego filmu. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę legendę rysunku w prawym górnym rogu mapy. Jeśli różnica między średnicą maksymalną i minimalną jest niewielka, ważne jest, aby porównać STmap z filmem, z którego został wygenerowany, aby określić ważność zmiany odcienia pikseli przedstawionej w STmap. W związku z tym badanie skali w połączeniu z rzeczywistym zapisem ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji mapy.

Nagrywanie wideo i mapowanie czasoprzestrzenne segmentów jelita grubego i okrężnicy zastosowano do różnych gatunków, w tym danio pręgowanego ²⁶, myszy ^25,27-30, szczura ^7,9,30-33, świnki morskiej ^{5,6,8,13-19,24,30,32,34,35}, oposa zaroślowego ^12,36, królika ^2,30,37,38, kurczaka ³⁹, świni ^40,41 i człowieka ⁴². Najszerzej badanym gatunkiem jest świnka morska. Nie jest to zaskakujące, ponieważ jelitowy układ nerwowy świnki morskiej został najpełniej scharakteryzowany i historycznie był zwierzęciem najlepiej zbadanym in vitro pod względem ruchliwości układu napędowego jelita ⁴³. Mapowanie czasoprzestrzenne było najczęściej stosowane do rurkowatych odcinków jelit małych zwierząt; Jednak badania na królikach i świniach z wykorzystaniem zmodyfikowanych systemów wykazują zastosowanie tej metodologii do większych zwierząt. W przypadku królika podejście jest identyczne jak w przypadku mniejszych zwierząt, z wyjątkiem tego, że zastosowano większe segmenty i kąpiele narządowe ³⁰. Podejście zastosowane u świni polegało na użyciu zewnętrznej pętli jelita od znieczulonej świni, a nie na zanurzeniu wypreparowanego segmentu tkanki w kąpieli narządowej. Ponadto STmapy zostały wygenerowane przez korelację krzyżową, a nie metodę transiluminacji stosowaną w większości badań ⁴⁰. Izolowany, perfuzjonowany naczyń krwionośnych preparat pętlowy do nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego został również zastosowany do mniejszych gatunków, takich jak szczur ³³. Niedawne badanie przeprowadzone przez Kuizenga i wsp. jest pierwszym zastosowaniem STmap zarejestrowanych wideo wzorców ruchliwości w segmentach ex vivo ludzkiego jelita ⁴²; chociaż podejścia STmapping zostały zastosowane do analizy zapisów manometrycznych (ciśnienia) u ludzi in vivo ^3,44. Zarejestrowane wzorce ruchliwości w tkance ludzkiej są podobne do tych już zarejestrowanych w modelach zwierzęcych przy użyciu podobnych technik i potwierdzają rozszerzenie tego podejścia na tkanki ludzkie. Warto zauważyć, że w badaniu tym połączono STmapy pochodzące z nagrań wideo z pomiarem skurczu mięśni zarejestrowanym przez przetworniki siły. Pomiar ciśnienia śródświetlnego za pomocą światłowodowego cewnika manometrycznego wprowadzonego do segmentu ex vivo został również przekształcony w STmap, co pokazuje wszechstronność STmap w wizualizacji czegoś więcej niż tylko zmian średnicy światła. To połączone podejście korelujące napięcie mięśniowe, ciśnienie śródświetlne i ruchy ścian pozwala na bardziej dogłębną analizę funkcjonalną map STmaps wygenerowanych na podstawie nagrania wideo.

Badania STmap generowanych na podstawie ruchów ścian i zmian średnicy światła (zwanych również Dmapami) pozwoliły na szczegółowe opisy wzorców ruchliwości, takich jak pulsujące fale perystaltyczne i zlokalizowane skurcze segmentowe. Podczas gdy wzorce te zostały zidentyfikowane za pomocą wcześniejszych metod eksperymentalnych, obecne podejście pozwala na bardziej precyzyjną definicję zlokalizowanych ruchów skurczowych, takich jak zmarszczki i nowe skurcze antyperystaltyczne ^{9,24,25,30,31,42}. Konstrukcja STmap i analiza zmian we wzorcu motoryki została zastosowana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące motoryki przewodu pokarmowego jelita grubego i jelita grubego. Należą do nich: różnicowanie skurczów neurogennych i miogennych oraz określenie roli komórek śródmiąższowych Cajal ^{6,9,11,12,16,24,26,27,29-31,33,37-40,42}, zrozumienie złożonych interakcji między kolistymi i podłużnymi warstwami mięśni ^{2,7,8,11,12,32,39,40}, badanie wpływu śródświetlnych składników odżywczych ^10,18,19, szczepów drobnoustrojów ³⁴ i lepkości ^12,36 na różnych wzorcach ruchliwości i zrozumienie roli różnych endogennych czynników neurohormonalnych i egzogennych środków farmakologicznych 2,4-7,9,10,13-17,28,35,40 w generowaniu i modyfikacji ruchliwości. Przyszłość tej techniki polega na połączeniu jej z innymi pomiarami, w tym ciśnieniem, elektrofizjologią i napięciem/kurczliwością. Ostatnie badania często obejmowały jeden lub więcej z tych pomiarów w połączeniu z zapisem wideo i mapowaniem czasoprzestrzennym, aby dostarczyć dodatkowych szczegółów korelacyjnych ^2,42. Ponadto system może być używany do pomiaru ruchliwości w innych narządach rurkowych i nierurowych. Na przykład podjęto próby pomiaru motoryki żołądka za pomocą takiego systemu, ale technika i oprogramowanie wymagają udoskonalenia, aby lepiej określić ilościowo ruchliwość w takim narządzie nierurkowym ⁴⁵. Nie ma wątpliwości, że zastosowanie technik mapowania czasoprzestrzennego samodzielnie i w połączeniu z bardziej tradycyjnymi metodami analizy doprowadzi w przyszłości do bardziej dogłębnego i wszechstronnego zrozumienia motoryki przewodu pokarmowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu (NaCl)	Fisher	BP358	Do buforu Krebsa.
Chlorek potasu (KCl)	Fisher	BP366	Do bufora Krebsa.
Fosforan potasu (KH2PO4)	Fisher	P285	Do buforu Krebsa.
Siarczan magnezu (MgSO4)	Sigma	M2643	Do buforu Krebsa.
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma	C7902	Do buforu Krebsa.
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Fisher	BP328	Do buforu Krebsa.
Glukoza	Sigma	G7021	Do buforu Krebsa.
Karboxygen (95% O2/5% CO2)
Szpilki
preparacyjne Tace/naczynia
Dunkin Hartley Guinea Pigs	Charles River	Szczep 051
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/	Bezpłatnie dostępne online.
Monitor motoryki przewodu pokarmowego (GIMM)	Catamount Inc., St. Albans, Vermont		Zawiera części wymienione poniżej.
		perystaltyczne	w zestawie z GIMM.
Kamery			w zestawie z GIMM.
		wanny TransIllumination	w zestawie z GIMM.
Kąpiele organowe			w zestawie z GIMM.
Regulacja			w zestawie z GIMM.
Procesor GIMM Wtyczka			dołączona do GIMM.
Rurki			w zestawie z GIMM.
Złącza rurowe			w zestawie z GIMM.
Rurki Masterflex do pomp			w zestawie z GIMM.
Kąpiel grzewcza/cyrkulator			w zestawie z GIMM.